Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Marinônio Cornélio Lopes / Banca: Rubens Camargo Siqueira / Resumo: Matrizes de quitosana e colágeno podem oferecer nicho biológico para o crescimento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC). O objetivo deste trabalho foi caracterizar as propriedades físicoquímicas das matrizes e sua biocompatibilidade com ADSC, bem como suas interações e influências diretas das matrizes sobre o comportamento da ADSC. A metodologia incluiu o tratamento enzimático de tecido adiposo obtido por lipoaspiração com colagenase IV, imunofenotipagem, cinética de crescimento das células, estudos de biocompatibilidade das matrizes analisadas pela atividade de fosfatase alcalina (AP), determinação de óxido nítrico (NO) por macrófagos e imagens das matrizes por microscopia óptica e eletrônica de varredura. A concentração de reticulação de genipina e glutaraldeído foi avaliada por ensaios de ninidrina, testes de solubilidade e de degradação das matrizes. Os melhores resultados foram obtidos com genipina a 0,5 %. Após nove expansões a viabilidade foi de 99 % e o tempo de duplicação da população de células diminuiu de sete para dois dias. Os resultados mostraram que as matrizes são biocompatíveis, exibem propriedades físicas e químicas necessárias para as células e são fortes estimuladoras de proteínas de sinalização (fosfatase alcalina) e de outras moléculas (NO), que são importantes no processo de regeneração tecidual. Portanto, as matrizes podem proporcionar um nicho biológico para adesão, proliferação e controle das atividades das ADSC / Abstract: Scaffolds of chitosan and collagen can offer a biological niche for the growth of adipose derived stem cells (ADSC). The objective of this work was to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds and the ADSC, as well as their interactions to direct influences of the scaffolds on the behavior of ADSC. The methodology included an enzymatic treatment of fat obtained by liposuction by collagenase IV, ASDC immunophenotyping, cell growth kinetics, biocompatibility studies of the scaffolds analyzed by the activity of alkaline phosphatase (AP), nitric oxide (NO) determination, and images of both optical and scanning electron microscopy of the matrices. The extent of the crosslinking of genipin and glutaraldehyde was evaluated by ninhydrin assays, solubility tests and degradation of the matrices. The best results were obtained with 0.5 % genipin. After nine expansions viability was 99 % and the population doubling time decreased from seven to two days.The results showed that the matrices are biocompatible, exhibit physical and chemical properties needed to house cells in vivo and are strong stimulators of signaling proteins (alkaline phosphatase) and other molecules (NO) which are important in tissue regeneration. Therefore, the matrices provide a biological niche for ADSC adhesion, proliferation and cells activities / Mestre

A sepse é sempre acompanhada de mudanças na temperatura corporal, seja esta febre ou hipotermia. O presente trabalho tem como objetivos principais (1) caracterizar o curso temporal de hipotermia em um grupo raro de pacientes sépticos; (2) desenvolver um modelo experimental bem controlado de sepse grave monobacteriana e; (3) estudar mecanicamente como o pulmão é preservado na sepse frente à virada de febre para hipotermia. Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a hipotermia em pacientes sépticos é um fenômeno transitório, não terminal. Ainda desenvolvemos um modelo experimental de sepse grave, no qual observamos que a hipotermia provoca a reprogramação das principais células envolvidas na resposta inflamatória. Essas mudanças favorecem o hospedeiro, pois induzem diminuição do infiltrado inflamatório e manteve a infecção controlada. Logo, podemos concluir que a hipotermia é um fenômeno transitório, auto-limitante e não terminal, diferente da resposta desregulada e progressiva que se acreditava existir. / Sepsis is always accompanied by changes in body temperature, whether it is fever or hypothermia. The present study has as main objectives (1) to characterize the temporal course of hypothermia in a rare group of septic patients; (2) to develop a well-controlled experimental model of severe monobacterial sepsis and; (3) to mechanically study how the lung is preserved in the sepsis in the face of the onset of fever for hypothermia. Our results showed, for the first time, that hypothermia in septic patients is a transitory, non-terminal phenomenon. We have also developed an experimental model of severe sepsis, in which we observed that hypothermia causes reprogramming of the main cells involved in the inflammatory response. These changes favor the host, as they induce a decrease in the inflammatory infiltrate and kept the infection under control. Therefore, we can conclude that hypothermia is a transitory phenomenon, self-limiting and not terminal, different from the deregulated and progressive response that was believed to exist.

