O uso das águas costeiras para fins recreacionais está associado com benefícios à saúde e bem-estar, todavia eventuais impactos negativos podem diminuir estes benefícios. Esses usos variam de acordo com o tipo de atividade desenvolvida, sendo que a recreação de contato primário requer contato direto e prolongado com a água, durante a qual pode ocorrer ingestão acidental. A Resolução CONAMA nº 274/2000 dispõe sobre os critérios de balneabilidade e reza que as condições da qualidade das águas recreacionais devem ser avaliadas através de indicadores microbiológicos de contaminação fecal, e ainda recomenda que seja realizada pesquisa de organismos patogênicos em praias sistematicamente impróprias. Dada a escassez de dados da ocorrência de patógenos em águas costeiras, no período de 2010 a 2012, a CETESB realizou o Estudo de microrganismos patogênicos nas praias do Litoral Paulista pesquisando enterovírus, adenovírus, vírus da hepatite A, Cryptosporidium sp e Giardia sp, no intuito de preencher esta lacuna e gerar dados primários. Assim, o objetivo deste trabalho foi estimar a probabilidade de infecção por Cryptosporidium sp e Giardia sp após exposição a águas recreacionais costeiras usando como ferramenta a Avaliação Quantitativa de Risco Microbiológico (AQRM), como também o risco de doença. As concentrações de (oo)cistos nas águas das praias são oriundas dos relatórios de Qualidade das Praias Litorâneas no Estado de São Paulo da CETESB dos anos de 2011 e 2012. Nesse período foram analisadas 203 amostras coletadas de 12 praias na 1ª fase e de cinco praias na 2ª fase para a pesquisa de ocorrência de (oo)cistos. As amostras de água foram coletadas na isóbata de um metro, com frequência mensal. Giardia sp foi o microrganismo mais frequente, presente em 43 por cento das amostras e Cryptosporidium sp em 13 por cento . O cenário de exposição considerou tipos de atividade, tipos de usuários (crianças, adultos e esportistas), concentração de (oo)cistos, volume de ingestão, duração e frequência da exposição. A probabilidade de infecção foi maior em praias com mais amostras positivas para oocistos e cistos, no grupo dos esportistas e para Giardia sp. Em alguns casos os valores de risco de doença ultrapassaram o risco tolerável pela U.S. EPA (2012) de 3,6 por cento casos de gastroenterite, assim como ultrapassaram os resultados de incidência acumulada encontradas por LAMPARELLI et al. (2015). Os resultados apontaram a necessidade de melhoria nos sistemas de tratamento de efluentes no Litoral Paulista. A AQRM é uma ferramenta capaz de estimar a probabilidade de infecção no cenário das águas recreacionais e pode auxiliar no gerenciamento dos riscos. / The use of coastal water for recreational purposes has been associated with benefits to health and well-being; however some negative impacts can diminish such benefits. The usages can vary according to the type of activity but the primary contact demands physical contact resulting in a high probability in accidental ingestion of water. Brazilian legislation for coastal recreational waters CONAMA 274/2000 establishes criteria for fecal indicator bacteria and furthermore recommends investigation of pathogenic organisms for beaches which classification is systematically as improper. Given the scarcity of data referring to pathogenic presence in beaches´ waters, CETESB carried out a study, in 2010 and 2012, for quantifying enterovirus, adenovirus, hepatitis A virus, Cryptosporidium sp and Giardia sp in coastal waters of São Paulo state in order to obtain data about their occurrence of these pathogens in coastal waters. The objective of this study was to estimate the annual risk of infection and disease for Giardia sp and Cryptosporidium sp by ingestion of water during primary contact recreation using QMRA approach. Concentrations of both parasites were taken from the annual report entitled Quality of coastal beaches in São Paulo state by CETESB (2011 and 2012). In these years were analyzed 203 samples of water for quantifying (oo)cysts of Giardia and Cryptosporidium from 12 beaches in the first year and five beaches in the second year of research. The samples were collected at one meter isobaths, with monthly frequency. Giardia was the most frequent parasite present in 43 per cent of samples and Cryptosporidium sp in 13 per cent . Exposure scenario was built considering types of activity, beach goers (children, adults and athletes), concentration of parasites, ingestion rate, duration and frequency of exposure. The probability of annual infection was higher in beaches in which there were more positive results for parasites for athletes and for Giardia infection. The tolerable risk for gastroenteritis by USEPA, which is 3.6 per cent , was overpassed in some cases. Though the results found in this study overpassed the cumulative incidence reported by LAMPARELLI et al. (2015). The results indicate the need for improvements in wastewater treatment systems in the coastal area of São Paulo. As QMRA is a tool capable in estimating the probability of infection it can help to highlight crucial issues in risk management.

