Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) diego_rodrigues_ioc_mest_2009.pdf: 6237150 bytes, checksum: 6688132dca9a5eef5cf8d01c0a302000 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), representa um dos patógenos de maior interesse clínico das últimas décadas. Durante a infecção pelo HIV-1 muitas células CD4+ morrem; enquanto outras, como os macrófagos, sobrevivem e sustentam a replicação do HIV-1 por longos períodos, transformando-se em reservatórios virais. Desta forma, o reconhecimento de fatores que possam manter esses reservatórios celulares vivos e influenciar a replicação do HIV-1 é uma das maiores tarefas para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica mais eficaz. Uma vez demonstrado que a infecção pelo HIV-1 aumenta a secreção do fator de crescimento do nervo (NGF) e que esta molécula é crucial para a sobrevivência de macrófagos, nós analisamos se o NGF poderia modular a replicação do HIV-1 em PBMCs e macrófagos e os mecanismos relacionados a esse fenômeno. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e macrófagos infectados in vitro com HIV-1 foram tratadas com NGF. A replicação viral foi medida por ELISA para p24 em sobrenadantes de cultura. Diferentes inibidores farmacológicos foram utilizados para a análise de possíveis vias de sinalização intracelular envolvidas com a replicação de HIV-1 induzida por NGF. A participação de APOBEC3G foi avaliada em macrófagos expostos ao NGF, utilizando RT-PCR e \201Cimmunoblotting\201D. Infecções com HIV-1 sincronizadas foram utilizadas para estudar se o NGF poderia influenciar a ligação e entrada do vírus. A integração e a transcrição do HIV-1 foram avaliadas por PCR e real-time PCR, respectivamente. Nossos resultados demonstraram que o NGF estimulou a replicação do HIV-1 em macrófagos mas não em PBMCs atingindo um aumento de até 20 vezes em relação ao controle quando tratado com 10ng/mL. Esta neurotrofina não afetou a adsorção, a penetração, nem a integração do DNA proviral. Desta forma, o NGF deve atuar através da estimulação da transcrição das proteínas virais. A via disparada por NGF que estimula a transcrição do HIV-1 é dependente do receptor TrKA, que leva a mobilização de cálcio intracelular derivado do reticulo endoplasmático e na ativação de PKC. Uma vez disparado, PKC ativa ERK1/2, p38quinase e NFkB. A diminuição da produção de APOBEC3G em macrófagos tratados com NGF, também foi observada, inclusive quando tratado com interferon-y. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o NGF estimula a produção de HIV-1 em macrófagos. Esse efeito envolve o receptor TrKA e está associado com a regulação negativa de APOBEC3G. Nosso estudo evidencia uma nova forma de interação entre o HIV-1 e a célula hospedeira, trazendo bases para uma melhor compreensão sobre esta complexa reação / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV - 1), the e tiological agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), represents one of the main pathogens of clinical interest of the last decades. During HIV - 1 infection many CD4 + cells die; while others, such as macrophages, survive and sustain HIV - 1 repli cation for long periods, becoming viral reservoirs. Therefore, the recognition of factors that can maintain these reservoir cells alive and influence HIV - 1 replication is one of the main tasks for the development of a more efficient therapeutic strategy. S ince it has been shown that HIV - 1 infection increases nerve growth factor (NGF) secretion , and that this molecule is crucial for macrophage survival, we further analyzed whether NGF could modulate HIV - 1 replication in PBMCs and macrophages and the mechanis ms underlying this phenomenon. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and macrophages infected i n vitro by HIV - 1 were treated with recombinant human NGF. Viral replication was measured by p24 - ELISA in culture supernatants. Different pharmacological inhi bitors were employed to analyze the possible signaling pathway involved in NGF - induced HIV - 1 replication. Participation of APOBEC3G was evaluated in macrophages exposed to NGF, using RT - PCR and immunoblotting assays. Synchronized HIV - 1 infections were also used to study whether NGF would influence HIV - 1 biding/entry. HIV - 1 integration and transcription were evaluated by PCR and real - time PCR, respectively. Our results demonstrated that NGF stimulated HIV - 1 replication in macrophages, but not in PBMCs reach ing as much as a 20 - fold increase at 10 ng/mL. This neurotrophin did not affect viral adsorption and penetration, nor integration of proviral DNA. Therefore, NGF probably act trough the stimulation of viral transcription. The pathway triggered by NGF to st imulate HIV - 1 transcription was dependent on the engagement of high affinity receptor TrKA, which led to a mobilization of intracellular calcium, derived from endoplasmatic reticulum, and to PKC signaling. Once triggered, PKC activated ERK1/2, p38kinase, a nd NF - kB. We also observed a decrease of APOBEC3G production in NGF - treated macrophages, even when they were stimulated with interferon -  . All together, o ur results suggest that NGF stimulates HIV - 1 production in an important HIV - 1 reservoir, such as macro phages. This effect involves TrKA engagement and is associated with APOBEC3G down - regulation. Our study evidences a new feature of HIV - 1/cell host interaction, providing basis for a better comprehension of this complex interaction

