Orientador: Vânia Niéto Brito de Souza / Resumo: A infecção pelo Mycobacterium leprae (ML) estimula um processo de desdiferenciação e proliferação das células de Schwann (SCs) que pode contribuir para a disseminação do bacilo. Os macrófagos (MOs) são células efetoras da resposta imune que promovem a eliminação de patógenos, entretanto, na hanseníase são colonizados pelo ML. Sabe-se que os MOs podem apresentar uma polarização funcional na qual os MOs M1 apresentam características pró-inflamatórias e microbicidas enquanto os MOs M2 atuam na reparação tecidual e possuem perfil anti-inflamatório. SCs infectadas pelo ML produzem mediadores capazes de interferir com a função dos MOs aumentando sua sobrevida e promovendo sua migração. Embora diferentes programas funcionais tenham sido observados em MOs de pacientes com formas polares da hanseníase a influência de SCs nesse processo não é sabida. Neste estudo avaliamos se SCs infectadas pelo ML podem interferir na polarização de MOs murinos derivados de medula óssea. Para tanto, culturas primárias de SCs murinas foram infectadas experimentalmente com bacilos viáveis e cocultivadas com MOs. Nossos resultados indicam que a produção de óxido nítrico foi baixa nas culturas de MOs após a infecção com o bacilo, mas mostrou-se aumentada nas coculturas de MOs e SCs infectadas pelo ML. A infecção com ML não induziu produção significante das citocinas IL-6, IL-10 e TNF em culturas de MOs e SCs, entretanto, a interação entre MOs e SCs infectadas com o bacilo resultou em aumento na produção de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mycobacterium leprae (ML) infection stimulates dedifferentiation and proliferation of Schwann cells (SCs) that may contribute to the spread of the bacillus. Macrophages (MOs) are effector cells of the immune response that promote the elimination of pathogens, however, in leprosy they are colonized by ML. It is known that MOs can present a functional polarization in which M1 MOs show pro-inflammatory and microbicidal activities while M2 MOs act in tissue repair presenting an anti-inflammatory profile. SCs infected by ML produce mediators able to interfere with MOs function, increasing their survival and promoting their migration. Although different functional programs have been observed in MOs from patients with polar forms of leprosy, the influence of SCs in this process is not known. In this study we evaluated whether SCs infected with ML could interfere in the polarization of murine MOs derived from bone marrow. For this purpose, primary cultures of murine SCs were experimentally infected with viable bacilli and co-cultivated with MOs. Our results indicate that nitric oxide production was low in cultures of MOs after infection with the bacillus, but it was increased in the co-cultures of MOs and ML-infected SCs. The infection with ML did not induce significant production of IL-10, TNF and IL-6 in cultures of MOs and SCs, however, the interaction between MOs and ML infected-SCs resulted in increased production of cytokines, mainly IL-10, inducing a decrease in the TNF/IL-10 ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP- 3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p<0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the capacity of different concentrations of endotoxins (LPS) of Escherichia coli to induce secretion of MMP-3 and MMP-8 in macrophages in vitro, in the periods of 24, 48 and 72 h. For this purpose, human monocytes line U937 were differentiated into mature macrophages with phorbol-12-myristate-13- acetate (PMA) and were activated with different concentrations of endotoxins: 0 (control), 5, 10 and 20 EU/ml and the production of MMP-3 and MMP-8 were evaluated at three periods of time (24, 48 e 72 h) by immunoenzymatic assays (ELISA). The results were analyzed statistically by ANOVA and Tukey's test, 5%. Significant increase in the production of MMP-3 (p<0.05) after the activation with different concentrations of LPS in relation to the control at the periods of 24, 48 and 72 h were observed. Regarding MMP-8, significant reduction in the production after the activation with different concentrations of endotoxins in relation to the control was observed at all the periods evaluated. Basically in all groups (including the controls) the production of MMP-3 and MMP-8 increased significantly in relation to the time. It could be concluded that: a) different concentrations of endotoxins were able to induce significant increase in the production of MMP-3 at the periods of 24, 48 and 72 h, independently of the concentration used, suggesting that this activation is dependent of the presence of the endotoxin and dosis-independent; b) the presence of different concentrations of endotoxins induced significant reduction in the production of MMP-8 in relation to the control in all the periods of evaluation. / Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Coorientador: Luciane Dias de Oliveira / Banca: Cristiane Yumi Koga Ito / Banca: Mariella Vieira Pereira Leão / Mestre