O princípio do ensaio turbidimétrico é simples: a solução-teste é adicionada à suspensão do microrganismo-teste em meio de cultura, a mistura é incubada em condições adequadas e o crescimento microbiano é medido através da leitura fotométrica. O emprego de método de microplacas com leitura cínética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizados. O objetivo deste trabalho é determinar as condições experimentais ideais para o desenvolvimento de metodologia para a dosagem microbiológica de apramicina empregando microplacas e modo de leitura cinético, e validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, limite de detecção e quantificação, exatidão e precisão. As condições estabelecidas abrangem curva-padrão de apramicina com concentrações entre 5 e 35 µg/ml, e emprego de meio de cultura caldo de triptona-soja inoculado com Escherichia coli (ATCC 8739) na proporção de 5%. Foram obtidos resultados satisfatórios após 2 horas de incubação. O método desenvolvido apresentou especificidade e seletividade adequadas, linearidade na faixa de 5 a 35 µg/ml, limite de detecção e quantificação de 0,1 e 0,4 µg/ml, respectivamente, exatidão (recuperação = 98,5%) e precisão (DPR = 6,0%) satisfatórias. O ensaio em microplaca agrega características dos ensaios microbiológicos (avaliação da atividade do antibiótico frente a microrganismo-teste sensível) e físico-químicos (facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultdos). / The turbidimetric assay principle is simple: the test-solution is added to a suspension of test-microorganism in culture media, the mixture is incubated in appropriate conditions and the microbial growth is measured by photometric reading. Microplate with kinetic reading mode employed in antibiotic assay is considerable interesting, once it allows reduction of material and analysis time and it permits that a great numbers of samples could be analyzed simultaneously, with automated reading and calculating. The aim of this work is to determinate best experimental conditions to development of methodology for microbiological assay of apramycin employing microplate and kinetic reading mode, and to validate the developed method, through evaluation of parameters of specificity and selectivity, linearity, linear range, limit of detection and quantification, accuracy and precision. Established conditions considered standard-curve of apramycin in concentrations from 5 to 35 µg/ml, and tryptic soy broth inoculated with 5% of Escherichia coli (ATCC 8739) suspension. Satisfactory results were obtained with 2 hours incubation. The developed method showed appropriate specificity and selectivity, linearity in the range from 5 to 35 µg/ml, limit of detection and quantification of 0,1 and 0,4 µg/ml, respectively, satisfactory accuracy (recuperation = 98,5%) and precision (RSD = 6,0%). Microplate assay considered characteristics of microbiological assay (evaluation of antibiotic activity against sensible test-microorganism) and physical-chemistry (operational facility and quicker results).

Intestinal parasites are a problem of great public health importance. Both in rural areas as in urban areas, they are widespread due to poor sanitation and irrigation water is one of the major intestinal diseases transmission vehicles. We evaluated the prevalence of intestinal parasites in children aged 7 to 11, from a public school in Maceio, through parasitological examination of Lutz, popularly known as HPJ in two steps (with and without drug treatment) investigating whether there influence of sanitation and socioeconomic and environmental conditions. After preventive education and adequate pharmacological treatment, repeated parasitology and the physical analysis, chemical (titration of complexation and Argentometric - Alfakit/Ecokit) and microbial by the Technical Multiple tubes of water. It was the prevalence of Giardia lamblia and Ascaris lumbricoides in 59.25% of the positive samples. After preventive education and adequate pharmacological treatment the prevalence of intestinal parasites was statistically significant (p <0.05), being effective in reducing the degree of parasitism in the period. The water distributed for consumption at the Municipal School Rui Palmeira is not within the potability standards required by Brazilian law. The concentration of residual chlorine and the presence of fecal coliform leaves unsuitable for consumption. The study showed that not enough only minimum conditions of sanitation and public policy of urban and housing planning must also be encouraged educational practices of tutoring to raise awareness of the need to acquire the knowledge to prevent parasites. / As parasitoses intestinais representam um problema de grande importância em Saúde Pública. Tanto nas áreas rurais quanto nas urbanas, elas são amplamente difundidas devido às más condições sanitárias, sendo a água um dos principais veículos de transmissão de enfermidades intestinais. Avaliou-se a prevalência de enteroparasitos em crianças em idade entre 7 e 11 anos, de uma escola pública de Maceió, por meio de exame parasitológico de Lutz, conhecido popularmente como HPJ, em duas etapas (sem e com tratamento farmacológico) investigando se existe influência do saneamento básico e das condições socioeconômica e ambiental. Após educação preventiva e tratamento farmacológico adequado, repetiu-se o exame parasitológico bem como as análises físico, química (Titulação de complexação e argentimétrica – Alfakit/Ecokit) e microbiológica, pela Técnica dos Tubos Múltiplos da água. Verificou- se a prevalência de Giárdia lamblia e Ascaris lumbricoides em 59,25% das amostras positivas. Após educação preventiva e tratamento farmacológico adequado a prevalência de enteroparasitos foi estatisticamente significativa (p<0,05), sendo eficaz para reduzir o grau de parasitismo no período. A água distribuída para consumo na Escola Municipal Rui Palmeira não se apresenta dentro dos padrões de potabilidade exigidos pela legislação brasileira. A concentração de cloro residual e a presença de coliformes termotolerantes a deixa inadequada para o consumo. O estudo evidenciou que não bastam apenas mínimas condições de saneamento básico e políticas públicas de planejamento urbano e habitacional, há também que se incentivar práticas educacionais de orientação pedagógica para a conscientização da necessidade de adquirirem os conhecimentos para prevenção de parasitoses.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:55:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 3.pdf: 1209769 bytes, checksum: 5ca426f3d62b4023c66df6040fc8d22e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Atualmente é notório o crescimento da Gestão da Qualidade e, com esta, desenvolvem-se também as Boas Práticas de Fabricação e Controle, que são ferramentas que auxiliam na obtenção de produtos de qualidade. Ao falar de qualidade na indústria farmacêutica, fala-se, sobretudo da qualidade físico-química e microbiológica tanto das matérias-primas empregadas na fabricação como do produto terminado obtido após as diversas etapas produtivas. Com objetivo de alcançar esta qualidade este projeto buscou verificar as metodologias empregadas no dia a dia da Divisão de Controle de Especificação do Laboratório Farmacêutico da Marinha (LFM). As técnicas empregadas no controle microbiológico, em sua maioria, são as mesmas, consistindo na realização do ensaio limite (contagem de micro-organismos) e na pesquisa e identificação de patógenos. No entanto deve-se verificar se o produto analisado não afeta o crescimento microbiano, inibindo-o e fazendo com que se tenha resultados falso-negativos, o que acarretaria em desvios da qualidade podendo levar a danos para a saúde do usuário e prejuízos para a imagem da Instituição. Elegeram-se as seguintes formulações, todas de uso oral, para serem avaliadas: aciclovir 200 mg comprimidos, isoniazida 100 mg comprimidos, pirazinamida 500 mg comprimidos, ofloxacino 400 mg comprimidos, pirazinamida suspensão 3%, bromexina xarope, prednisona 5 mg comprimidos e complexo vitamínico e minerais comprimidos. Estas formulações foram avaliadas frente às cepas de referência, conforme procedimentos preconizados pela Farmacopeia Brasileira 5ª Ed. Durante o ensaio verificou-se que todas as formulações, exceto o aciclovir e a pirazinamida suspensão, inibiram o crescimento das cepas testadas. Foram testados métodos de neutralização da atividade inibitória do crescimento microbiano, tendo sido selecionados os seguintes procedimentos: diluição para as formulações de isoniazida 100 mg, prednisona 5 mg e complexo vitamínico, uso de neutralizante, polissorbato 80, para bromexina xarope e filtração por membrana para pirazinamida 500 mg comprimidos, logrando-se êxito para o ensaio do limite. Somente para o ofloxacino não foi possível recuperar os micro-organismos e no caso da pirazinamida comprimidos, a mesma não foi susceptível à pesquisa de Escherichia coli, nas condições preconizadas pela Farmacopeia Brasileira 5ª Ed. O presente trabalho identificou que das oito formulações testadas, seis inibem o crescimento microbiano e, portanto interferem na análise. Após adequações, os métodos responderam aos testes e foram desta forma considerados validados, podendo ser utilizados de forma segura na rotina do laboratório. / Nowadays it is remarkable the development of the Quality Management, together with it the Good Manufacturing Practices and Control, which are tools that help to afford products with high quality. Concerning to quality issues in the Pharmaceutical Industry, the main objective is to achieve high physical-chemical and microbiological quality of the raw materials used for manufacturing, as well of the final product after the several processing steps. Aiming to succeed in attaining this quality parameter, this project has attempted to verify the methodologies daily employed by the Specification Control Division of Brazilian Navy Pharmacautical Laboratory (LFM). The techniques employed for the microbiological quality control are usually the same, and consist of performing the limit assay (microorganism counting) and the search and identification of pathogens. Nevertheless, it must be checked if the product under analysis does not affect the microbial growth, causing an inhibition and leading to false-negative results, which might drive to quality deviance, ultimately harming the final user and bringing damage to the institution image. In this project, the following oral formulations have been selected to be evaluated: aciclovir 200 mg tablets, isoniazid 100 mg tablets, pyrazinamide 500mg tablets, ofloxacin 400 mg tablets, pyrazinamide 3% suspension, bromexine syrup, prednisone 5 mg tablets and tablets containing vitamin complex and minerals. These formulations have been evaluated against the growth of reference strains, in accordance to the procedures described in the Brazilian Pharmacopeia 5th Edition. During