A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.

Apesar das evidências sobre o efeito de bactérias probióticas sobre Candida albicans, os mecanismos envolvidos nesta interação não estão totalmente esclarecidos. Visando contribuir com o entendimento sobre os mecanismos pelos quais bactérias probióticas interferem na colonização por C. albicans, o presente estudo testou a hipótese de que Lactobacillus probióticos interferem na resposta de macrófagos humanos induzida por C. albicans e inibem o desenvolvimento do biofilme de C. albicans. Macrófagos humanos THP-1 foram pré-tratados com Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m e Lactobacillus acidophilus NCFM, e desafiados com C. albicans e/ou lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli, em ensaio de co-cultura. Após incubação, foram determinados o perfil de citocinas por ELISA, a transcrição relativa do gene clec7a por RT-qPCR. Biofilmes de C. albicans ATCC SC5314 e 75 (isolado clínico) em fase de adesão inicial, colonização inicial e maturação foram tratados com suspensão de Lactobacillus probióticos. Além disso, os biofilmes de C. albicans foram tratados com meio condicionado com L. rhamnosus após diferentes períodos experimentais. O efeito dos probióticos foi avaliado por contagem de células de C. albicans viáveis e avaliação da morfologia celular por microscopia confocal e eletrônica de varredura. O pré-tratamento com bactérias probióticas promoveu alteração no perfil de citocinas produzidas por macrófagos desafiados com LPS e C. albicans, induzindo um aumento nos níveis de IL-10 e redução de IL-12 (p<0,05). Além disso, o pré-tratamento com probióticos provocou redução do nível de transcritos de clec7a, que codifica o receptor Dectina-1 (p<0,05), indicando a redução da expressão de Dectina-1 nestas células. A interação entre cepas de Lactobacillus e C. albicans promoveu significativa redução (p<0,05) no número de células de C. albicans no biofilme (25,5-61,8%), na dependência da cepa probiótica e da fase do biofilme de C. albicans. Todos os Lactobacillus testados impactaram negativamente na diferenciação levedura-hifa de C. albicans e na formação do biofilme. Análises microscópicas revelaram que as suspensões de L. rhamnosus reduziram a diferenciação de Candida em hifas, levando a uma predominância de crescimento em levedura. O meio condicionado com L. rhamnosus não exerceu efeito significante sobre biofilme maduro (p>0,05), mas promoveu redução significativa do número de UFC de C. albicans quando utilizado nos estágios iniciais da formação do biofilme (p<0,01). Os resultados sugerem que Lactobacillus probióticos são capazes de interferir na expressão de receptores de macrófagos para o reconhecimento de C. albicans e reduzir a resposta de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, os resultados indicam que Lactobacillus probióticos são capazes de inibir a diferenciação de C. albicans de leveduras para hifas, e o desenvolvimento de biofilme de C. albicans, particularmente na fase de colonização inicial da levedura, por interações célula-célula e secreção de exometabólitos. O conjunto de dados deste estudo contribui para elucidar os mecanismos pelos quais Lactobacillus atuam como probióticos, dando suporte para o seu uso como terapia suplementar contra infecções de mucosas por C. albicans. / The infection rates of Candida albicans in human may be reduced by probiotics. However, the mechanisms involved in the interaction between C. albicans and probiotic bacteria are largely unknown. The present study comprised two parts. The first aimed to test the hypothesis that probiotics may impair the signaling induced by C. albicans in human macrophages, thus lowering the inflammatory challenge. The second aimed to evaluate the inhibitory effects of Lactobacillus on different phases of C. albicans biofilm development. In the first part, macrophages were pretreated with a probiotic strain (Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m and Lactobacillus acidophilus NCFM) and challenged with C. albicans and/or lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli in a co-culture assay. After incubation, cytokine profile of macrophage\'s supernatant was assessed by ELISA and the expression of clec7a gene was determined by RT-qPCR. Probiotic strains altered the cytokine profile of macrophages stimulated with LPS and C. albicans, leading to increased levels of IL-10 and reduced levels of IL-12 (p<0.05), and reducing the relative expression of clec7a gene encoding Dectin-1 receptor (p < 0.05). In the second part, quantification of biofilm growth and microscopic analyses were performed on C. albicans biofilms treated with Lactobacillus cell suspensions and their supernatants. Lactobacilli induced a significant reduction (p<0,05) in the number of biofilm cells (25.5-61.8%) dependent on the probiotic strain and the biofilm phase. L. rhamnosus supernatants had no significant effect on the mature biofilm (p>0.05), but significantly reduced the early stages of Candida biofilm formation (p<0.01). Microscopic analyses revealed that L. rhamnosus suspensions reduced Candida hyphal differentiation, leading to a predominance of budding growth. All lactobacilli negatively impacted C. albicans yeast-to-hyphae differentiation and biofilm formation. The inhibitory effects of Lactobacillus on C. albicans involved both cell-cell interactions and secretion of exometabolites. To conclude, the probiotic lactobacilli reduce inflammation by impairing the recognition of C. albicans by macrophages and altering the production of proinflammatory cytokines. It was also clarified, for the first time, the mechanics of how the Lactobacillus species antagonize C. albicans colonization, particularly in the critical, early colonization phase of the yeast. Taken all together, our data elucidated the inhibitory mechanisms of lactobacilli that define their probiotic candicidal activity, supporting the use of these probiotics as a supplemental therapy against mucosal infections by C. albicans.