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 michelle_machado_ioc_mest_2014.pdf: 6230482 bytes, checksum: fd56019db1296559466fdb14552694e1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania, clinicamente classificadas como leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. As leishmanioses representam um grave problema de saúde pública no Brasil, onde já foram registradas em todos os estados. Considerando que os mecanismos pelos quais as diferentes espécies de Leishmania causam diferentes patologias ainda são amplamente desconhecidos, pretendeu-se caracterizar diferenças no perfil de citocinas e quimiocinas produzido por macrófagos murinos infectados com L. (Leishmania) amazonensis e L. (Viannia) braziliensis, espécies causadoras de leishmaniose tegumentar americana no Brasil e investigar uma possível relação entre os resultados deste trabalho e as características imunopatológicas das infecções com as espécies em estudo. Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados com diferentes cepas de L. (L.) amazonensis e de L. (V.) braziliensis. A carga parasitária e a taxa de infecção de macrófagos foram determinadas através de microscopia ótica. As cepas de L. (L.) amazonensis apresentaram uma maior variabilidade intraespecífica do que as de L. (V.) braziliensis, porém sem diferença estatisticamente significante A produção de NO foi avaliada por meio da reação de Griess. Todas as cepas de L. (L.) amazonensis induziram a produção de NO, enquanto que apenas na infecção por uma cepa de L. (V.) braziliensis observaram-se níveis detectáveis de NO. Entretanto, esta aparente diferença também não foi estatisticamente significante. A produção de ureia foi determinada através da ocorrência da reação de hidrólise de L-arginina pela enzima arginase. Observou-se que a produção de ureia nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis foi mais heterogênea do que nas infectadas por L. (L.) amazonensis. Observou-se também uma correlação inversa forte e significativa (Spearman r = -0,8051; p = 0,0218) entre os níveis de nitrito e de uréia caracterizando as duas vias de ativação macrofágica: clássica e alternativa, respectivamente. Citocinas e quimiocinas foram dosados nos sobrenadantes dos macrófagos infectados através da técnica de Luminex e a avaliação da expressão gênica destas citocinas e quimiocinas foi realizada por meio do PCR Multiplex em tempo real. Observaram-se importantes diferenças entre o perfil de citocinas e quimiocinas caracterizados através de Luminex e de PCR Multiplex em tempo real Apesar disso, ambos os métodos mostraram níveis mais altos de citocinas e quimiocinas nas culturas infectadas com L. (V.) braziliensis em comparação às infectadas com L. (L.) amazonensis. Os resultados do Multiplex mostraram ausência de diferença estatística entre os macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis e o controle de macrófagos não infectados. Por outro lado, nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis houve um aumento significativo (p < 0,05) da expressão gênica das citocinas IL-1\03B1, IL-6, G-CSF e da enzima NOS, além do aumento sugestivo (p<0,1) da expressão da citocina IL-10, da quimiocina CCL3 e dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Concluiu-se, portanto, que a infecção por L. (V.) braziliensis modulou uma resposta predominantemente pró-inflamatória nos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, enquanto que não foi observada alteração na expressão de qualquer dos genes alvos do estudo na infecção com a espécie L. (L.) amazonensis em relação às culturas controle não infectadas / Leishmaniasis is a group of diseases caused by vari ous species of protozoa of the genus Leishmania , clinically classified as cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis. Leishmaniasis represents a serious p ublic health problem in Brazil, where the desease has been registered in all states . Whereas the mechanisms by which the different species of Leishmania cause different diseases are still largely unknown, we sought to characterize differences in t he profile of cytokines and chemokines produced by murine macrophages infected with L. (Leishmania) amazonensis and L. (Viannia) braziliensis species, both of them causing American cutaneous leishmaniasis in Brazil, and to investiga te a possible relationship between the results of this work and the immunopathological characteristics of the infections with these species. Peritoneal macrophages from BAL B/c mice were infected with different L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis strains. The parasite load and the infection rate of macrophages were determined b y optical microscopy. The L. (L.) amazonensis strains apparently showed greater intraspecific va riability than those of L. (V.) braziliensis , although no statistically significant difference was found. NO production was assessed by the Griess reaction. All strains of L. (L.) amazonensis induced