Título original: Análise morfofisiológica in vitro da ação de extratos de glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) sobre a linhagem J774 e macrófagos peritoneais de camundongos BALB/C / Orientador: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Fabiana Alonso Rocha / Banca: Patricia Ucelli Simioni / Resumo: A espécie Rhipicephalus sanguineus s. l., mais conhecida como "carrapato do cão", possui uma grande importância médico-veterinária, não só por espoliar seus hospedeiros, mas também por ser um potencial vetor de agentes patogênicos. O sucesso biológico desses ectoparasitas deve-se à produção de uma saliva complexa produzida pelas glândulas salivares, cujos compostos são capazes de modular o sistema imune inflamatório e hemostático dos hospedeiros. No entanto, mesmo com o conhecimento adquirido sobre o potencial da saliva no sistema imune-inflamatório dos hospedeiros, pouco se estudou sobre os mecanismos de ação dos extratos glandulares nessa resposta, e as alterações morfofisiológicas envolvidas. Desta forma, o presente projeto propôs a análise dos efeitos in vitro de extratos de glândulas salivares de fêmeas de carrapatos R. sanguineus s. l. com 2 e 4 dias de alimentação (EG2 e EG4) sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e células da linhagem J774, observando possíveis variações na atividade e na morfofisiologia destas células em função das diferentes exposições ao extrato. Os resultados demonstraram que apenas a concentração de 4 µg/mL do extrato EG2 apresentou citotoxicidade sobre células da linhagem J774 quando expostas por 48 horas; as concentrações de 4 e 2 µg/mL de ambos os extratos estimularam perfis pró inflamatórios em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c; a concentração de 2 µg/mL no tempo de 48 horas de exposição e 1 µg/mL no de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The species Rhipicephalus sanguineus s. l., better known as "dog tick", has a great medical-veterinary importance, not only for spolling its hosts, but also because it is a potential vector of pathogens. Biological success of these ectoparasites is due to the production of a complex saliva produced by salivary glands, whose compounds are able to modulate the immune system inflammatory and hemostatic properties of the hosts. However, even with the knowledge acquired on the potential of saliva in the immune-inflammatory system of the hosts, little was studied about the mechanisms of action of glandular extracts in this response, and the morphophysiological changes involved. In this way, the present project proposed analysis of the in vitro effects of extracts of salivary glands from female ticks R. sanguineus s. l. with 2 and 4 days of feeding (EG2 and EG4) on peritoneal macrophages of BALB / c mice and J774 cells, noting possible variations in the activity and in the morphophysiology of these cells due to the different exposures to extract. The results demonstrated that only the concentration of 4 μg / mL of the extract EG2 showed cytotoxicity on cells of the J774 lineage when exposed by 48 hours; the concentrations of 4 and 2 μg / mL of both extracts stimulated pro-inflammatory response in peritoneal macrophages of BALB / c mice; the concentration of 2 μg / mL at the 48 hour exposure time and 1 μg / mL at the 24 hour exposure time of the EG2 and concentrations 2 and 1 μg / m... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Gangliosídios são glicoesfingolipídios que possuem pelo menos um resíduo de ácido siálico em sua estrutura. Localizam-se principalmente na membrana plasmática, podendo ser encontrados em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e glicoesfingolipídios, chamados rafts - estruturas de membrana dinâmicas consideradas como plataformas de sinalização. Gangliosídios têm sido amplamente descritos por estarem envolvidos em processos de proliferação em diversos tipos celulares através da modulação de receptores de fatores de crescimento e suas rotas de sinalização. O GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) é uma das principais citocinas que controlam os eventos da cascata mielopoiética. Seu receptor (GMR) é um heterodímero composto de uma sub-unidade alfa (GMRα) específica para o ligante e uma sub-unidade beta (βc) responsável pela transdução dos sinais de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. O objetivo deste trabalho é estudar a modulação dos gangliosídios na resposta proliferativa induzida por GM-CSF em uma linhagem mielóide murina, FDC-P1. Para isto, utilizamos abordagens complementares de adição exógena de gangliosídios purificados e/ou depleção endógena através de um inibidor da enzima glicosilceramida sintase (D-PDMP). Além disso, avaliamos se a modulação observada na resposta ao GMCSF se dá via ativação do receptor e cascata downstream, expressão gênica do GMR e fator de transcrição C/EBPα, distribuição na membrana e da formação de complexos macromoleculares com gangliosídios. Em resumo, os resultados demonstram que alterações no conteúdo de gangliosídios celulares podem modular a proliferação induzida por GM-CSF através da modulação de vias de sinalização incluindo eventos de transcrição gênica. Além disso, a caracterização e quantificação diferencial da expressão das isoformas tmGMRα e solGMRα na linhagem FDC-P1, constitui uma interessante ferramenta para análise da modulação da expressão gênica deste receptor em diferentes estudos envolvendo a sinalização via GM-CSF. / Gangliosides are glycosphingolipids with at least one residue of siálico acid. They localize mainly at plasma membrane, frequently in microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, called rafts – dynamic membrane structures related to signaling processes. Gangliosides have been extensively reported to be involved in proliferation in several cell types through the modulation of growth factor