the assay, it has been found all formulations, exemption given to aciclovir and pyrazinamide suspension, inhibited the growth of the assayed strains. Methods for neutralizing the microbial growth inhibition activity have been assessed and the selected procedures were: diluition for isoniazid 100mg, prednisone 5 mg and vitamin complex; use of the neutralizer polysorbate 80 for bromexine syrup; and membrane filtration for pyrazinamide 500 mg tablets, which allowed the recovery of all microorganisms. Only for ofloxacin it was not possible to recover the microorganisms and for pyrazinamide tablets, the formulation was not susceptible to the Escherichia coli assay, pursuant to the Brazilian Pharmacopeia 5th Edition. The present study has identified that six out of the eight assayed formulations have inhibited microbial growth, therefore interfering in the analysis outcome . After adjustments, the methods have trustworthy worked and were thus considered validated, and now can be applied safely in the laboratory's routine.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 7.pdf: 2671790 bytes, checksum: 3ea789720d5aa831716c6bfe2ca4f9b6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Instituto de Tecnologia em Fármacos (Farmanguinhos), unidade técnico-científica da Fundação Oswaldo Cruz, representa o maior laboratório farmacêutico oficial vinculado ao Ministério da Saúde brasileiro responsável pela produção de mais de um bilhão de medicamentos por ano. As legislações sanitárias vigentes definem que devem ser utilizadas instalações segregadas e dedicadas para a produção de medicamentos, como penicilinas, minimizando os riscos de contaminação cruzada, que consequentemente possam gerar danos à saúde. Por isso, Farmanguinhos possui, atualmente, uma área dedicada à produção de amoxicilina, assim como o sistema gerador de água purificada, que atende à referida fabricação, também é dedicado à mesma. A água é a matéria-prima de mais elevado volume empregada na produção farmacêutica, exercendo profundo impacto na qualidade do produto e na segurança do paciente. O controle microbiológico da qualidade da água utilizada em processos farmacêuticos torna-se fundamental, já que micro-organismos podem sobreviver e proliferar em sistemas de água, tornando-se fontes de contaminação microbiana e pirogênica. A identificação destes micro-organismos e as informações obtidas sobre os mesmos podem ser extremamente úteis na identificação da fonte de contaminação microbiana de um produto ou processo, alem de direcionar ações corretivas, se necessário. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade microbiana presente em sistema gerador de água purificada, dedicado à produção de penicilínicos, de Farmanguinhos. Para isto, as amostras de água coletadas a partir do ponto de entrada, ponto de água potável, e do ponto de saída do sistema, ponto de água purificada, foram analisadas microbiologicamente quanto à contagem de micro-organismos mesófilos e quanto à presença de patógenos: Escherichia coli; coliformes totais e Pseudomonas aeruginosa. As amostras foram analisadas entre janeiro e maio de 2013. Todas as colônias obtidas foram isoladas e submetidas à identificação, através de equipamento MALDI-TOF. Não foram observados resultados acima da especificação para ambos os pontos, no período analisado. Do ponto de água potável foram isoladas apenas três espécies bacterianas: Bacillus cereus, Delftia acidovorans e Acinetobacter sp. Uma diversidade microbiana maior foi isolada a partir do ponto de água purificada, como: Burkholderia sp, Delftia acidovorans, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Pseudomonas oryzihabitans e Pseudomonas putida. A espécie Delftia acidovorans, associada a fenômenos de biocorrosão foi o micro-organismo mais encontrado, sendo identificado em cerca de 1/3 do total de isolados. O sistema de água de Farmanguinhos é sanitizado mensalmente com sanitizante à base de glutaraldeído. Pode-se concluir que a sanitização está sendo eficiente para manter a contagem total de micro-organismos mesófilos dentro dos limites especificados. No entanto, algumas ações podem ser tomadas para evitar a presença de biofilmes, o que aprimorará ainda mais a qualidade da água purificada gerada. / The Instituto de Tecnologia em Fármacos (Farmaguinhos), technical- scientific unit of Fundação Oswaldo Cruz, is the largest official pharmaceutical laboratory under the Brazilian Ministry of Health responsible for producing more than one billion drugs per year. The current sanitary laws define that segregated facilities must be dedicated and used for the production of drugs such as penicillin, thus the risk of serious damage to health, due to crosscontamination, can be minimized. Because of this, Farmanguinhos has a dedicated production of amoxicillin, as well as a purified water generator system that caters to such manufacturing is also dedicated to this area. Water is the raw material of the highest volume used in pharmaceutical production so that it has a profound impact on the product quality and patient safety. Therefore, the microbiological quality control of water used in pharmaceutical processes becomes crucial, since microorganisms can survive and proliferate in water systems, becoming sources of microbial and pyrogenic contamination. The identification of these microorganisms and the information obtained about them can be extremely useful in identifying the source of microbial contamination of a