CD163, the receptor for haptoglobin–hemoglobin complex, is expressed on monocytes/macrophages and neutrophils. A soluble form (sCD163) has been associated with the M2 macrophage phenotype. M2 macrophages down-modulate the inflammatory response and has previously been described in the most severe, lepromatous (LL) clinical presentation of leprosy as well as tuberculosis. We hypothesized that sCD163 would correlate with severity of diseases caused by intracellular pathogens. Our general objective was to verify the presence of sCD163 in sera of Leprosy and Visceral leishmaniasis (VL) patients. Sera of patients with diferent clinical forms of leprosy (n = 47), and VL (n = 65) were tested for the presence of sCD163. The levels of sCD163 were compared in the diferent clinical forms of leprosy (Indeterminate - IL, Tuberculoid-TL, Boderline-BL and Lepromatous leprosy-LL). The levels of sCD163 were also compared in sera of VL patients before treatment (D0) (n = 46), and at D30 post treatment (n = 19), and also compared at D0, between patients with classical VL (n = 33) and severe VL (n = 13). High levels of sCD163 were detected in sera from leprosy patients as compared to contact controls, and confirmed the association of sCD163 with LL leprosy, finding it at elevated levels in this clinical form. ROC curves showed high sensitivity and specificity for the association between higher levels of this molecule with the most severe LL clinical form. VL patients also presented with high levels of sCD163 in sera at D0 as compared with healthy individuals, and even higher in sera from severe VL patients. Further stratification on infection and disease status revealed a clear association with clinical parameters of disease severity and clinical cure, with a direct correlation sCD163 concentration and liver and spleen sizes. ROC curves also demonstrated high sensitivity and specificity of this molecule to associate this molecule with disease severity of VL. Additionally, sCD163 concentrations reduces after treatment (D30). In vitro cultures indicated that Leishmania infection induced CD163 expression on the surface of monocyte/macrophages and neutrophils, suggesting these cells as possible sources of sCD163 in the sera. Interestingly, the association of sCD163 levels with disease status was not mirrored by levels of haptoglobin, heme-oxygenase, or arginase. Taken together, our data support the use of sCD163 as a biomarker of disease and severity in both leprosy and VL, and indicate a role of Leishmania infection in induce the expression of CD163 in macrophages and neutrophils. This data also suggest CD163 as a marker for M2 and N2, which down modulate inflammatory responses and interfere in the outcome of intracellular infections and the severity of their associated diseases. / O marcador CD163, receptor para o complexo Haptoglobina-Hemoglobina, é expresso em monócitos/macrófagos e neutrófilos. Sua forma solúvel (sCD163) tem sido associada com o fenótipo de macrófagos M2, que modulam negativamente a resposta inflamatória e descritos como relacionados à apresentação Virchowiana da Hanseníase bem como à Tuberculose. Este trabalho se baseou na hipótese de que sCD163 poderia se correlacionar com a gravidade de doenças provocadas por patógenos intracelulares. O objetivo geral foi verificar a presença e caracterizar a associação do marcador CD163 com apresentação clínica da Hanseníase e Leishmaniose Visceral (LV). Soros de pacientes com diferentes formas clínicas de hanseníase (n = 47), e de pacientes com LV foram testados para a presença do sCD163. Foram comparadas as concentracões do sCD163 entre as formas clínicas da hanseníase (Indeterminada - HI, Tuberculóide - HT, Dimorfa - HD e Virchowiana - HV). A presença do sCD163 foi também avaliada nos soros de pacientes com LV (n = 46) no D0 (antes do tratamento) (n = 33), D30 (pós-tratamento) (n = 19) e comparada entre os pacientes no D0 com LV grave (n = 13). Foram observados altos níveis do sCD163 nos soros dos pacientes com hanseníase em comparação com controles contactantes, e confirmou-se a associação desta molécula com a forma HV. Curvas ROC demontraram alta sensibilidade e especificidade da dosagem desta molécula para a associação com a forma mais grave HV da doença. Na LV, foram observadas concentrações elevadas do sCD163 no D0, sendo estas ainda mais elevadas nos pacientes com LV grave. Além disso, observou-se redução do sCD163 após o tratamento (D30). Análises de correlação confirmaram inter-relação entre o biomarcador e parâmetros de gravidade da LV, sendo observadas correlacões diretas entre as concentrações de sCD163 e as medidas do fígado e do baço. Curva ROC, também confirmou a associação entre o nível sérico alto desta molécula com a forma mais grave da LV. Adicionalmente, há uma redução significativa do sCD163 com cura clínica pós-tratamento. Experimentos in vitro indicaram indução da expressão de CD163 na superfície de macrófagos e neutrófilos por Leishmania amazonensis, sugerindo que estas células sejam possíveis fontes para a molécula sérica encontrada nos pacientes com LV. Não houve diferenças nos níveis de haptoglobina, heme-oxigenase-1 e arginase-1 entre os pacientes com LV clássico e LV grave. Em conjunto, esses dados um possível papel da molécula de sCD163 como biomarcador de doença e de gravidade na hanseníase e LV, e sugere um papel da leishmania na indução da expressão dessa molécula. Além disso, os achados sugerem que CD163 pode serum marcador de macrófagos e neutrófilos M2 e N2, os quais podem modular a resposta imune e contribuir para a apresentação clínica de infecções por patógenos intracelulares.