A microbiota intestinal humana é um ecossistema complexo que abriga centenas de espécies bacterianas e que de um modo geral convive harmonicamente com o hospedeiro. Essa interação promove o desenvolvimento e estimulação do sistema imune. A microbiota tem papel primordial na saúde humana por produzir nutrientes, participar no metabolismo de carboidratos e por competir com bactérias patogênicas na colonização do ambiente intestinal. Ela alcança sua estabilidade em torno do segundo ano de vida. O tipo de parto, de alimentação, as condições sanitárias, sociais e os elementos do hospedeiro, como fatores genéticos, peristaltismo e pH intestinal, influenciam na sua composição. Quando há a instalação de infecções intestinais ou uso de antimicrobianos e de imunossupressores ocorre o desequilíbrio desse sistema. Esse estudo tem como objetivo avaliar o estabelecimento e a diversidade da microbiota intestinal em onze crianças a partir do segundo dia até o décimo segundo mês de vida. As amostras fecais das crianças foram coletadas no segundo e sétimo dias de vida e mensalmente do primeiro ao décimo segundo meses de vida. As análises de \"fingerprinting\" foram realizadas pelo método de eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) usando os iniciadores para a região V3 do gene 16S rRNA. Os perfis de similaridade foram feitos a partir da construção de dendrogramas e para avaliar as relações entre as amostras temporais das crianças e o perfil de bandas obtido com o DGGE foram feitas análises de correspondência. A análise do \"fingerprinting\" mostrou que cada criança apresentou um padrão de colonização distinto. Apesar de compartilharem algumas características como a forma de nascimento, quadro sócio-econômico e terem condições sanitárias semelhantes, observaram-se diferenças no processo de estabelecimento da microbiota de cada uma delas, o que pode ser devido aos fatores individuais e particularidades da alimentação, do uso de medicamentos e das intercorrências infecciosas. As análises de correspondência mostraram agrupamentos temporais, onde as amostras mais tardias (a partir de 10 meses até 12 meses de idade) estão muito relacionadas entre si indicando o início da estabilização da microbiota ao final do 1º ano de vida. O uso da técnica de \"fingerprinting\" por DGGE permitiu uma análise global dos estágios diferentes no estabelecimento da microbiota intestinal. / The human intestinal microbiota is a complex ecosystem that homes hundreds of bacterial species, which generally live in harmony with the host. This interaction promotes the development and stimulation of the immune system. The microbiota plays a major role in human health by producing nutrient involved in carbohydrate metabolism and competes with pathogenic bacteria in the colonization of the intestinal environment. The stability is achieved around the second year of life. The type of delivery, food, sanitation, and social elements of the host, such as genetic factors, peristaltism and intestinal pH, influence their composition. The imbalance of this system happens due the installation of intestinal infections, in the use of antibiotics and immunosuppressants. The aim of this study is to evaluate the establishment and the diversity of the intestinal microbiota of eleven children from the second day of life until the twelfth month of life. The fecal samples were collected from children in the second and seventh days of life and monthly from the first month to the twelfth month of life. Analyses of fingerprinting was performed by the method of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) using the primers for the V3 region of the 16S rRNA gene. The similarity profiles were made with the construction of dendrograms and to evaluate the relationships between the temporal samples of children and the profile obtained from the DGGE bands were made the correspondence analysis (CA). The fingerprinting analysis showed that each child had a distinct pattern of bands. Although sharing some characteristics such as delivery mode, socio-economic context and similar health conditions were observed differences in the process of establishment of the microbiota of each, which may be due to individual factors, the use of medicine and infectious complications. The correspondence analysis showed temporal clusters, where the later samples (from 10 months to 12 months of age) are closely related to each other indicating the beginning of the stabilization of the microbiota at the end of the first year of life. Using the technique of fingerprintin by DGGE allowed a comprehensive analysis of different stages in the intestinal microbiota establishment.