Os macrófagos (MO) são populações heterogêneas de células residentes em diversos tecidos, onde iniciam a resposta imune através do reconhecimento de padrões moleculares de patógenos. Para avaliar a modulação funcional dessas populações, MO peritoneais (PM) e alveolares (AM), com perfil M1 e M2, foram ativados in vivo por flagelina (FliCi) e lipopolissacarídeos bacterianos (LPS). Esse trabalho mostra que o microambiente parece influenciar a resposta diferencial das populações de MO, uma vez que a expressão de MHCII, CD80, CD86 e CD40 e produção de NO por PM são mais intensamente modulados por FliCi, enquanto os AM são mais sensíveis ao LPS. Porém, dentro da população de PM, encontramos duas subpopulações distintas, nomeadas F4/80hi e F4/80lo. A população F4/80hi parece adquirir um perfil M1 após estimulo com FliCi, com alta expressão de iNOS, enquanto a população F4/80sup>lo apresenta um perfil M2, com maior expressão basal de mTGF-ß, indicando que a heterogeneidade dos MO também pode estar expressa no mesmo microambiente. / Macrophages (MO) are a heterogeneous cell population that resides in distinct tissues, where they trigger the immune response through the recognition of pathogen-associated molecular patterns. To evaluate the functional modulation of these populations, peritoneal (PM) and alveolar (AM) MO, from M1 and M2 profile, were in vivo activated by flagellin (FliCi) and bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this study we show that microenvironment seems to influence the differential responses of MO populations, since MHCII, CD80, CD86 e CD40 expression and NO production by PM are more intensely modulated by FliCi whereas AM are more sensitive to LPS. However, we found two distinct subpopulations within PM, named F4/80hi e F4/80lo. cells show a M1 profile after FliCi stimulation, with high iNOS expression of mTGF-ß, indicating that the MO heterogeneity can also be finding in the same microenvironment. NOS expression, and F4/80lo population presents a M2 profile, with higher basal expression of mTGF-ß, indicating that the MO heterogeneity can also be finding in the same microenvironment

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e o óxido nitrico (NO) está envolvido na eliminação de patógenos. Nós propusemos investigar o papel do NO na doença em animais NO-/- sintase deficientes (iNOS-/-) e seu grupo WT. Na 2ª semana de infecção, a ausência de NO resultou em doença menos grave com aumento dos níveis de TNF-a acompanhado com o intenso afluxo de linfócitos T e macrófagos para os pulmões. Na 10ª semana, os animais iNOS-/- desenvolveram alta carga fúngica nos pulmões com menor afluxo de celulas T ativadas e macrófagos e presença de células T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ nos pulmões. Somente os animais iNOS-/- desenvolveram lesões pulmonares organizadas em granulomas, embora não foi detectado diferença na mortalidade para ambos os grupos. As diferenças morfológicas nas lesões foram abolidas pela depleção de TNF-a que induziu nos animais iNOS-/- uma mortalidade precoce e intenso afluxo inflamatório nos pulmões. Além disso, a depleção de linfócitos TCD8+ resultou em doença mais grave e menor recrutamento celular pulmonar nos animais iNOS-/-. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and nitric oxide (NO) is involved in the killing of pathogens, we aimed to investigate the role of NO in the course of the disease using NO- synthase deficient (iNOS-/-) and WT mice. At week 2 postinfection, NO absence resulted in less severe infection associated with increased TNF-a levels besides a massive influx of activated T cells and macrophages to the lungs. By week 10, iNOS-/- mice developed increased fungal burdens allied with less pronounced influx of activated T cells and macrophages and increased presence of regulatory CD4+CD25+FoxP3+ T cells to the lungs. Only iNOS-/- mice developed organized pulmonary granulomas, although no differences in the mortality rates were detected. The differences in the morphology of lesions were partially abrogated by TNF-a depletion which, induced a precocious mortality of iNOS-/- and massive influx of inflammatory pulmonary cells. Indeed, the CD8+T cells depletion developed a more severe infection with less recruitment of pulmonary cells in iNOS-/- mice.

