Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:13:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torres_TatianaTeixeira_D.pdf: 5404919 bytes, checksum: 33cdb805f7c8934dd855ce4d3d6ea798 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A importância cultural e econômica da produção animal na América Latina tem suas raízes na era colonial. Este continente possui uma das maiores populações de gado do mundo e países como o Brasil, a Argentina e o Uruguai têm um papel importante no cenário mundial como produtores e exportadores de uma grande variedade de produtos pecuários. Doenças parasitárias afetam profundamente a produtividade animal e a venda de animais vivos ou derivados e, conseqüentemente, representam um grande impacto no desenvolvimento do setor agropecuário nos países sul americanos. A mosca da bicheira, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) é um dos principais agentes causadores de miíases traumáticas na região Neotropical. Larvas da mosca da bicheira alimentam-se de tecidos vivos de animais de sangue quente. Esta espécie foi erradicada da América do Norte e parte da América Central através da técnica do inseto estéril (SIT). Na América do Sul, no entanto, esta peste continua causando um grande prejuízo à pecuária e um projeto internacional está em andamento para se avaliar a execução de um programa de controle da mosca da bicheira neste continente. Neste sentido, o principal objetivo deste estudo foi gerar informações sobre padrões de variabilidade, estrutura genética e fluxo gênico de populações sul americanas de C. hominivorax. Estas são importantes informações para o investimento em programas de controle de insetos-praga. Os microssatélites são uma classe especial de marcadores moleculares tipicamente codominantes e multi-alélicos altamente polimórficos e com uma alta heterozigosidade esperada. Estas características fazem com estes marcadores sejam cada vez mais empregados para investigar questões acerca da variabilidade genética, fluxo gênico e sistemas de acasalamento, até mesmo em espécies com baixos níveis de variabilidade em outros marcadores. A principal limitação dos microssatélites é a necessidade de se desenvolver marcadores microssatélites de novo para cada nova espécie a ser estudada, o que pode ser uma tarefa cara e demorada, mas indispensável na maioria dos casos. Para investigar padrões de variabilidade genética e diferenciação populacional na atual distribuição de C. hominivorax, duas abordagens foram empregadas para isolar marcadores microssatélites a partir de bibliotecas genômicas. Inicialmente, 10 locos foram isolados a partir de uma biblioteca enriquecida em repetições (AC)n. A amplificação destes locos em 30 indivíduos de C. hominivorax, revelou uma média de 6,9 alelos por loco, com heterozigosidades esperadas variando de 0,3831 a 0,8022. Na segunda abordagem, sete novos marcadores polimóficos foram desenvolvidos utilizando uma estratégia diferente, na qual uma sonda (AG)n foi usada em vez de (GT)n na etapa de enriquecimento. A média de alelos encontrados nos sete novos locos foi de 7,8 alelos por loco, com heterozigosidades esperadas variando de 0,4220 to 0,9045. Os "primers" desenvolvidos para C. hominivorax foram utilizados com sucesso na amplificação heteróloga em outras espécies da família Calliphoridae, sugerindo que os locos caracterizados poderão ser úteis em estudos nessas espécies após a avaliação do conteúdo de polimorfismo. Estas duas abordagens também motivaram o desenvolvimento de um conjunto de ferramentas de bioinformática para a análise de seqüências contendo microssatélites, o FiRe ("Find Repeats"). Esta iniciativa representa uma importante contribuição para facilitar o isolamento e caracterização destes marcadores. Doze, dos 17 marcadores desenvolvidos, foram selecionados para caracterizar a variabilidade genética e a estrutura populacional de amostras de C. hominivorax da América do Sul. Em uma análise da estrutura espacial e temporal de populações geográficas do Uruguai, desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados em todas as subpopulações. Vários pares de locos também apresentaram desequilíbrio de ligação independentemente nas subpopulações. Um baixo, mas significativo, nível de diferenciação foi observado entre as subpopulações, mas não foi detectado isolamento por distância. A análise temporal indicou um aumento na diferenciação populacional global após um ano e foi observada uma diferenciação populacional significativa entre subpopulações da mesma localidade em períodos diferentes. As diferenças observadas entre as populações locais são, provavelmente, um resultado de alterações demográficas em populações da mosca da bicheira. A análise conjunta de 21 populações geográficas da América do Sul (distantes de 15 a 5180 km entre si) revelou uma alta variabilidade genética. Desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de ligação entre pares de locos foram freqüentes nas amostras analisadas. Foi observada uma diferenciação populacional baixa, mas significativa, indicando uma homogeneidade entre as amostras analisadas. A correlação entre as distâncias genéticas e geográficas das amostras não foi significativa. As evidências encontradas apontam para uma expansão populacional recente da espécie no continente sul americano, mas as observações também podem ser uma evidência de uma dinâmica populacional envolvendo eventos freqüentes de extinção e recolonização, na qual cada subpopulação de C. hominivorax se comportaria como uma metapopulação. Independentemente de qual seja o cenário que melhor descreva a história evolutiva desta espécie, fica evidente o potencial de dispersão e adaptação desta espécie, o que terá profundas implicações em programas de controle da espécie. Estudos futuros poderão fornecer um quadro mais completo sobre a dinâmica das populações da mosca da bicheira, gerando informações fundamentais para a tomada de decisões no que concerne à erradicação desta importante praga da pecuária / Abstract: The cultural and economic importance of animal production in South America dates back to the colonial era. This continent has one of the largest percentages of the world's total cattle population and countries like Brazil, Argentina and Uruguay play a major role as exporters of a variety of livestock products. Diseases affecting livestock can have a significant impact on animal productivity, on trade of live animais, meat and other animal products, which, consequently, affects the overall process of the economic development of South American countries. The New World screw-worm (NWS), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), is an important parasitic insect pest in Neotropical regions. NWS myiasis is caused by the larval stage of the fly