Made available in DSpace on 2013-08-07T19:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422803-Texto+Completo-0.pdf: 2994221 bytes, checksum: 7c29345e7e01926a972683bfed251f7d (MD5) Previous issue date: 2010 / The main aim of this study is to assess the potential therapeutic benefits of a mice bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplant into an ataxia model in rats. To do so, we infused ibotenic acid bilaterally into the fastigial cerebellar nuclei of Wistar rats using a stereotaxic procedure. As control animals, we infused saline instead of ibotenic acid (sham group) or submitted some animals to the same procedures without intracerebellar infusions (naive group). Three days after surgery, we conducted the motor assessment using the rotarod test (using both fixed and accelerated speed protocols) and the wire suspension test. In comparison to the control groups, the rats that were given ibotenic acid had shorter latencies to fall in both protocols of the rotarod test, and also a shorter phase in which the fall occured in the accelerated one. In the fourth day, the lesioned animals were designated to receive one of the following transplants: saline infusion, BMMCs or inactivated BMMCs. Both control groups received a saline infusion. In new motor assessments carried on days 7 and 14 postsurgery, we observed that in the latter the transplant of both BMMCs and inactivated BMMCs increased the phase and latency to fall in the accelerated rotarod test, as well as the latency to fall in the fixed rotarod test, yelding a performance similar to the control groups. The lesioned group that received a saline infusion as a transplant remained with the hindered performance across the later tests. There was no difference in the wire suspension test regarding either the presence or the absence of fastigial lesions or the transplant type. In the end of the experiment, we couldn’t visualize any difference between any of the lesioned groups regarding the histological lesions at a histological level in the three lesioned groups. Hence, we demonstrated that a xenotransplant of mouse BMMCs can improve the motor performance in an ataxia model induced with the excitotoxic lesion of the fastigial nucleus of rats. However, it was not possible to assess if that effect involves neuronal repopulation and trophic action of the stem cells or is mediated by mechanisms related to the immunological response of the host. / O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial do transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) de camundongos reverter o déficit motor em um modelo de ataxia em ratos. Para isto, utilizou-se a cirurgia estereotáxica a fim de infundir ácido ibotênico bilateralmente no núcleo fastigial do cerebelo de ratos Wistar. Nos animais controle, infundiu-se salina ao invés de ácido ibotênico (sham) ou submeteu-se alguns animais aos mesmos procedimentos sem nenhuma infusão (naive). Três dias após a cirurgia, realizou-se o teste de marcha em cilindro giratório (rotarod, em uma versão com velocidade fixa e outra com aceleração progressiva) e o teste de suspensão em fio. Verificou-se que os animais que recebem ácido ibotênico apresentam menor latência de queda no teste do rotarod executado com ambos os protocolos, e menor fase de queda no protocolo acelerado, quando comparado aos controles. No quarto dia, os animais lesionados foram designados para um dos seguintes tratamentos, todos pela via venosa: salina, CMMO ou CMMO inativadas. Os animais controle receberam transplante de salina. Realizou-se nova avaliação do comprometimento motor 7 e 14 dias após a cirurgia estereotáxica. Verificou-se que o transplante de CMMO ou CMMO inativadas aumentou a latência e a fase de queda no teste do rotarod executado com o protocolo acelerado, bem como a latência de queda no teste executado com o protocolo fixo quando executados 14 dias após a cirurgia, havendo desempenho semelhante aos controles. O grupo com lesão que recebeu transplante de salina não apresentou melhora em nenhum parâmetro e momento dos testes. Não houve diferença no teste de suspensão em fio, em função da lesão ou do transplante. Ao final do experimento, em análise histológica, não se observou diferença no aspecto das lesões entre os grupos que tiveram o núcleo fastigial lesionado. Assim, demonstramos que um xenotransplante de CMMO de camundongos em ratos pode melhorar o desempenho motor em um modelo de ataxia induzido pela lesão excitotóxica bilateral do núcleo fastigial, sem ser possível, entretanto, identificar se tal efeito deve-se à repopulação neuronal e ação trófica das células tronco ou envolve outros mecanismos relacionados com a resposta imunológica do hospedeiro.

Introdução: A dor neuropática (dor originada como consequência direta de uma lesão ou doença afetando o sistema somatossensorial, em seus elementos periféricos ou no sistema nervoso central - SNC) possui uma alta incidência na população mundial e afeta a qualidade da vida dos pacientes acometidos por ela. O tratamento dessa condição dolorosa é ainda um desafio aos profissionais da saúde, pois os fármacos usados possuem ação limitada e diversos efeitos colaterais. Assim, há um grande interesse na busca por novos fármacos para tratar dor neuropática. Os estudos mostram o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (EROs) nos distintos tipos de dor, incluindo a neuropática. Dado ao envolvimento dessas espécies, moléculas com ação antioxidante são fortes candidatas como coadjuvantes no tratamento de condições dolorosas. Diversos estudos mostraram que a administração de N-acetilcisteína (NAC), uma molécula com ações complexas, dentre elas a de antioxidante, produz antinocicepção em animais com constrição crônica no nervo isquiático (CCI, do inglês chronic constriction injury), um modelo de dor neuropática. Contudo, ainda são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo da NAC. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos temporais da administração intraperitoneal de solução salina e NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, dado por 1, 3 ou 7 dias, sobre indicadores de comportamento nociceptivo e de recuperação de função locomotora, e moléculas de sinalização celular e parâmetros de estresse oxidativo em medula espinal lombossacral de ratos sem e com CCI. Esse segmento da medula espinal foi escolhido por ser a região de entrada das informações aferentes do nervo isquiático. O projeto que antecedeu o presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no uso de animais da UFRGS (número de protocolo: 23407). Metodologia: Foram utilizados 180 ratos Wistar machos, pesando 200-300g, divididos em 3 grupos experimentais: controle (animais que não sofreram nenhuma intervenção cirúrgica), sham (animais que tiveram o nervo isquiático direito apenas exposto) e CCI (animais que tiveram o nervo isquiático direito exposto e recebeu 4 amarraduras em seu terço inicial). Estes grupos experimentais foram subdivididos em subgrupos que receberam administração X intraperitoneal de solução salina ou NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, por período de 1, 3 ou 7 dias. Os testes de von Frey eletrônico e do índice funcional do isquiático (IFI) avaliaram a sensibilidade mecânica e a recuperação funcional do nervo, respectivamente, nos períodos antes da lesão e 1, 3 e 7 dias após a lesão nervosa. Ao final dos períodos de 1, 3 e 7 dias, os animais foram mortos por decapitação e a medula espinal lombossacral retirada e usada para as determinações: formação do ânion superóxido, hidroperóxidos lipídicos, capacidade antioxidante total (TAC, do inglês total antioxidante capacity), ácido ascórbico, expressão da proteína p-38 fosforilada, e quantificação do RNA mensageiro (mRNA) do NFкB. Outros grupos de animais foram perfundindos com paraformoldeído 4% preparado em tampão fosfato salino, 0,2 M, pH 7,4. Após a coleta e a crioproteção em solução de sacarose 15 e 30%, a medula espinal e os gânglios da raiz dorsal do nervo isquiático ipsilateral à lesão foram submetidos às técnicas de imunohistoquímica à proteína p-38 e histoquímica a NADPH-diaforase, essa última para marcação de células com atividade da óxido nítrico sintase (NOS), a enzima envolvida na síntese de NO. Os resultados de sensibilidade foram analisados por ANOVA de medidas repetidas; os demais resultados por ANOVA de três vias (fatores: lesão, tratamento e tempo), exceto os do NFκB, que foram por ANOVA de duas vias. O pós-teste usado foi o de Tukey. O P foi considerado significativo quando > 0,05. Resultados: A sensibilidade mecânica aumentou no dia 1 pós-lesão em todos os grupos CCI, e permaneceu elevada nos demais períodos analisados nos ratos com CCI tratados com solução salina. No grupo de ratos com CCI que recebeu tratamento com NAC, o valor da sensibilidade mecânica foi similar ao encontrado na pré-lesão, tanto aos 3 como aos 7 dias. No grupo sham que recebeu salina houve aumento na sensibilidade mecânica no dia 1, estando esse parâmetro com valor similar ao encontrado nos ratos controle nos demais períodos analisados. O aumento na sensibilidade mecânica não foi observado nos ratos sham que receberam NAC. O IFI melhorou nos ratos com CCI que receberam salina e NAC por 7 dias. Porém, enquanto o percentual de recuperação desse índice foi 28% nos ratos tratados com salina, a administração de NAC provocou recuperação de 44%. Paralelamente a essas mudanças, houve aumento estatisticamente significativo na geração de ânion superóxido na medula espinal de todos os ratos com CCI, independente do tratamento e do período de tempo analisado. Os hidroperóxidos lipídicos aumentaram (823%) na medula espinal de ratos com CCI tratados com salina no dia 1, mas o acréscimo foi de apenas 142% nos ratos com CCI que receberam NAC. Aos 3 e 7 dias, os hidroperóxidos lipídicos estavam ainda aumentados na medula espinal de ratos sham e com CCI, mas o aumento foi de 180%. A TAC teve redução apenas nos animais CCI tratados com salina, no dia 7. Os valores de ácido ascórbico aumentaram significativamente na medula espinal de ratos com CCI que receberam salina, nos dias 1 e 3. Apesar de elevado, o valor de ácido ascórbico na medula espinal desses ratos aos 7 dias não foi estatisticamente significativo quando comparado ao encontrado nos ratos controle. Nos ratos com CCI tratados com NAC não houve diferença significativa nos valores de ácido ascórbico da medula espinal comparados àqueles dos ratos controle. Quanto às moléculas de sinalização intracelular, observou-se aumento na expressão da p-38 fosforilada nos ratos sham e com CCI tratados com salina, nos dias 1, 3 e 7, comparados aos controles. O tratamento com NAC provocou o retorno da expressão dessa proteína nos ratos sham nesses dias, e uma redução de aproximadamente 187% nos ratos com CCI nos dias 3 e 7, sendo no dia 1 o valor similar ao do grupo controle. NAC também reduziu o aumento na imunorreatividade a p-38 em neurônios do gânglio da raiz dorsal e neurônios e células semelhantes à glia da medula espinal, aumentos esses induzidos pela CCI nos dias 1, 3 e 7. NAC também XI reduziu o aumento induzido pela CCI no número de neurônios reativos a NADPH-diaforase nas lâminas superficiais do corno dorsal e substância cinzenta localizada em volta do canal central da medula espinal. O tratamento com NAC ainda reduziu o mRNA do NFкB aumentado pela CCI e cirurgia sham. Conclusão: Estes resultados mostram que a administração intraperitoneal de NAC, na dose de 150 mg/kg/dia, reproduziu o efeito antinociceptivo dessa molécula e promoveu melhora no IFI. Paralelamente, o tratamento modificou parâmetros de estresse oxidativo e sinalização intracelular na medula espinal, os quais possivelmente se relacionam com as melhoras na sensibilidade mecânica e recuperação funcional do nervo isquiático nos ratos com