product or process, in addition to direct corrective actions, if necessary. The objective of this study was to evaluate the microbial diversity present in the purified water generator system, dedicated to the area of manufacturing penicillin-based drugs of Farmanguinhos. To aim this objective, water samples collected from the entry point of the system, point of drinking water, and the point of departure, point of purified water, were analyzed microbiologically for the count of mesophilic and for the presence of pathogens: Escherichia coli; coliforms and Pseudomonas aeruginosa, respectively. The samples were analyzed between January and May of 2013. All colonies obtained were isolated and subjected to identification by MALDI - TOF equipment. No results above specification for both points were observed in the analyzed period. From the point of drinking water only three bacterial species were isolated: Bacillus cereus, Acinetobacter sp and Delftia acidorovans. A higher microbial diversity was observed from the purified water source, such as Burkholderia sp, Delftia acidovorans, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Pseudomonas putida and Pseudomonas oryzihabitans. The species Delftia acidovorans associated with biocorrosion phenomena was the microorganism most frequently found and was identified in about 1/3 of the total isolates. The water system of Farmaguinhos water is sanitized monthly with sanitizing agent comprising glutaraldehyde. It can be concluded that sanitization is being effective to maintain the total count of mesophilic within the specified limits. However, some actions can be taken to avoid the presence of biofilms, which will improve even more the quality of purified water generated.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work presents the development and validation of analytical methods to assay daptomycin injection. Daptomycin is a drug of a new class of antibiotics, known as cyclic lipopeptides. It was approved in USA in 2003 and in Brazil in 2009. Up to now, there are no reports about methods to assay the drug in pharmaceutical products, both in scientific literature or in official compendia. Methods to identify daptomycin in raw material were realized as solubility, melting point, infrared spectrophotometry (IR), ultraviolet spectrophotometry (UV) and differential scanning calorimetry (DSC) and they showed appropriate results. The following methods to assay daptomycin injection were developed and validated: high performance liquid chromatography (HPLC), microbiological assay (turbidimetric) and UV-spectrophotometry. All of them were validated according current guidelines, by the following parameters: specificity, linearity, precision, accuracy and robustness, being all the requirements met. The mean values of daptomycin assay by the three methods were: 100,23 ± 0,59% (HPLC); 100,96 ± 2,58% (turbidimetric assay) and 98,98 ± 1,35% (UV-spectrophotometry). They were compared by ANOVA, which indicated that HPLC and turbidimetric assay are interchangeable. The stress testing showed that daptomycin is very susceptible to alkaline medium and that the degradation follows first order kinetic, in the conditions adopted. It was found that the degradation product(s) of daptomycin do not have antimicrobial activity. Considering their characteristics, HPLC and turbidimetric assays can be used in routine quality control and in stability studies of daptomycin injection. / Este trabalho apresenta o desenvolvimento e validação de métodos analíticos para o doseamento da daptomicina injetável. A daptomicina é um antibiótico pertencente a uma nova classe de antimicrobianos, conhecidos como lipopeptídeos cíclicos. Foi aprovada para comercialização nos Estado Unidos em 2003 e no Brasil em 2009. Até o momento, não foram relatados métodos de quantificação para o fármaco em produtos farmacêuticos, tanto na literatura científica quanto em compêndios oficiais. Foram realizados métodos para a caracterização da matéria-prima como solubilidade, ponto de fusão, espectrofotometria no infravermelho (IV) e na região do ultravioleta (UV) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), sendo que os mesmos permitiram a identificação do fármaco na matéria-prima. Os seguintes métodos para análise quantitativa da daptomicina injetável foram desenvolvidos e validados: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), ensaio microbiológico (método turbidimétrico) e espectrofotometria na região do UV. Todos os métodos foram validados de acordo com as guias vigentes, frente aos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez, tendo sido atendidos os requisitos estabelecidos. Os teores médios de daptomicina na formulação em estudo, pelos métodos desenvolvidos (n=12/método) foram: 100,23 ± 0,59% (CLAE); 100,96 ± 2,58% (ensaio microbiológico) e 98,98 ± 1,35% (espectrofotometria no UV). Esses resultados foram comparados pelo teste de ANOVA, que indicou que os métodos de CLAE e microbiológico são intercambiáveis. Pelo estudo de degradação forçada verificou-se que a condição que induz à maior degradação do fármaco é o meio alcalino, sendo que a reação segue cinética de primeira ordem nas condições usadas. Constatou-se ainda que a amostra degradada da daptomicina não tem ação antimicrobiana. Pelas suas características, os métodos de CLAE e microbiológico podem sem usados no controle de qualidade de rotina e em estudos de estabilidade da formulação injetável de daptomicina.