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T19:45:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_BetinaMuller.pdf: 2340597 bytes, checksum: 9b2e7abafe20d9c76ebb8713b0789f07 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T19:45:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_BetinaMuller.pdf: 2340597 bytes, checksum: 9b2e7abafe20d9c76ebb8713b0789f07 (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Carbon nanotubes (CNT) have unique properties that are of great interest to the biotechnology area. The idea of using CNTs as carriers of drugs, adjuvants for vaccines and biosensors, is attracting great interest from the scientific community. However, the biocompatibility and toxicity in vitro and in vivo of these structures need to be investigated. Thus, the aim of this study was to investigate the cytotoxicity caused by carbon nanotubes multi-walled (MWCNT) in peritoneal macrophages isolated from C57BL/6 mice and the secondary line RAW 264.7. To perform the in vitro test, cultured cells were treated with concentrations of 1 mg/mL and 5mg/mL MWCNT and 1μg/mL of lipopolysaccharide (LPS). The control group of cells with culture medium were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and the negative control at 100 mϻ hydrogen peroxide. The cells remained in treatments for periods of 24 and 48 hours. Then was determined cell viability through the exclusion method using trypan blue, which remained around 70%. After the biochemical cytotoxicity tests were conducted using the release of lactate dehydrogenase (LDH) in the cell supernatant, allowing to note that the concentrations of MWCNT were unable to cause any damage to the cell membrane, as well as any cytotoxic effect. These results confirm the microscopic images, which do not show cell death caused by MWCNT at these concentrations. The citotoxicity caused by MWCNT was evaluated by the measurement of nitric oxide (NO) and the gene expression of TNF-α and IL-1β. In these tests it was revealed that the toxicity was present in cells treated with the secondary line MWCNT, which did not have an increase in NO production and gene expression of cytokines analyzed. / Os nanotubos de carbono (NTC) apresentam propriedades exclusivas que são de grande interesse para a área de biotecnologia. A idéia de se utilizar NTCs como carreadores de fármacos, adjuvantes para vacinas e biosensores, vem despertando grande interesse da comunidade científica. No entanto, a biocompatibilidade e toxicidade in vitro e in vivo dessas estruturas precisam ser investigadas. Com isso, o objetivo desse trabalho foi investigar a citotoxicidade causada pelos nanotubos de carbono de paredes múltipla (NTCPM) em macrófagos peritoneais isolados de camundongos C57BL/6, e macrófagos da linhagem secundária RAW 264.7. Para a realização dos testes in vitro, as células tratadas foram cultivadas com as concentrações de 1mg/mL e 5mg/mL de NTCPM, e 1μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS). As células do grupo controle com meio de cultura foram cultivadas com meio de cultura DMEM suplementado a 10% de soro bovino fetal (SBF), e o controle negativo com 100 mϻ de peróxido de hidrogênio. As células permaneceram em tratamentos pelos períodos de 24 e 48 horas. Em seguida foi determinado a viabilidade celular, através do método de exclusão pelo azul tripan, a qual permaneceu em torno de 70%. Após foram conduzidos os testes bioquímicos de citotoxicidade através da liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante celular, o que possibilitou observar que as concentrações dos NTCPM utilizadas não foram capazes de causar nenhum dano na membrana celular, assim como nenhum efeito citotóxico. Estes resultados confirmam as imagens microscópicas, as quais não mostram a morte celular causada pelos NTCPM nestas concentrações. A toxicidade causada pelos NTCPM foi avaliada através da dosagem do óxido nítrico (NO) e pela expressão gênica das citocinas TNF-α e IL-1β. Nesses testes foi possível perceber que a citotoxicidade não se fez presente nas células da linhagem secundária tratadas com NTCPM, as quais não tiveram um aumento da produção de NO e na expressão gênica das citocinas analisadas.

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Caracterizada por uma infecção do sistema reticuloendotelial e intensa resposta inflamatória, a LV clássica apresenta como principais manifestações clínicas: hepatoesplenomegalia, febre e edema, além de neutropenia, plaquetopenia e hipergamaglobulinemia. A presença da inflamação mediada por IFN-g e IL-12, teoricamente controlaria a infecção, contudo, o que se observa é a participação de citocinas Th2 associadas a IL-10. Entretanto, não está claro porque 90% dos indivíduos infectados não desenvolvem a doença enquanto outros desenvolvem a forma clássica e alguns evoluem para forma mais severa da doença sem responder ao tratamento. Considerando esse espectro de respostas o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica de indivíduos infectados com Leishmaniachagasie associá-lacom o desenvolvimento da doença bem como a resposta terapêutica. Para associar perfil de citocinas com desenvolvimento da doença, soros de pacientes com diagnóstico confirmado para LV foram avaliados quanto a presença de citocinas, sCD14, MIF e LPS e então comparados com controles saudáveis e indivíduos assintomáticos. Os resultados sugerem que sCD14 pode estar iniciando a ativação da resposta inflamatória via IFN-g e estimulando a produção de IL-27, IL-10 e IL-6. Estas estão fortemente associadas com hepatoesplenomegalia, neutropenia e plaquetopenia. Foi observado também que indivíduos com IL-6 maior que 200pg/mL evoluíram para óbito. Para avaliar a regulação de macrófagos na LV, células mononucleares do sangue periférico foram isoladas de sangue venoso de indivíduos assintomáticos e sintomático, diferenciadas em macrófagos e em seguida infectados com Leishmaniachagasi nos tempos de 2, 24, 48 e 72 horas. Os sobrenadantes das infecções foram avaliados quanto a presença de citocinas e as células coradas para avaliação doíndice de infecção. Apesar de no início da infecção os indivíduos assintomáticos apresentaram maior percentual de macrófagos infectados em relação aos sintomáticos, foi observado um controle da infecção já com 24 horas. Os indivíduos sintomáticos, pelo contrário, exibiram um aumento tanto no percentual de macrófagos infectados quanto no número de amastigotas por macrófagos e mesmo após 48 horas não controlou a infecção. Macrófagos de indivíduos assintomáticos apresentaram maior produção IL-12p70 após duas horas de infecção, enquanto que macrófagos de indivíduos sintomáticos apresentam maior produção de IL-10. Esses resultados sugerem que o controle da infecção ocorre já no início da infecção pela produção de citocinas pró-inflamatórias em detrimento das moduladoras. Em adição, para identificarbiomarcadores imunológicos de bom prognóstico da LV pós tratamento, soros de pacientes foram coletados antes, durante e após o tratamento e avaliados quanto a produção de citocinas, quimiocinas e metaloproteinases. Os dados indicam que IFN-g, TNF-a, IL-10 e IL-17, FGF e VEGF associados com a clínica podem compor um painel de triagem para desenvolvimento de novos fármacos contra LV. Juntos nossos dados reforçam a estreita relação de IFN-g, IL-10, IL-6, TNF-a e IL-27 na dinâmica imunológica da LV e sugerem a participação direta de sCD14 na ativação da resposta imune frente a Leishmaniachagasi.