CCI. A partir desses resultados, pode-se dizer que o efeito antinociceptivo da NAC em ratos com dor neuropática por CCI envolve não apenas sua ação antioxidante, mas também seu efeito em vias de sinalização intracelular. / Introduction: Neuropathic pain (pain arising as a direct result of an injury or disease affecting the somatosensory system in their peripheral elements or the central nervous system - CNS) has a high incidence in the world population and affects the quality of life of patients affected by it. The treatment of this painful condition is still a challenge for health professionals, since the drugs used have limited action and cause side effects. Thus, there is great interest in the search for new pharmaceuticals to treat neuropathic pain. Research shows the involvement of reactive oxygen species (ROS) in different types of pain, including neuropathic pain. Given the involvement of these species, molecules with antioxidant action are strong candidates as adjuvants in the treatment of painful conditions. Several studies have shown that N-acetylcysteine (NAC), a molecule with complex actions, including an antioxidant one, produces antinociception in animals with chronic constriction of the sciatic nerve (CCI, chronic constriction injury), a neuropathic pain model. However, the mechanisms involved in the antinociceptive effect of NAC are still poorly understood. Thus, this study aimed to evaluate the temporal effects of intraperitoneal administration of saline and NAC at a dose of 150 mg/kg/day, given for 1, 3 or 7 days, on nociceptive behavior and recovery of locomotor function, and cell signaling molecules and oxidative stress parameters in lumbosacral spinal cord of rats with and without CCI. This segment of the spinal cord was chosen because it is the entry region of the sciatic nerve afferent information. The project that preceded this study was approved by the Ethics Committee of UFRGS on the use of animals (protocol number: 23407). Methods: We used 180 male Wistar rats, weighing 200-300g, divided in 3 groups: control (animals which underwent no surgery), sham (animals which had only the right sciatic nerve exposed) and CCI (animals that had the right sciatic nerve exposed and received 4 ligatures in its initial third). These experimental groups were subdivided into subgroups receiving intraperitoneal administration of saline or NAC at a dose of 150 mg/kg/day for a period of 1, 3 or 7 days. Electronic von Frey tests and the sciatic functional index (SFI) evaluated the mechanical sensitivity and functional recovery of the nerve, respectively, in the periods before the injury and 1, 3 and 7 days after the nerve injury. At the end of these periods, the animals were killed by decapitation and the lumbosacral spinal cord was removed and used to determine the formation of superoxide, lipid hydroperoxide, total antioxidant capacity (TAC), ascorbic acid, expression of phosphorylated p-38 protein, and quantification of messenger RNA (mRNA) of NFκB. Other animal groups were perfused with 4% paraformaldehyde prepared in 0.2 M phosphate buffered saline, pH 7.4. After collection and cryoprotection in 15% and 30% sucrose solution, the spinal cord and dorsal root ganglia of the sciatic nerve ipsilateral to the lesion were subjected to immunohistochemistry of protein p-38 and histochemistry of NADPH-diaphorase, the latter for labeling the activity of nitric oxide (NO) synthase, the enzyme involved in the synthesis of NO. The results of sensitivity were analyzed by ANOVA of repeated measures; the other results by three-way ANOVA (factors: injury, treatment, and time), except those of NFκB, which were analyzed by two-way ANOVA. The post-test used was Tukey’s. P was considered significant when <0.05. Results: Mechanical sensitivity increased on day 1 post-injury in all CCI groups, and remained elevated in the other period analyzed in saline-treated CCI rats. In the group of NAC-treated CCI rats, the value of mechanical sensitivity was close to the pre-injury one, both at 3 and 7 days. In the sham group receiving saline, there was an increase in mechanical sensitivity on day 1, whose value was close to those of control rats in the other periods analyzed. Increased mechanical sensitivity was not observed in sham rats receiving NAC. The SFI improved in CCI rats receiving saline and NAC for 7 days. However, while the recovery rate of this index was 28% in the saline-treated rats, NAC administration caused a recovery of 44%. Alongside these changes, there was a statistically significant increase in the generation of superoxide anion in the spinal cord of all CCI rats, regardless of treatment and time period analyzed. Lipid hydroperoxides increased (823%) in the spinal cord of saline-treated CCI rats on day 1, but the increment was only 142% in CCI rats receiving NAC. At 3 and 7 days, lipid hydroperoxides were further increased in the spinal cord of sham and CCI rats, but the increment was 180%. TAC was reduced only in saline-treated CCI animals, on day 7. Ascorbic acid values increased significantly in the spinal cord of CCI rats receiving saline on days 1 and 3. Although high, ascorbic acid in the spinal cord of these rats on day 7 was not statistically significant as compared to control rats. In NAC-treated CCI rats, there was no significant difference in ascorbic acid values of the spinal cord as compared to control rats. As regards intracellular signaling molecules, increased expression of phosphorylated p-38 was observed in saline-treated CCI and sham rats on days 1, 3 and 7 compared to controls. NAC treatment caused a return of expression of this protein in sham rats on these days, and a reduction of approximately 187% in CCI rats on days 3 and 7, with the value of day 1 close to that of the control group. NAC also reduced the increase in p-38 immunoreactivity in dorsal root ganglion neurons and neurons and cells similar to spinal