Vem se verificando uma crescente preocupação por parte de diversos países e de órgãos internacionais de saúde e conservação animais quanto à necessidade de monitoramento da ocorrência e da distribuição de enfermidades infecciosas em populações de animais silvestres, devido ao potencial destas doenças de causarem impacto na dinâmica e conservação de espécies silvestres, na saúde dos animais domésticos e na saúde pública. A ocorrência de brucelose vem sendo relatada em diversas espécies de mamíferos marinhos, em vários centros de pesquisa no mundo, contudo, não há dados na literatura científica sobre a ocorrência desta infecção em mamíferos aquáticos fluviais brasileiros. Nos cetáceos, a brucelose é causada pela Brucella ceti, sendo associada a problemas reprodutivos, quadros de meningoencefalite e infecções em tecidos linfóides. Assim, o presente trabalho teve como objetivo pesquisar a ocorrência de infecção por Brucella spp. em botos-vermelhos de vida livre da Amazônia (Inia geoffrensis), procedentes da Reserva de Desenvolvimento Sustentável de Mamirauá, Tefé, Amazonas, Brasil. A pesquisa foi realizada em animais de vida livre, de ambos os sexos e várias idades, sendo realizadas duas expedições para colheita de amostras, nos anos de 2010 e 2011. De cada animal foram coletadas amostras de sangue, leite e suabes genital, anal, nasal, oral e de eventuais lesões cutâneas apresentadas. Um total de 161 animais foi capturado. A detecção de anticorpos séricos anti-Brucella foi realizada utilizando-se as provas de soroaglutinação com antígeno acidificado tamponado (AAT), teste do 2-mercaptoetanol (2-ME) e o teste de polarização fluorescente (PF). As amostras de leite e de suabes foram submetidos ao cultivo microbiológico e à reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção direta de Brucella spp. As colônias bacterianas que apresentaram características morfológicas compatíveis com Brucella spp. foram identificadas pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se os primers específicos para detecção do gênero Brucella, direcionados ao DNA codificador da região interespaçadora do RNA ribossomal de Brucella (PCR-ITS). As amostras que apresentaram resultados positivos, foram caracterizadas quanto ao gene recA pela amplificação (PCR-recA) e posterior sequenciamento do produto amplificado. A PCR-ITS também foi empregada para o diagnóstico direto das infecções por Brucella spp. nas amostras de sangue, leite e suabes, as quais foram caracterizadas da mesma forma que as colônias bacterianas isoladas. As 67 amostras de soros colhidas apresentaram resultados negativos nos testes de AAT, PF e IDGA. Das 369 amostras submetidas ao cultivo microbiológico, duas amostras de suabe apresentaram características compatíveis com o gênero Brucella e resultados positivos pela PCR-ITS. Uma delas foi identificada como pertencendo à espécie Ochrobactrum intermedium. A segunda amostra não pôde ser caracterizada por não ter sido obtida em cultura pura. Das 118 amostras de sangue total analisadas pela PCR-ITS, seis (7,08%) apresentaram resultados positivos. Das 248 amostras de suabes analisadas pela PCR-ITS, uma (0,4%) apresentou resultado positivo. Das 29 amostras de leite analisadas pela PCR-ITS, cinco (17,24%) apresentaram resultados positivos. Considerando os 128 animais amostrados, 11 (8,59%) apresentaram resultado positivo pela PCR-ITS em pelo menos uma amostra testada. Das 12 amostras biológicas que apresentaram resultados positivos pela PCR-ITS e foram submetidas à PCR-recA, apenas duas apresentaram o produto amplificado no tamanho esperado. De acodo com a análise filogenética utilizada, uma delas apresentou similaridade aos microrganismos Cellulomonas fimi, Cellulomonas flavigena e Cellvibrio gilvus. A segunda amostra foi agrupada juntamente