Os produtos de modificação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) como a subfração eletronegativa [LDL(-)] desempenham um importante papel na progressão da aterosclerose. O acúmulo massivo de LDL modificada captada por macrófagos resulta em células espumosas que liberam mediadores inflamatórios e contribuem para a aterogênese. O scFv (single chain fragment variable) é um fragmento de anticorpo recombinante que contém o sítio completo de ligação ao antígeno. Diante do papel da LDL(-) na aterogênese e da necessidade de novas intervenções terapêuticas que possam inibir o acúmulo de lipídeos em macrófagos, este trabalho objetivou a expressão do scFv anti-LDL(-) 2C7 em Pichia pastoris, bem como a avaliação do efeito deste fragmento de anticorpo sobre a formação de células espumosas em cultura de macrófagos RAW 264.7. O vetor inicial de expressão pPIgLE apresentava como estratégia de detecção e purificação o fusionamento com a proteína A. No entanto, a alta imunogenicidade da proteína A inviabilizaria o estudo da proteína de fusão em cultura de macrófagos, o que determinou a substituição da estratégia de purificação anterior pela cromatografia com resina de níquel através da inserção de hexahistidina na região C-terminal da proteína. A análise de sequenciamento confirmou a presença da inserção e das regiões determinantes de complementariedade. O cassete de expressão com hexahistidina foi inserido no vetor pPIgLE de P. pastoris e transformado na linhagem SMD1168 (Invitrogen®). Testes preliminares de expressão em pequena escala permitiram a análise entre sete clones diferentes, demonstrando uma banda correspondente ao peso molecular de 28 KDa em SDS-PAGE, confirmado por Western Blot. A separação do scFv 2C7 através de resina de níquel obteve uma proteína pura, conforme foi analisado em SDS-PAGE corado com prata. A afinidade do scFv 2C7 a 9 LDL(-) foi confirmada por Dot Blot. O ensaio de captação de LDL(-) demonstrou que o scFv 2C7 foi eficaz na redução de células espumosas e este efeito foi acompanhado pela diminuição na expressão gênica de CD36, TLR-4 e COX-2. Baseado nestes dados, o scFv 2C7 demonstra uma propriedade importante para uma futura intervenção terapêutica para a aterosclerose. / The modification products of low-density lipoprotein (LDL), as the electronegative subfraction [LDL(-)], play an important role in the progression of atherosclerosis. The massive accumulation of modified LDL uptake by macrophages results in foam cells that release inflammatory mediators and contribute to atherogenesis. The scFv (singlechain fragment variable) is a recombinant antibody fragment that contains the complete site antigen-binding. Considering the role of LDL(-) in atherogenesis and the need for new therapeutic interventions that may inhibit the accumulation of lipids in macrophages, this study aimed the expression of anti-LDL(-) 2C7 scFv in Pichia pastoris and the evaluation of the effect of this recombinant antibody fragment on foam cells formation in cultured RAW 264.7 macrophages. The pPIgLE expression initial vector presented as a strategy for detection and purification the fusion with protein A. However, the high immunogenicity of the protein impairs the study of the fusion protein in cultured macrophages, leading to the replacement of the previous strategy of purification by chromatography with nickel resin by inserting hexahistidine tag at the C-terminus of the protein. The sequence analysis confirmed the presence of insertion and the complementary determining regions. The expression cassete with hexahistidine was inserted into the pPIgLE vector of P. pastoris and transformed in the SMD1168 strain (Invitrogen®). Preliminary tests of expression in small-scale allowed the analysis of seven different clones, showing a band corresponding to the molecular weight of 28KDa on SDS-PAGE, confirmed by Western Blot. The separation of 2C7 scFv by the nickel resin yield a pure protein, as it was shown by SDS-PAGE stained with silver. The affinity of 2C7 scFv was confirmed by Dot Blot. The assay of LDL(-) uptake showed that the 2C7 scFv was effective in reducing foam cells and this effect was determined by the decrease in gene expression of CD36, TLR-4 and COX-2. Based on these data, the 2C7 scFv demonstrates an important property for future therapeutic intervention for atherosclerosis

O resveratrol, um polifenol de origem natural, é descrito como uma substância antiinflamatória, antioxidante, cardioprotetora e anticancerígena. Diversos estudos comprovam a atividade imunomodulatória do resveratrol in vitro e in vivo, estimulando ou diminuindo a secreção de citocinas envolvidas na resposta Th1/Th2. Além do uso em vacinas como adjuvantes, a descoberta de novas substâncias imunomodulatórias pode ser aplicada na profilaxia e tratamento de doenças imunodegenerativas com perda da tolerância sistêmica ou periférica. O objetivo desse estudo é relacionar o efeito modulador do resveratrol em ensaios de endocitose em macrófagos e de secreção de citocinas IL-6(produção de IgA) e IL-10(resposta Th2 e tolerância em mucosas) com a produção de anticorpos anti-ova IgG e IgA após imunização via-oral. Os resultados obtidos demonstraram que in vitro, houve aumento da endocitose em macrófagos e diminuição na secreção de IL-6 pelas células isoladas de placas de peyer em concentrações abaixo de 50 µM de resveratrol. Após a administração oral de resveratrol de 5 mg e 10 mg/kg observou-se o aumento significativo da secreção de IL-10 em esplenócitos isolados de camundongos Balb/C. Nos grupos imunizados com 1 mg de ovalbumina/animal e resveratrol (5 mg e 10 mg/kg) via oral 2 vezes, com 14 