infesting tissues of warm-blooded vertebrates. This species has been successfully eradicated from North and most of Central America by the sterile insect technique. In South America, however, this pest continues to affect the development of the livestock sector and an international effort is underway to evaluate the feasibility of eradicating the NWS from endemic areas of Central and South America. Therefore, the aim of this study was to provide some insight into the patterns of genetic variation, structure and gene flow of C. hominivorax populations from South America. Those are valuable information required prior to an investment on large-scale efforts aiming at controlling insect pests. Microsatellites stand out as co-dominant markers with a high number of alleles per locus, high polymorphism and high-expected heterozygosities. Due to those features, these markers have been increasingly used to investigate questions regarding population structure, gene flow and mC!ting system even in populations that have low levels of allozyme and mitochondrial variation. The major drawback of microsatellites is that they must often be isolated de novo for each species. In order to investigate patterns of genetic differentiation of C. hominivorax from its current distribution using microsatellite loci, two efforts were made to isolate these markers from enriched genomic libraries. Initially, a set of 10 polymorphic microsatellite loci was isolated from an AC-enriched genomic library. Amplification of the reported loci in 30 screw-worms revealed an average of 6.9 alleles per locus with expected heterozygosities ranging from 0.3831 to 0.8022. In the second effort, seven new pOlymorphic microsatellite markers were developed using a different protocol. An (AG)n probe was used instead of (GT)n in the enrichment step. The number of alleles found in the seven new loci ranged from 3 to 13 per locus, with the expected heterozygosities ranging from 0.4220 to 0.9045. Cross-species amplifications of the 17 microsatellite markers were successful in other Calliphoridae species, suggesting that these loci may be useful in those species after evaluating the extent of polymorphism. These efforts have also motivated the development of a web-based, user-friendly toolkit for microsatellite sequence characterization, the FiRe (Find Repeats). This initiative represents an important contribution to other efforts aimed at isolating and characterizing microsatellite markers. Twelve of the 17 isolated loci were used to characterize genetic variability and population structure across NWS South American populations. In the spatio-temporal analysis of C. hominivorax populations from Uruguay, significant departures from Hardy-Weinberg equilibrium were observed for ali populations. Linkage disequilibrium was also detected for severa I locus pairs. Low, but significant, levels of subdivision were recorded between populations, but no evidence of isolation by distance was observed. The temporal analysis indicated a population differentiation increase over time and ali pairwise comparisons between temporal subpopulations yielded significant estimates of population differentiation. The observed differences between local populations are probably a result of the occurrence of demographic changes that affected NWS populations. Analysis of populations from 21 geographical sites in South America (distances ranging from 15 to 5180 km) revealed a high genetic variability within NWS populations. Deviations from Hardy-Weinberg equilibrium and linkage disequilibrium were frequent. A strikingly low, but significant, genetic differentiation was observed, indicating a broad-scale genetic homogeneity in the continent. This low differentiation was coupled with a lack of isolation by distance. These results are consistent with the patterns expected from a species that has undergone range expansion. The pattern of genetic variation among populations could also be an evidence of colonization-extinction dynamics, where subpopulations of this species might usefully be viewed as a metapopulation. Whichever scenario best describes the population structure of NWS, it will have deep implications in contrai strategies. Further studies should complement these findings and provide support for decision makers in the planning and implementation of new area-wide contrai programs of this important livestock pest / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T08:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_AlineCoelhoda_M.pdf: 1020874 bytes, checksum: 5958193e586711ee1cf0c5fe30134718 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Este trabalho consiste na construção de uma biblioteca genômica enriquecida em microssatélites e na caracterização de dez locos polimórficos para a espécie Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae), popularmente conhecida como mosca-dos-chifres, um ectoparasita de grande importância econômica para a pecuária de diversos países, principalmente no Brasil. A biblioteca genômica enriquecida em microssatélites teve um rendimento de 67% considerando-se o número de microsatélites (contendo mais de 7 repetições em série) caracterizados em um total de 109 sequências analisadas. Um rendimento de 22% foi encontrado referente à obtenção de 16 locos potencialmente informativos. Dos microssatélites identificados nesta análise, 85% possuíam motivos (CA)n e apenas 12% apresentaram motivos (GA)n, apesar da biblioteca ter sido enriquecida para ambos os motivos. Neste projeto, dez locos polimórficos de microssatélites foram descritos para a espécie H. irritans. Destes, oito locos apresentaram motivos dinucleotídeos, sendo cinco motivos (CA)n e três motivos (GA)n, além da identificação de um loco com motivo trinucleotídeo (CAA)7 e um tetranucleotídeo (CCGT)6. Entre os dez locos polimórficos, o número de alelos por loco variou entre dois e oito, tendo uma média de quatro alelos por loco, considerados um número baixo quando comparado com outras espécies de dípteros. As heterozigosidades esperada e observada apresentaram um intervalo de 0,1421-0,7702 e 0,1500-0,6750, respectivamente. Os valores de heterozigosidade também foram considerados baixos, sendo inferiores a 0,5 em pelo menos três locos. Após correção seqüencial de Bonferroni, oito locos não apresentaram desvios significativos pelo esperado por Hardy-Weinberg, bem como não foi verificado desequilíbrio de ligação entre os pares de locos. A caracterização destes marcadores microssatélites polimórficos, é potencialmente informativa para elucidar questões evolutivas envolvendo H. irritans como a compreensão da dinâmica populacional e estrutura genética desta espécie. A análise deste marcador molecular poderá orientar projetos de manejo e controle da