cord glia, such increases induced by CCI on days 1, 3 and 7. NAC also reduced the CCI-induced increase in the number of NADPH diaphorase reactive neurons in the superficial lamina of the dorsal horn and gray matter located around the central canal of the spinal cord. NAC treatment also reduced the mRNA of NFкB increased by CCI and sham surgery. Conclusion: These results show that intraperitoneal administration of NAC at 150 mg/kg/day reproduced the antinociceptive effect of this molecule and promoted improvement in SFI. In addition, the treatment changed oxidative stress parameters and intracellular signaling in the spinal cord, which are possibly related to improvements in mechanical sensitivity and functional recovery of the sciatic nerve in rats with CCI. From these results, one can say that the antinociceptive effect of NAC in rats with neuropathic pain from CCI involves not only its antioxidant action, but also its effect on intracellular signaling pathways.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:28:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281751.pdf: 2813307 bytes, checksum: 6667e18ff620b043e8f40c51f47a9a5e (MD5) / A proposta deste estudo foi avaliar a relevância do receptor TRPA1 (receptor de potencial transitório com domínios tipo anquirina 1) na hiperatividade da bexiga urinária decorrente da lesão medular em ratos. A lesão medular resultou em alterações na capacidade locomotora dos animais, em hipertrofia muscular e dano na bexiga urinária, representado pela perda de células uroteliais, formação de edema, deposição de fibrina e infiltração de neutrófilos, bem como por mudanças na contratilidade do órgão e nos parâmetros urodinâmicos envolvidos no processo de micção. Além disso, a lesão medular induziu aumento nos níveis do RNAm e da expressão do receptor TRPA1 na bexiga urinária e nos neurônios do GRD (gânglio da raiz dorsal) e da expressão do receptor TRPV1 (receptor de potencial transitório vanilóide 1) na bexiga urinária, nos neurônios do GRD (L6-S1) e na porção correspondente da medula espinhal. A exposição do KCl (agente despolarizante), carbacol (agonista de receptores muscarínicos), cinamaldeído (agonista do receptor TRPA1) ou da capsaicina (agonista do receptor TRPV1) às preparações de bexiga urinária induziu resposta contrátil, a qual foi potencializada pela lesão medular. A pré-incubação das preparações de bexiga urinária com HC-030031 (antagonista do receptor TRPA1) ou com SB-366791 (antagonista do receptor TRPV1), ou ainda o tratamento intratecal com antisense oligodeoxinucleotídeo para o receptor TRPA1 (AS-ODN TRPA1), todos reduziram significativamente a resposta contrátil da bexiga urinária induzida pelo cinamaldeído. Por outro lado, o tratamento intratecal com AS-ODN TRPA1 não interferiu com a resposta contrátil induzida pelo carbacol (agonista muscarínico). Ademais, a remoção das células uroteliais reduziu a resposta contrátil mediada pelo cinamaldeído ou pelo carbacol. A lesão medular aumentou a amplitude da atividade fásica espontânea da bexiga urinária, o número de contrações não associadas à micção (CNMs), a pressão basal, a pressão limiar, a capacidade de armazenamento da bexiga urinária, o volume residual e reduziu o intervalo entre as contrações, o volume eliminado e a eficiência do esvaziamento vesical. O tratamento sistêmico agudo com HC-030031 reduziu significativamente a amplitude e o número de CNMs, enquanto o tratamento intratecal com AS-ODN TRPA1 reduziu o número de CNMs e normalizou a atividade fásica espontânea da bexiga urinária. Além disso, o tratamento com AS-ODN TRPA1 reduziu acentuadamente a expressão do receptor TRPA1 nos neurônios do GRD (L6-S1), na porção correspondente da medular espinhal, no músculo detrusor, porém não no urotélio da bexiga urinária. Estudos realizados em cultura neuronal mostraram que a lesão medular induziu aumento na proporção de neurônios do GRD (L6-S1) responsivos e na mobilização de cálcio intracelular ao estímulo com cinamaldeído e apenas na mobilização de cálcio intracelular ao estímulo com capsaicina. A exposição dos neurônios do GRD (L6-S1) às neurotrofinas NGF (fator de crescimento derivado do nervo) ou BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro) induziu aumento na mobilização de cálcio intracelular ao estímulo com cinamaldeído ou capsaicina, enquanto a exposição ao BDNF induziu aumento na proporção de neurônios do GRD responsivos ao cinamaldeído. Finalmente, após a lesão medular os níveis de NGF e BDNF foram aumentados na bexiga urinária, nos neurônios do GRD (L6-S1) e na porção correspondente da medula espinhal. Em conjunto, os resultados sugerem que o modelo animal de lesão medular utilizado neste estudo reproduziu as alterações fisiopatológicas no trato urinário inferior e evidencia um papel importante do receptor TRPA1 na hiperatividade urinária causada pela lesão medular em ratos.

Orientador :Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Danielle Cardoso Geraldo Maia / Banca: Márcia Antoniazi Michelin / Banca: Dagmar Ruth Stach-Machado / Banca: Leila Aparecida Chiavacci / Resumo: Introdução: a integrina αvβ3 causa adesão celular à vitronectina e está expressa em diversos tumores humanos, mas está em níveis muito reduzidos nos tecidos normais, sendo mais notável em células derivadas da medula óssea. A desintegrina recombinante DisBa-01 se liga à integrina αvβ3, inibindo a adesão celular à vitronectina. Apresenta também uma capacidade antimetastática in vivo e antitrombótica in vitro. As micelas são sistemas de transporte que podem direcionar o fármaco ao tecido alvo de forma passiva, se acumulando onde a microvasculatura esteja mais permeável, como no caso do câncer. Objetivos: verificar a perda de adesão, a liberação de mediadores, a citotoxicidade e a anoikis gerados pela desintegrina DisBa-01, tanto em sua forma livre como incorporada em micelas, em linhagens celulares que expressem ou não