dias de intervalos, houve aumento significativo da produção de IgG sérico em relação ao grupo imunizado somente com ovalbumina. Porém a produção de IgA sérico e em lavado intestinal diminuiu, indicando um possível aumento da tolerância oral. Esses resultados demonstram o efeito imunomodulador do resveratrol in vitro/in vivo e a necessidade de maiores estudos sobre o uso desta substãncia como adjuvante de vacinas ou uma droga imunossupressora de mucosa. / Resveratrol, a polyphenol of natural origin, is described as a substance-inflammatory, antioxidant, cardioprotective and anticancer. Several studies have demonstrated the immunomodulatory activity of resveratrol in vitro and in vivo, stimulating or decreasing the secretion of cytokines involved in Th1/Th2 response. Besides the use as adjuvants in vaccines, the discovery of new immunomodulatory substances can be applied for prophylaxis and treatment of diseases imunodegenerativas with loss of peripheral tolerance or systemic. The aim of this study is to relate the modulating effect of resveratrol on tests of endocytosis in macrophages and secretion of IL-6 (IgA production) and IL-10 (Th2 response and mucosal tolerance) with the production of anti-ova IgG and IgA after oral immunization route. The results of in vitro tests showed an increase of endocytosis in macrophages and decrease in IL-6 secretion by cells isolated from Peyer\'s patches at concentrations below 50 mM of resveratrol. After oral administration of resveratrol 10 mg / kg was observed to significantly increase the secretion of IL-10 in splenocytes isolated from Balb / C. In groups immunized with 1 mg ovalbumin / animal and resveratrol (5 mg and 10 mg / kg) orally two times with 14 days intervals, significant increase of IgG level in relation to the group immunized with ovalbumin only. But the production of IgA in serum and intestinal lavage decreased, indicating a possible increase in oral tolerance. These results demonstrate the immunomodulatory effect of resveratrol in vitro / in vivo and the need for more studies on substance use as a vaccine adjuvant or immunosuppressive drugs mucosa.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-19T15:07:55Z No. of bitstreams: 4 Dissertação Parcial (Cap. 1-4) - Luma C. Loureiro.pdf: 1497392 bytes, checksum: 13f91a02fd24dc31022afc14786f874e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Dissertação Parcial (Cap. 7) - Luma C. Loureiro.pdf: 260521 bytes, checksum: 479ddd5a004985a4fea7ef881128da94 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-19T15:08:50Z (GMT) No. of bitstreams: 4 Dissertação Parcial (Cap. 1-4) - Luma C. Loureiro.pdf: 1497392 bytes, checksum: 13f91a02fd24dc31022afc14786f874e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Dissertação Parcial (Cap. 7) - Luma C. Loureiro.pdf: 260521 bytes, checksum: 479ddd5a004985a4fea7ef881128da94 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T15:08:50Z (GMT). No. of bitstreams: 4 Dissertação Parcial (Cap. 1-4) - Luma C. Loureiro.pdf: 1497392 bytes, checksum: 13f91a02fd24dc31022afc14786f874e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Dissertação Parcial (Cap. 7) - Luma C. Loureiro.pdf: 260521 bytes, checksum: 479ddd5a004985a4fea7ef881128da94 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-06-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Gram-negative bacteria, such as Klebsiella pneumoniae, have LPS in their membranes, a component that triggers inflammatory process, by cells of the host immune system such as macrophages (MA), produced cytokines, chemokines and lipid mediators. Inflammation is important in preventing microorganisms, but the exacerbation can cause serious tissue damage. Indeed, MA are also important in the control of infections, phagocytosis and death of microorganisms. Membrane lipids have been the subjects of studies to development of new pharmacological therapies (Membrane Lipid Therapy - MLT). On this way, lipid of surfactant liquid (LS) were target to development pulmonary MLT. Among the most abundant phospholipids in LS, we found POPC, a phosphatidylcholine (PC), the oxidized phospholipids product, such as PaldoPC. In this work, our aim was to evaluate the effects of LS-derived PCs on modulation of polarization (M1 and M2), inflammatory and phagocytic activity of macrophages against K. pneumoniae. Our results demonstrated that POPC and PaldoPC increase NO production when M1 are stimulated with LPS. Indeed, the treatment with PC increased the production of inflammatory cytokines and chemokines in the M0 and M1 profile, post LPS-stimulated. The increment on inflammatory mediators production by MA treated with PC, correlated with the increased on gene expression of TLR2, TLR4, and MYD88. The treatment with POPC increased phagocytosis of K. pneumoniae, corroborating with the increased production of PGD2. However, PaldoPC inhibited the phagocytosis and increased the production of PGE2. Our data suggest that PC did not have inflammatory effect direct on MA, but increased the MA response against LPS, increasing expression of innate immune receptors, and modulation of prostaglandins production; influenced the pulmonary microenvironment immune response. / Bactérias Gram-negativas, como Klebsiella pneumoniae, possuem LPS em suas membranas, componente responsável por desencadear processo inflamatório por células do sistema imune como os macrófagos (MA), produzindo citocinas, quimiocinas e mediadores lipídicos. A inflamação é importante no combate aos microrganismos, mas a exacerbação deste evento pode causar sérios prejuízos ao tecido. Da mesma forma, os MA são importantes no controle de infecções, atuando na