Nosso grupo demonstrou que a captura de baixas doses de DNA plasmideal pode inibir a apresentação de antígeno e induzir um padrão de resposta anti-inflamatória, e que após a captação do DNA plasmideal por macrófagos, estas moléculas podiam prevenir a acidificação de vesículas endossomais, um passo essencial para a apresentação de antígenos para células T CD4+. Além disso, em modelos in vivo, a baixa dose de DNA foi suficiente para amenizar o quadro inflamatório e diminuir a produção de citocinas inflamatórias. Estes resultados estão em contraste com os modelos de vacinas gênicas comumente utilizadas. A baixa dose de DNA plasmideal, no contexto da indução da resposta imune, pode levar à modificação na apresentação do antígeno e ativação celular levando ao controle da resposta imune exacerbada desencadeada por outro antígeno, tornando o tratamento por DNA um importante foco de estudo para o combate de doenças autoimunes e inflamações. O objetivo deste trabalho foi identificar os microRNAs expressos em macrófagos tratados com alta ou baixa dose de DNA plasmideal e avaliar o papel destas moléculas na modulação da cascata de sinalização intracelular visando esclarecer o mecanismo imunomodulador observado. Macrófagos da linhagem J774 foram estimulados por 2 horas com o vetor plasmideal pcDNA3, nas concentrações de 10 g ou 100 g de pcDNA3/mL de RPMI. O RNA total foi extraído e o ensaio de microarray para microRNAs foi realizado. Os miRNAs diferencialmente expressos foram confirmados pela RT-qPCR, e o programa de bioinformática miRDB foi utilizado para predição de genes alvos. Os miRNAs e genes selecionados também foram dosados em macrófagos estimulados com LPS e tratados com pcDNA3. Foram detectados 6 miRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) diferencialmente expressos em macrófagos estimulados somente com pcDNA3. A expressão do miR-494-3p foi aumentado somente em células tratadas com DNA em baixa concentração tanto na ausência quanto presença de LPS. O gene IBk (IKK-) foi identificado como alvo do miR-494-3p, dosado e teve sua função detectada por western blot, mostrando que seu papel biológico foi alterado na presença deste miRNA. Além disso, os dados do tratamento com pcDNA3 em camundongos knockout para o receptor TLR9, sugerem que a expressão do miR-494-3p é independente deste tipo de receptor, porém é inibida na presença do mesmo quando no tratamento com alta dose de DNA. Os dados sugerem que quando macrófagos são tratados com baixa dose de DNA plasmideal (10 g/mL), o miR-494-3p age como regulador negativo do fator de transcrição NF-B, por meio da inibição da expressão e função da proteína IKK-. / Our group demonstrated that the capture of low doses of plasmid DNA can inhibit antigen presentation and induce an anti-inflammatory response pattern together with the decrease of pro-inflammatory cytokines expression, as observed in in vivo experimental models. Moreover, we observed that after the uptake of plasmid DNA by macrophages, these molecules could prevent endosomal vesicles acidification, an essential step for antigen presentation to CD4+ T cell. These results are in contrast with the usual DNA vaccines models commonly used. The low dose of plasmid DNA, in the context of immune response induction, can take to a modification in antigen presentation leading to the control of the response already established, what can be a potential treatment in auto-immune diseases and inflammation. The objective of this work is to identify expressed microRNAs on J774 macrophages triggered by different concentrations of plasmid DNA stimuli in order to evaluate the observed immunomodulatory mechanism. J774 macrophages were treated with low (10 µg/mL) and high (100 µg/mL) doses of pcDNA3 for 2 hours. Total RNA was extracted and microarray (Agilent plataform) was performed for detection of differentially expressed microRNAs. All obtained data was normalized in Genespring GX11.5 software. The microRNAs expression was confirmed by RT-qPCR and their mRNA targets were predicted by miRDB software. The miRNAs and their respective targets were also evaluated on DNA and LPS-treated macrophages. We detected 6 differentially expressed microRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) between the two conditions (fold change 2, p-value 0,05). The miR-494-3p expression increased only in cells treated with low dose of pcDNA3, on either previously LPS-stimulated cells or not. IBk (IKK-) was one of the predicted targets for miR-494-3p. RT-qPCR was performed to calculate its expression and its biological function was assessed by western blot. Besides, results from pcDNA3-treated cells from TLR9 knockout mice suggest that miR-494-3p expression is TLR9 independent although the receptor presence impaired miR-494-3p expression on high dose of pcDNA3-treated cells. Together, the data indicate that when macrophages are treated with low dose of plasmid DNA, miR-494-3p expression is increased, acting as negative regulator of the transcription factor NF-B, through IKK- inhibition.