a integrina αvβ3. Métodos: a desintegrina foi expressa em bactérias Escherichia coli a partir de um cDNA fusionado ao vetor pET28a, e então purificada por cromatografias e diálises. As micelas controle (M-C) ou contendo a desintegrina (M-DB) foram estruturadas com polissorbato 80 e fosfatidilcolina de soja, e foi observado o diâmetro médio e índice de polidispersidade por espalhamento dinâmico de luz, o potencial zeta por microeletroforese, a eficiência de encapsulação por dosagem protéica de Lowry, a avaliação estrutural da desintegrina encapsulada por espectroscopias de dicroísmo circular e de fluorescência e a estrutura das micelas pela curva de SAXS. As micelas e a proteína livre foram testadas em linhagens HUVEC e SC, contendo a integrina αvβ3, e K562, não contendo esta integrina. Foram avaliados a citotoxicidade pelo teste de MTT, a inibição de adesão celular ou descolamento a vitronectina e fibronectina por quantificação das células aderidas com cristal violeta, a anoikis por observação das células viáveis e em apoptose se aderidas ou não por MTT, Apo-Direct ... / Abstract: Introduction: integrin αvβ3 sustain cellular adhesion to vitronectin and is expressed on a diversity of human tumors but is present at very low levels on normal tissues, with notable expression on bone marrow-derived cells. The recombinant disintegrin DisBa-01 binds to αvβ3 integrin, inhibiting cell adhesion to vitronectin. It also features an in vivo anti-metastatic ability and in vitro anti-thrombotic function. Micelles are a transport system that can direct a drug to the target tissue passively, accumulating where microvasculature is more permeable, which happens on cancer. Objectives: to verify adhesion loss, mediators production, citotoxicity and anoikis generated by disintegrin DisBa-01, both in its free form or incorporated into micelles, in cell lines expressing or not αvβ3 integrin. Methods: the disintegrin was expressed in Escherichia coli using a cDNA fused to vector pET28a, and then purified by chromatography and dialyses. Control micelles (M-C) or containing disintegrin (M-DB) were assembled using polysorbate 80 and soy phosphatidylcholine, and it was observed the average diameter and polydispersity index by dynamic light scattering, zeta potential by microelectrophoresis, the efficiency of encapsulation by protein determination using Lowry reagent, structural assessment of disintegrin encapsulated by circular dichroism spectroscopy and fluorescence spectroscopy and micelles' structure by SAXS curve. The protein free or incorporated into micelles were tested in HUVEC and SC, containing integrin αvβ3, and in K562, not containing this integrin. Cytotoxicity was evaluated by MTT assay, inhibition of cell adhesion and detachment to vitronectin or fibronectin by quantifying the adherent cells with crystal violet, the anoikis by observation of viable cells and apoptosis, whether attached or not, by MTT, Apo-Direct and annexin V, and production of mediators VEGF-A, IL-8, TGF-β, TNF-α, IL-12 and ... / Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pos-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289480.pdf: 1840258 bytes, checksum: 1a58fd49245ad6bea3a26426f0d7f25a (MD5) / O envolvimento dos receptores B1 e B2 para as cininas em processos fisiopatológicos da bexiga urinária tem sido demonstrado em diversos estudos. No entanto, a implicação destes receptores na hiperatividade da bexiga urinária após lesão medular permanece inexplorada até o momento. Desse modo, este estudo investigou o envolvimento dos receptores B1 e B2 na hiperatividade da bexiga urinária induzida por lesão da medula espinhal por compressão ao nível torácico T9-T10. A lesão medular induziu uma resposta inflamatória pronunciada e diversas mudanças funcionais na contratilidade e nos parâmetros urodinâmicos da bexiga urinária. A lesão medular resultou, ainda, em um aumento nos níveis de RNAm para os receptores B1 na bexiga urinária, nos gânglios da raiz dorsal (L6-S1) e nos segmentos correspondentes da medula espinhal. Houve também, em um aumento na expressão dos receptores B1 e B2 na bexiga urinária. Ensaios in vitro com preparações da bexiga urinária obtidas 2, 7, 14 e 28 dias após a lesão medular reveleram aumento significativo da resposta contrátil a agonistas seletivos dos receptores B1 (des-Arg9-BK) ou B2 (bradicinina) quando comparadas às respostas obtidas de grupos controle ou falso-operado. As respostas aos agonistas B1 ou B2 foram reduzidas pelos seus respectivos antagonistas seletivos, des-Arg9-[Leu8]-BK ou Hoe 140. De maneira interessante, estudos cistométricos em animais com lesão medular demonstraram que o tratamento sistêmico com Hoe 140 reduziu significativamente a amplitude e o número das contrações não-associadas a micção (CNMs) na bexiga urinária. Tratamento sistêmico com o antagonista do receptor B1, des-Arg9-[Leu8]-BK, apenas reduziu significativamente o número das CNMs na bexiga urinária dos animais lesionados. O presente estudo demonstra o importante envolvimento dos receptores B1 e B2 para as cininas na hiperatividade da bexiga urinária induzida por lesão medular em ratos e apontam novos alvos terapêuticos para o tratamento da hiperatividade da bexiga urinária decorrente de lesão medular traumática. / The B1 (B1R) and B2 (B2R) kinin receptors has been implicated in physiological and pathological conditions of the bladder, but its role in overactive bladder (OB) following spinal cord injury (SCI) remains elusive. Here we assessed by means of functional and molecular approaches the relevance of these receptors in OB caused by SCI in rats. SCI resulted in an inflammatory process, changes in bladder contractility and in urodynamic parameters. Moreover, SCI caused a marked up-regulation of B1 mRNA levels in bladder, spinal cord and dorsal root ganglion (L6-S1). SCI also caused an up-regulation of B1 and B2 protein levels in bladder. The exposure of B1 agonist, des-Arg9-BK, and B2 agonist, bradykinin (BK), to bladder strips induced a contractile response significantly enhanced following SCI. Pre-incubation of the bladder preparations with des-Arg-Leu8-BK (B1 antagonist) or Hoe 140 (B2 antagonist), significantly reduced bladder contraction. In addition, cystometric studies on SCI animals revealed that systemic Hoe 140 treatment significantly reduced the amplitude and the number of non-voiding contractions (NVCs) while systemic treatment with DALBK only reduced the number of NVCs. There were no significant changes in basal pressure, threshold pressure, maximum voiding pressure, voided volume and voiding efficiency before administration of vehicle, HOE 140 or DALBK. Taken together, these results suggest that up-regulation of BK receptors are involved in the mechanism inducing OB following SCI in rats.