A capacidade de degradação de compostos xenobióticos por organismos vivos, principalmente bactérias, tem sido objeto intenso de pesquisa, principalmente por aqueles microrganismos isolados do solo. Dessa forma, a busca por novos nichos que resultem no isolamento de microrganismos altamente eficientes se torna cada vez mais necessária. Assim, dada a diversidade de interações inseto - bactérias, este estudo buscou explorar insetos resistentes a inseticidas como nicho de bactérias com capacidade de degradação de pesticidas para o desenvolvimento de estudos voltados à i) utilização dessas bactérias na biorremediação e ii) determinação de sua contribuição na metabolização de inseticidas pelo hospedeiro. Assim, esse trabalho teve por objetivos i) isolar, identificar e caracterizar microrganismos associados ao trato digestivo de linhagens de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) resistentes a lambda-cyhalothrin e deltamethrin (piretróide), chlorpyrifos ethyl (organofosforado), spinosad (naturalyte) e lufenuron (inibidor de síntese de quitina), ii) verificar o seu potencial de biodegradação desses compostos, iii) estudar sua associação a populações naturais de S. frugiperda e iv) determinar seu papel na metabolização de xenobióticos. Bactérias com potencial de biodegradação foram selecionadas via cultivo seletivo da flora associada ao trato intestinal de lagartas de quinto ínstar de S. frugiperda em meio mínimo M9 acrescido de 10 ?g/mL de um dos inseticidas em estudo como única fonte de carbono. As bactérias isoladas foram sujeitas à análise de PCR-RFLP do gene do 16S rDNA, com três enzimas de restrição (EcoRI, Rsa, DdeI), resultando na identificação de 16 isolados. Após sequenciamento, dez filotipos foram identificados, distribuídos em Firmicutes (Enterococcaceae e Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae), ?-Proteobacteria (Comamonadaceae) e Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas e Microbacterium foram os únicos representados por dois filotipos, sendo ainda encontrados um filotipo de Delftia, Leclercia, Staphylococcus e Arthrobacter. Enterococcus casseliflavus e Enterococcus mundtii foram isolados de praticamente todas as linhagens resistentes de S. frugiperda. Análises de antibiograma e do metabolismo de carboidratos indicaram a similaridade entre os clones de E. casseliflavus, enquanto que os clones de E. mundtii diferiram de maneira expressiva. Apesar disso, os alelos analisados para tipagem via multilocus não resultaram em diferenças. Análises de PCR-diagnóstico do intestino de lagartas de S. frugiperda de linhagem suscetível de laboratório resultaram na detecção de quatro dos dez filotipos isolados do intestino de linhagens resistentes de S. frugiperda. Já em populações naturais foram encontrados cinco dos dez filotipos. O isolado com maior capacidade de crescimento em cada inseticida foi selecionado e todos apresentaram resposta dependente da concentração dos inseticidas, sendo encontrado efeito antimicrobiano em alguns inseticidas. A análise de cromatografia acoplada a espectrometria de massas comprovou a degradação dos inseticidas utilizados pelos diferentes isolados. A colonização do trato digestivo de linhagem suscetível de S. frugiperda com um dos filotipos (Microbacterium arborescens) isolado de lagartas resistentes a lufenuron resultou em CL50 cerca de 10 vezes superior àquela da linhagem apossimbionte. Assim, linhagens resistentes de S. frugiperda se mostraram um excelente reservatório de bactérias com capacidade de degradação dos inseticidas testados e que podem auxiliar na metabolização desses produtos pelo hospedeiro, assim como ser exploradas na descontaminação de áreas que apresentam resíduos desses xenobióticos. / The capacity of living organisms to degrade xenobiotics has been intensively studied, mainly for soil-associated bacteria. Thus, there is a growing need to search for new niches to lead to the isolation of highly efficient microrganisms. As insect-bacteria interactions are very diverse, we focused on exploiting insecticide resistant insects as a niche of pesticidedegrading bacteria to develop studies devoted to a) bacterial utilization in bioremediation and ii) determination of bacterial contribution to insecticide metabolization by the host insect. Our main objetives were to i) isolate, identify and characterize the microrganisms associated to the gut of resistant strains of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) capable to degrade lambda-cyhalothrin,deltamethrin (pyrethroids), chlorpyrifos ethyl (organophosphate), spinosad (naturalyte) and lufenuron (chitin synthesis inhibitor), ii) verify their potential to degrade these insecticides, iii) to verify their association to natural populations of S. frugiperda, and iv) to determine their role in the metabolization of xenobiotics in the host. Bacteria with biodegrading capacity were selected from the gut flora of fifth instars of S. frugiperda on selective media based on the minimum media M9 added of 10 ?g/mL of one of the insecticides selected as the sole carbon source. The isolated bacteria were subjected to RFLP-PCR analysis of the 16S rDNA gene using three restriction enzymes (EcoRI, Rsa, DdeI), which led to the identification of 16 isolates. These isolates were grouped in ten phylotypes after sequencing, representing Firmicutes (Enterococcaceae and Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae), ?- Proteobacteria (Comamonadaceae) and Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas and Microbacterium were the only represented by more than two phylotypes. Delftia, Leclercia, Staphylococcus and Arthrobacter were also represented. Enterococcus casseliflavus and Enterococcus mundtii were isolated from almost all resistant lines of S. frugiperda. Antibiogram and carbohydrate metabolism assays indicated the similarity among the isolates of E. casseliflavus, while those of E. mundtii displayed some differences. However, no molecular differences were observed by comparing different alleles in multilocus sequence analysis. Diagnostic-PCR analysis of a susceptible, lab-strain of S. frugiperda allowed the identification of four out of the ten phylotypes isolated from resistant strains. But no bacteria from the susceptible strain could be cultivated in the selective media. In natural populations of S. frugiperda, five out of the ten isolates were detected. The most active isolate to degrade each pesticide was selected for further tests and all displayed a dose-dependent response to the insecticides. Analyses by gas or liquid chromatography-coupled mass spectrometry demonstrated the capacity of each isolate to degrade the insecticides tested. Gut colonization of larvae from the susceptible strain with Microbacterium arborescens isolated from resistant larvae increased the LC50 to lufenuron in 10 fold when compared to the aposymbiont strain. Thus, resistant strains of S. frugiperda are an excellent reservoir of bacteria capable of degrading the tested insecticides, and have a potential to be exploited for the bioremediation of xenobiotic contaminated areas. Moreover, these bacteria can auxiliate the host insect to metabolize insecticides and may play a role in insect response to insecticides.