fagocitose e morte de microrganismos. Os lipídios de membrana têm sido alvo de estudos para o desenvolvimento de novas terapias farmacológicas (Terapia de Lipídios de Membrana - TLM). Neste sentindo, os lipídios do líquido surfactante (LS) são alvos para desenvolvimento de TLM pulmonar. Dentre os fosfolipídios mais abundantes do LS, encontramos o POPC, uma fosfatidilcolina (PC), e também seus produtos oxidados, como PaldoPC. Neste trabalho, nosso objetivo foi avaliar os efeitos das PC derivadas do LS na modulação da polarização (M1 e M2), atividade inflamatória e fagocítica de MA contra K. pneumoniae. Nossos resultados demonstram que POPC e PaldoPC aumentaram a produção de NO nos M1 estimulados com LPS. Da mesma forma, o tratamento com as PC aumentaram a produção de citocinas e quimiocinas inflamatórias no perfil M0 e M1 pós-estimulados com LPS. O aumento da produção de mediadores inflamatórios nos MA tratados com PC, correlacionou com o aumento da expressão gênica de TLR2, TLR4, e MYD88. Além disso, o tratamento com POPC aumentou a fagocitose de K. pneumoniae, corroborando com o aumento produção de PGD2. No entanto, o tratamento com PaldoPC inibiu a fagocitose, e aumentou a produção de PGE2. Nossos dados sugerem que PC não tem efeito inflamatório direto sobre MA, mas, potencializa a resposta de MA com LPS, aumentando a expressão de receptores da imunidade inata e modulando a produção de prostaglandinas; influenciando a resposta imune do microambiente pulmonar.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-08-26T17:02:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao - Lohane Suzart Martins - 2014.pdf: 1088223 bytes, checksum: 32629b7ed64c638cc7b7548031ebeac3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-08-26T17:02:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao - Lohane Suzart Martins - 2014.pdf: 1088223 bytes, checksum: 32629b7ed64c638cc7b7548031ebeac3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T17:02:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao - Lohane Suzart Martins - 2014.pdf: 1088223 bytes, checksum: 32629b7ed64c638cc7b7548031ebeac3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / L. (L.) amazonensis is one of the species that cause American tegumentary leishmaniasis. Resistance to Leishmania infection is associated with Th1 lymphocytes, which produce IFN-γ and activate macrophages and promote the death of the parasites. However, during the infection, other T cells subtypes can develop, such as the Th17 subtype, which produce IL-17. The role of IL-17 is known in inflammatory diseases and infections with extracellular pathogens, and its function is associated to the migration and activation of neutrophils. In Leishmania infection, it is not clear whether this cytokine would influence the activation of a phenotype that controls infection. Aim: To assess whether IL-17 interferes with activation of murine macrophages and with their Leishmania amazonensis leishmanicidal. Methods: Thyoglycolate-elicited peritoneal macrophages from BALB/c or C57BL/6 mice were primed with IL-17, IFN-γ or IL-4, activated or not with lipopolysaccharide (LPS) and infected with L. (L.) amazonensis promastigotes. Culture supernatants were harvested 48 h after the stimulus to assess nitric oxide (NO) and IL-12p40 production. The cells were used to determine the phagocytic, leishmanicidal and arginase activity. Results: Macrophages from BALB/c and C57BL/6 mice stimulated with IL-17 and LPS produced IL-10 and increased arginase activity. IL-17 was not able to induce NO production by these cells, but promoted a small increase in IL-12p40 secretion by C57BL/6 mice macrophages. IL-17 favored the proliferation of Leishmania in macrophages from BALB/c mice, but not in C57BL/6 mice. A synergism was observed between IL-17 and IL-4 that increased IL-10 production and arginase activity in macrophages from BALB/c mice. In macrophages from C57BL/6 mice, however, a synergism was observed between IL-17 and IFN-γ in the stimulation of NO production. Conclusion: These results suggest that IL-17 may participate in the activation of macrophages toward either phenotype depending on the mouse strain. The finding that IL-17 impairs the control of L. (L.) amazonensis in BALB/c mice was not observed in C57BL/6 mice. IL-10 production in macrophages stimulated with IL-17 suggests a regulatory role of this last cytokine. / A L. (L.) amazonensis é uma das espécies que causam a leishmaniose tegumentar americana. A resistência à infecção é associada à linfócitos Th1, os quais produzem IFN-γ que ativam macrófagos e promovem a morte do parasito. No entanto, durante a infecção, há o desenvolvimento de outros perfis de linfócitos, como o Th17, que produz IL-17. O papel da IL-17 é bem descrito em doenças inflamatórias e infecções por patógenos extracelulares, sendo que sua função está relacionada com a quimiotaxia e ativação de neutrófilos. Quanto à infecções por patógenos intracelulares, como a leishmânia, não está claro se esta citocina poderia agir interferindo no perfil dos macrófagos e, consequentemente, no controle da doença. Objetivo: avaliar se a IL-17 é capaz de influenciar na ativação dos macrófagos e nos mecanismos leishmanicidas de macrófagos murinos infectados com L. (L.) amazonensis. Métodos: macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e C57BL/6 foram estimulados com IFN-γ, IL-4 ou IL-17, ativados ou não com LPS e infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis. O sobrenadante foi utilizado para avaliar produção de NO, IL-12p40 e IL-10 e as células remanescentes usadas para avaliar a atividade de arginase, a atividade fagocítica e