mosca-dos-chifres / Abstract: The aim of this work was the construction of a genomic microsatelliteenriched library for the species Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae), commonly known as ¿horn fly¿, an ectoparasite of great economic importance world-wide, and particularly in Brazil. Here we describe ten polymorphic microsatellite loci isolated from this species. From a complete set of 109 sequences analised, 67% contained microsatellites regions (considering sequences with more than 7 repeats). The analysis of these sequences resulted in the identification of 16 potentially informative microsatellites loci (an efficience of 22%). Regarding the composition of the microsatellites sequenced retrived in this process, 85% have (CA)n motifs and only 12% have (GA)n motifs, despite enrichment on both. From the ten polymorphic microsatellite loci isolated from H. irritans, 8 have dinucleotide motifs (5 (CA)n and 3 (GA)n), one was a trinucleotide motif (CAA)7 and one was a tetranucleotide motif (CCGT)6. The number of alleles per locus ranged from two to eight, with an average of four alleles per locus. This number of alleles was considered low if compared with other dipterans studies. The expected and observed heterozigosities ranged from 0,1421 to 0,7702 and 0,1500 to 0,6750, respectively. Heterozigosity values were considered low. In this analysis, at least three loci presented heterozigosity values under 0,5. After sequential Bonferroni correction, significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was found for 2 loci. No linkage disequilibrium was observed between pairs of loci after correction for multiple tests. The characterization of these polymorphic microsatellites markers is potentially informative to investigate evolutionary questions regarding H. irritans populations by providing fundamental insights into population dynamics and genetic structure. Further projects on horn flies control and management could also benefit from this molecular marker analysis / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Pólipos adenomatosos colorretais são conhecidos como lesões pré-malignas. Mutações germinativas nas enzimas de reparo (MMR) hMLH1, hMSH2 e hMSH6 são causas reconhecidas de câncer colorretal hereditário não polipóide, induzindo um fenótipo mutante caracterizado por instabilidade de microssatélite (MSI). A MSI também é detectada em cânceres colorretais esporádicos. O Cox-2 é uma enzima induzível que regula a síntese de prostaglandina, sendo fortemente manifestada em locais de inflamação, pólipos adenomatosos colorretais e câncer. Objetivos: Avaliar a imunoexpressão do hMLH1, hMSH2 e Cox-2 em pólipos ressecados através da colonoscopia e associar às características clínico-patológicas (idade, sexo, localização, tamanho, histologia e grau de displasia). Métodos: 138 pacientes com pólipos colônicos, 6 com mucosa colônica normal e 23 pacientes com adenocarcinoma colorretal foram incluídos no estudo. Nenhum paciente apresentava histórico familiar de câncer colorretal. Cento e sessenta e sete amostras foram coletadas e imunocoradas para hMLH1, hMSH2 e Cox-2, usando a técnica ABC-imunohistoquímica e amplificação por tiramida biotinilada. Resultados: A média de idade foi 60,2 + 13,8 (variando de 21 a 90 anos de idade) sendo 77 homens (55,8%) e 61 mulheres (44,2%). Adenomas tubulares estavam presentes em 81,4%, tubulo-viloso em 15,9%, serrilhados em 1,8% e vilosos em 0,9%. A maioria dos adenomas localizava-se na região retossigmoideana (63,5%), seguido pelo ascendente em 14,2%, descendente em 8,2%, ceco em 7,5% e o transverso em 6,7%. Displasia de alto grau foi detectada em 46 (40,4%) e de baixo grau em 68 (59,6%) dos adenomas. Perda de imunoexpressão hMLH1 e hMLH2 foi observada em 20% e 15,5% dos adenomas, respectivamente. O Cox-2 foi positivo em 9% dos adenomas e em 40% dos adenocarcinomas. Além disso, a imunoexpressão Cox-2 foi associada à multiplicidade de adenomas no mesmo paciente (p=0,001). Não houve associação entre a imunoexpressão de marcadores e o sexo, idade, localização, tamanho, histologia ou grau de displasia. Conclusões: 1. A perda de imunoexpressão hMLH1 e hMLH2 em adenomas é relativamente freqüente em pacientes sem histórico familiar de câncer colorretal; 2. O Cox-2 é fortemente manifestado em pólipos adenomatosos e adenocarcinomas colorrretais sendo que sua positividade em adenomas pode indicar um risco maior de lesões múltiplas. / Colorectal adenomatous polyps are known as premalignant lesions. Mutations in the mismatch repair (MMR) enzymes hMLH1, hMSH2 and hMSH6 are recognized causes of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and act by inducing a mutator phenotype characterized by microsatellite instability (MSI). MSI is also detected in sporadic colorectal cancers. Cox-2 is an inducible enzyme that regulates prostaglandin synthesis and is overexpressed at sites of inflammation, in colorectal adenomatous polyps and cancer. Aims: To evaluate the immunoexpression of hMLH1, hMSH2 and Cox-2 in resected polyps through colonoscopy, and to associate to the clinicopathologic characteristics (age, gender, location, size, histology and grade of dysplasia). Methods: 138 patients with colonic polyps, 6 with normal colonic mucosa and 23 patients with colorectal adenocarcinoma were enrolled in this study. All patients had no familial history of colorectal cancer. The 167 samples were collected and immunostained for hMLH1, hMSH2 and Cox-2 using the ABC-immunohistochemistry technique and amplification by biotinylated tyramide. Results: The mean age was 60.2 + 13.8 (varying from 21 to 90 years-old) where 77 (55.8%) were men and 61 women (44.2%). Tubular adenomas were present in 81.4%, tubulous-villous in 15.9%, serrated in 1.8%, and villous in 0.9%. The majority of the adenomas were located in the retossigmoid region (63.5%), followed by ascendent in 14.2%, descendent in 8.2%, cecum in 7.5% and transverse in 6.7%. High-grade dysplasia was detected in 46 (40.4%) and low-grade dysplasia in 68 (59.6%) of the adenomas. Loss of hMLH1 and hMLH2 immunoexpression was observed in 20% and 15.5% of the adenomas, respectively. Cox-2 was positive in 9% of the adenomas, and in 40% of the adenocarcinomas. Moreover, Cox-2 immunoexpression was associated to the multiplicity of adenomas in the same patient, p=0.001. There was no association between marker immunoexpression and gender, age, location, size, histology or grade of dysplasia. Conclusions: 1. Loss of hMLH1 and hMLH2 immunoexpression in adenomas is relatively frequent in patients without colorectal cancer familial history; 2. Cox-2 is overexpressed in colorectal adenomatous polyps and adenocarcinomas, and its positivity in adenomas may indicate higher risk for multiple lesions.