NO production while detectable NO levels we re observed only in the infection by one strain of L. (V.) braziliensis . However, this apparent difference was not statistically significant. The urea production was determined by the occurrence of the hydrolysis reaction of L-arginine by the enzyme arginase. It was observed that urea production in cultures infected by L. (V.) braziliensis was more heterogeneous than in those infected by L. (L.) amazonensis . We also observed a strong and significant inverse correlation (Spearman r = -0.80 51, p = 0.0218) between the levels of nitrite and urea featuring the two routes of mac rophage activation: classical and alternative, respectively. Cytokines and chemokines were measured in the supernatants of infected macrophages through the Lu minex technique and the assessment of gene expression of these cytokines an d chemokines was performed using real-time PCR Multiplex. Important difference s were observed between the profile of cytokines and chemokines revealed by Lum inex and real-time PCR Multiplex. Nevertheless, both methods showed higher levels of cytokines and chemokines in cultures infected with L. (V.) braziliensis as compared to those infected with L. (L.) amazonensis . The Multiplex results showed no statistical difference between macrophages infected with L. (L.) amazonensis and uninfected macrophages control. On the other hand, in cultures infected with L. (V.) braziliensis xii there was a significant increase (p<0.05) of gene e xpression of IL-1 α , IL-6, G-CSF cytokines and NOS enzyme, and also a suggestive inc rease (p < 0.1) of the expression of the cytokine IL-10, the chemokine CCL 3 and CCR2 and the chemokine receptors CCR5. Therefore, it was concluded that in fection with L. (V.) braziliensis modulated a response predominantly proinflammatory in peritoneal macrophages from BALB/c mice, whereas no change was observed in the expression of any target gene in infections with L. (L.) amazonensis when compared to uninfected control cultures

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

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Os objetivos foram: a) desenvolver uma metodologia de criação de G. mellonella, avaliando quatro dietas diferentes sobre crescimento larval, volume da hemolinfa, quantidade de hemócitos e resposta à infecção por meio da curva de sobrevivência b) avaliar os efeitos de L. rhamnosus sobre G. mellonella analisando: curva de sobrevivência; contagem de hemócitos, melanização da hemolinfa, produção de óxido nítrico na hemolinfa e os efeitos de L. rhamnosus sobre macrófagos RAW 264.7 desafiados por S. aureus ou E. coli, analisando o perfil de indução de citocinas e óxido nítrico. Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e Tukey, 5%) e a curva de morte e estimativa das diferenças na sobrevivência foram determinadas por Log-rank (Mantel-Cox, 5%). As rações a base de fubá e pólen apresentaram os melhores resultados, sendo semelhantes entre si e diferentes das demais rações (p < 0,05), sendo a ração a base de fubá escolhida por apresentar resultados semelhante ao pólen e menor custo. Os resultados in vivo demontraram diminuição na mortalidade das lagartas no grupo com inoculação de L. rhamnosus, entretanto, sem diferença estatística. Houve aumento na contagem de hemócitos quando G. mellonella foi inoculada com S. aureus e E. coli, com ou sem inoculação de L. rhamnosus, além de haver melanização da hemolinfa, demonstradno que o L. rhamnosus melhorou a resposta de G. mellonella quando desafiada por bactérias. Os resultados in vitro demonstram que L. rhamnosus induziu alta produçaõ de TNF-α, igualmente aos demais grupos (p ≤ 0,05), não havendo produção de IL-1β e IL-6 no grupo estimulado apenas por L. rhamnosus. Nos grupos que receberam o segundo estímulo ou apenas o contato com S. aureus ou E. coli, houve produção de IL-1β, IL-6 e IL-10. As maiores produções de óxido nítrico foram observadas nos grupos estimulados com S. aureus. Houve diminuição na contagem de UFC/mL de S. aureus e E. coli, quando os macrófagos foram estimulados com lactobcilos. Isso sugere que L. rhamnosus inativado foi capaz de modular produção de citocinas e óxido nítrico quando as células foram desafiadas por S. aureus e E. coli, além de diminuir a contagem de CFU/mL, sugerindo melhorar a capacidade fagocitária dos macrófagos. / Galleria mellonella is used to study microorganisms virulence and antimicrobial power. This study aimed to standardize the creation of worms used in In vivo assays and evaluate the effect of heat-killed probiotic, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, on this model and in in vitro studies. The objectives were: a) developing a methodology for breeding G. mellonella with four different diets influence on larval growth, hemolymph volume, quantity of hemocytes and infection response by means of survival curve; b) evaluating the effects of L. rhamnosus on G. mellonella by means of the following analyzes: survival curve, hemocytes counting, hemolymph melanization, nitric oxide release, and the effects of L. rhamnosus on macrophages RAW 264.7 challenged by S. aureus or E. coli by means of cytokines and nitric oxide production. Results were statistically