O estudo da relação entre os aditivos utilizados e os nutrientes é fundamental para o aprimoramento da utilização desses insumos e o máximo desempenho dos animais. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho e saúde intestinal (morfometria, microbiota do intestino e produção de mucina) em frangos de corte desafiados com Eimeria spp. alimentados com rações com níveis crescentes de treonina digestível e a inclusão de uma combinação de óleos essenciais. Os tratamentos foram arranjados em esquema fatorial 3x2, com três níveis de treonina digestível (100, 110 e 120% das recomendações) e suplementação ou não de óleos essenciais na ração, em um experimento no delineamento inteiramente casualizado. As rações baseadas em milho e farelo de soja foram formuladas para atender as necessidades de todos os nutrientes e fornecidas à vontade. Cada tratamento tinha seis repetições com 45 aves cada, totalizando 1620 animais. Aos 14 dias de idade, todas as aves foram desafiadas com Eimeria spp. via oral. O desempenho das aves foi avaliado semanalmente até 40 dias e, aos 21 e 40 dias de idade, foram coletadas amostras dos intestinos para análise de morfometria das vilosidades. Aos 21 dias de idade foram coletadas amostras do conteúdo do intestino delgado e cecos para análise da microbiota. Aos 40 dias, o conteúdo do íleo foi coletado para a determinação da produção de mucina. Os dados foram submetidos à análise de variância a 5%, avaliando a interação e os efeitos dos fatores principais. Aos 40 dias de idade, a inclusão do blend de óleos essenciais na dieta diminui o consumo de ração dos animais, sem alterar o ganho de peso e a conversão alimentar. Aos 21 dias, houve efeito significativo (p<0,05) no nível de 120% de treonina digestível comparado ao nível de 110%, onde os animais que receberam um maior nível de treonina na dieta obtiveram uma maior altura de vilos no íleo. Não houve efeito dos tratamentos sobre a quantidade de mucina no conteúdo ileal de frangos de corte aos 40 dias de idade. A inclusão de níveis crescente de treonina digestível e óleos essenciais na dieta, não modifica a população microbiana, podendo ser observado apenas tendências de alterações nas frequências de alguns gêneros no ceco dos animais. / The study of the relationship between the additives and nutrients is essential for improving the use of these substances and the maximum animal performance. The purpose of this study was to examine the effects of levels of threonine and the inclusion of blends of essential oils on the performance and intestinal health (morphology, intestinal microbiota and mucin production) in broilers challenged with Eimeria spp. The treatments followed a 3x2 factorial arrangement with three levels of digestible threonine (100, 110,120% of the Brazilian Tables recommendations), and supplementation or not of a blend of essential oils in the feed in a completely randomized design experiment. The diets based on corn and soybean meal to meet the nutritional requirements were fed ad libitum. Each treatment had six replicates of 45 birds each, totaling 1620 animals. On day 14, all birds were orally gavaged with 10 times the recommended dose of a commercial coccidial vaccine with sporulated live oocysts of Eimeria spp. . Performance was evaluated weekly until 40 days of age. At 21 and 40 days of age, samples of the intestines were collected for morphometry. At 21 days of age samples of the contents of the small intestine and the cecum were collected for analysis of microorganisms. At 40 days of age, the contents of the ileum were collected for determining the mucin production. The data were submitted to analysis of variance at 5%, studying the interaction and the effects of the main factors. At 40 days of age the inclusion of essential oils in the diet decrease the feed intake of the animals, without changing growth and feed conversion . At 21 days of age, 120% of digestible threonine in the diet increased the height of villus in the ileum when compared with 110% of digestible threonine (p<0,05). There was no effect of treatments on the production of mucin in the contents of the ileum. The increasing levels of digestible threonine and essential oils in the diet did not modify the microbiota.It is possible to observe a tendency of change on the frequency of some genera in the cecum of the animals.