receptors and signaling cascades. GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) is one of the major cytokines that regulate myelopoiesis. Its receptor is a heterodimer composed of a specific ligandbinding alpha subunit (GMRα) and a beta subunit (βc) responsible for signal transduction. This work aimed to study the modulation of ganglioside in the GM-CSF-induced proliferation in a murine myeloid lineage, FDC-P1. For that, we used complementary approaches of ganglioside exogenous addition and/or endogenous depletion by the use of a glucosylceramide synthase inhibitor (D-PDMP). Moreover, we studied if the observed proliferative modulation was through modulation of GMR downstream signaling, GMR and C/EBPα gene expression, membrane distribution and receptor complex formation with gangliosides. Taken together, these results indicate that gangliosides (either those arising from extra cellular media or endogenously expressed) modulate GM-CSF-mediated proliferative response through modulation of signaling cascade and gene transcription. Moreover, the characterization of and differential quantification of GMRα isoformas (tmGMRα e solGMRα) in FDC-P1 cell lineage constitute a useful tool to study GMRα gene expression modulation.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-18T15:46:49Z No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-25T17:38:28Z No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-31T14:15:20Z No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-09-08T18:41:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T18:41:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kene_d_gallois_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 8919174 bytes, checksum: 5cb63a99e70a1503eb86db1086b275b0 (MD5) Previous issue date: 2009-01-16 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é a pneumoconiose de maior prevalência no Brasil partículas de sílica cristalina, sendo caracteriza colágeno e formação de granulomas, mediadores. O fator inibidor inflamatória atuante em diferentes tipos de patologias, sendo importante em respostas imunes e nos mecanismos decorrentes do dano tecidual. do MIF no modelo experimental de silicose murina. MIF “knockout” (MIF-/-) foram submetidos à instilação as análises realizadas 7 (fase aguda) e 28 dias (fase crônica) pós existência de um aumento significativo no número de leucócitos totais broncoalveolar de camundongos silicóticos de células mononucleares elevado por pelo menos 28 dias. infiltrado de células inflamatórias 7 dias pós fibrótica com formação de granuloma camundongos silicóticos exibiram um aumento na deposição de colágeno nos pulmões quando comparados aos controle quimiocinas MIP-1 MIPtempos analisados. Esse fenômeno apresentou correlação direta com o quadro de comprometimento da função pulmonar (aumento de resistência e elastância) e de hiperreatividade das vias aéreas ao agente broncoconstrictor metacolina. MIF-/- sílica apresentaram, ainda, paralelo a um menor infiltrado leucocitário, expressão diminuída menor proporção dos granulomas, acompanhado por redução da resposta de hiperreatividade das vias aéreas. Em contraste, foi verificado processo exacerbado de granulomas no pulmão dos camundongos sílica MIF área tecidual ocupada por granulomas TNF- e TGF- , quando comparados ao detectada, na fase crônica da doença, uma expres camundongos sílica MIF-/-, refletindo a presença de miofibroblastos camundongos silicóticos tratados com anticorpo neutralizante anti comprometimento da função pulmonar e alteraçõe reduzidos, indicando a participação do MIF como mediador pró silicose. Em conclusão, nossos resultados indicam que o MIF coloca atuante na modulação do quadro silicótico, c terapêutica no caso da doença humana. / Silicosis is the pneumoconiosis of highest prevalence in Brazil and is of crystalline silica particles, being characterized by granuloma formation, in a way dependent on a wide range of mediato migration inhibitory factor (MIF) several inflammatory diseases to investigate the potential role of MIF in a model of (BALB/c) and MIF knockout the analyses made on day 7 (acute phase) and 28 (chronic phase). increase in the number of total l mice, on day 7 after silicosis induction mononuclear cells and neutrophil least 28 days. Tissue analyses day 7, followed by fibrotic response day 28. We also noted that silicotic mice exhibited an increase in a marked increase in the levels of MIP increase in the levels of fibrogenic cytokines TNF These phenomena directly correlated resistance and elastance) and MIF-/- silicotic mice showed hyperreactivity to methacholine of MIP-1 and MIP-2 and F4/80 expression and granuloma area phase, a marked increased in granuloma tissue area compared to WT mice, together with lower collagen deposition and and TGF- . An increase in the expression of also noted. When silicotic mice were treated with anti the reduced pulmonary function and tissue damage were noted, indicating a role for MIF as a proinflammatory mediator in silicosis. In conclusion, our results to play a relevant modulatory role in as a potential therapeutic target in human disease.