com as bactérias Propionicimonas paludicola, Micropruina glycogenica, Naumannella halotolerans e Propionibacterium propionicum com maior proximidade com a espécie P. propionicum. De acordo com os resultados apresentados, não foi evidenciada a ocorrência de infecções por Brucella spp. na população amostrada pelos métodos sorológicos e microbiológicos. Foi isolada uma estirpe de Ochrobactrum intermedium de um exemplar da espécie Inia geoffrensis, contudo, a importância sanitária destes resultados para esta espécie de boto não pôde ser determinada. / There is a growing concern among several countries and international institutions of animal health and conservation regarding the surveillance of infectious diseases in wildlife populations, because these infections may cause impact on the dynamics and conservation of wildlife species, as well as on the health of livestock and public health. Brucellosis has been reported in several species of marine mammals in various research centers worldwide. However, there is no data about the occurrence of brucellosis in aquatic mammals in Brazil. Brucellosis in cetacean is caused by Brucella ceti and has been associated to reproductive problems, meningoencephalitis and lymphoid tissues infections. The objective of this study was to investigate the occurrence of Brucella spp. infection in free living amazon river dolphin (Inia geoffrensis), from Mamirauá Sustainable Development Reserve, in Tefé municipality, Amazonas State, Brazil. Samples were collected from free-living animals from both sexes and different ages during two expeditions, in 2010 and 2011. Samples of serum, whole blood and milk as well as genital, anal, nasal, oral and cutaneous lesions swabs were collected. One hundred and sixty one animals were samples. Serodiagnosis was performed using the acidified buffered antigen test (ABAT), the 2-mercaptoethanol (2ME) test and the fluorescent polarization assay (FPA). Milk and swabs samples were submitted to microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR) to the direct diagnosis of Brucella spp. Bacterial colonies showing morphologies compatible with Brucella spp. were tested by a PCR using specific primers directed to the 16S-23S interpace region of the ribosomal DNA of Brucella (ITS-PCR). Samples with positive results by ITS-PCR were amplified using primers specific to the gene recA (PCR-recA), and the amplicon was sequenced. ITSPCR was also used to diagnosis of Brucella spp. infections directly in samples of blood, milk and swabs which were characterized as the bacterial colonies. All 67 serum samples were negative in the three serological tests used. Eleven of the 128 (8.59%) animals showed positive results by ITS-PCR in at least one biological sample. Of the 369 samples tested by microbiological culture, two had positive results in ITS-PCR. Accroding to the characterization of recA gene, one of them was identified as Ochrobactrum intermedium and the other sample could not be characterized because it was not isolated in pure culture. Of the 118 whole blood samples, six (7.08%) were positive by ITS-PCR. Five of the 248 (17.24%) milk samples and one of the 248 (0.4%) swab samples were positive by ITS-PCR. Of the 12 psoitive samples by ITS-PCR, only two were amplified by the recA-PCR and sequenced. According to the phylogenetic analysis, one sample clustered with Cellulomonas fimi, Cellulomonas flavigena e Cellvibrio gilvus group showing major similarity with C. fimi. The other sample clustered with the bacteria Propionicimonas paludicola, Micropruina glycogenica, Naumannella halotolerans, being more similar to Propionibacterium propionicum. An Ochrobactrum intermedium strain was isolated from a dolphin, however, the sanitary importance of the detection could not be determined.