O objetivo do presente estudo foi investigar as implicações da suplementação com levedura viva Saccharomyces cerevisiae e de um programa de treinamento físico de baixa intensidade sobre a digestibilidade dos componentes da dieta (MS, PB, EE, FDN, FDA, MO e amido), a resposta glicêmica e insulinêmica, perfil sérico de triglicerídeos, colesterol total e frações (HDL-C; LDL-C; VLDL-C), bem como mensurar a produção dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) butírico, acético e propiônico, quantificar levedura viva nas fezes, avaliar o pH fecal, a população microbiana nas fezes e os níveis séricos de endotoxinas, além de mensurar a frequência cardíaca dos animais em exercício físico e na recuperação. Foram utilizados dez cavalos da raça Puro Sangue Árabe, machos, castrados, com idade média 72±7,5 meses e peso médio de 473±34,75 kg, alojados em baias individuais, alimentados com dieta constituída de 2% do PC em MS/dia, divididos em 0,75% de concentrado comercial multiparticulado e 1,25% de feno de gramínea (Cynodon dactylon sp. cv Tifton-85). Os tratamentos foram divididos em controle (sem adição de levedura) e suplementados (adição de 15g/dia de levedura viva Saccharomyces cerevisiae) em uma fase sem exercício e outra fase com exercício físico. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com esquema fatorial 2x2 e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo teste F. Para os coeficientes de digestibilidade observou-se efeito de exercício para os coeficientes de digestibilidade da MS, MO, FDN, FDA e PB (P<0,05). Para a variável EE observou-se interação da inclusão de levedura e exercício físico (P<0,1). O amido não apresentou efeito de tratamentos (P>0,1). Para os níveis plasmáticos de glicose observou-se efeito de exercício (P=0,015). Os níveis séricos de insulina não apresentaram efeito de tratamentos (P>0,1). Para triglicérides e VLDL-C não foi observado efeito de tratamentos (P>0,1). O CT, HDL-C e LDL-C apresentaram efeito de interação da inclusão de levedura e exercício (P<0,1). Para a produção de AGCC nas fezes com base na matéria original (MO) não houve efeito para os ácidos acético e butírico (P>0,1), no entanto, observou-se efeito da inclusão de levedura na produção do ácido propiônico (P=0,052). A quantificação de levedura viva nas fezes demonstrou efeito de interação da inclusão de levedura e exercício (P<0,001). Os resultados de pH apontaram efeito de interação da inclusão de levedura e exercício físico para as faixas de horário 1 (P=0,050) e 2 (P=0,080) e efeito de exercício para as faixas 3 (P<0,007) e 4 (P=0,001). Os resultados do perfil bacteriano nas fezes apontaram efeito de exercício para Fibrobacter succinogenes (P=0,083) e de interação da inclusão de levedura e exercício para Lactobacillus genus (P=0,020); não foi observado efeito de tratamentos para Ruminococcus flavenfaciens (P>0,1). Para os níveis séricos de endotoxinas, observou-se efeito de interação da inclusão de levedura e exercício (P=0,689). A FC dos animais em exercício demonstrou efeito de tempo durante o exercício (P<0,001). Para a FC de recuperação, foi possível observar interação da inclusão de levedura e exercício físico (P=0,020). A inclusão de levedura viva S. cerevisiae na dieta de equinos influencia a produção de AGCC propiônico. O exercício físico de baixa intensidade influencia os coeficientes de digestibilidade da MS, MO, FDN, FDA e PB, os níveis plasmáticos de glicose e a quantificação de Fibrobacter succinogenes nas fezes. A inclusão de levedura viva S. cerevisiae na dieta e o exercício físico influenciam o coeficiente de digestibilidade do EE, níveis séricos de HDL-C e LDL-C, a quantificação de levedura viva nas fezes, os níveis séricos de endotoxinas, o pH fecal, a quantificação de Lactobacillus genus nas fezes e a frequência cardíaca de recuperação pós-exercício. O tempo de exercício em cada velocidade influencia a frequência cardíaca dos animais durante o exercício físico / The aim of this study was to investigate the implications of supplementation with live yeast Saccharomyces cerevisiae and a low-intensity exercise training program on digestibility of dietary components (DM, CP, EE, NDF, ADF, MO and starch), the glycemic and insulin response, serum profile of triglycerides (TC), total cholesterol and fractions (HDL-C, LDL-C, VLDL-C), measure the production of short chain fatty acids (SCFA) butyric acid, acetic and propionic, quantify yeast live in feces, evaluating faecal pH, microbial population in faeces and serum levels of endotoxins, in addition to measuring the heart rate of the animals exercise and recovery. Ten horses in the Purebred Arabian race, castrated male, mean age 72 ± 7.5 months and average weight of 473 ± 34.75 kg were used, housed in individual pens, fed diet consisting of 2% of the BW in DM / day, divided into 0.75% multiparticulate commercial concentrate and 1.25% grass hay (Cynodon dactylon sp. cv Tifton -85). The treatments were divided into control (no addition of yeast) and supplemented (plus 15 g / day of live yeast Saccharomyces cerevisiae) in one phase and another phase with and without exercise, respectively. The experimental design was completely randomized in a factorial 2x2 and the data were submitted to analysis of variance by F test. For the digestibility coefficients it was observed exercise effect for the digestibility coefficients of DM, OM, NDF, ADF and PB (P<0.05). For the variable EE it was observed interaction of yeast inclusion and exercise (P<0.1). Starch no effect of treatments (P>0.1). For plasma glucose levels it was observed effect of exercise (P=0.015). Serum insulin levels showed no treatment