A ocorrência de Listeria monocytogenes em alimentos vem sendo estudada desde o início dos anos 80, após seu envolvimento em vários surtos de doença de origem alimentar. Os frutos do mar são o grupo de alimentos que despertou menor atenção por parte dos pesquisadores, apesar de terem sido envolvidos em casos esporádicos de listeriose e mesmo em surtos da doença. A amostragem ambiental e de produto, ao longo de uma linha de processamento é uma forma de localizar áreas relacionadas à contaminação do alimento permitindo que sejam feitas correções para evitar a produção de bens que exponham o consumidor a doenças. Com a finalidade de avaliar a contribuição da matéria prima e fatores ambientais na ocorrência e distribuição de L. monocytogenes em uma indústria processadora de pescados, e mais especificamente, numa linha processadora de camarão rosa (penoeus brasiliensis), é que desenvolveu-se a presente pesquisa. Também buscou-se determinar as diversidades antigênica e genética das cepas de L. monocytogenes isoladas, e correlacionar esta diversidade à sua distribuição na indústria. Assim, um total de 363 amostras coletadas em diferentes pontos de uma linha de processamento de camarão rosa foram examinadas para a presença de L. monocytogenes, empregando-se a metodologia recomendada pelo Health Protection Branch, do Canadá. A seguir, 115 cepas de L. monocytogenes representativas das amostras positivas para o microrganismo foram sorotipadas e o polimorfismo do seu DNA cromossomico avaliado com o auxílio dos métodos RAPD (\"randon amplified polimorphic DNA\") e PFGE (\"pulsed-field MTDestro - Doutorado - Listeria monocytogeneses em camarao... 140 gel electrophoresis\"). Um grupo de 25 cepas foi também submetido a sorotipagem completa, fagotipagem e ribotipagem pelo sistema RiboPrint da DuPont. Do total de amostras examinadas, 64 (17,6%) apresentaram-se contaminadas por L. monocyfogenes. As amostras ambientais apresentaram 25,0% de positividade (14 positivas/56 examinadas). As amostras de utensílios 24,2% (8/33) e as de água 23,8% (5/21). As amostras de camarão apresentaram 18,0% de contaminação (32/178) e as de manipuladores 7,6% (5/66). Nenhuma das amostras de gelo foi positiva para L. monocyfogenes. Durante o processamento observou-se um aumento na percentagem de amostras positivas para L. monocytogenes, chegando esta percentagem a 35,0% em algumas etapas, mas reduzindo-se a 16,0% no produto final. O perfil composto gerado pela combinação dos resultados obtidos com a tipagem molecular das 115 cepas de L. monocyfogenes selecionadas, permitiu a sua divisão em 24 grupos, de acordo com seus perfis de DNA. A sorotipagem das 25 cepas selecionadas mostrou que 11 pertenciam ao sorovar 4b, 7 ao sorovar 1/2b, 2 ao sorovar 1/2c e 5 ao sorovar 1/2a. A fagotipagem permitiu que elas fossem divididas em 7 fagovares, sendo que a maior parte das cepas do sorovar 4b (81,8%) não foi fagotipável. A ribotipagem destas 25 cepas originou 6 RiboGroupsTM. Os resultados indicaram que cepas de L. monocytogenes de origem ambiental pertenciam a perfis compostos exclusivos para o ambiente, enquanto que cepas provenientes da água e de utensílios possuiam um perfil composto em comum. Amostras de camarão coletadas nas diversas etapas doprocessamento apresentaram L. monocytogenes com pelo menos um perfil composto em comum, perfil este também presente nas cepas isoladas das mãos dos manipuladores. / The importance of seafood in the spread of foodborne pathogens is well known, however, until the last few years, little attention has been paid to the role of seafood in disseminating L. monocytogenes. Two foodborne listeriosis outbreaks have been linked to the consumption of seafood. L. monocytogenes and other Listeria species have been isolated from different types of raw or processed seafood, but the main source of contamination is unknown. For this reason, it is important to monitor the potential sources of this pathogen in food processing plants, in order to minimize product contamination. The aim of this study was to evaluate the contribution of raw material and environment in the occurrence and distribution of L. monocytogenesin shrimp (Penaeus brasiliensis) processing plant. The antigenic and genetic diversities of L. monocytogenes strains were also determined. A total of 363 samples, collected in different areas of a shrimp processing plant in Santos, SP, were examined using the methodology recomended by the Health Protection Branch, Canada. One hundred and fifteen strains of L. monocytogenes representing the L. monocytogenes positive samples were first serotyped and then sub-typed by molecular typing (RAPD and PFGE). A group of 25 strains were also ribotyped and phage-typed. L. monocytogeneswas isolated from 64 (17.6%) of the total samples analysed. Environmental samples showed the highest positivity rate (25%) followed by utensils (24,2%) and water (23.8%) samples. Shrimp samples presented 18% of positivity for L. monocytogenes while food handlers samples presented 7.6%. None of the ice samples was positive for the microorganism. When the composite profile from \"both (RAPD-PFGE) methods was generated, the 115 strains could be separated in 24 groups, according to their DNA pattern. The results indicated that environmental strains of L. monocytogenes ali feel into composite profile groupings unique to the environment, while strains from both water and utensils shared another composite profile group. L. monocytogenes fresh shrimp iso/ates belonging to one profile group, were found in the different areas of the processing line. This same latter group was also present in food handlers from the processing and packaging areas of the plant.