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-16T19:35:07Z No. of bitstreams: 1 Vinicius Pinto Costa Rocha. Avaliação da atividade antileishmania...2012.pdf: 1625526 bytes, checksum: 4407e0cb5e7b4ade8175d66ca2a59a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T19:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vinicius Pinto Costa Rocha. Avaliação da atividade antileishmania...2012.pdf: 1625526 bytes, checksum: 4407e0cb5e7b4ade8175d66ca2a59a34 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose compreende um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, e é endêmica em 88 países, com uma população de 350 milhões de indivíduos sob o risco de contrair a infecção. O tratamento convencional da leishmaniose é realizado com antimoniais pentavalentes, e está associado a inúmeros efeitos adversos e falha terapêutica. Dessa forma, a busca por novas alternativas terapêuticas para esta doença é de extrema relevância. O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade antileishmania de fármacos antimaláricos in vitro e em modelo murino de leishmaniose tegumentar causada por Leishmania amazonensis. Os fármacos antimaláricos testados foram o artesunato, a cloroquina, a hidroxicloroquina, a mefloquina e a primaquina. Destes, a cloroquina e a hidroxicloroquina não reduziram, de forma significativa, o crescimento de formas promastigotas do parasito na concentração de 50 μM. Entretanto, estes dois fármacos foram eficazes em reduzir o número de amastigotas em macrófagos murinos, apresentando valores de IC50 de 0,78 ± 0,08 μM e 0,67 ± 0,12 μM, respectivamente. A mefloquina apresentou valor de IC50 de 8,4 ± 0,70 μM contra promastigotas do parasito, enquanto que, contra formas amastigotas o IC50 foi 1,56 ± 0,19 μM. A análise ultraestrutural de células infectadas e tratadas com a cloroquina ou com a mefloquina mostrou o acúmulo de corpos multivesiculares no citoplasma do parasito. Este resultado sugere o comprometimento da via endocítica da Leishmania após o tratamento com estas moléculas. O tratamento oral de camundongos CBA infectados com L. amazonensis reduziu a lesão e o parasitismo nos animais infectados. Diferente destes resultados, o tratamento com a mefloquina não reduziu o parasitismo nos animais infectados, apesar de ter reduzido o tamanho da lesão. Com base nestes resultados é possível concluir que a cloroquina pode representar uma alternativa terapêutica ao tratamento convencional da leishmaniose tegumentar. / Leishmaniasis comprises a complex of diseases caused by parasites of the genus Leishmania and is endemic in 88 countries, with a population of 350 million individuals at risk of contracting the infection. The conventional treatment of leishmaniasis based on pentavalent antimonials is associated with several adverse effects and treatment failure. Thus, the search for new therapeutic alternatives for this disease is extremely relevant. This study aims to evaluate the antileishmanial activity of antimalarial drugs in vitro and in a murine model of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis. The antimalarial drugs tested were artesunate, chloroquine, hydroxychloroquine, mefloquine and primaquine. Of these, chloroquine and hydroxychloroquine did not reduce, significantly, the growth of promastigotes of the parasite at a concentration of 50 μM. However, these two drugs were effective in reducing the number of amastigotes in murine macrophages, with IC50 values of 0.78 ± 0.08 μM and 0.67 ± 0.12 μM, respectively. Mefloquine had an IC50 value of 8.4 ± 0.70 μM against promastigote forms, whereas the IC50 against amastigotes was 1.56 ± 0.19 μM. The ultrastructural analysis of infected cells and treated with chloroquine or mefloquine showed accumulation of multivesicular bodies in the cytoplasm of the parasite. This result suggests the involvement of the endocytic pathway of Leishmania after treatment with these molecules. Oral treatment of CBA mice infected with L. amazonensis reduced lesion size and parasitism in infected animals. In contrast, treatment with mefloquine did not reduce the parasite load in infected animals, although it did reduce the size of the lesion. Based on these results we conclude that chloroquine may represent a therapeutic alternative to conventional treatment of cutaneous leishmaniasis.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. O câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC) representa aproximadamente 85% dos casos diagnosticados. Apesar de o conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumentado muito, o prognóstico do CPNPC continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada à detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados apresenta estágios avançados. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela dificuldade de compreender o microambiente que circunda o tumor, o qual está relacionado, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Nesse contexto, o estabelecimento e o avanço do processo neoplásico resultam em uma estimulação da resposta imunológica do hospedeiro contra o avanço tumoral. Uma das células recrutadas são os macrófagos, os quais desempenham um papel fundamental tanto na resistência tumoral, quanto na progressão da neoplasia. Essas células apresentam uma plasticidade celular de amplo espectro – a qual dificulta a análise da influência dessas células em relação a determinadas patologias - podendo, de acordo com o estímulo ambiental, apresentarem propriedades anti ou pró-inflamatórias. Essa plasticidade confere ao macrófago uma característica que o faz ser central no estabelecimento do microambiente tumoral. Nesse contexto, sabe-se que os agentes quimioterápicos, e outras moléculas, induzem a morte celular, principalmente, pelo processo apoptótico, sendo