leishmanicida. Resultados: macrófagos de camundongos BALB/c e C57Bl/6 estimulados com IL-17 e LPS produziram IL-10 e aumentaram a atividade de arginase. A IL-17 não foi capaz de induzir a produção de NO pelos macrófagos, mas promoveu um pequeno aumento da produção de IL-12p40 em macrófagos de C57BL/6. A IL-17 favoreceu a proliferação da L. (L.) amazonensis em macrófagos de camundongos BALB/c, mas não nos de camundongos C57BL/6. Observou-se um sinergismo entre IL-17 e IL-4 na produção de IL-10 e a atividade de arginase em macrófagos de camundongos BALB/c. Em macrófagos de camundongos C57BL/6, por sua vez, foi observado sinergismo entre IL-17 e IFN-γ para a produção de NO. Conclusão: A IL-17 pode estar relacionada tanto com a ativação clássica de macrófago quanto com sua ativação alternativa. Porém, a morte da leishmânia é prejudicada em macrófagos de BALB/c estimulados com IL-17. A indução da produção de IL-10 em macrófagos estimulados com IL-17 sugere um potencial regulador desta última citocina.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-12-06T16:54:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Bruno César Ferreira Gonzaga - 2016.pdf: 2851863 bytes, checksum: 3316d056c52b9a8ca6ed7608909e2b80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-12-13T15:35:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Bruno César Ferreira Gonzaga - 2016.pdf: 2851863 bytes, checksum: 3316d056c52b9a8ca6ed7608909e2b80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T15:35:12Z (GMT). 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Carcasses of cattle aged 20-36 months were weighed and divided into two groups: Group 1 (544.87-607.13 pounds) and Group 2 (689.42-757.24 pounds) The livers of bovines were weighed and samples of the right lobe were collected for histopathologic analysis. The areas of hepatic parenchyma containing foamy macrophages were measured using the ImageJ® program. Statistical analysis of the parameters (liver weight, hot carcass weights and affected area of liver tissue) was performed quantitatively, by calculating the mean, standard deviation and coefficient of variation. These data were analyzed for normality and homogeneity of variances, through the Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests. As the variables were homogeneous and had a normal distribution were evaluated by parametric test analysis of variance. The correlation of variables was performed by Spearman test. The significance level was set at 5% and all descriptive analyzes were performed by EXCEL program and statistical tests by the software R. Cattle grazing Brachiaria spp. presented hepatic lesions characterized by degeneration, necrosis, presence of mild inflammatory infiltrates and small area of hepatic tissue containing foamy macrophages. There was no influence of the affected area of the hepatic parenchyma containing foamy macrophages with hot carcass weight of cattle. / O capim braquiária, com ampla distribuição geográfica no Brasil, vem sendo apontado como causa de fotossensibilização e do aparecimento de macrófagos espumosos no fígado e linfonodos hepáticos e mesentéricos de ruminantes. Foram relatadas perdas de peso na ordem de 2,52% em bovinos com fotossensibilização hepatógena subclínica e estimou-se que mais de R$ 100.000 em perdas anuais por lesões hepáticas em apenas um frigorífico fosse decorrente do consumo de Brachiaria spp. O objetivo deste estudo foi correlacionar a extensão do parênquima hepático contendo macrófagos espumosos com o peso de carcaça quente dos bovinos. As carcaças dos bovinos, com idade entre 20 a 36 meses, foram pesadas e distribuídas em dois grupos: Grupo 1 (247,15 a 275,39 kg) e Grupo 2 (312,72 a 343,48 kg). Os fígados dos bovinos foram pesados e amostras do lobo direito coletadas para análise histopatológica. As áreas do parênquima hepático contendo macrófagos espumosos hepáticos foram mensuradas utilizando-se o programa ImageJ®. A análise estatística dos parâmetros (peso do fígado, peso da carcaça quente e área comprometida do tecido hepático) foi realizada de forma quantitativa, calculando a média, desvio padrão e coeficiente de variação. Esses dados foram analisados quanto à normalidade e homogeneidade das variâncias, por meio dos testes de Kolmogorov-Smirnov e Bartlett. Como as variáveis foram homogêneas e tiveram uma distribuição normal, foram avaliadas pelo teste paramétrico de análise de variâncias. A correlação das variáveis foi realizada pela correlação de Spearman. O grau de significância adotado foi de 5% e todas as análises descritivas foram realizadas pelo programa EXCEL e os testes estatísticos pelo programa R. Os bovinos sob pastejo de Brachiaria spp. apresentaram lesões hepáticas caracterizadas por degeneração, necrose, presença de infiltrados inflamatórios de intensidade leve e pequena área do tecido hepático contendo macrófagos espumosos. Não houve influência da área comprometida do parênquima hepático contendo macrófagos espumosos com o peso de carcaça quente dos bovinos.