Orientador: Anete Pereira de Souza. / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_CarlaCristina_D.pdf: 7310053 bytes, checksum: 1acc7f4e6eb7811b25670f85f9563217 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A seringueira (Hevea brasiliensis), espécie nativa da Amazônia, é a maior fonte de borracha natural do mundo. Programas de melhoramento genético da seringueira têm sido cruciais para a obtenção de caracteres desejáveis. Entretanto, o ciclo de melhoramento da seringueira é muito longo (cerca de 30 anos), tornando-se essencial o desenvolvimento de novas técnicas de avaliação precoce. As bibliotecas de cDNA e Expressed Sequence Tags (ESTs) são ferramentas muito importantes em biologia molecular: possibilitam identificar genes preferencialmente expressos em tecidos ou tipos celulares e também são valiosas fontes de marcadores polimórficos, instrumentos poderosos para genotipagem e mapeamento molecular. O uso de marcadores derivados de ESTs permite construir mapas funcionais, nos quais são posicionados genes transcritos ou regiões próximas aos genes. Este tipo de mapeamento é importante para estudos de associação gene-característica, e identificação de genes candidatos. Este trabalho objetivou a construção de bibliotecas de cDNA de diferentes tecidos (painel, látex e folha) e tratamentos (exposição ao frio e infecção controlada por Microcyclus ulei) de seringueira para desenvolver sequências EST e marcadores moleculares gene-direcionados a partir destas sequências, para aumentar a saturação de um mapa integrado baseado em microssatélites, no qual identificaram 18 quantitative trait loci (QTLs) para características de crescimento, construído previamente em nosso laboratório. Foram sequenciados 10.464 clones, gerando 8.551 ESTs de alta qualidade que agrupadas formaram 5.211 unigenes. Destes, 3.582 (68,7%) apresentam similaridade com uma proteína hipotética ou expressa. Foram desenvolvidos 173 marcadores EST-SSR e 43 marcadores SNP para H. brasiliensis. 150 EST-SSRs (87%) podem estar associados a genes funcionais, e 98,8% foram transferidos para outras espécies de Hevea, sugerindo que o gênero seja um complexo formado pelas diferentes espécies. Os SNPs foram identificados em 13 ESTs similares a proteínas de resposta a estresse, desenvolvimento e síntese de látex. Seis sequências foram abundantes nas bibliotecas de exposição ao frio e análises de expressão demonstraram que a expressão de cinco sequências aumentou durante o experimento, principalmente a expressão de duas sequências que foi aumentada mais de 70 vezes. Dos EST-SSRs desenvolvidos, 46 foram genotipados na população segregante F1 com 270 indivíduos, e estes marcadores foram adicionados ao mapa genético de seringueira, totalizando 330 marcadores. O programa OneMap foi usado para a construção do mapa que possui 3.068,9 cM de extensão e 22 grupos de ligação (LGs). Cinco locos foram mapeados em regiões QTL, e os transcritos de três são similares a proteínas de resposta a estresse e desenvolvimento. Estes locos podem ser genes candidatos para estudos relacionados a características de crescimento em seringueira. Até o momento, este é o primeiro trabalho em seringueira que combina análises de ESTs de diferentes tecidos e tratamentos, e análises sobre a exposição a baixas temperaturas, em vários genótipos de seringueira. Os novos marcadores adicionados ao mapa poderão auxiliar na identificação de genes de interesse e de QTLs para outras características de importância agronômica. Os vários marcadores gene-direcionados desenvolvidos serão utilizados para mapeamento e posicionamento de possíveis genes em outras populações de mapeamento que estão sendo avaliadas no Laboratório de Análise Genética e Molecular / Abstract: Rubber tree (Hevea brasiliensis), native species of the Amazon, is world¿s major source of natural rubber. Rubber tree breeding programs have been fundamental for the selection of desirable traits. However, the breeding cycle is time consuming (around 30 years), which makes the development of new techniques for early evaluation a necessity. cDNA libraries and Expressed Sequence Tags (ESTs) are very important tools in molecular biology: they enable the identification of genes preferentially expressed in tissues or cellular types and are also a valuable resource of polymorphic markers, powerful instruments for genotyping and molecular mapping. The use of EST-derived markers allows the construction of functional maps, wherein expressed genes or regions near genes are positioned. This type of mapping is important for gene-trait association studies and candidate genes identification. The present study aimed at the construction of cDNA libraries from different tissues (panel, latex and leave) and treatments (cold exposure and Microcyclus ulei controlled infection) of rubber tree for the development of EST sequences and gene-targeted molecular markers, to raise the saturation of a microsatellite-based integrated genetic map previously constructed in our laboratory, in which 18 quantitative trait loci (QTLs) related to growth traits were identified. Sequencing of 10.464 clones generated 8,551 high quality ESTs that were clustered into 5,211 unigenes. Among these, 3,582 (68.7%) showed similarity to a hypothetical or expressed protein. A total of 173 EST-SSR and 43 SNP markers were developed for H. brasiliensis. 