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:15:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290026.pdf: 4869598 bytes, checksum: 3bbf5740e51b2bfa65dac3af923c75e3 (MD5) / A medula espinhal tem sido considerada um potencial sítio de modulação da inflamação e não apenas uma simples linha de transmissão da periferia para o cérebro. O reflexo da raiz dorsal (RRD) caracterizado pela atividade antidrômica nas fibras aferentes primárias pode interferir na inflamação periférica. Neste contexto, estudos anteriores demonstraram que a administração de morfina intratecal resulta em efeito antiedematogênico com envolvimento da via L-arginina/ Óxido Nítrico (NO)/ GMPc. O presente estudo estende esses resultados a fim de avaliar a hipótese do envolvimento dos canais de potássio em tal efeito. As drogas foram injetadas na intratecal de ratos Wistar machos em volume de 20 L, 30 min antes do estímulo edematogênico da carragenina (CG -150 g/50 l, subcutâneo) na pata posterior direita. A avaliação do edema foi medido como aumento de volume da pata (ml) e pelo extravasamento plasmático pelo corante azul de Evans. A migração de neutrófilos foi avaliada indiretamente pelo ensaio da mieloperoxidase (MPO). A quantificação do infiltrado inflamatório e congestão vascular ocorreu através da análise histológica. A administração de morfina (37 nmol) inibiu o edema inflamatório, o extravasamento do corante azul de Evans e a congestão vascular. Entretanto, não teve efeito na atividade da MPO e no infiltrado inflamatório. A coadministração da morfina (37 nmol) com 4-aminopiridina (10 nmol), Glibenclamida (5 nmol) e Dequalinium (10 pmol) reverteu o efeito inicial da morfina. Estes resultados suportam a idéia de que a morfina pode atuar em receptores opióides medular produzindo efeito antiedematogênico, mediado pela abertura de canais de potássio, via NO/GMPc.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:40:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290296.pdf: 2092290 bytes, checksum: 0d72e1b88bfccac79bd8102a0d2f0d6c (MD5) / O envolvimento das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) em lesões do sistema nervoso central já foi demonstrado em alguns estudos. Porém, a implicação da ativação dessas proteínas na medula espinhal após a lesão medular traumática necessita de maior esclarecimento. O presente estudo investigou a participação das MAPKs ERK1/2, p38 e JNK no dano espinhal e funcional induzido pela lesão medular traumática em ratos. A compressão da medula espinhal, através da inserção de um cateter de embolectomia no espaço epidural, resultou em uma lesão espinhal caracterizada histologicamente por resposta inflamatória pronunciada, com edema, infiltração de neutrófilos, produção de mediadores inflamatórios e apoptose, associada com comprometimento locomotor significativo. A lesão medular não alterou a expressão protéica total de quaisquer das MAPKs na medula espinhal. Contudo, os níveis de expressão das isoformas fosforiladas de cada MAPK em amostras espinhais de animais lesados apresentaram-se elevadas, em relação às de amostras de animais falso-operados, nos seguintes momentos após indução da lesão: p38 fosforilada em 2 e 6 h, ERK1/2 fosforilada em 2, 6 e 24 h, e JNK fosforilada apresentou uma elevação significativa em 6 e 24 h. Amostras espinhais de animais lesados apresentaram ainda aumento nos níveis das citocinas IL-1ß em 2, 6 e 24 h após a lesão e de TNF-a em 2 h, atividade aumentada da enzima mieloperoxidase (uma medida indireta da infiltração de neutrófilos) em 6, 24 e 72 h, e do número de células apoptóticas em 24 e 72 h após a lesão. A administração intratecal do inibidor seletivo da proteína JNK, o SP600125 (2 injeções de 150 nmol, 1 e 4 h após a lesão medular), reduziu a expressão da proteína JNK fosforilada (mas não de p-38 ou ERK1/2 fosforiladas) e bloqueou a apoptose em 6 h, sem alterar os níveis espinhais de mieloperoxidase. O tratamento com SP600125 acentuou marcadamente a recuperação da atividade locomotora dos animais no transcorrer das primeiras 4 semanas após a lesão, e atenuou os danos histológicos espinhais. Este estudo demonstra o importante envolvimento das MAPKs na lesão medular e aponta a proteína JNK como um importante alvo terapêutico no tratamento da lesão medular traumática, uma vez que um inibidor seletivo desta proteína foi capaz de inibir a apoptose espinhal e potencializar a recuperação da função locomotora. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) have been extensively implicated in injuries of the CNS, however the roles played by spinal cord MAPK activation following spinal cord injury (SCI) still remain elusive. Considering that the therapies currently available for treatment of this condition have limited efficacy, the use of animal models of SCI is still mandatory for development of new more effective approaches. The current study investigates the changes in expression of the three main MAPKs, namely ERK1/2, p38 and JNK following traumatic SCI, as well as the role played by spinal JNK in motor impairment following lesion. SCI induced by inflation of a balloon catheter placed in the epidural space at T9-T10, was associated with a marked spinal inflammatory response, histological changes and a pronounced locomotor impairment which subsided only partially over the first 4 weeks. Spinal expression levels of total p38, ERK1/2 and JNK proteins were unchanged after SCI, but levels of the phosphorylated (phospho) forms of each of the MAPKs were enhanced as follows: phospho-p38 MAPK at 2 and 6 h after SCI, phospho-ERK1/2 at 2, 6 and 24 h after SCI, and phospho-JNK at 6 and 24 h after SCI. SCI also increased IL-1â at 2, 6 and 24 h, TNF-á at 2 h, spinal cord MPO levels at 6, 24 and 72 h and elevated the number of spinal apoptotic cells in the spinal cord at 24 and specially 72 h after the lesion. Notably, intrathecal administration of a specific inhibitor of JNK phosphorylation, SP600125 (2 injections of 150 nmol, given at 1 and 4 h after SCI surgery), reduced the expression of phospho-JNK (but not of phospho-p38 or phospho-ERK1/2) and the number of spinal apoptotic cells at 6 h after SCI, as well as many of the histological signs of spinal injury, but spinal MPO levels were unchanged. Most importantly, restoration of locomotor performance throughout the first 4 weeks following SCI was clearly ameliorated by this same treatment schedule with SP600125. Altogether, the results demonstrate that SCI induces the activation of spinal MAPKs and that, among these, spinal JNK plays a major role in mediating the deleterious consequences of spinal injury, not only at the spinal level, but also those regarding motor function. Moreover, they suggest that inhibition of JNK activation in the spinal cord might hold therapeutic potential for the functional recovery from SCI.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-10-10Bitstream added on 2014-08-13T18:01:11Z : No. of bitstreams: 1 000736177_20181010.pdf: 393728 bytes, checksum: e7efdc1d70357c8accce55f226b8cee1 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-10-19T12:50:41Z: 000736177_20181010.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-10-19T12:51:40Z : No. of bitstreams: 1 000736177.pdf: 1699234 bytes, checksum: 7c74f9ca1ff900faa29c2fee3b7096f2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bolsa de estudos / Introdução: a integrina αvβ3 causa adesão celular à vitronectina e está expressa em diversos tumores humanos, mas está em níveis muito reduzidos nos tecidos normais, sendo mais notável em células derivadas da medula óssea. A desintegrina recombinante DisBa-01 se liga à integrina αvβ3, inibindo a adesão celular à vitronectina. Apresenta também uma capacidade antimetastática in vivo e antitrombótica in vitro. As micelas são sistemas de transporte que podem direcionar o fármaco ao tecido alvo de forma passiva, se acumulando onde a microvasculatura esteja mais permeável, como no caso do câncer. Objetivos: verificar a perda de adesão, a liberação de mediadores, a citotoxicidade e a anoikis gerados pela desintegrina DisBa-01, tanto em sua forma livre como incorporada em micelas, em linhagens celulares que expressem ou não a integrina αvβ3. Métodos: a desintegrina foi expressa em bactérias Escherichia coli a partir de um cDNA fusionado ao vetor pET28a, e então purificada por cromatografias e diálises. As micelas controle (M-C) ou contendo a desintegrina (M-DB) foram estruturadas com polissorbato 80 e fosfatidilcolina de soja, e foi observado o diâmetro médio e índice de polidispersidade por espalhamento dinâmico de luz, o potencial zeta por microeletroforese, a eficiência de encapsulação por dosagem protéica de Lowry, a avaliação estrutural da desintegrina encapsulada por espectroscopias de dicroísmo circular e de fluorescência e a estrutura das micelas pela curva de SAXS. As micelas e a proteína livre foram testadas em linhagens HUVEC e SC, contendo a integrina αvβ3, e K562, não contendo esta integrina. Foram avaliados a citotoxicidade pelo teste de MTT, a inibição de adesão celular ou descolamento a vitronectina e fibronectina por quantificação das células aderidas com cristal violeta, a anoikis por observação das células viáveis e em apoptose se aderidas ou não por MTT, Apo-Direct ... / Introduction: integrin αvβ3 sustain cellular adhesion to vitronectin and is expressed on a diversity of human tumors but is present at very low levels on normal tissues, with notable expression on bone marrow-derived cells. The recombinant disintegrin DisBa-01 binds to αvβ3 integrin, inhibiting cell adhesion to vitronectin. It also features an in vivo anti-metastatic ability and in vitro anti-thrombotic function. Micelles are a transport system that can direct a drug to the target tissue passively, accumulating where microvasculature is more permeable, which happens on cancer. Objectives: to verify adhesion loss, mediators production, citotoxicity and anoikis generated by disintegrin DisBa-01, both in its free form or incorporated into micelles, in cell lines expressing or not αvβ3 integrin. Methods: the disintegrin was expressed in Escherichia coli using a cDNA fused to vector pET28a, and then purified by chromatography and dialyses. Control micelles (M-C) or containing disintegrin (M-DB) were assembled using polysorbate 80 and soy phosphatidylcholine, and it was observed the average diameter and polydispersity index by dynamic light scattering, zeta potential by microelectrophoresis, the efficiency of encapsulation by protein determination using Lowry reagent, structural assessment of disintegrin encapsulated by circular dichroism spectroscopy and fluorescence spectroscopy and micelles’ structure by SAXS curve. The protein free or incorporated into micelles were tested in HUVEC and SC, containing integrin αvβ3, and in K562, not containing this integrin. Cytotoxicity was evaluated by MTT assay, inhibition of cell adhesion and detachment to vitronectin or fibronectin by quantifying the adherent cells with crystal violet, the anoikis by observation of viable cells and apoptosis, whether attached or not, by MTT, Apo-Direct and annexin V, and production of mediators VEGF-A, IL-8, TGF-β, TNF-α, IL-12 and ... / FAPESP: 10/05428-0 / FAPESP: 10/01568-2

