Orientador: Mário Tyago Murakami / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T11:13:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_AndreyFabricioZiem_D.pdf: 59337766 bytes, checksum: b26927ac8e7083ceb39d09631e1b378f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As miosina de classe V, amplamente distribuídas em sistemas eucarióticos desde leveduras até vertebrados, são um dos mais caracterizados motores moleculares da superfamília das miosinas e desempenham um papel chave no transporte intracelular de vesículas, organelas e RNA mensageiro. As miosinas V consistem de duas cadeias pesadas idênticas que se dimerizam através da formação de uma estrutura coiled-coil e sua arquitetura tridimensional pode ser dividida em três distintos domínios: a porção N-terminal ou domínio motor que apresenta os sítios de interação com ATP e actina; a porção central ou pescoço formada por 6 domínios IQ, responsável pela regulação e interação com calmodulina; e a porção C-terminal que inclui a região coiled-coil e o domínio de ligação de cargas celulares também conhecido como domínio cauda globular (GTD). Uma das mais importantes questões pertinentes até hoje é como ocorre a sinalização e a interação entre as vesículas/organelas e o domínio globular C-terminal das miosinas V. Neste estudo, foram resolvidas as estruturas dos domínios cauda globular das miosinas Va, Vb e Vc humanas, revelando pequenas mudanças estruturais que levam a diferenciação funcional e, ainda, um novo mecanismo redox que controla a dimerização do GTD de forma independente do coiled-coil, que é exclusivo para a miosina Vc. As alterações estruturais induzidas pela fosforilação do GTD também foram exploradas, mostrando que o estado fosforilado possuí uma flexibilidade menor, podendo estar envolvido na regulação do estado inibido e/ou reconhecimento de cargas nucleares. Além disso, os sítios de ligação a carga e ao domínio motor foram estruturalmente anotados, indicando uma conservação de resíduos envolvidos na interação com adaptadores para o transporte de peroxissomos e proporcionando detalhes da inibição da atividade motora pelo GTD. Estes resultados contribuem para a compreensão dos determinantes estruturais para o transporte de carga, autoinibição e mecanismos de regulação dos motores de miosina V. Além dos resultados obtidos com a cauda globular, alguns problemas cristalográficos como o problema da fase, pseudosimetria e ordem-desordem cristalina foram abordados (descrito nos Apêndices 9.3 e 9.4). Patologias cristalinas como ordem-desordem parcial ou total podem estar relacionadas à valores elevados de Rfactor e Rfree, mesmo após a conclusão do refinamento, ou mesmo à dificuldade de resolução da estrutura. Problemas de ordem-desordem rotacional parcial e pseudosimetria foram observados em cristais de uma hidrolase glicosídica (TpAbn). Nesse caso, valores satisfatórios de Rfactor e Rfree foram obtidos somente após um minucioso processamento dos dados e redução da simetria. Além disso, os dados dos GTDs das miosinas de classe V foram utilizados como caso teste para o desenvolvimento de novas metodologias de faseamento ab initio em média e baixa resolução (2 ¿ 3 Å) em colaboração com o grupo de Prof. Dr. Isabel Usón (IBMB, Barcelona, Espanha). Utilizando o programa ARCIMBOLDO foi possível resolver a estrutura do GTD-MioVb a 2,1 Å utilizando apenas duas hélices de poli-Ala de 22 resíduos (7,5% do conteúdo da unidade assimétrica), mostrando o grande potencial desta metodologia para dados de média a baixa resolução / Abstract: The class V myosins (MyoVs) are widely distributed in eukaryotic organisms from yeast to vertebrates, being one of the most characterized molecular motors of the myosin superfamily. MyoVs play a central role in the intracellular transport of vesicles, organelles, messenger RNA and proteins. MyoVs consist of a coiled-coil-stabilized dimer of two identical heavy chains and their general structure can be divided into three distinct domains: the N-terminal portion or motor domain which binds both actin and ATP; the central portion or neck formed by 6 IQ domains, responsible for the regulation and interaction with calmodulin; and