analyzed (ANOVA and Tukey, 5%). Death curve and estimation of differences in survival were determined by Log-rank (MantelCox, 5%). Cornmeal and pollen-based rations showed the best results, being similar to each other and different from the other ones (p <0.05).Cornmeal ration was chosen since it presents results similar to pollen and lower cost. In vivo results showed reduction in mortality of caterpillars in the group inoculated with L. rhamnosus, with no statistical difference. Hemocyte counting increased when G. mellonella was inoculated with S. aureus and E. coli, with or without inoculation of L. rhamnosus, add to that hemolymph melanization, showing that L. rhamnosus improved G. mellonella response challenged by bacteria. In vitro results show that L. rhamnosus induced high production of TNF-α, like other groups (p = 0.05), with no production of IL-1β and IL-6 in the group stimulated only by L. rhamnosus. The groups which received only the second stimulus or only the contact with S. aureus or E. coli, there was IL-1β, IL-6 and IL-10 production. The highest nitric oxide production was observed in the groups challenged with S. aureus. S. aureus and E. coli CFU/mL counting decreased when macrophages were stimulated with lactobacilli. This suggests that heat-killed L. rhamnosus was capable of modulating cytokine and nitric oxide production when cells were challenged with S. aureus and E. coli and reduce the CFU/mL counting, suggesting that there was enhancement in the phagocytic capacity of macrophages.

Gangliosídios são glicoesfingolipídios que possuem pelo menos um resíduo de ácido siálico em sua estrutura. Localizam-se principalmente na membrana plasmática, podendo ser encontrados em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e glicoesfingolipídios, chamados rafts - estruturas de membrana dinâmicas consideradas como plataformas de sinalização. Gangliosídios têm sido amplamente descritos por estarem envolvidos em processos de proliferação em diversos tipos celulares através da modulação de receptores de fatores de crescimento e suas rotas de sinalização. O GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) é uma das principais citocinas que controlam os eventos da cascata mielopoiética. Seu receptor (GMR) é um heterodímero composto de uma sub-unidade alfa (GMRα) específica para o ligante e uma sub-unidade beta (βc) responsável pela transdução dos sinais de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. O objetivo deste trabalho é estudar a modulação dos gangliosídios na resposta proliferativa induzida por GM-CSF em uma linhagem mielóide murina, FDC-P1. Para isto, utilizamos abordagens complementares de adição exógena de gangliosídios purificados e/ou depleção endógena através de um inibidor da enzima glicosilceramida sintase (D-PDMP). Além disso, avaliamos se a modulação observada na resposta ao GMCSF se dá via ativação do receptor e cascata downstream, expressão gênica do GMR e fator de transcrição C/EBPα, distribuição na membrana e da formação de complexos macromoleculares com gangliosídios. Em resumo, os resultados demonstram que alterações no conteúdo de gangliosídios celulares podem modular a proliferação induzida por GM-CSF através da modulação de vias de sinalização incluindo eventos de transcrição gênica. Além disso, a caracterização e quantificação diferencial da expressão das isoformas tmGMRα e solGMRα na linhagem FDC-P1, constitui uma interessante ferramenta para análise da modulação da expressão gênica deste receptor em diferentes estudos envolvendo a sinalização via GM-CSF. / Gangliosides are glycosphingolipids with at least one residue of siálico acid. They localize mainly at plasma membrane, frequently in microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, called rafts – dynamic membrane structures related to signaling processes. Gangliosides have been extensively reported to be involved in proliferation in several cell types through the modulation of growth factor receptors and signaling cascades. GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) is one of the major cytokines that regulate myelopoiesis. Its receptor is a heterodimer composed of a specific ligandbinding alpha subunit (GMRα) and a beta subunit (βc) responsible for signal transduction. This work aimed to study the modulation of ganglioside in the GM-CSF-induced proliferation in a murine myeloid lineage, FDC-P1. For that, we used complementary approaches of ganglioside exogenous addition and/or endogenous depletion by the use of a glucosylceramide synthase inhibitor (D-PDMP). Moreover, we studied if the observed proliferative modulation was through modulation of GMR downstream signaling, GMR and C/EBPα gene expression, membrane distribution and receptor complex formation with gangliosides. Taken together, these results indicate that gangliosides (either those arising from extra cellular media or endogenously expressed) modulate GM-CSF-mediated proliferative response through modulation of signaling cascade and gene transcription. Moreover, the characterization of and differential quantification of GMRα isoformas (tmGMRα e solGMRα) in FDC-P1 cell lineage constitute a useful tool to study GMRα gene expression modulation.

