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Investigação de fatores genéticos na etiologia de fendas orofaciais típicas / Investigation of genetic factors on the etiology of orofacial clefts typical

Simioni, Milena, 1983- 21 February 2008 (has links)
Orientador: Vera Lucia Gil da Silva Lopes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T00:02:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simioni_Milena_D.pdf: 16919327 bytes, checksum: fa845dbc925978762cb44d70536f9ec7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As fendas orofaciais típicas (FOT) são defeitos congênitos prevalentes que possuem múltiplas etiologias. Estudos populacionais apontaram diferentes genes relacionados às FOTs. Entretanto, em muitos casos, a etiologia permanece desconhecida. A investigação individualizada, utilizando em conjunto diferentes ferramentas laboratoriais, é uma abordagem mais complexa que pode contribuir na caracterização etiológica das FOTs. Assim, este estudo teve como objetivo investigar os fatores genéticos envolvidos na etiologia das FOTs em uma casuística composta por 23 indivíduos afetados, incluindo casos sindrômicos e não-sindrômicos, familiais e esporádicos. Participaram do grupo controle 20 indivíduos sem história familial de fenda em três gerações. Todos os indivíduos portadores de FOT foram previamente avaliados por um médico geneticista e por exame de cariótipo em linfócitos, sendo dois casos detectados com aberrações cromossômicas. A análise de alterações no número de cópias de segmentos de DNA (Copy Number Variation, CNVs) por hibridação genômica em arrays (aGH), baseada na comparação com grupo controle, apontou um novo gene de candidato para FOT, o gene TCEB3, e identificou uma duplicação no gene FGFR1. Em um paciente com fenda palatal submucosa e quadro sindrômico, a utilização da técnica de aGH, em conjunto à hibridação in situ fluorescente (FISH) e Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA), possibilitou a caracterização da aberração cromossômica detectada pelo cariótipo. Em todos os portadores de FOT também foi realizado sequenciamento direto dos genes IRF6, FOXE1, GLI2, MSX2, SKI, SATB2, SPRY1, MSX1, FGF8, FGFR1; em um paciente específico, foi avaliado o gene P63. Alterações de sequencia inéditas foram encontradas nos genes FOXE1, MSX1, GLI2 e FGF8, assim como uma inserção no gene P63, cujos efeitos na proteína codificada deverão ser confirmados em estudos futuros. Os resultados deste trabalho exemplificam a diversidade de fatores genéticos envolvidos na etiologia das FOTs e o desenho de estudo utilizado mostrou a eficácia do uso concomitante de diferentes abordagens investigativas neste grupo de defeitos congênitos / Abstract: Typical oral cleft (TOC) is a prevalent and heterogeneous group of congenital defects with multiple etiologies, which remain unknown in several cases. Population studies detected several genes related to TOC. An individualized investigation, involving different laboratorial tools at same time, is an approach that can contribute on the etiological characterization of the TOC. The aim of this study was to investigate genetic factors involved on TOC in a sample composed by 23 individuals (syndromic and non-syndromic; familial and sporadic cases). The control group included 20 individuals without TOC in three generations. All patients were previously evaluated by clinical geneticists and performed karyotype test that showed chromosomal aberrations in two cases. Copy number variation (CNV) investigation by genomic hibridization in arrays (aGH), based in a comparative to control group data, detected a new candidate gene to TOC (TCEB3), and identified a duplication affecting FGFR1 gene. In one patient with syndromic form of submucous cleft palate, the use of aGH technique, together with Fluorescent in situ hibridization (FISH) and Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), characterized the chromosomal aberration previously detected by karyotype. Direct sequencing of IRF6, FOXE1, GLI2, MSX2, SKI, SATB2, SPRY1, MSX1, FGF8 and FGFR1 genes was performed in all individuals; in a specific case, P63 gene was investigated. New sequence alterations were found in FOXE1, MSX1, GLI2 e FGF8 genes, as well as an insertion in P63 gene, which effects will be verified in futures studies. In conclusion, results here described reflect the diversity of genetic factors involved in the etiology of TOC and the type of study show the efficiency of the use of different techniques in the etiological investigation of this congenital defect / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas
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Avaliação da expressão gênica de marcadores inflamatórios em células mononucleares de pacientes com trombose venosa profunda / Evaluation of the genetic expression of inflammatory mediators in mononuclear cells from deep venous thrombosis patients