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MAGALHÃES, Samira Rocha. Influência da espiritualidade, religião e crenças na qualidade de vida de pessoas com lesão medular. 2014. 96 f. Dissertação (mestrado em Enfermagem) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-06-18T12:08:05Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_srmagalhães.pdf: 2329800 bytes, checksum: c6a1617c3551c82d3e82691110e62a21 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-06-18T12:09:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_srmagalhães.pdf: 2329800 bytes, checksum: c6a1617c3551c82d3e82691110e62a21 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-18T12:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_srmagalhães.pdf: 2329800 bytes, checksum: c6a1617c3551c82d3e82691110e62a21 (MD5) Previous issue date: 2014 / The importance of spirituality, religiosity and beliefs to overcome difficulties has been noted. The aim of this study was to evaluate the influence of spirituality, religiosity and personal beliefs in the life quality of people who had a spinal cord injury (SCI). This is an exploratory longitudinal study with a quantitative approach, conducted in the city of Fortaleza - CE, in two phases: in the hospital and then with the same patients, in their homes, through telephone contact. The study’s target population consisted of 55 people in the hospital, but only 49 participated in the second phase. In order to meet the aims of this study, two instruments were applied; one to trace the socio-demographic and clinical profiles and the Quality of Life instrument of the World Health Organization - Module Spirituality, Religion and Personal Beliefs - WHOQOL-SRPB WHO, which features eight factors, totalling 32 items on the Likert scale, where 1 represents never and 5 indicates always. Exploratory analyzes were performed by using univariate frequency distribution, descriptive measures and the Box Plot graph. The validation of the internal consistency of the responses and calculation of the scores of the respective dimensions of scale WHOQOL-SRPB were verified in both phases of the study. The ethical aspects were observed, according to Resolution 466/12 of the National Health Council (BRAZIL, 2012), and approved by the ethics committee of the UFC with Protocol 338 980 and committee co-participant (IJF) with paragraph 348 114. The validation of the internal consistency of the responses and calculate the scores of the respective dimensions of the scale were observed in both phases of the study and proved to be excellent. The Wilcoxon T test – a non parametric test for paired samples’ comparison – was used to compare the average values of the groups (hospitalized and at home). High scores were obtained from WHOQOL-SRPB domains, in both phases, in which the ones that stood out were those related to hope and optimism, spiritual strength and faith. Regarding changes in scores for the two sides domains that demonstrated a statistically significant difference was domains, meaning in life and spiritual strength, it is believed that this difference was due to the change of environment in which the person is still going through the period adaptation. Therefore, it is expected that this study lead nurses to the reflection on the relevance of spiritual and emotional care of people with SCI and to the practice of mutual respect. / Tem-se observado a importância da espiritualidade, religiosidade e crenças para superar momentos difíceis. Desse modo, este trabalho objetivou avaliar a influência da espiritualidade, religiosidade e crenças pessoais na qualidade de vida de pessoas com lesão medular (LM). Trata-se de um estudo exploratório de corte longitudinal, com abordagem quantitativa, realizado na cidade de Fortaleza - CE, em duas fases, no ambiente hospitalar e depois com os mesmos pacientes, em seu domicílio, por meio de contato telefônico. A população alvo do estudo foi constituída de 55 pessoas no ambiente hospitalar, mas somente 49 participaram da segunda fase. Foram aplicados dois instrumentos; um para traçar os perfis sociodemográfico e clínico e o instrumento de Qualidade de vida da Organização Mundial da Saúde - Módulo Espiritualidade, Religião e Crenças Pessoais - WHOQOL-SRPB, o qual apresenta oito facetas, totalizando 32 itens com respostas em escala Likert. Foram realizadas análises exploratórias mediante uso de distribuições de frequências univariadas e medidas descritivas. Os aspectos éticos foram respeitados, conforme a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde (BRASIL, 2012), e aprovado pelo comitê de ética da UFC com protocolo nº 338.980 e do comitê coparticipante (IJF) com o nº 348.114. A validação da consistência interna das respostas obtidas e cálculo dos escores das respectivas dimensões da escala foram verificados em ambas as fases do estudo e mostrou ser excelente. Para comparação dos valores médios dos grupos (hospitalizados e no domicílio) foi utilizado o Teste T de Wilcoxon. Confirmam-se os altos escores obtidos nos domínios da WHOQOL-SRPB, em ambas as fases, nas quais os domínios que mais se destacaram foram os relacionados com a esperança e otimismo, força espiritual e fé. Em relação às modificações dos escores durante as duas faces os domínios que demostraram diferença estatística significante foi os domínios, sentido na vida e força espiritual, acredita-se que essa diferença ocorreu devido à mudança de ambiente, no qual a pessoa ainda estar passando pelo período de adaptação. Portanto, espera-se que este estudo possa despertar os enfermeiros para a reflexão sobre a relevância do cuidado espiritual e emocional das pessoas com LM.