Submitted by Valquíria Barbieri (kikibarbi@hotmail.com) on 2018-04-18T21:33:42Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-04-27T17:33:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-27T17:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / FAPEMAT / CNPq / A leishmaniose tegumentar americana é causada por protozoários do gênero Leishmania e a transmissão ocorre através da picada de flebotomíneos. É uma doença infecciosa, que acomete pele e mucosa. A resposta imune celular tem sido apontada como um importante fator na progressão das lesões da leishmaniose tegumentar. A proteína anti-inflamatória anexina-A1 é reconhecida como um importante mediador no processo inflamatório. O objetivo deste trabalho foi quantificar a expressão da anexina-A1, nos macrófagos e nas células T CD4+ e T CD8+ de fragmento da pele de paciente com leishmaniose cutânea, e correlacionar com o aspecto histopatológico. Biópsias de pele de pacientes (n=55) com leishmaniose cutânea foram processadas e analisadas. Para caracterizar a espécie de Leishmania foi utilizada PCR–ITS1/RFLP, identificando que todas as amostras biológicas apresentavam o parasita Leishmania brasiliensis. Na análise histopatológica, observou-se intensa migração leucocitária, evidenciando infiltrado histiolinfoplasmocitário. Em seguida foi realizada a determinação da expressão de anexina-A1 nos macrófagos e nas células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes pela técnica de imunofluorescência. Na quantificação da expressão da anexina-A1, observou-se um aumento dessa proteína nos macrófagos da pele de pacientes com leishmaniose cutânea, quando comparados com essas células em individuos saudáveis (controle: 64,6 ± 3,0 UA; LT: 107,0 ± 2,7 UA; p<0,0001). Esses dados podem indicar a atuação dessa proteina durante o processo de fagocitose. Além disso, os macrófagos presentes nas lesões do tipo reação exudativa necrótica da pele de pacientes com leishmaniose cutânea apresentavam maior expressão dessa proteína (123,5 ± 6,9 UA) quando comparados com as células presentes nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa e reação exudativa celular (100,0 ± 4,1, p<0,01; e 104,6 ± 3,0, p<0,05). Esses dados podem indicar que, nas lesões do tipo reação exudativa necrótica, os macrófagos expressam mais anexina-A1 devido a ativação celular para fagocitose dos parasitas e de fragmentos celulares provenientes das regiões necróticas. Com relação as células T CD4+ e T CD8+, nossas análises demonstraram que essas células apresentavam maiores níveis de anexina-A1 nas lesões do tipo reação exudativa celular (TCD4+: 123,9 ± 11,6 UA) (TCD8+: 121,3 ± 9,0 UA), quando comparadas com as células presentes nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa e reação exudativa necrótica (TCD4+: 87,7 ± 5,2, p<0,05; e 53,7 ± 15,7, p<0,01) (TCD8+: 76,0 ± 11,4, p<0,05; e 77,0 ± 10,4, p<0,05). Esses dados demonstram que essa proteína está expressa durante a resposta celular frente aos antígenos da Leishmania. Além disso, a expressão aumentada da anexina-A1 nas células T presentes nas lesões do tipo reação exudativa celular pode ser explicada pelo aspecto mais disseminado do infiltrado histiolinfoplasmocitário, com maior presença de edema e ausência de contenção da infecção como ocorre nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa. Em conclusão, os dados apresentados nesse trabalho, em associação com os dados da literatura, demonstram a relevância da dinâmica da anexina-A1 na regulação do sistema imunológico durante a leishmaniose cutânea. Esses dados trazem, pela primeira vez, uma contribuição