150 SSRs (87%) could be associated with functional genes, and 98.8% were transferred to other Hevea species, suggesting that the genus is a complex formed by different species. The SNP markers were identified in 13 ESTs that showed similarity to stress response, development and latex biosynthesis proteins. Six sequences were highly abundant in the cold exposure libraries and expression analyses demonstrated that five sequences were up-regulated during the exposure, with emphasis to two sequences with more than 70-fold increase in expression. From the developed EST-SSRs, 46 were genotyped in the segregating F1 population comprised of 270 plants. These markers were added to the genetic map, which know contains a total of 330 markers. The OneMap software was used for the map construction that now has 3,068.9 cM and 22 linkage groups. Five loci were mapped into QTLs, and transcripts of three of them present similarity to proteins involved in stress response and developmental processes. These loci may be candidate genes for studies related to rubber tree growth traits. To our knowledge, this is the first work in rubber tree that combines analyses of ESTs from different tissues and treatments, and to analyze sequences under cold stress, in several H. brasiliensis genotypes. The new positioned markers may help in the identification of genes of interest and QTLs for other agronomic important traits. The several gene-targeted markers developed here will be used in the mapping and positioning of possible genes in other mapping populations that are now being evaluated at Genetics and Molecular Analysis Laboratory / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-13T16:38:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1190631 bytes, checksum: 2b92d725f9f689a441f7d27c62a316aa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-13T16:38:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1190631 bytes, checksum: 2b92d725f9f689a441f7d27c62a316aa (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Muitas áreas de pesquisa possuem conjuntos de dados com os desafios da alta dimensionalidade e multicolinearidade a serem superados, de modo que métodos específicos para ajuste do modelo devem ser empregados. Embora os métodos existentes sejam eficientes para construção do modelo, frequentemente se faz necessário selecionar as variáveis mais importantes em explicar o modelo, visto que essa prática pode aumentar sua capacidade preditiva, diminuir custos e tempo das análises. Esse trabalho teve como objetivo principal avaliar e construir modelos empregando três métodos de seleção de variáveis aplicados a dados de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) e a dados de espectroscopia no infravermelho próximo (NIR), além de avaliar a melhoria na qualidade de predição, quando comparado ao uso dos dados completos. Os métodos avaliados foram o de seleção dos preditores ordenados associado a regressão por quadrados mínimos parciais (PLS-OPS), o Sparce partial least Square (SPLS) e o Lasso bayesiano (BLASSO) supervisionado, este último é uma adaptação do método BLASSO com a vantagem de selecionar as variáveis. Foram utlizados conjuntos de dados simulados compostos por 100 amostras e 500 marcadores SNPs avaliados em dois cenários que diferem entre si no vetor de coeficientes de regressão utilizado e quatro conjuntos de dados reais, sendo um de SNPs e três de dados NIR. Usou-se o software R para a modelagem dos dados. As amostras foram separadas em conjuntos de treinamento e de teste via algoritmo de Kennard e Stone. A qualidade preditiva do modelo foi avaliada com base no coeficiente médio de correlação (r) entre valores preditos e reais, e a raiz quadrada do erro quadrático médio (RMSE). No conjunto de dados simulados avaliado no primeiro cenário, havia 52 marcadores de maiores efeitos. Os modelos usando o BLASSO supervisionado, o SPLS e o PLS-OPS selecionaram, respectivamente, em média, 100, 310 e 124 variáveis. Em termos de capacidade preditiva os modelos após seleção foram semelhantes quando comparados ao uso dos dados completos. No segundo cenário, 10 marcadores de menor efeito foram escolhidos para serem significativos. Nesse cenário, para escolha do número de variáveis a serem selecionadas pelo BLASSO supervisionado utilizou-se dois critérios: no primeiro 20% das variáveis foram selecionadas, e no segundo o número de variáveis selecionadas eram iguais ao do SPLS e do PLS-OPS. Em média os modelos apresentaram um desempenho melhor utlizando a seleção de variáveis em relação aos modelos construídos com os dados completos, sendo o SPLS levemente superior, com r = 0,846 e intervalo de RMSE de menor amplitude. Para a predição da produção de grãos em dados de SNPs, o método BLASSO supervisionado foi superior, com menor valor de RMSE (0,56) e maior valor de r (0,569). O PLS-OPS também apresentou bom desempenho nesse conjunto de dados, atestando o uso deste método para dados dessa natureza. No primeiro conjunto de dados NIR em que foi avaliado o teor de fibra da cana-de-açúcar, de maneira geral os valores de RMSE e de r se mantiveram próximos àqueles obtidos para os dados completos. No segundo conjunto de dados reais NIR em que foi avaliado o teor de lignina da cana-de-açúcar, pode-se observar que os melhores resultados foram obtidos com o método BLASSO supervisionado (RMSE = 0,705 e r = 0,956). No terceiro conjunto de dados reais NIR em que foram avaliadas amostras de repolho roxo, os melhores resultados foram obtidos quando utlizou-se o PLS-OPS (RMSE = 13,05 e r = 0,996). No segundo e terceiro conjuntos de dados NIR avaliados as estatísticas obtidas foram próximas às obtidas com os dados completos, porém com a vantagem de possuir menos variáveis. De maneira geral, os métodos funcionam de forma semelhante, mas cada um exibe vantagens sobre o outro em determinadas situações. Ao utilizarmos os métodos de seleção, podemos observar que os modelos se tornaram mais simples, visto que o número de variáveis reduziu significamente em todos os conjuntos de dados estudados. / Researches from many different areas have data sets with the challenges of high dimensionality and multicollinearity still to be overcome, therefore specific methods for model fit must be employed. Although the existing methods are efficient to construct the model, it is often necessary to select the most important variables in explaining the model, once this practice can increase its predictive capacity, reduce costs, and analysis time. The main objective of this work was to evaluate and construct models using three