the C-terminal portion that includes the coiled-coil region and the cargo-binding domain also known as globular tail domain (GTD). One of the most important issues still obscure so far is how occurs the interaction between the cargoes and the globular C-terminal domain of myosin V. Here, we have solved the globular tail domain structures of the three human MyoV paralogs (Va, Vb and Vc), revealing subtle structural changes that drive functional differentiation and a novel redox mechanism controlling the GTD dimerization process, which is unique for the MyoVc subclass. The structural changes induced by the phosphorylation of GTD have also been explored, showing that the phosphorylated state is less flexible and may be involved in the regulation of the auto-inhibition mechanism and/or in the recognition of nuclear cargoes. Moreover, the cargo- and motor-binding sites were structurally assigned indicating the conservation of residues involved in the recognition of adaptors for peroxisome transport and providing high-resolution insights into motor domain inhibition by GTD. These results contribute to the understanding of the structural requirements for cargo transport, auto-inhibition and regulatory mechanisms in myosin V motors. In addition to the results obtained with the GTD structures, some crystallographic problems, such as the phase problem, pseudosymmetry and lattice order-disorder were discussed (described in Appendices 9.3 and 9.4). Crystal pathologies such as partial or total order-disorder may be related to high values of Rfactor and Rfree, even at late stages of crystallographic refinement, or even hindering the structure determination. Problems of partial rotational order-disorder and pseudosymmetry were found in TpAbn crystals where only after a careful data processing and symmetry reduction was possible to obtain satisfactory values of residuals (Rfactor and Rfree). Moreover, data from MyoV GTDs were used as a test case for the development of new methodologies for ab initio phasing at medium and low resolution (2 ¿ 3 Å) in collaboration with the group of Prof. Dr. Isabel Usón (IBMB, Barcelona, Spain). Using the program ARCIMBOLDO we have solved the GTD-MioVb structure at 2.1 Å using only two 22-residue-long poly-Ala helix fragments (7.5% of asymmetric unit content), showing the great potential of this methodology for data at medium to low resolution / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-14T12:26:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Marcos Paulo Galdino Coutinho.pdf: 2381887 bytes, checksum: 97d1ef06b04ac1f2b61ddb127fb6bba0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-14T12:26:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Marcos Paulo Galdino Coutinho.pdf: 2381887 bytes, checksum: 97d1ef06b04ac1f2b61ddb127fb6bba0 (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / CNPq / Objetivo: Avaliar os efeitos do treinamento resistido de salto livre com sobrecarga sobre a composição muscular e as propriedades biomecânicas do complexo gastrocnêmio-plantar de ratos induzidos ao diabetes experimental tipo 1. Métodos: Foram utilizados oitenta e oito ratos da linhagem Wistar, com 60 dias de vida, distribuídos em quatro grupos: Grupo Controle Sedentário – GCS (n=15), Grupo Diabético Sedentário – GDS (n=27), Grupo Controle Treinado – GCT (n=17), Grupo Diabético Treinado – GDS (n=29). A indução ao diabetes foi feita por estreptozotocina. O protocolo de exercício resistido de salto teve duração de 9 semanas. Foram avaliadas glicemia e peso corpóreo dos animais do início ao fim do experimento. Com o término do protocolo de exercício o complexo gastrocnêmio-plantar direito dos animais foram coletados, com parte da amostra (n=65) sendo encaminhada para avaliação das propriedades mecânicas, e a outra parte da amostra (n=22) sendo encaminhada para a imunohistoquímica. Resultados: Os animais de todos os grupos diabéticos apresentaram pesos corporais finais inferiores (p<0,05) e valores glicêmicos superiores a 200mg/dl desde a indução até o fim do experimento em relação aos controles. Foi evidenciado uma redução na Força máxima, Deformação , Deformação Específica, Energia/Área, Rigidez, Área