para o entendimento do papel da anexina-A1 na ativação dos macrófagos e células T na leishmaniose cutânea. Estudos futuros permitirão o entendimento preciso do mecanismo de ação da anexina-A1 no processo infeccioso da leishmaniose cutânea. / American tegumentary leishmaniasis is caused by protozoa of the genus Leishmania, and the transmission occurs through the sandflies bite. It is an infectious disease that affects the skin and mucosa. The cellular immune response has been identified as an important factor in the progression of tegumentary leishmaniasis lesions. The anti-inflammatory protein annexin A1 is recognized as an important mediator in the inflammatory process. The aim of this study is quantify the annexin-A1 expression in macrophages and CD4+ and CD8+ T cells from skin fragment of patients with cutaneous leishmaniasis, and correlates with histopathological aspects. Skin biopsies of patients (n= 55) with cutaneous leishmaniasis were processed and analyzed. To characterize the species of Leishmania, it was used ITS1-PCR/RFLP, which identified that all biological samples had parasite Leishmania brasiliensis. In the histological analysis, there was an intense leukocyte migration, showing lymphohistiocytic and plasmocytic infiltrate. Then, it was conducted the determination of annexin-A1 expression in macrophages and CD4+ and CD8+ T cells by immunofluorescence technique. In annexin-A1 expression quantification, there was an increase of this protein in macrophages from patients skin with cutaneous leishmaniasis, when compared to these cells from healthy individuals (control: 64.6 ± 3.0 AU, LT: 107.0 ± 2.7 AU; p <0.0001). These data might indicate the role of this protein in the phagocytic process. In addition, macrophages present in the necrotic exudative reaction skin lesions of patients with cutaneous leishmaniasis showed higher expression of the protein (123.5 ± 6.9 AU) when compared with cells present in the granulomatous exudative reaction and cellular exudative reaction lesions (100.0 ± 4.1, p <0.01, and 104.6 ± 3.0, p <0.05). These data may indicate that in necrotic exudative reaction lesions, macrophages express more annexin-A1 due to cell activation induce by phagocytosis of parasites and cellular debris from necrotic regions. Regarding CD4+ and CD8+ T cells, our analysis showed that these cells had higher levels of annexin-A1 in cellular exudative reaction lesions (CD4+: 123.9 ± 11.6 AU) (CD8+: 121.3 ± 9.0 AU) when compared with cells present in necrotic exudative reaction and granulomatous exudative reaction lesions (CD4+: 87.7 ± 5.2, p <0.05; and 53.7 ± 15.7, p <0.01) (CD8+ T: 76.0 ± 11.4, p <0.05; and 77.0 ± 10.4, p <0.05). These data demonstrate that this protein is active during the cellular response to Leishmania antigens. Furthermore the increased annexin-A1 expression in T cells from cellular exudative reaction lesion could be explained by the widespread aspect of lymphohistiocytic and plasmocytic infiltrate, with higher presence of edema and absence infection containment, as occurs in the granulomatous exudative reaction lesions. In conclusion, the data presented here, together with the literature, show the relevance of the annexin-A1 dynamics in the immune system regulation during cutaneous leishmaniasis. These data shows for the first time, a contribution to understanding the role of annexin-A1 in the activation of macrophages and T cells in the cutaneous leishmaniasis. Future studies will allow the accurate understanding of the annexin-A1 mechanism of action in the infection process of cutaneous leishmaniasis.