methods of variable selection applied to single nucleotide polymorphisms (SNPs) and near infrared spectroscopy (NIR) data, besides evaluating the improvement in prediction quality, when compared to the use of complete data. The methods evaluated were: the selection of ordered predictors associated with partial least squares regression (PLS-OPS); the Sparce partial least square (SPLS); and the supervised Bayesian Lasso (BLASSO) – the last one is an adaptation of the BLASSO method with advantage of selecting variables. Were used simulated data sets composed of 100 samples and 500 SNP markers evaluated in two scenarios that differ from one another in the regression coefficient vector used, and four real data sets – composed by one set of SNPs and three sets of NIR data. It was used the software R in order to model the data. Samples were separated into training and test sets via Kennard and Stone algorithm. The predictive quality of the model was evaluated based on the mean correlation coefficient (r) between predicted and actual values, and the square root mean square error (RMSE). In the simulated data set evaluated in the first scenario, there were 52 markers of greater effects. The models using supervised BLASSO, SPLS and PLS-OPS selected an average of 100, 310 and 124 variables, respectively. In terms of predictive capacity, the models after selection were similar when compared to the use of the complete data. In the second scenario, 10 lower-effect markers were chosen to be significant. In this scenario, two criteria were used to select the number of variables to be selected by supervised BLASSO: in the first 20% of the variables were selected, and in the second, the number of variables selected were the same as SPLS and PLS-OPS. On average, the models presented a better performance when using the variables selection, than in relation to the models constructed with the complete data, once the SPLS was slightly higher – with r = 0.846 and a lower amplitude RMSE interval. For the prediction of grain yield in SNP data, the supervised BLASSO method was superior, with a lower RMSE value (0.56) and a higher r value (0.569). PLS-OPS also performed well in this data set, attesting to the use of this method for data of this nature. In the first set of NIR data in which the sugar cane fiber content was evaluated, the RMSE and r values were, in general, close to those obtained for the complete data. In the second set of real NIR data in which the lignin content of sugarcane was evaluated, it can be observed that the best results were obtained with the supervised BLASSO method (RMSE = 0.705 and r = 0.956). In the third set of real NIR data in which samples of purple cabbage were evaluated, the best results were obtained when PLS-OPS (RMSE = 13.05 and r = 0.996) was used. In the second and third NIR data sets, the statistics obtained were close to those obtained with the complete data, but with the advantage of having fewer variables. In general, the methods used work in a similar way; however, each one of them has advantages over another in specific situations. By using the selection methods, it can be observed that the models have become simpler, once the number of variables reduced significantly in all datasets studied.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-15T13:31:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1719985 bytes, checksum: f66cfc87387f56886fa18e23b937cc79 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-15T13:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1719985 bytes, checksum: f66cfc87387f56886fa18e23b937cc79 (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A espécie Coffea arabica é a mais importante, economicamente, do gênero Coffea. Essa espécie é autógama e apresenta base genética estreita. Assim, o sucesso dos programas de melhoramento para essa cultura é desafiador. Nesse sentido, métodos seletivos robustos e precisos são necessários para maximizar os ganhos com seleção, mantendo a variabilidade genética presente nas populações. O uso de marcadores moleculares, por permitir o acesso à informação do DNA dos indivíduos, e da seleção baseada em dados fenotípicos por meio de procedimentos de modelos mistos (REML/BLUP), por permitirem a estimação de parâmetros genéticos de forma acurada mesmo em situação de experimentos desbalanceados, têm se mostrado vantajosos. Finalmente, os métodos de seleção genômica ampla (GWS), que buscam conhecer as associações entre os dados genotípicos e os fenotípicos, tem se mostrado acurado e promissor para diversas espécies vegetais, inclusive para espécies perenes. O objetivo do trabalho foi identificar marcadores SNP e validá-los em estudos de diversidade genética; estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP); aplicar o princípio da GWS e avaliar sua eficiência em população de C. arabica. A população em estudo, inicialmente, foi composta por 72 genótipos nos quais os marcadores SNP foram identificados e validados. A seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP, foi realizada em 228 genótipos de cafeeiros. A GWS foi realizada em população composta por 195 genótipos, genotipados com 21.211 e fenotipados para 18 características agronômicas. Um total de 40.000 sondas específicas foram construídas, sendo identificados 91.517 marcadores SNP em 72 indivíduos de C. arabica. Após análises de qualidade, 11.187 SNP foram selecionados e validados em análises de diversidade e estrutura genética de populações. Os marcadores foram eficientes na avaliação da diversidade e estrutura genética de C. arabica. Com base nos dados fenotípicos por meio de análises de modelos mistos foi possível estimar os parâmetros genéticos da população avaliada e obter ganhos expressivos com seleção. Os resultados da GWS demonstram o potencial dessa metodologia seletiva para o melhoramento de C. arabica, por predizer com acurácia os valores genéticos genômicos dos indivíduos e possibilitar a redução no tempo