que a remoção dessas células e dos corpos apoptóticos é realizada pelos fagócitos, ocorrendo, assim, uma modulação do sistema imune, principalmente em relação aos macrófagos. Portanto, o presente trabalho tem por objetivo analisar a influência dos macrófagos e da apoptose na sobrevida de pacientes com CPNPC, verificar se a fagocitose de células apoptóticas advindas de diferentes indutores apresentam diferentes capacidades imunomodulatórias sobre o macrófago e buscar ferramentas que auxiliem na caracterização dos fenótipos dos macrófagos. Para tanto, inicialmente, realizou-se uma meta-análise de dados clínicos correlacionando macrófagos e apoptose com o desfecho clínico de pacientes com CPNPC. Em seguida, induziu-se a apoptose na linhagem de CPNPC A549 com os indutores cisplatina (droga padrão-ouro na clínica), taurina cloramina (um oxidante biológico produzido por macrófagos e neutrófilos) e ácido bromopirúvico (um inibidor metabólico), sendo as células apoptóticas postas em contato com os macrófagos. Para verificar a modulação dos macrófagos, analisou-se as citocinas liberadas. Por fim, através de bioinformática e RT-PCR, criaram-se duas assinaturas gênicas de macrófagos. Nossos resultados mostraram que há discrepâncias quanto ao papel dos macrófagos e da apoptose no desfecho dos pacientes com CPNPC. Nas análises in vitro, observamos que existem diferenças entre a eficiência da fagocitose das células apoptóticas advindas do tratamento com taurina cloramina quando comparada aos demais tratamentos. Observou-se também que ocorre uma modulação diferencial nos macrófagos que fagocitaram as células apoptóticas advindas do tratamento com cisplatina e taurina cloramina. Por fim, as assinaturas gênicas criadas conseguiram caracterizar de forma robusta não somente os fenótipos dos macrófagos in vitro, mas também seus fenótipos em determinados contextos clínicos, além da capacidade de correlacionar genes com o desfecho de determinadas patologias. / Lung cancer is the most lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Non small cell lung cancer represents approximately 85% of all cases diagnosed. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors has increased, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an overall survival of 10 months. One reason for this difficulty is the poor prognosis associated with early detection, since most of the patients diagnosed with this pathology have advanced stages. The lack of clinical progress occurs often due to the difficulty of understanding the microenvironment surrounding the tumor, which is related with metastatic capacity and resistance to chemotherapy. In this context, the establishment and advancement of the neoplastic process result in a stimulation of the host immune response against tumor. One of recruited immune cells are the, which plays a key role in tumor resistance or progression. These cells exhibit a broad spectrum of cellular plasticity (which results in the difficulty to correlate these cells in human pathologies) may, depending on the environmental stimulus, presenting anti or pro-inflammatory properties. This plasticity confers to macrophage a key role in the establishment of tumor microenvironment. It is known that chemotherapy agents, and other molecules induce cell death mainly by apoptosis, and the removal of these cells and apoptotic bodies by phagocytes modulates the immune system, especially macrophages. Therefore, this study aims to analyze the influence of macrophages and apoptosis in patients’ outcome and survival in NSCLC, to verify whether the phagocytosis of apoptotic cells obtained from different inducers had to capacity to modulate differently the macrophages and lastly found tools that can help in the characterization of macrophges’ phenotypes. For that, firstly was made a meta-analysis of clinical data correlating macrophages and apoptosis with clinical outcome of patients with NSCLC. Further, apoptosis was induced in NSCLC cell line A549 with the inducers Cisplatin (gold standard in clinic), Taurine Chloramine (physiological oxidant) and Bromopyruvic Acid (metabolic inhibitor), and the apoptotic cells were putted in contact with macrophages. To verify the macrophages’ modulation, we analyzed the cytokines released. Lastly, using bioinformartics and RT-PCR, we constructed two gene signatures of macrophages. Our results showed discrepancies concerning the role of macrophages and apoptosis in NSCLC patients’ outcome. In in vitro analysis, we observed that the phagocytosis efficiency of apoptotic cells induced by Taurine Chloramine was different when compared to the others treatments. We also observed a differential modulation of macrophages that phagocytosed the apoptotic cells obtained from the treatment of Cisplatin and Taurine Chloramine. Finally, the gene signatures created were capable to characterize robustly not only the macrophages’ phenotypes in vitro, but also the phenotypes in clinical contexts, predicting the correlation between genes expression and diseases outcomes.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores, tais como processos inflamatórios, estresse oxidativo, endotoxinas bacterianas, infecções e febre. Este efeito citoprotetor é principalmente atribuído à habilidade de as proteínas de choque térmico estabilizarem estruturas protéicas através de interações reversíveis. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Previamente, nós descrevemos a relação entre os níveis de HSP70 sérica, o estatus oxidante e o desfecho clínico de pacientes sépticos; o grupo de pacientes com maiores níveis pró-oxidantes e maiores níveis de HSP70 sérica também foi aquele que houve maior mortalidade. Afim de investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada, e a produção de nitrito, proliferação celular, viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de TNF-α e atividade fagocítica foram avaliadas. Também foram avaliadas as modificações estruturais causadas pela oxidação na HSP70 purificada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os efeitos modulatórios da HSP70 oxidada sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7 foram diferentes dos efeitos modulatórios da HSP70 nativa. Os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli, such as inflammation, oxidative stress, hypoxia, endotoxins, infections and fever. This cytoprotective effect is mainly attributed to their ability to stabilize protein structures through chaperon-like reversible interactions. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. Previously, we have described the relationship between serum HSP70 levels, oxidant status and clinical outcome of septic patients; the group of patients with higher pro-oxidant status and higher serum HSP70 had also higher mortality. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70 and evaluated nitrite production, cell proliferation, cell viability, reactive oxygen species production, TNF-α release and phagocytic activity. We also evaluated structural modifications caused by oxidation in purified HSP70. Oxidation of HSP70 altered its protein structure; besides, the modulatory effect of oxidized HSP70 on RAW265.7 cells was different from native HSP70. Macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leishmanioses constituem um importante problema de saúde pública no Brasil, em razão da incidência da doença associada à alta taxa de morbidade. Devido ao fato da Leishmania ser um parasita intracelular no hospedeiro vertebrado, estudos de moléculas do parasita, que atuam na interação do parasita com a célula do hospedeiro vertebrado, são de alta importância para uma melhor compreensão dos mecanismos de invasão e sobrevivência do parasita. Seguindo este racional, nesta tese foram identificados, purificados e caracterizados os proteofosfoglicanos secretados por formas promastigotas (pPPG) e amastigotas (aPPG) de L. (L.) amazonensis, respectivamente de meios de cultura e de macrófagos infectados com esses parasitas. A purificação dos PPGs foi realizada por combinações de cromatografias em DEAE-Sephadex, Octyl-Sepharose e Bio-Gel A- 0.5 e ultracentrifugações. Por "Western blotting" e radioimunoensaio em fase sólida utilizando diferentes anticorpos monoclonais (mAbs), observou-se que o pPPG apresenta alto peso molecular, contem cadeias fosfoglicanas e é reconhecido por mAbs anti-glicoesfingolipídeos (GSLs) ST-3 e ST-5, e mAb anti-lipofosfoglicano (LPG) VST-1. Em estudos imunohistoquímicos de cortes de lesão de hamsters infectados com L. (L.) amazonensis, observou-se a presença de material reativo com os mAbs ST-3, ST-4 e ST-5 na superfície do parasita e em torno do vacúolo parasitóforo. Após delipidação de cortes da lesão (processo em que são extraídos os glicolipídeos), a reatividade com os mAbs limitou-se a algumas regiões do vacúolo, sugerindo a possível localização dos aPPGs na célula infectada. O aPPG apresentou padrão de migração eletroforética similar ao pPPG, e foi reconhecido pelos mAbs ST-3, ST-4 e ST-5, mas não pelo mAb VST-1. A análise da composição monossacarídica dos PPGs de L. (L.) amazonensis por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa mostrou que o pPPG é composto por manose:galactose:glucose, na proporção molar de 1:1,2:1,7. Por outro lado, o aPPG apresenta em sua estrutura manose:galactose:glucose na proporção de 1:2:9. Em experimentos paralelos foram avaliados os níveis de produção de óxido nítrico e do fator de necrose tumoral por macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c expostos a diferentes estímulos com antígenos parasitários de L. (L.) amazonensis. Observamos que LPG, pPPG e GSLs per se não estimularam os macrófagos na produção de NO. Por outro lado o aPPG per se mostrou-se capaz de estimular a produção de NO. LPGs e pPPGs foram capazes de estimular a produção de óxido nítrico quando incubados na presença de interferon gama. Por outro lado, GSLs e interferon gama não foram capazes de estimular a produção de NO em macrófagos. Nenhum dos antígenos de Leishmania utilizados estimulou a produção de fator de necrose tumoral. O perfil glicolipídico de amastigotas axênicos de L. (L.) amazonensis em comparação com o de amastigota isolado de lesão foi analisado por HPTLC, tendo sido verificadas diferenças significativas no padrão cromatográfico dos glicolipídeos. Os glicolipídeos de formas axênicas não são reconhecidos por mAbs anti-GSLs. A organização dos glico(esfingo)lipídeos e glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) de formas amastigotas e promastigotas de L. (L.) amazonensis foi analisada. Para isso, membranas resistentes ao detergente não-iônico Triton X-100 foram isoladas a 4ºC. Em formas amastigotas foi verificado que os GSLs, esfingomielina e esteróis estão predominantemente localizados em frações de membranas resistentes ao tratamento com Triton X-100. Em formas promastigotas foi verificado que inositol fosforilceramida, GIPLs