effect (P>0.1). For triglycerides and VLDL-C was not observed treatment effect (P>0.1). The TC, HDL-C and LDL-C showed interaction effect of adding yeast and exercise (P<0.1). For the production of SCFA in the faeces based on this matter (OM) there was no effect for acetic and butyric acids (P>0.1), however, it was observed effect of including yeast in the production of propionic acid (P=0.052). The quantitation of live yeast in the feces demonstrated interaction effect of adding yeast and exercise (P<0.001). The pH values indicated yeast inclusion of the interaction effect and exercise for time range 1 (P=0.050) and 2 (P=0.080) and exercise effect to the time range 3 (P<0.007) and 4 (P=0.001). The results of the bacteriological profile in feces showed exercise effect to Fibrobacter succinogenes (P=0.083) and interaction of the yeast include the genus Lactobacillus and exercise (P=0.020). It wasnt observed for treatment effects Ruminococcus flavenfaciens (P>0.1). For serum levels of endotoxin it was observed interaction effect of adding yeast and exercise (P=0.689). The CF of animals in exercise demonstrated time effect during exercise (P<0.001). For CF recovery, it was observed interaction of yeast inclusion and exercise (P=0.020). The inclusion of live yeast S. cerevisiae in horse\'s diet influences propionic SCFA production. The low-intensity exercise influences the digestibility coefficients of DM, OM, NDF, ADF and PB, the plasma levels of glucose and quantification of F. succinogenes in the stool. The inclusion of live yeast S. cerevisiae in horses diet and exercise influence EE digestibility, serum levels of HDL-C and LDL-C, quantification of live yeast in the stool, serum levels of endotoxin, fecal pH and quantifying the genus Lactobacillus in stool and heart rate of post-exercise recovery. The exercise time at each speed influences the heart rate of the animals during exercise

Anfíbios possuem uma microbiota cutânea que os protege contra patógenos. Essa proteção se dá pela produção de moléculas antimicrobianas e pela competição por espaço e nutrientes contra patógenos. Alterações na composição da microbiota, causadas por fatores bióticos e abióticos do ambiente e por fatores ecofisiológicos do hospedeiro, podem afetar a resistência dos anfíbios à doenças. Assim, é possível que ambientes artificiais, por conter condições ambientais diferentes dos naturais e por alterarem aspectos ecofisiológicos dos indivíduos, devem modular a microbiota cutânea de animais mantidos e nascidos em cativeiro. Nós avaliamos diferenças inter e intra-populacionais no perfil da comunidade bacteriana de Scinax alcatraz entre três grupos: indivíduos selvagens; indivíduos nascido em cativeiro; e indivíduos mantidos em cativeiro por dois anos. Também verificamos o efeito temporal de ambientes artificiais no perfil da microbiota cutânea entre e dentre indivíduos selvagens mantidos em cativeiro ao longo de 312 dias. Os parâmetros microbiológicos utilizados foram riqueza de morfotipos bacterianos e abundância de colônias bacterianas. As diferenças encontradas entre populações apontam para o ambiente como um importante modulador da microbiota cutânea. No entanto, as diferenças encontradas entre indivíduos de uma mesma população apontam para a importância de aspectos fisiológicos do hospedeiro na modulação. Por fim, a avaliação temporal foi importante para mostrar que tanto aspectos ambientais quanto aspectos ecofisiológicos atuam juntos na modulação da comunidade bacteriana cutânea de anfíbios mantidos em cativeiro / Amphibians harbor a skin microbiota that provides protection against pathogens. This protection happens by production of antimicrobial substances and by competition for space and nutrients against pathogens. Changes in the microbiota composition, caused by biotic and abiotic factors of the environment and ecophysiology factors of the host, may affect disease resistance of amphibians. As artificial environments contain different environmental conditions compared to natural ones and may alter physiological aspects of individuals, it may modulate the cutaneous microbiota of captive animals. Our study evaluated inter- and intra-population differences in the profile of bacterial community of Scinax alcatraz from three distinct groups: wild individuals; individuals born in captivity and individuals kept in captivity for two years. We also investigated the temporal effects of artificial environments on the cutaneous microbiota profile between and within wild individuals kept in captivity over 312 days. Microbiological parameters analyzed were richness of bacterial morphotypes and abundance of bacterial colonies. The differences found between populations show that the environment may be an important modulator of the microbial community. However the differences between individuals within a population demonstrate the importance of physiological aspects of the host for the composition of the microbiota. Finally, the temporal evaluation performed was important to show that both environmental and ecophysiological aspects act together in modulating the cutaneous microbiota community of amphibians kept in captivity