A linezolida é um antibiótico oxazolidinona efetivo contra bactérias patogênicas gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus resistente a glicopeptídeos (GISA) e enterococci resistente a vancomicina (VRE). As oxazolidinonas inibem a translação bacteriana na fase de iniciação da síntese de proteínas, enquanto que a síntese de RNA e DNA não são afetadas. Diversos métodos por cromatografia líquida de alta-eficiência (HPLC) têm sido relatados para a determinação da concentração de linezolida em plasma humano, soro e urina. Entretanto, um número pequeno de métodos estão disponíveis para a determinação de linezolida em formulações farmacêuticas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos espectrofotométrico, de cromatografia líquida de ultraeficiência em fase reversa (RP-UPLC), doseamento microbiológico em placas e doseamento microbiológico rápido em microplacas com leitura cinética para a determinação de linezolida em soluções injetáveis e comprimidos. Adicionalmente, foram identificadas e quantificadas as principais fontes de incerteza relacionadas aos métodos. O desenvolvimento dos métodos utilizou uma abordagem racional, empregando-se planejamento de experimentos (análise fatorial e metodologia de superfície resposta) para otimização das condições analíticas. As fontes de incertezas foram identificadas empregando-se diagrama de Ishikawa e quantificadas conforme procedimento da Eurachem/Citac. Os métodos desenvolvidos apresentaram especificidade/seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez adequadas, conforme os critérios estabelecidos pelo ICH e ANVISA. A análise estatística demonstrou equivalência entre os resultados providos por cada um dos métodos, sendo intercambiáveis entre si. Portanto, os métodos podem ser empregados no controle de qualidade de rotina na indústria farmacêutica. / Linezolid is an oxazolidinone antibiotic effective against gram-positive pathogenic bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus (GISA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). Oxazolidinones inhibit bacterial translation at the initiation phase of protein synthesis, while RNA and DNA synthesis are not affected. Several high performance liquid chromatographic (HPLC) methods have been reported to determine the concentration of linezolid in human plasma, serum and urine. However, a few number of methods are available to determine the concentration of linezolid in pharmaceutical dosage forms. The aim of the present work was to develop and validate a spectrophotometric method, a reverse-phase ultra-high performance liquid chromatographic method, microbiological assay and microbiological rapid assay in microplates using kinetic reading for the determination of linezolid in injections and tablets dosage forms. In addition, the most important sources of uncertainty were identified and quantified for each method. A rational approach was used in the development of these methods, using design of experiments (factorial design and response surface methodology) for optimization of analytical conditions. The sources of uncertainties were identified using Ishikawa diagram and quantified as described in Eurachem/Citac procedure. The developed methods were specific/selective, linear, precise, accurate and robust, as required by ICH and ANVISA guidelines. Statistical analysis showed equivalence among the results provided by each method, being interchangeable. Thus, the methods may be employed in routine quality control analysis by pharmaceutical industry.

O princípio do ensaio turbidimétrico é simples: a solução-teste é adicionada à suspensão do microrganismo-teste em meio de cultura, a mistura é incubada em condições adequadas e o crescimento microbiano é medido através da leitura fotométrica. O emprego de método de microplacas com leitura cínética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizados. O objetivo deste trabalho é determinar as condições experimentais ideais para o desenvolvimento de metodologia para a dosagem microbiológica de apramicina empregando microplacas e modo de leitura cinético, e validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, limite de detecção e quantificação, exatidão e precisão. As condições estabelecidas abrangem curva-padrão de apramicina com concentrações entre 5 e 35 &#181;g/ml, e emprego de meio de cultura caldo de triptona-soja inoculado com Escherichia coli (ATCC 8739) na proporção de 5%. Foram obtidos resultados satisfatórios após 2 horas de incubação. O método desenvolvido apresentou especificidade e seletividade adequadas, linearidade na faixa de 5 a 35 &#181;g/ml, limite de detecção e quantificação de 0,1 e 0,4 &#181;g/ml, respectivamente, exatidão (recuperação = 98,5%) e precisão (DPR = 6,0%) satisfatórias. O ensaio em microplaca agrega características dos ensaios microbiológicos (avaliação da atividade do antibiótico frente a microrganismo-teste sensível) e físico-químicos (facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultdos). / The turbidimetric assay principle is simple: the test-solution is added to a suspension of test-microorganism in culture media, the mixture is incubated in appropriate conditions and the microbial growth is measured by photometric reading. Microplate with kinetic reading mode employed in antibiotic assay is considerable interesting, once it allows reduction of material and analysis time and it permits that a great numbers of samples could be analyzed simultaneously, with automated reading and calculating. The aim of this work is to determinate best experimental conditions to development of methodology for microbiological assay of apramycin employing microplate and kinetic reading mode, and to validate the developed method, through evaluation of parameters of specificity and selectivity, linearity, linear range, limit of detection and quantification, accuracy and precision. Established conditions considered standard-curve of apramycin in concentrations from 5 to 35 &#181;g/ml, and tryptic soy broth inoculated with 5% of Escherichia coli (ATCC 8739) suspension. Satisfactory results were obtained with 2 hours incubation. The developed method showed appropriate specificity and selectivity, linearity in the range from 5 to 35 &#181;g/ml, limit of detection and quantification of 0,1 and 0,4 &#181;g/ml, respectively, satisfactory accuracy (recuperation = 98,5%) and precision (RSD = 6,0%). Microplate assay considered characteristics of microbiological assay (evaluation of antibiotic activity against sensible test-microorganism) and physical-chemistry (operational facility and quicker results).

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.