Submitted by Samira Prince (prince@ufpa.br) on 2012-10-16T14:14:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ModulacaoImunologicaInvitro.pdf: 477216 bytes, checksum: b32e46d44b06218c4e2ebe58d0f28a6b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-10-16T18:28:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ModulacaoImunologicaInvitro.pdf: 477216 bytes, checksum: b32e46d44b06218c4e2ebe58d0f28a6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-16T18:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ModulacaoImunologicaInvitro.pdf: 477216 bytes, checksum: b32e46d44b06218c4e2ebe58d0f28a6b (MD5) Previous issue date: 2008 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As células de Langerhans (CLs) estão localizadas na epiderme e desempenham um papel chave na indução da resposta imune e da tolerância imunológica. Os macrófagos são células fagocíticas que atuam como primeira linha de defesa do organismo, e que estão envolvidos na formação de granulomas em pacientes com hanseníase. A imunopatogenia da resposta celular nos estados reacionais ainda é pouco estudada, porém, diversas evidências sugerem que as drogas prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina, utilizadas no controle das reações hansênicas, exercem seus efeitos pela modulação das funções de diferentes células imunocompetentes. O objetivo do presente estudo foi analisar a ação in vitro das drogas prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina sobre a produção de citocinas por CLs e macrófagos de camundongos BALB/c. As CLs foram isoladas, purificadas e cultivadas a partir da epiderme pela técnica de “panning” e os macrófagos foram isolados da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c. Após 36 h de tratamento com as drogas, os níveis de TNF-, IL-12 e IL-10 foram medidos por ELISA. Prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina inibiram os níveis de TNF- produzidos pelas CLs, em ambas as concentrações, no entanto, não foi detectada alteração significativa na produção de IL-12. A produção de TNF- e de IL-12 por macrófagos peritoneais também foi diminuída após o tratamento, porém os níveis de IL-10 não foram modificados por nenhuma das drogas testadas. Nossos resultados mostram que estas drogas podem modular a resposta imune através da regulação das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-12 por CLs purificadas da epiderme e por macrófagos peritoneais, indicando que as citocinas constituem importante alvo de drogas usadas no tratamento dos estados reacionais. / Langerhans cells (LCs) are localized in the epidermis and performs a key role in the induction of immune response and immunologic tolerance. Macrophages are phagocytic cells that act as first line of defense of the organism, and they are involved in the granuloma formation in patients with leprosy. The immunopathogeny of the cellular response in the reactional states is yet little studied, however, several evidences suggest that the drugs prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline, used in the control of leprosy reactions, perform their effects by the modulation of different immunocompetent cells functions. The objective of the present study was to analyze in vitro action of prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline on the cytokine production by LCs and macrophages of BALB/c mice. LCs were isolated, purified and cultivated from the epidermis by the panning technique and macrophages were isolated by the peritoneal cavity of BALB/c mice. After 36 h of treatment with the drugs, the levels of TNF-, IL-12 and IL-10 were measured by ELISA. Prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline inhibited TNF- produced by LCs, in both concentrations, however no important alterations in IL-12 production were detected. TNF- and IL-12 production by macrophages was also decreased after treatment, but IL-10 levels were not modified for none of the drugs tested. Our results show that these drugs can modulate the immune response by the regulation of pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-12 by purified epidermal LCs and peritoneal macrophages, indicating that they constitute an important target for the drugs used in treatment of leprosy reactional states.