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ottoni_JuliaRonzella_D.pdf: 14116261 bytes, checksum: f49982ceaff5d9b1dd9c87dcf8c01fcf (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os manguezais são ecossistemas peculiares de alta atividade biológica, considerados um dos ambientes mais ricos do mundo. No Brasil, os manguezais ainda são pouco estudados, tornando o conhecimento e exploração de micro-organismos e seus metabólitos nesses ecossistemas um tópico importante. Os manguezais são ambientes adversos, caracterizados, em muitos casos, pela alta salinidade, variações constantes de pH e temperatura, e condições anóxicas. Micro-organismos adaptados à essas condições podem ser fontes de moléculas bioativas ainda desconhecidas e de interesse ambiental e econômico. Neste contexto, o presente trabalho teve como um dos objetivos analisar a diversidade taxonômica e funcional presente em sedimento de manguezal contaminado com petróleo através do sequenciamento de uma biblioteca metagenômica construída em vetor do tipo fosmídio. As análises taxonômicas da biblioteca metagenômica mostraram predominância do filo Proteobacteria, seguido por Actinobacteria, Planctomycetes, Firmicutes, Cloroflexi e Bacteroidetes. Em nível de classe, a mais abundante foi Gamaproteobacteria, seguida de Alfaproteobacteria e Deltaproteobacteria. A diversidade taxonômica se reflete na diversidade metabólica, com espécies capazes de degradar hidrocarbonetos, oxidar enxofre em zonas de transição oxica-anóxica costeiras, transformar metais pesados e outros compostos xenobióticos, dentre outras habilidades. Em adição, foram realizadas triagens funcionais com 4.800 clones da biblioteca e 215 isolados bacterianos para esterase e lipase, 5.184 clones para atividade proteolítica e os genomas de duas bactérias foram analisados in silico na busca de genes que codificam para atividade de catalase. As triagens dos clones resultaram em 17 hits positivos para esterases que posteriormente se revelaram falsos-positivos, e 182 hits positivos para proteases nos ensaios com sondas, sendo 60 hits positivos no pH 4,0, 55 no pH 7,0 e 67 no pH 9,0. Nos ensaios com isolados de bactérias foram detectados 42 com atividade de esterase e 20 com atividade de lipase, sendo que a melhor atividade de esterase foi obtida com um isolado de Gordonia sp. e a melhor atividade de lipase foi obtida para um isolado de Bacillus safensis. Estes dois isolados já possuem seus genomas sequenciados e uma análise in silico foi realizada para busca dos respectivos genes de atividade lipolítica. Na busca in silico por catalases foi selecionada uma sequência completa para ensaios de expressão. Foram desenhados pares de primers para amplificação dos genes das três enzimas e, destes, os genes da lipase e da catalase foram expressos, ambos do Bacillus safensis. A caracterização funcional e estrutural foi realizada com a catalase, cujo gene possui 1500 pb, é um tetrâmero composto por 4 monômeros de 59 kDa cada, ativa em intervalo de pH de 6,0 a 12 e temperaturas de 25 ºC a 55 ºC, com atividade ótima em pH 10 e 30 ºC e estável até 40 ºC. Os resultados mostraram que o mangue impactado é composto por populações microbianas adaptadas ao ambiente, e também responsáveis pela degradação de compostos xenobióticos, auxiliando na sua recuperação. A abordagem metagenômica foi bem sucedida nas triagens funcionais para proteases, indicando um grande potencial proteolítico no ambiente. As triagens funcionais com os isolados mostraram a presença de enzimas lipolíticas ativas, e a catalase expressa exibiu características funcionais interessantes, tais como atividade ótima em pH 10 e estabilidade térmica até 40 ºC, com potencial aplicação industrial / Abstract: Mangroves are unique ecosystems of high biological activity and are considered one of the richest environments in the world. In Brazil, mangroves are still poorly studied, making the knowledge of microorganisms and their metabolites in these ecosystems an important topic. Mangroves are harsh environments characterized, in many cases, by high salinity, high pH and temperature variations, and anoxic conditions. Microorganisms adapted to these conditions may be sources of yet unknown bioactive molecules of environmental and economic interest. In this context, one of the objectives of the present study was to analyze the taxonomic and functional diversity present in mangrove sediment contaminated with oil through the sequencing of a metagenomic library constructed using fosmid vector. The taxonomic analysis of the metagenomic library showed predominance of Proteobacteria phylum, followed by Actinobacteria, Planctomycetes, Firmicutes, Chloroflexi and Bacteroidetes. At class level, the most abundant was Gammaproteobacteria, followed by Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria. The taxonomic diversity is reflected in the metabolic diversity, with species capable of degrading hydrocarbons, oxidizing sulfur in oxic-anoxic coastal transition zones, transforming heavy metals and other xenobiotic compounds, among other skills. In addition, functional screenings were performed with 4,800 fosmid clones and 215 bacterial isolates for esterases and lipases, and with 5,184 clones for proteolytic activity and the genomes of two bacteria were analyzed in silico to search for genes encoding catalase activity. The screening of the clones resulted in 17 positive hits for esterases that later proved to be false-positive, and 182 positive hits for proteases using probe-based assays: 60 positive hits at pH 4.0, 55 at pH 7.0 and 67 at pH 9.0. Tests with bacterial isolates yielded 42 positive hits for esterase activity and 20 for lipase activity. The best esterase activity was obtained with one isolate of Gordonia sp. and the best lipase activity was obtained with one isolate of Bacillus safensis. These two isolates have their genomes already sequenced and in silico analyses were performed in the search for the respective genes of lipolytic activity. In silico analysis for catalase genes was performed and a complete sequence was selected for expression assays. Primer pairs were designed