necessário para completar o ciclo de seleção, proporcionando ganhos significativos em eficiência seletiva. / The Coffea arabica species is the most important, economically, of the Coffea genus. This species is autogamous and has a narrow genetic base. Thus, the success of breeding programs for this crop is challenging. In this sense, robust and accurate selective methods are necessary to maximize the gains with selection, keeping the genetic variability present in the populations. The use of molecular markers, by allowing access to the DNA information of the individuals, and selection based on phenotypic data through mixed model procedures (REML/BLUP), because they allow the estimation of genetic parameters accurately even in situations of unbalanced experiments, have proved to be advantageous. Finally, genome wide selection (GWS), which seek to know the associations between genotypic and phenotypic data, have been shown to be accurate and promising for several plant species, including for perennial species. The objective of this study was to identify SNP markers and to validate them in studies of genetic diversity; to estimate genetic parameters and selection gains using the mixed model methodology (REML/BLUP); apply the GWS principle and evaluate its efficiency in C. arabica population. The population was initially consisted of 72 genotypes in which the SNP markers were identified and validated. Phenotypic selection, using the REML/BLUP procedure, was performed on 228 coffee genotypes. Finally, GWS was performed in a population consisted of 195 genotypes, genotyped with 21,211 and phenotyped for 18 agronomic traits. A total of 40,000 specific probes were constructed, with 91,517 SNP markers identified in 72 C. arabica individuals. After quality analyzes, 11,187 SNPs were selected and validated in analyzes of population structure and genetic diversity of coffee progenies derived from Catuaí and Híbrido de Timor. The markers were efficient in evaluating the diversity and structure genetic of C. arabica. Based on the phenotypic data through analyzes of mixed models, it was possible to estimate the genetic parameters of the evaluated population and obtain expressive gains with selection. Finally, GWS results demonstrate the potential of this selective methodology for the improvement of C. arabica by accurately predicting the genomic genetic values of the individuals and enabling the reduction in the time required to complete the selection cycle, providing significant gains in selective efficiency.

Evalúa la diversidad genética de la caballa. Se empleó 10 marcadores moleculares (EPIC-PCR) en muestras de 3 zonas del Perú (norte, centro y sur). De estos, 8 marcadores intrónicos fueron estandarizados (se determinaron las condiciones de PCR), corridos en geles de poliacrilamida y genotipados. Se obtuvieron 3 marcadores monomórficos (GnRH3-1, GnRH3-2 y Act-2), 3 dimórficos (GnRH3-3, Am2B-1 y MHCII), y 2 polimórficos (Am2B-3 y Cam-4); de los cuales, Cam-4 fue el único polimórfico e informativo. La diversidad genética en la población total de caballa empleando Cam-4 fue moderada (He: 0.422) con significativo desequilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) con un déficit de heterocigotos, con alto coeficiente de endogamia (Fis =0.69). A nivel local, las poblaciones de Paita (zona norte) e Ilo (zona sur) evidencian un significativo desequilibrio de HW mientras que la población de Ventanilla (zona centro) se halla en equilibrio. Posibles causas como la alta probabilidad de alelos nulos (raro en intrones) y el efecto hitchhiking pueden presentarse. / Tesis

Explora la genética poblacional de Plasmodium vivax en la comunidad de Santa Emilia (Iquitos, Loreto), una comunidad aislada en medio de la Amazonía Peruana. Para ello, se realizó un seguimiento de un año a un total de 213 habitantes de la comunidad, a partir de los cuales se seleccionaron 103 muestras, y se identificó una elevada proporción de infecciones asintomáticas (74%) y no detectables por microscopía (72%). A pesar del aislamiento geográfico, la diversidad genética encontrada en Santa Emilia (He=0.61) fue comparable con la reportada en otras localidades de la Amazonía que presentan menores restricciones de flujo génico. No obstante, también se encontró niveles significativos de desequilibrio de ligamiento (ISA=0.19, p<0.001). Diversos análisis de estructuración y diferenciación genética revelaron la presencia de 4 subpoblaciones de P. vivax en Santa Emilia, y a su vez se detectó la ocurrencia de expansiones clonales. Los hallazgos de este estudio sugieren que Santa Emilia representaría un riesgo importante para la reintroducción y mantenimiento de la malaria en otras localidades de la Amazonía Peruana, por lo cual sería necesario la implementación de estudios a mayor escala y la combinación de distintas estrategias para el control de la enfermedad. / Tesis

Evalúa la diversidad genética de la caballa. Se empleó 10 marcadores moleculares (EPIC-PCR) en muestras de 3 zonas del Perú (norte, centro y sur). De estos, 8 marcadores intrónicos fueron estandarizados (se determinaron las condiciones de PCR), corridos en geles de poliacrilamida y genotipados. Se obtuvieron 3 marcadores monomórficos (GnRH3-1, GnRH3-2 y Act-2), 3 dimórficos (GnRH3-3, Am2B-1 y MHCII), y 2 polimórficos (Am2B-3 y Cam-4); de los cuales, Cam-4 fue el único polimórfico e informativo. La diversidad genética en la población total de caballa empleando Cam-4 fue moderada (He: 0.422) con significativo desequilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) con un déficit de heterocigotos, con alto coeficiente de endogamia (Fis =0.69). A nivel local, las poblaciones de Paita (zona norte) e Ilo (zona sur) evidencian un significativo desequilibrio de HW mientras que la población de Ventanilla (zona centro) se halla en equilibrio. Posibles causas como la alta probabilidad de alelos nulos (raro en intrones) y el efecto hitchhiking pueden presentarse. / Tesis