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Janaina de Cassia Orlandi Sardi / Banca: Gil Benard / Resumo: A interação fungo-hospedeiro resulta em um processo complexo cujo conhecimento permite melhor entendimento da patogênese das micoses sistêmicas. Espécies de Paracoccidioides são agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), doença progressiva, crônica e sistêmica, geograficamente confinada na América Latina. O fungo é termodimórfico e a infecção ocorre após a inalação de conídios ou fragmentos de hifas, que ao entrarem em contato com o hospedeiro podem ser transformadas em formas leveduriformes. Esse evento é importante para o estabelecimento da PCM, associado a fatores ligados ao fungo bem como ao hospedeiro. A virulência fúngica é descrita como um evento altamente complexo onde em diferentes estágios da infecção ocorre a expressão de múltiplos genes, podendo estar fortemente associados ao estabelecimento da doença. A adesão e a sobrevivência no interior do hospedeiro são extremamente importantes para o estabelecimento da patogênese. Alguns genes de Paracoccidioides spp se apresentam diferencialmente expressos durante a transição dimórfica do fungo, apresentando baixos níveis de expressão na forma miceliar quando comparadas com a forma leveduriforme, sugerindo que estes possivelmente seriam fatores na composição de estratégias moleculares que P. brasiliensis utiliza para morfo-adaptação e sobrevivência no hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão de genes relacionados a alguns dos fatores de virulência de P. brasiliensis e P. lutzii na fase miceliar e leveduriforme, visando verificar o nível de expressão no fungo bem como na interação com células fagocíticas e epiteliais. Para tanto foram realizados ensaios de infecção com P.brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (P01), nas fases miceliar e leveduriforme em células epiteliais pulmonares (MRC-5) e macrófagos alveolares (AMJ2-C11) utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Os genes eleitos para este estudo foram os ... / Abstract: The fungus - host interaction results in a complex process whose knowledge allows a better understanding of the pathogenesis of systemic mycoses. Paracoccidioides species are causative agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a progressive, chronic and systemic disease , geographically confined to Latin America. The fungus is thermally and infection occurs after inhalation of conidia or hyphal fragments, which on contact with the host can be transformed into yeast forms. This event is important for the establishment of PCM besides other factors related to the host-fungus interaction. The fungal virulence is described as a highly complex event that enables the expression of multiple genes of the fungus in different stages of infection and can be strongly associated with the development of the disease. Adherence and survival within the host are extremely important for the establishment of pathogenesis. Paracoccidioides spp differentially expressed some genes during the dimorphic fungus transition, having low expression levels in the mycelial form compared with yeast-form, suggesting that these factors were likely to be in the composition of molecular strategies of P. brasiliensis that uses to morpho- adaptation and survival in the host. The aim of this study was to compare the gene expression of the some virulence factors of Paracoccidioides species by real-time PCR. For the assays, the infection was performed with the yeast and mycelial phase of P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (P01) in pulmonary epithelial cells (MRC-5) and alveolar macrophages (AMJ2 -C11) using RT- PCR. The genes chosen for this study were those which express the 43 kDa glycoprotein (gp43), enolase, glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), 14-3-3 (30kDa), phospholipase, protease and hemolysin (Duf gene). The results showed a significant increase in the levels expression of enolase, gp43 and GAPDH in the yeast phase of P. brasiliensis. Enolase was more ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T18:31:25Z : No. of bitstreams: 1 vilela_pgf_me_sjc.pdf: 389414 bytes, checksum: e94b74337996f5291f23f9666ba4f093 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP- 3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p<0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados. / The aim of this study was to evaluate the capacity of different concentrations of endotoxins (LPS) of Escherichia coli to induce secretion of MMP-3 and MMP-8 in macrophages in vitro, in the periods of 24, 48 and 72 h. For this purpose, human monocytes line U937 were differentiated into mature macrophages with phorbol-12-myristate-13- acetate (PMA) and were activated with different concentrations of endotoxins: 0 (control), 5, 10 and 20 EU/ml and the production of MMP-3 and MMP-8 were evaluated at three periods of time (24, 48 e 72 h) by immunoenzymatic assays (ELISA). The results were analyzed statistically by ANOVA and Tukey’s test, 5%. Significant increase in the production of MMP-3 (p<0.05) after the activation with different concentrations of LPS in relation to the control at the periods of 24, 48 and 72 h were observed. Regarding MMP-8, significant reduction in the production after the activation with different concentrations of endotoxins in relation to the control was observed at all the periods evaluated. Basically in all groups (including the controls) the production of MMP-3 and MMP-8 increased significantly in relation to the time. It could be concluded that: a) different concentrations of endotoxins were able to induce significant increase in the production of MMP-3 at the periods of 24, 48 and 72 h, independently of the concentration used, suggesting that this activation is dependent of the presence of the endotoxin and dosis-independent; b) the presence of different concentrations of endotoxins induced significant reduction in the production of MMP-8 in relation to the control in all the periods of evaluation.