to amplify the genes encoding the three enzymes, and of these, lipase and catalase were expressed, both from Bacillus safensis. The functional and structural characterization was carried out with catalase, which gene has 1500 bp, it is a tetramer composed of four monomers of 59 kDa each, active in the pH range from 6.0 to 12 and temperatures of 25 °C to 55 °C, with optimum activity at pH 10 and 30 °C and stable until 40 ºC. The results showed that oil-impacted mangrove is composed by microbial populations adapted to the environment, responsible for the degradation of xenobiotics and assisting in the recovery of the mangrove. The metagenomics approach was successful in the functional screening for proteases, indicating a great proteolytic potential in the environment. Functional screening with the bacterial isolates showed presence of active lipolytic enzymes, and the expressed catalase exhibited unique functional characteristics, such as optimal activity at pH 10 and thermal stability until 40 ºC, with potential industrial application / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Resumo: A criptosporidiose, uma das principais causas de diarreia infantil, é causada por parasitos do Filo Apicomplexa pertencentes ao gênero Cryptosporidium. A falta de medicamentos eficazes está motivando pesquisas para desenvolver tratamentos alternativos. Para este objetivo, o impacto dos probióticos no curso da criptosporidiose foi investigado. A microbiota intestinal nativa de camundongos imunossuprimidos livres de patógenos específicos foi inicialmente esgotada com antibióticos administrados por via oral. Um produto probiótico comercialmente disponível destinado ao consumo humano foi subsequentemente adicionado à água potável. Os camundongos foram infectados com oocistos de Cryptosporidium parvum. Em média, os camundongos tratados com probiótico desenvolveram uma infecção mais grave. Os probióticos alteraram significativamente a microbiota fecal, mas não foi observada associação direta entre a ingestão de bactérias probióticas e sua abundância na microbiota fecal. Esses resultados sugerem que os probióticos alteram indiretamente o microambiente intestinal ou o epitélio intestinal de maneira a favorecer a proliferação de C. parvum. / Abstract: Cryptosporidiosis, a leading cause of infant diarrhea, is caused by apicomplexan parasites classified in the genus Cryptosporidium. The lack of effective drugs is motivating research to develop alternative treatments. To this aim, the impact of probiotics on the course of cryptosporidiosis was investigated. The native intestinal microbiota of specific pathogen-free immunosuppressed mice was initially depleted with orally administered antibiotics. A commercially available probiotic product intended for human consumption was subsequently added to the drinking water. Mice were infected with Cryptosporidium parvum oocysts. On average, mice treated with probiotic developed a more severe infection. The probiotics significantly altered the fecal microbiota, but no direct association between ingestion of probiotic bacteria and their abundance in fecal microbiota was observed. These results suggest that probiotics indirectly altered the intestinal microenvironment or the intestinal epithelium in a way that favors proliferation of C. parvum. / Doutor

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Over the past few decades, it has become increasingly apparent that host-associated microbial communities play an integral role in the development, physiology, and health of their host organisms. All hosts have evolved mechanisms to filter the microbial taxa that comprise their resident intestinal microbial community, or gut microbiota. Utilizing the zebrafish as a model host organism, we documented the development of the gut microbiota through time, and found a significant shift in the composition of the gut microbiota after the onset of adaptive immunity. This led us to hypothesize that adaptive immunity is an important determinant of gut microbiota composition. We tested this hypothesis using wild type and rag1-/- zebrafish, which lack a functional adaptive immune system. Additionally we tested the robustness of the effects of adaptive immunity to dispersal of microbes between immune-compromised and immune-competent genotypes. We found that adaptive immunity had less of an effect on the composition of the gut microbiota than we expected, although there were intriguing differences in the nature of selection imposed when adaptive immunity was present than when it was absent. Because “westernization”, or market-integration, has been associated with significant changes in the human microbiota and certain health risks, we used similar analyses to those we applied to the zebrafish system to determine whether market-integration alters the filtering effects of inflammation and intestinal helminth parasites on the intestinal microbial community. We found that market-integration increased inter-subject dissimilarity and reduced inter-subject dispersal. Even small changes in the inflammation marker, CRP, were associated with differences in the gut microbiota, but these effects were reduced in the presence of helminth infection, which has been hypothesized to affect the microbiota by reducing inflammation. In total, this dissertation provides evidence for the nature and importance of host filters of the gut microbiota across two vertebrate species, as well as providing a framework for future studies of the effects of such filters on the assembly of the gut microbiota. This dissertation includes previously published, and unpublished, co-authored material.

Triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae) conhecidos no Brasil como “barbeiros” são os vetores do flagelado Trypanosoma cruzi, o parasita causador da doença de Chagas, uma das mais importantes doenças parasitárias no continente americano. O estudo da microbiota intestinal dos triatomíneos tem ganhado relevância nos últimos anos dado seu papel potencial em modular a competência vetorial, além do uso de bactérias modificadas geneticamente para inibir o desenvolvimento do inseto ou do parasita. Porém, para um uso prospectivo em estratégias de controle, se requer um bom conhecimento da interação vetor-microbiota-parasita, incluindo a composição da microbiota, rotas de transmissão e a resposta a infecção com T. cruzi. Para responder estas perguntas, neste trabalho foi amostrada a microbiota intestinal de insetos criados em colônias de laboratório de seis espécies representativas dos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus, usando sequenciamento em larga escala de um fragmento do gene ribossomal 16S. Nosso estudo compara insetos desafiados experimentalmente contra T. cruzi e controles não desafiados, bem como amostras obtidas de intestino e gônadas. Nossos resultados demostram que a microbiota intestinal de triatomíneos tem uma baixa diversidade dentro de indivíduos, pode ser transmitida horizontal ou tanto vertical como horizontalmente, e é altamente variável na sua composição taxonômica dentro de uma mesma espécie de hospedeiro. No entanto, as espécies bacterianas da microbiota padrão são principalmente restritas a Enterobacteriales e Corynebacteriales. Nossos resultados sugerem que desafio com T. cruzi influencia a composição da microbiota de acordo com a susceptibilidade do vetor: nas espécies com infecção não detectável, ela é variável entre os grupo desafiado e o controle, mas nas espécies com infecção detectável, ela permanece em sua maioria sem mudanças. Nossas observações são discutidas à luz do nosso conhecimento sobre a resposta imune do inseto e sobre a capacidade do parasita de modulá-la. Nós consideramos que, embora a diversidade da microbiota ser altamente variável entre espécies e indivíduos, grupos taxonômicos-chave definem a microbiota padrão intestinal dos triatomíneos, permitindo-nos explorar o papel dos simbiontes na nutrição e defesa do hospedeiro. Finalmente, nós sugerimos caminhos através dos quais novas pesquisas sobre a regulação fisiológica dos triatomíneos pela microbiota intestinal podem ser realizados a fim de avaliar a sua resposta posterior contra T. cruzi e ser usada como indicador de susceptibilidade dos insetos à infecção pelo o parasita. / Triatomine bugs (Hemiptera: Reduviidae) known in Brazil as “barbeiros” are the vectors of flagellate Trypanosoma cruzi, the causative agent of the Chagas disease, one of the most important parasitic diseases in the American continent. The study of triatomine gut microbiota has gained relevance in the last years given its potential role to modulate vector competence, besides the use of genetically modified bacteria to inhibit the development of either insects or parasites. However, for a prospective use in control strategies, a good understanding of the vector-microbiota-parasite interactions is required, including microbiota composition, its transmission routes, and its responses to T. cruzi infection. To answer these questions, we sampled the gut microbiota of colony-reared insects of six representative species of the genera Triatoma, Rhodnius and Panstrongylus, using high throughput sequencing of a fragment of the ribosomal gene 16S. Our study compares experimental T. cruzi-challenged and non-challenged control individuals, as well as samples obtained from guts and gonads. Our results demonstrate that the triatomine gut microbiota has a low intra-individual diversity, is either horizontally or both horizontally and vertically transmissible, and is highly variable in its taxonomic composition within the same host species. Nevertheless, bacterial species of the core microbiota are mostly restricted to Enterobacteriales and Corynebacteriales. T. cruzi-challenge seems to influence microbiota composition according to vector susceptibility: in species with non-detectable infection, it is variable between experimentally challenged and non-challenged vectors, while in species with detectable infection, the microbiota remains mostly undisturbed. This latter observation is discussed in the light of insect immune responses and the parasite capacity of modulating it. We consider that, although the microbiota diversity is highly variable between species and individuals, key taxonomic groups define the core triatomine gut microbiota, allowing us to explore their symbiotic role in host nutrition and defense. Finally, we suggest avenues through which new research on triatomine physiological regulation of gut microbiota could be conducted in order to evaluate its subsequent response to T. cruzi and be used as indicator of infection susceptibility to the parasite.