Bassora, Fernanda Dutra Santiago, 1982- 21 August 2018 (has links)
Orientador: Joyce Maria Annichino Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bassora_FernandaDutraSantiago_D.pdf: 2667928 bytes, checksum: 612538a2c5c4e4e33577d2303de3a9c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A trombose venosa é definida como a oclusão de um vaso do sistema venoso. Três fatores básicos para a formação de um trombo no interior dos vasos são: alteração do fluxo sangüíneo, da parede vascular e/ou dos elementos sangüíneos. A trombose venosa e a embolia pulmonar, que ocorre como uma complicação subseqüente representa uma causa importante de morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. A freqüência da trombose venosa foi estimada em aproximadamente 1/1000 na população em geral. Na maior parte dos casos existe uma tendência para trombose determinada pela presença de um fator causal herdado ou adquirida, ou pela interação desses fatores, bem como por variações genéticas que determinam alterações nos níveis das proteínas pró-coagulantes e anticoagulantes. Dados da literatura têm sugerido a associação de mecanismos inflamatórios com a fisiopatologia da trombose venosa profunda (TVP). Os monócitos, estimulados por citocinas ou endotoxinas, expressam fator tecidual, o maior indutor da coagulação sangüínea, e que também tem a função de sinalização para a mobilidade celular e vascular. Os leucócitos apresentam receptores capazes de ligar e ativar o fator X da coagulação, servindo como via alternativa para a formação de trombina. As plaquetas podem aderir ao endotélio intacto e através da liberação de mediadores e citocinas como interleucina (IL)-1 e Fator de necrose tumoral-a (TNF-a), induzindo a expressão de moléculas de adesão e fator tecidual pela célula endotelial. Com base nestes dados e considerando que a migração leucocitária é um dos principais eventos que caracterizam o processo inflamatório, justificamos a escolha de células mononucleares (monócitos e linfócitos) como células centrais do nosso estudo. Utilizando técnicas de separação de células mononucleares por centrifugação em gradiente de "Ficoll-Hypaque", extração do Ácido ribonucléico (RNA) total, hibridação em Ácido desoxiribonucléico complementar (cDNA) -Microarray, e validação usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR) avaliamos do perfil de expressão gênica de alguns mediadores inflamatórios nessas células e a possível relação com a trombose venosa. Neste trabalho, usando a tecnologia de Microarray encontramos 60 induzidos e 56 genes reprimidos diferencialmente expressos nos pacientes com TVP, estes genes que estavam relacionados à resposta imune, inflamação, proteólise e transcrição. Destes genes diferencialmente expressos, selecionamos nove relacionados com inflamação para validação usando a técnica de qRT-PCR. Destes, somente houve aumento de expressão do gene da caspase 4 (CASP4) nos pacientes com TVP, sendo que, esta diferença se manteve no subgrupo com TVP espontâneo. Neste mesmo subgrupo, também foi verificado o aumento da expressão no gene Elong factor 1, alpha 2(EEF1A2) / Abstract: Venous thrombosis is defined as a vessel occlusion of the venous system. Three basic factors for the formation of a thrombus inside the vessel are: changes in blood flow, vascular wall and / or blood elements. Venous thrombosis and pulmonary embolism, which occurs as a subsequent complication is a major cause of morbidity and mortality in hospitalized patients. The frequency of venous thrombosis was estimated to be approximately 1 / 1000 in the general population. In most cases there is a tendency for thrombosis determined by the presence of a causal factor inherited or acquired, or by the interaction of these factors, as well as genetic variations that determine changes in protein levels of procoagulants and anticoagulants. Literature data have suggested the association of inflammatory mechanisms in the pathophysiology of deep venous thrombosis (DVT). Monocytes, stimulated by cytokines or endotoxin, express tissue factor, the greater inducer of blood coagulation, and also have the function of signaling for cell motility and vascular. Leukocytes have receptors that can bind and activate coagulation factor X, serving as an alternative route for the formation of thrombin. Platelets can adhere to intact endothelium and through the release of mediators and cytokines such as interleukin (IL)-1 and Tumor necrosis factor-a (TNF-a), inducing expression of adhesion molecules and tissue factor by endothelial cells. Based on these data and considering that leukocyte migration is one of the main events that characterize the inflammatory process, we justify the choice of mononuclear cells (monocytes and lymphocytes) as the central cells of our study. Using techniques of separation of mononuclear cells by gradient centrifugation "Ficoll-Hypaque," extraction of total RNA, cDNA-Microarray hybridization, and validation using real time qPCR assessed the gene expression profile of some inflammatory mediators in these cells and the possible relationship with venous thrombosis. In this work using Microarray technology we found 60 genes upregulated and 56 downrelated differentially expressed in patients with DVT. Genes that were related to immune response, inflammation, proteolysis and transcription. Of these differentially expressed genes, we selected nine genes that were related with inflammation to validation using qRT- PCR technique. Just one of then, the caspase 4 (CASP4) genes was differentially increased in DVT patients, this increase kept in patients with spontaneous DVT and an increased of Elong factor 1, alpha 2 (EEF1A2) gene too / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas
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Análise da expressão gênica em resposta ao choque térmico e cádmio no fungo aquático Blastocladiella emersonii / Analysis of gene expression in response to cadmium and heat shock in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii

Raphaela de Castro Georg 01 December 2006 (has links)
Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.
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Análise da expressão gênica global durante a germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii / Globlal gene expression analysis during germination of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii

Silvia Maria Salem Izacc 04 April 2006 (has links)
Foi realizado um programa de seqüenciamento de cDNAs obtidos de bibliotecas da fase de germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii. Os dados gerados, em conjunto com o projeto de seqüenciamento de cDNAs da fase de esporulação do fungo, permitiram a descoberta de aproximadamente 4.900 genes diferentes de B. emersonii (Ribichich et al., 2005). Os genes putativos foram anotados e associados com as categorias funcionais descritas pelo Gene Ontology Consortium e encontram-se na base de dados http://www.blasto.iq.usp.br. O perfil de expressão dos genes foi avaliado por Northern digital e vários transcritos apresentaram perfil de expressão regulado durante a germinação. Numa segunda etapa deste trabalho, cerca de 3.600 genes putativos de B. emersonii foram arranjados em lâminas de vidro e empregados como sondas para a investigação da expressão gênica global em células de diferentes tempos após a indução da germinação. Analisamos ainda, as diferenças entre a germinação induzida em meio nutriente e a germinação em solução inorgânica, na qual os indutores efetivos da germinação foram adenina ou íons potássio. Na germinação em meio nutriente mais de 900 genes, cerca de 26% do total presente nos micro-arranjos, mostraram-se diferencialmente expressos em pelo menos um dos tempos analisados. Foram induzidos durante a germinação, principalmente, genes envolvidos no crescimento celular, incluindo biossíntese de proteínas, transcrição e ativação do metabolismo energético. No entanto, estes genes não foram induzidos quando a germinação ocorreu em solução inorgânica. Verificamos ainda que vários transcritos envolvidos com a percepção do meio extracelular e com a sinalização celular, codificando proteínas necessárias para disparar o programa de germinação, encontram-se presentes nos zoósporos. Além disso, observamos que alguns dos transcritos encontrados nos zoósporos foram reprimidos na germinação em meio nutriente, mas mantiveram níveis elevados de expressão quando a germinação foi feita em solução inorgânica, indicando que os nutrientes exercem um papel importante na regulação da expressão de determinados genes nesta fase do desenvolvimento. / We conducted large scale cDNA sequencing from libraries obtained using RNA from germinating cells of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Data obtained in this work, along with cDNAs from sporulating cells, lead to the discovery of nearly 4.900 different genes from B. emersonii (Ribichich et al., 2005). The putative genes were annotated and associated with the functional categories described by the Gene Ontology Consortium and are available at the web site http://www.blasto.iq.usp.br. The expression patterns of these genes were evaluated by digital Northern analysis and we detected several transcripts that presented expression profile regulated during germination. In a second approach, nearly 3.600 putative genes from B. emersonii were spotted into glass slides and used as probes to investigate the global gene expression pattern in cells isolated at different times after induction of germination. We also analyzed the differences between the germination triggered in nutrient medium and the germination in inorganic solution, in which the effective inducers of germination were either adenine or potassium ions. More than 900 genes were differentially expressed during germination in nutrient medium in at least one of the time points analyzed, which correspond to 26 % of the total genes in the microarrays. The genes induced during this process were mainly those involved in cellular growth, including protein biosynthesis, transcription and energetic metabolism. However, these genes were not induced when germination occurred in inorganic solution. In addition, we verified that many transcripts involved in sensing the environment and also in signal transduction, encoding proteins necessary to trigger the germination program, were present in the zoospores. Another finding is that some of the transcripts found in zoospores were repressed when germination proceeded in nutrient medium, but were maintained at high levels when germination occurred in inorganic solution, suggesting that nutrients exert an important role in regulating the expression of some genes in this stage of development.
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Análise estrutural e funcional do genoma de Xanthomonas axonopodis pv. citri / Structural and functional analyses of Xanthomonas axonopodis pv. citri genome