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-29T13:03:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Márcia de Jesus A. Silva.pdf: 2397176 bytes, checksum: 10d2601e2d4c7bb5bd425131e63a0ebc (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-29T13:04:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Márcia de Jesus A. Silva.pdf: 2397176 bytes, checksum: 10d2601e2d4c7bb5bd425131e63a0ebc (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-11-29T13:04:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Márcia de Jesus A. Silva.pdf: 2397176 bytes, checksum: 10d2601e2d4c7bb5bd425131e63a0ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T13:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Márcia de Jesus A. Silva.pdf: 2397176 bytes, checksum: 10d2601e2d4c7bb5bd425131e63a0ebc (MD5) Previous issue date: 2016-04-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Inflammation is a physiological process that begins in response to infection or tissue damage. It is a mechanism focusing on tissue repair after injury and consists of a cascade of cellular and microvascular events that aims to remove damaged tissue and generation of new ones. In this cascade is observed an increasing in microvascular permeability, followed by adhesion and cell infiltration at the site of injury, apoptosis, and growth of new tissue and blood vessels. The nitrostyrene is a group of compounds consisting of an aromatic ring linked to a chain of the nitro group (NO2). It has been studied by having various biological activities such as anti-apoptotic, anti-platelet or anti-microbial, although few studies have been made for the anti-inflammatory activity of these compounds. The aim of this study was to evaluate anti-inflammatory activity of four new compounds from the class of nitrostyrene (NPA, 7B, 7D and 7E) in in vitro/in vivo assays. Initially, the compounds were submitted to in vitro testing in a murine macrophages model activated by lipopolysaccharide (LPS) and MRC5 human lung fibroblast in order to assess the cytotoxic potential of such compounds. Shortly thereafter, they were evaluated for inhibition of nitric oxide (NO·), for dosage of the cytokine TNF-α and evaluation of the expression of proteins involved in the inflammatory process. To evaluate the acute inflammatory process in vivo was performed edema induction by carrageenan tests on zebrafish model of LPS-induced pleurisy in mice. The four new compounds tested showed cytotoxic activity on J774A.1 and MRC5 cell when tested in the concentrations (3.12-25 μg/ml). For THP-1 cytotoxic activity was starting concentration of 10 μg/ml. All compounds inhibited nitric oxide production by macrophages activated by LPS but only the NPA showed a possibly significant concentration-response at the concentrations of 10 and 20 μg/ml. This same compound also reduced TNF-α, NF-B and ERK 1/2 levels in THP-1 cells. The NPA possibly also inhibited the carrageenan-induced edema in Zebrafish fish and leukocyte migration into the pleural cavity of mice by inhibiting the intracellular signaling pathways NF-B and ERK 1/2 in in vivo assays. In conclusion, compounds tested in this study not only presented significant cytotoxic activity, as also showed an excellent in vitro/in vivo anti-inflammatory potential, most likely by acting in the inhibition of NF-B and ERK 1/2 pathways. Data were important to explore the biological activity of these novel compounds and their possible application in the treatment of inflammatory diseases. / A inflamação é um processo fisiológico que se inicia em resposta a uma infecção ou dano aos tecidos. É um mecanismo direcionado ao reparo tecidual após a lesão e consiste em uma cascata de eventos celulares e microvasculares que tem como objetivo a remoção de tecidos danificados e a geração de outros novos. Nessa cascata é observado o aumento da permeabilidade microvascular, seguido pela adesão e infiltração de células no local da lesão, apoptose celular e crescimento de novos tecidos e vasos sanguíneos. Os nitroestirenos são um grupo de compostos constituído por anel aromático ligado a uma cadeia do grupo nitro (NO2). Eles têm sido estudados por apresentar diversas atividades biológicas tais como anti-apoptótica, antiplaquetária e antimicrobiana, entretanto poucas pesquisas têm sido realizadas quanto à atividade anti-inflamatória desses compostos. O objetivo deste estudo foi avaliar atividade anti-inflamatória de quatro novos compostos da classe dos nitroestirenos (NPA, 7B, 7D e 7E) em ensaios in vitro/in vivo. Inicialmente, os compostos foram submetidos a ensaio in vitro em modelo de macrófagos murino ativados por lipopolissacarídeo (LPS) e fibroblastos de pulmão humano MRC5, a fim de avaliar a capacidade citotóxica desses compostos. Logo em seguida, foram avaliados quanto à inibição de óxido nítrico (NO·), dosagem da citocina TNF-α e avaliação da expressão de proteínas envolvidas com o processo inflamatório. Para avaliar o processo anti-inflamatório agudo in vivo foi realizado ensaios de indução do edema por carragenina em peixe Zebrafish e o modelo de pleurisia induzido por LPS em camundongos. Os quatro novos compostos testados apresentaram atividade citotóxica em célula J774A.1 e MRC5 quando testados nas concentrações (3.12-25 μg/mL). Para THP-1 a atividade citotóxica foi apartir da concentração 10 μg/mL. Todos os compostos inibiram a produção de óxido nítrico em macrófago ativado por LPS, entretanto somente NPA apresentou uma possível concentração-resposta significativa nas concentrações de 10 e 20 μg/mL. Este mesmo composto também reduziu os níveis de TNF-α, NF-B e ERK 1/2 em células THP-1. O NPA também possivelmente inibiu o edema induzido por carragenina em peixe Zebrafish e a migração de leucócitos na cavidade pleural de camundongos através da inibição das vias de sinalização intracelular NF-B e ERK 1/2 em ensaios in vivo. Em conclusão, compostos testados neste estudo nao somente apresentaram atividade citotóxica significativa, como também demonstraram um excelente potencial anti-inflamatório in vitro e in vivo, provavelmente por atuação de inibição das vias NF-B e ERK 1/2. Os dados obtidos foram importantes para exploração da atividade biológica destes novos compostos e sua possível aplicação na terapêutica de doenças inflamatórias.