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-03-04T18:46:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) Previous issue date: 2008 / A cromoblastomicose e uma infeccao subcutanea cronica, granulomatosa, causada pela implantacao traumatica de diversas especies de fungos demaceos, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiologico. O Brasil possui a segunda maior prevalencia mundial da doenca, sendo o estado do Para a maior area endemica. Histologicamente, a cromomicose e caracterizada pela presenca de celulas gigantes, onde podem ser observadas celulas escleroticas fagocitadas por macrofagos. O objetivo do presente estudo foi analisar os diferentes aspectos da interacao de macrofagos peritoneais de camundongos BALB/c e C57/BL6 com conidios ou celulas escleroticas de F. pedrosoi, determinando os indices de infeccao, fagocitose e fusao celular. Os resultados mostraram indices de fagocitose e infeccao maiores em conidios do que em celulas escleroticas para BALB/c (p<0.05), ocorrendo efeito inverso no indice de fusao, com a formacao de celulas gigantes do tipo Langhans na interacao com celulas escleroticas e celulas gigantes do tipo corpo estranho na interacao com conidios. Os macrofagos de BALB/c em interacao com conidios produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 3 a 72h; e mais IL-10 apos 3h. Macrofagos interagindo com celulas escleroticas produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 1h e 3h; e a quantidade de IL- 10 foi maior apos 72h de interacao. No co-cultivo de macrofagos de C57/BL6 com conidios observou-se a presenca de vacuolos aumentados apos 24h, enquanto na interacao com celulas escleroticas, os macrofagos se desprenderam da laminula nos tempos posteriores a 24 h. A quantidade de TNF-α e maior na interacao de conidios comparado ao controle em 1 e 72 h; e a quantidade de IL-10, no tempo de 48h. Ja na interacao com celulas escleroticas, apenas a quantidade de IL-10 diferiu do controle, sendo maior nos tempos de 1 a 48h. Estes dados sugerem que a resposta e macrofagos ao fungo e diferente entre os camundongos de BALB/c e C57/BL6, diferindo tambem a resposta de um mesmo tipo de macrofago para cada forma fungica, sendo as celulas escleroticas aparentemente mais imunogenicas que os conidios. / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic, subcutaneous, granulomatous infection caused by traumatic implantation in the skin of several dematiaceous fungi, usually Fonsecaea pedrosoi. Brazil has second highest disease prevalence in the world and Para State is the most endemic area. Histologically, CBM is characterized by the presence of multinucleated giant cells and sclerotic cells can be found engulfed by macrophages. The objective of this study was to analyze the different aspects of interaction between peritoneal macrophages from BALB/c or C57/BL6 mice with F. pedrosoi conidia or sclerotic cells, calculating infection, phagocytosis and cellular fusion rates. The results showed phagocytosis and infection rates with conidia higher than sclerotic cells to BALB/c (p <0.05), while the rate of cellular fusion was higher for sclerotic cells interaction, with Langhans giant cells formation, in comparison to foreign-body giant cells after interaction with conidia. Macrophages from BALB/c co-cultured with conidia produced more TNF-α than control group after 3 to 72 hours, and more IL-10 after 3h. Macrophages interacting with sclerotic cells produced more TNF-α than control group after 1h and 3h, and the amount of IL-10 was higher after 72h of interaction. In the co-culture of C57/BL6 macrophages with conidia, the presence of large vacuoles after 24h was observed, while in the coculture with sclerotic cells, macrophages were detached from coverslip glasses after 24 h. Our results indicate higher levels of TNF-α after interaction of conidia compared to controls at 1 and 72 h and increase of IL-10 after 48h. However, after interaction with sclerotic cells, only IL-10 differed from control, being higher after 1 to 48 hours. All of these data suggest that macrophage response to fungus is different between BALB/c and C57/BL6 mice, differing also on the response of the same type macrophage for each fungal form, sclerotic cells apparently being more immunogenic than conidia.