e esteróis estão localizados preferencialmente nas membranas de baixa densidade insolúveis em detergente nãoiônico a 4ºC. Em um outro conjunto de experimentos foi analisado o efeito de inibidor de síntese de esfingolipídeo, Aureobadisina A (AbA), em formas promastigotas e amastigotas de L. (L.) amazonensis. Em formas promastigotas foi observado que a AbA inibe o crescimento dos parasitas, entretanto esse efeito é reversível. Em ensaios de infectividade in vivo observou-se que camundongos BALB/c infectados com parasitas tratados com AbA apresentavam um desenvolvimento tardio das lesões em relação aos infectados com parasitas sem tratamento. Por outro lado, em culturas axênicas de amastigotas isoladas de lesão foi observado que a AbA é tóxica aos parasitas. Após a adição da AbA em cultura de macrófagos infectados com formas amastigotas, verificou-se uma diminuição significativa da infecção de macrófagos. Todos estes resultados sugerem que os glicoconjugados de L. (L.) amazonensis analisados nesta tese podem atuar na interação entre o parasita e o hospedeiro, exercendo papéis importantes na sobrevivência e progressão da leishmaniose. / Leishmaniasis is an important public health problem in Brazil. Since Leishmania is an obligatory intracellular parasite in the host, studies of parasite antigens responsible for interaction with the host cell during the infection are important to understand the mechanism of parasite invasion and survival. Following this rationale, in this work it was purified and characterized proteophosphoglycans secreted by promastigote (pPPG) and amastigote (aPPG) forms in culture supernatant and into parasitophorus vacuole of infected macrophages, respectively. The PPGs were purified by combination of chromatography (DEAE-Sephadex, Octyl-Sepharose and Bio-Gel A-0.5) and ultracentrifugation. By Western blotting and solid phase radioimmunoassay using different monoclonal antibodies (mAbs), it was observed that pPPG presents high molecular weight, contains phosphoglycan chains and it is recognized by anti-glycosphingolipids (GSLs) mAbs ST-3, ST-5 and by anti-lipophosphoglycan (LPG) mAb VST-1. Immunohistological analysis of hamster footpad lesions infected with L. (L.) amazonensis using different mAbs showed a strong labeling on amastigote forms and inside/around macrophage parasitophorus vacuole. After delipidation of lesion sections with a mixture of isopropanol/hexane/water (condition in which GSLs are removed) it was observed that the mAbs reactivity localized inside the vacuole remained in infected tissue, thus indicating the possible localization of aPPGs secreted by L. (L.) amazonensis recognized by the mAbs. The aPPG showed similar electrophoretic migration of pPPG, and it was recognized by mAbs anti-GSLs ST-3, ST-4 and ST-5, but not by mAb VST-1. The analysis of monosaccharide compositon of PPGs, determined by gas chromatography - mass spectrometry, showed that pPPG is constituted of mannose:galactose:glucose at molar proportion of 1:1.2:1.7. On the other hand, aPPGs showed in their strucuture mannose:galactose:glucose at proportion of 1:2:9. In parallel assays, nitric oxide (NO) and tumor necrose factor (TNF-α) production by BALB/c macrophages exposed to different L. (L.) amazonensis antigen stimuli were also analyzed. The pPPG, LPG and GSLs by themselves were not able to induce nitric oxide production by macrophages. On the hand, aPPG per se was able to induce nitric oxide production. The LPG and pPPGs were able to synergize with INF-γ the production of NO. Furthermore, GSLs were not able to stimulate NO production in presence of INF-γ. None of the antigens did induce the pro-inflammatory cytokines TNF-α secretion. The glycolipid profile of axenic and lesion amastigotes of L. (L.) amazonensis was analyzed by HPTLC. The results showed a significative difference in glycolipid chromatographic profile among the parasites, and axenic amastigote glycolipids were not recognized by anti-GSL mAbs. The membrane organization of glyco(sphingo)lipids and glycoinositolphospholipids (GIPLs) of L. (L.) amazonensis amastigote and promastigote forms were studied after Triton X-100 extraction at 4ºC. In amastigote forms it was observed that GSLs, sterol and sphingomyelin are present in the Triton X-100 resistant membrane domains. In promastigote parasites it was observed that inositol phosphorylceramide, GIPLs, sterol and a small amount of phosphatidylethanolamine are localized in the low-density membranes insoluble in non-ionic detergent at 4ºC. In another set of experiments, it was analyzed the effect of Aureobasidin A (AbA) in L. (L.) amazonensis promastigote and amastigote forms. AbA inhibited completely promastigotes growth, however, it should be noted that this effect was reversible. Infectivity assays in BALB/c mice using promastigote forms treated with AbA showed a delay in lesion development. On the other hand, the effect of AbA in L. (L.) amazonensis amastigotes showed that this drug is toxic to amastigote forms. AbA effect was also analyzed during the infection of macrophages by amastigote forms of L. (L.) amazonensis. After adition of AbA in the culture, it was observed a significative reduction of phagocytic index. The present study shows that Leishmania glycoconjugates may be crucial in parasite-host cell interaction, playing important role in the parasite survival and in the disease progress. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-29T19:07:35Z No. of bitstreams: 1 Ivana Nunes Gomes De Araujo Estudo de mecanismo... 2004.pdf: 52151625 bytes, checksum: 4f6174379d294a0210664b0966341227 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T19:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ivana Nunes Gomes De Araujo Estudo de mecanismo... 2004.pdf: 52151625 bytes, checksum: 4f6174379d294a0210664b0966341227 (MD5) Previous issue date: 2004 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Camundongos CBA são susceptíveis à Leishmania amazonensis e resistentes à L. major. Eventos da resposta imune inata parecem cruciais na determinação da resposta à infecção por Leishmania. Macrófagos desempenham papel importante no controle da infecção, pois in vitro controlam a infecção por L. major, entretanto são permissíveis à L. amazonensis. Neste trabalho, pretendeu-se investigar mecanismos moleculares envolvidos na determinação dos perfis de resposta de macrófagos de CBA infectados, in vitro, por L. amazonensis ou L. major. Observamos que IFN-y, apesar de induzir produção semelhante de NO, reduz a infecção causada por L. major, não alterando a infecção por L. amazonensis. Essa redução é dependente de TNF-a. Em estudos de biogênese do vacúolo parasitóforo, observou-se que há semelhança na cinética de fusão dos vacúolos contendo L. amazonensis ou L. major com lisossomas, evidenciando que a maior sobrevivência de L. amazonensis não está relacionada a um retardo na formação do fagolisossomo. O padrão de expressão de genes, que poderiam influenciar no desenvolvimento da resposta imune do hospedeiro à infecção por Leishmania, foi avaliado, utilizando-se a técnica de JMP^icroarray. A infecção por L. amazonensis ou L. major induz aherações no padrão de expressão de genes anteriormente relacionados à infecção por Leishmania, e outros que ainda não tinham sido associados. Genes relacionados á explosão respiratória, formação do vacúolo parasitóforo e receptores de superfície, envolvidos na ativação celular e fagocitose, estão induzidos ou suprimidos a depender da espécie de Leishmania e o tempo de infecção. Genes relacionados a receptores do tipo scavenger foram induzidos na infecção por L. major. Esse resultado está relacionado ao aumento na expressão in vitro do receptor scavenger MARCO em células infectadas por L. major, quando comparada à infecção por L. amazonensis. Estudos in vivo demonstraram que linfonodos de camundongos infectados por L. major apresentaram um aumento da expressão de MARCO em comparação à infecção por L. amazonensis. Observamos que L amazonensis induziu gene da catalase, enzima que inibe a explosão respiratória. Esse dado pode estar relacionado com a observação anterior, que na infecção in vitro de macrófagos com L. amazonensis há uma inibição da produção de H2O2, em comparação á célula controle. Esses dados sugerem que diferenças encontradas na infecção de macrófagos podem estar relacionadas com a determinação dos perfis de resistência ou susceptibilidade, reforçando a importância do macrófago para o estabelecimento da infecção. / CBA mice are susceptible to Leishmania amazonensis and resistant to L. major infection. Events of innate immune response are supposed to be determinants of Leishmania infection outcome. CBA macrophages control L. major and are permissive to L. amazonensis infection in vitro, indicating that macrophages participate in determination of host immune profile. In the present work, we intended to investigate the molecular mechanisms, which underlie these differences. We demonstrated that IFN-y was only able to reduce L. major infection although induced similar NO production by both L. amazonensis- and L. /wa/or-infected cells. This reduction is a TNF-a-dependent mechanism. Furthermore, the ability of L. amazonensis to survive inside CBA nacrophages was not related to a delay on L. amazonensis-mànceà phagosome fusion with lysosomes as both L. amazonensis- and L. mq/or-induced parasitophorous vacuoles present the same kinetic of fusion with lysosomes. DNAmicroarray was then performed in response to L. amazonensis or L. major infection which are the macrophages genes up or down-regulated. We showed that both parasites induced significant alterations on macrophage gene expression. Some of the expressed genes were previously related to Leishmania infection but some of them were not yet associated to Leishmania infection. Genes related to cell surface receptors, which participate both in cell activation and phagocytosis of microorganisms, as well as genes involved in respiratory burst response and in parasitophorous vacuole biogenesis had their expression modified dependending on the Leishmania species and time after infection. Interestingly, we observed that L. major induced higher expression of scavenger receptors. In addition, this result is related to a 20% higher expression of MARCO scavenger receptor in L. major-infected macrophages. We also demonstrated that L. amazonensis infected macrophages express genes of enzymes related to ROI scavenging such as catalase. These data is related to our previous observation that, in L. amazonensis-infected cells, there was similar H2O2 generation when compared to control non-infected cells. In summary, these data suggest that CBA macrophages are able to interact distinctly with L. amazonensis and L. major, supporting the idea that macrophage is a key cell in the determination of resistance and susceptibility in Leishmania infection.