A tuberculose ainda é pontuada como uma doença de impacto mundial, sendo considerada desde 1993 um problema de saúde pública global. Uma das grandes preocupações é a contínua prevalência de cepas da Mycobacterium tuberculosis multidroga resistentes, especialmente o genótipo hipervirulento W-Beijing. Acredita-se que este genótipo apresenta alguma vantagem seletiva em relação a outros genótipos da M. tuberculosis, além de estar associado à falha terapêutica, tuberculose extrapulmonar, resistência à vacinação pela BCG e acentuada capacidade de disseminação. Estas cepas apresentam variável capacidade de sobrevivência dentro de macrófagos e do granuloma, modulando vias metabólicas específicas que culminam no escape do sistema imunológico e sucesso na infecção. Buscando entender esta vantagem seletiva e capacidade de persistência na infecção, este estudo teve como objetivo analisar e comparar o perfil transcriptômico de macrófagos infectados com as cepas da M. tuberculosis, W-Beijing 1471 e H37Rv. Os RNAs mensageiros dos macrófagos infectados foram sequenciados em plataforma HiScan Genome Analyzer Illumina. Foram gerados aproximadamente 30 milhões de sequências por amostra, em leituras single reads, com mais de 70% de sequências com valores de score Q de qualidade superior ou igual a 30. Foram mapeados e analisados 35.581 transcritos. Em média, 63% dos genes não apresentaram diferenças nos valores de expressões, 19% tiveram suas expressões reduzidas e 18% dos genes foram classificados como mais expressos, para todas as amostras de macrófagos sequenciadas. Após as análises terciárias e validação por PCR em tempo real, as amostras infectadas com a cepa W-Beijing 1471 apresentaram um aumento nas expressões de IFNs da classe I (p<0,001) e aumento exacerbado de TNF-alfa (p<0,001), comparativamente ao controle e as amostras infectadas com a cepa padrão H37Rv. Aditivamente foi observado um aumento nas expressões de duas quinases, RIPK1 e RIPK3 e de moléculas envolvidas na indução e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS), que em infecções por bactérias intracelulares, estão correlacionadas com a morte de macrófagos por necroptose. A cepa hipervirulenta da M. tuberculosis, W-Beijing 1471, apresentou reduzida persistência intramacrofágica e induziu morte precoce dos macrófagos ao quinto dia de infecção. A morte observada nos macrófagos foi associada a ativação de IFNs da classe I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 e ROS, indicando necroptose. Ainda, foi observado um aumento na expressão do receptor TLR3 nas amostras infectadas com a cepa W-Beijing, comparativamente as amostras controles e infectadas com a cepa H37Rv. É provável que a ativação inicial dos IFNs da classe I tenha ocorrido via TLR3 através do reconhecimento de dsRNAs da M. tuberculosis. / Since 1993 the tuberculosis is considered as a disease of worldwide impact and a problem of public health. A major concern is the continuing prevalence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains, especially the hypervirulent W - Beijing genotype. It is believed that this genotype has a selective advantage over other genotypes of M. tuberculosis and has being associated with treatment failure, extrapulmonary tuberculosis, resistance to BCG vaccination and marked ability to spread. These strains have varying ability to survive within macrophages and granuloma, modulating specific metabolic pathways that culminate in the escape of the immune system response. To understand this selective advantage and ability to persist in infection, this study aimed to analyze and compare the transcriptomic profile of macrophages infected with strains of M. tuberculosis W - Beijing 1471 and H37Rv. The mRNAs of infected macrophages were sequenced in HiScan Illumina Genome Analyzer platform. Were generated approximately 30 million sequences per sample, in single-reads readings. More than 70 % of sequences had values of Q score superior or equal to 30. Were mapped and analyzed 35,581 transcripts. On average, 63% of the genes showed no differences in the expressions, 19% were downregulated and 18% were upregulated, for all samples sequenced macrophages. After tertiary analysis and validation by real-time PCR, samples infected with the strain W -Beijing in 1471 showed an increase in expression of IFN class I (p <0.001) and exacerbated increase of TNF- alpha (p < 0.001) when compared to the control samples and those infected with standard strain H37Rv. Additively was observed an increase in expressions of the two kinases RIPK1 and RIPK3 and molecules involved in the induction and control of reactive oxygen species (ROS). In infections by intracellular bacteria, activation of RIPK1, RIPK3, ROS and TNF-&#945;, are correlated with death of macrophages by necroptosis. The hypervirulent M. tuberculosis W - Beijing 1471 strain showed reduced persistence inside macrophage and induced early death of macrophages in the fifth day of infection. The death observed in macrophages was associated with activation of IFNs class I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 and ROS, indicating necroptosis. Also was observed an increase in the expression of TLR3 receptor in infected samples with W-Beijing 1471 strain compared to controls and those infected with H37Rv strain. Probably the initial activation of IFNs class I occurred by TLR3 through the recognition of M. tuberculosis dsRNAs.