Moreira, Leandro Marcio 11 October 2006 (has links)
O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.
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Perfil de expressão de genes modulados pela amilina em ilhotas pancreáticas de rato / Gene expression profile of genes modulated by amylin in rat pancreatic islets

Oliveira, Leonardo Sokolnik de 04 March 2009 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.
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Identificação e análise da expressão de genes relacioanados com tolerância à seca em soja através de microarranjos de DNA e PCR em tempo real /

Stolf, Renata. January 2007 (has links)
Resumo: A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em "chips" contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in "chips" containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below) / Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Coorientador: Alexandre Lima Nepomuceno / Banca: Ricardo Vilela Abdelnoor / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Francismar Corrêa Marcelino / Banca: João Martins Pizauro Junior / Doutor
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Perfil de expressão de genes modulados pela amilina em ilhotas pancreáticas de rato / Gene expression profile of genes modulated by amylin in rat pancreatic islets

Leonardo Sokolnik de Oliveira 04 March 2009 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.
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Genotipagem de grupos sanguíneos no suporte transfusional para pacientes com anemia falciforme / Blood group genotyping in transfusion support for sickle cell disease patients

Costa, Daiane Cobianchi da 18 August 2018 (has links)
Orientador: Lilian Maria de Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T03:42:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DaianeCobianchida_M.pdf: 4109266 bytes, checksum: 1d98746f4512e5faa380195b1b0b9c99 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala pela técnica de "microarray" tem se mostrado importante para doadores e pacientes, pois permite a determinação simultânea de múltiplos alelos que codificam antígenos de grupos sanguíneos e pode contribuir para a seleção mais exata de unidades de sangue compatíveis para pacientes politransfundidos. Neste trabalho, avaliamos a utilização da genotipagem em larga escala em 283 amostras de DNA de pacientes falciformes e, em 504 amostras de DNA de doadores de sangue pela plataforma HEA BeadChipTM na seleção de doadores fenótipo compatíveis em 4 níveis de compatibilidade de antígenos de grupos sanguíneos. Com o auxílio de um software e considerando que todos os doadores eram do grupo sanguíneo O, fomos capazes de encontrar um número significativo de doadores de sangue antígeno-negativo para pacientes aloimunizados e não aloimunizados quando buscamos por compatibilidade Nível 1 (ABO, D e um aloanticorpo) e Nível 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1). Em Nível 1 encontramos uma média de 482 doadores compatíveis e em Nível 2 uma média de 237 doadores compatíveis. Entretanto, a média de doadores compatíveis Nível 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) foi de 75 e, Nível 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb) foi de 31. Além disto, realizamos compatibilidade genética para 35 pacientes com as amostras de DNA dos pacientes e das unidades de sangue compatibilizadas para eles por técnicas sorológicas. Vinte e hum pacientes apresentaram discrepâncias para vários antígenos entre o seu perfil antigênico e as unidades de sangue sorológicamente compatibilizadas para eles, o que demonstra que as técnicas moleculares são superiores às técnicas sorológicas na identificação de unidades de sangue compatíveis para estes pacientes / Abstract: DNA arrays, with their high-throughput capability are particularly suited for mass screening donors because they permit the simultaneous determination of multiple alleles encoding RBC antigens and can facilitate the provision of more extensively matched blood for patients. Based on this we evaluated the usefulness of DNA array technology to provide a means to precisely genotype match donor blood units to the antigen-negative type of patients with SCD. We searched for compatible units for 283 SCD patients performing extended human erythrocyte antigen (xHEA) typing on the patient samples and on 504 donor samples. The degree of matching was determined at 4 increasingly stringent levels of compatibility. Using a special software, we were able to find 482 compatible donors for Level 1 (ABO, D and 1 Antibody) , 237 for Level 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1), 75 for Level 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) and 31 for Level 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb). We also investigated antigen-match RBC units with 35 recipients using blood group genotypes at the 4 levels of matching stringency. Units selected were serologically matched to the patients based on their ABO, Rh and K phenotypes and presence of antibody (ies). Twenty-one from 35 SCD patients presented discrepancies or mismatches for multiple antigens between their xHEA antigen profile and the blood units antigen profile serologically matched for them. According to these results we were able to find a better match for the patients in our extended HEA (xHEA)-typed units, and in the majority of cases the degree of matching was enhanced and the patients benefit to receive the transfusions as shown by better in vivo RBCs survival. DNA array based blood grouping typing of donors and patients showed to be a cost-effective procedure and has demonstrated improvements in SCD patients care facilitating their transfusion support and preventing the alloimmunization and hemolytic transfusion reactions / Mestrado / Ciencias Medicas / Mestre em Clinica Medica
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Análise do microtranscritoma em variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) submetidas a estresse hídrico / Microtranscriptome analysis of sugarcane (Saccharum spp.) cultivars under drought stress

Mattos, Raphael de Souza 18 August 2018 (has links)
Orientador: Marcelo Menossi Teixeira, Andréa Akemi Hoshino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T07:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattos_RaphaeldeSouza_M.pdf: 5526068 bytes, checksum: 090cb9f141a5a7dd324df049c18bf9c1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A cana-de-açúcar é uma das mais importantes espécies vegetais cultiváveis do mundo, sendo o Brasil o principal produtor. É uma fonte eficiente e de baixo custo para a obtenção de açúcar e etanol, que é considerado o mais promissor substituto do petróleo como fonte de energia a médio prazo, especialmente nos transportes. A seca é um dos principais estresses que reduzem a produtividade da cana e a produção de variedades tolerantes não só representa ganhos econômicos como contribui para a sustentabilidade dos canaviais. Embora a base genética da tolerância à seca ainda seja pouco conhecida, variedades desenvolvidas em programas de melhoramento tem apresentado progresso, apesar do ritmo ser mais lento que o desejado. Genômica funcional e desenvolvimento de marcadores colaboram aumentando a eficiência do melhoramento tradicional, mas ainda existem elementos do genoma que podem ser aproveitados de novas formas. Foram descobertos recentemente genes de função regulatória chamados microRNAs (miRNA) que também desempenham um papel na adaptação de plantas a diferentes estresses. Utilizando ESTs de cana-de-açúcar, sequenciamento de nova geração e microarranjos para avaliar a expressão de miRNAs sobre estresse hídrico foram descobertos novos miRNAs associados à seca e possíveis genes de miRNAs ligados à tolerância a este tipo de estresse / Abstract: Sugarcane (Saccharum spp.) is amongst the most relevant crops in the world and Brazil is the most prominent producer. It is an inexpensive and efficient source for commodities such as sugar and ethanol, the latter being increasingly considered the most promising immediate energy source substitute for oil, mainly in transportation. Apart from being very productive, it is largely affected by stress-related yield losses, notably from abiotic triggers. Drought stress is determinant for every crop field, and this is true for sugarcane as well. Although the molecular basis drought stress tolerance lacks further elucidation, newly developed cultivars have successfully reduced yield loss due to water shortage, albeit not at the desirable pace. Functional genomics and molecular markers development assist new cultivar selection programs by identifying and locating agronomically relevant alleles and QTL's, but there are other elements in the genome which can provide new ways to approach crop field improvement. The recently discovered microRNAs (miRNA) are regulatory genes found to have an important role in plants adaptation under different kinds of stresses. By using sugarcane ESTs, deep-sequencing and microarray technology to access stress induced miRNA expression, we have found novel sugarcane miRNA participating in the drought stress response and identified possible tolerance related miRNA genes / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

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