de Secção Transversa nos músculos dos animais do GDS comparado aos animais do GCS (p< 0,05). A Tensão na Força Máxima e o Módulo Elástico não diferiram entre os grupos (p> 0.05). com relação ao efeito do treino resistido no diabetes, ao comparar os músculos dos animais do GDT com o GDS observamos aumento para o parâmetro Força Máxima e Rigidez (p<0,05). Nos demais parâmetros não houve diferença entre os grupos (p>0,05). Foi observado que os pesos dos músculos gastrocnêmios laterais mostraram-se reduzidos no GDS quando comprado ao GCS (p<0,05), comportamento semelhante foi visto na comparado ao GCS com GCT (p<0,05). Já na comparação entre os animais do GDS e GDT não houve diferença significante. Na análise da miosina rápida e lenta, através da imunohistoquímica, não houve diferença entre os grupos estudados (p>0,05). Conclusão: O Diabetes experimental promove prejuízos em parâmetros mecânicos no complexo muscular gastrocnemio-plantar e o exercício resistido exerce papel protetor na Força Máxima e na Rigidez extrínseca muscular dos animais treinados. Com relação à composição muscular, a miopatia diabética não altera a distribuição normal da miosina rápida e lenta no músculo gastrocnemio lateral, e o treino resistido de força não apresenta qualquer efeito sobre a distribuição dessa proteína. / Objective: To evaluate the effects of a resistance training protocol on muscle composition and biomechanical properties of the gastrocnemius-plantaris complex of rats induced to experimental diabetes. Methods: At the age of 60 days eighty-eight Wistar rats were divided into four groups: Sedentary Control Group - SCG (n = 15), Sedentary Diabetic Group - SDG (n = 27), Trained Control Group - TCG (n = 17), Trained Diabetic Group - TDG (n = 29). Diabetic animals were induced to diabetes by streptozotocin. Exercise protocols had a 9 weeks duration. We evaluated animal’s blood glucose and body weight in the beginning and in the end of the experiment. At the end of the exercise protocol the right gastrocnemius-plantaris complex was collected, then part of the sample (n = 65) was referred for evaluation of mechanical properties, and the other portion of the sample (n = 22) was referred to the immunohistochemistry. Results: Animals of all diabetic groups showed lower final body weight (p <0.05) and blood glucose levels greater than 200 mg/dl from induction to the end of the experiment compared to control animals. A reduction in maximum strength, deformation, strain, energy/area, stiffness, section transverse area in the muscles of SDG animals compared to animals of SCG was noted (p <0.05). The Maximum Stress and the Elastic Modulus did not differ between groups (p> 0.05). Trained diabetic animals showed muscles with increased Maximum Force and Stiffness compared to SDG animals (p <0.05). The other parameters did not differ between the groups (p> 0.05). It was observed lower lateral gastrocnemius muscle weights in SDG animals compared to SCG animals (p <0.05). Similar behavior was seen when compared SCG to TCG (p <0.05). In the comparison between the TDG animals and the SDG animals no significant difference was found. In the analysis of fast and slow myosin by immunohistochemistry, there was no difference between groups (p> 0.05). Conclusion: Experimental diabetes promoted damage in mechanical parameters in gastrocnemius-plantaris complex and resistance exercise had a protective role in Maximum Strength and muscle stiffness of Trained Diabetic Group. With respect to muscle composition, diabetic myopathy did not alter the normal distribution of the fast and slow myosin in the lateral gastrocnemius muscle, and the resistance training had no effect on the distribution of this protein.

Avaliamos os efeitos da glicação do colágeno (CG) e da glicose elevada sobre a migração de fibroblastos. Utilizamos células de ratos controle e diabéticos (D) e células NIH-3T3, cultivadas em glicose 5 mM ou 30 mM (HG). Para glicação utilizou-se ácido glioxílico. O CG apresentou menor resistência à tração e elasticidade. Fibroblastos migraram menos sob HG e sobre o CG. As células D no CG não se deslocaram, apresentaram menos integrina &#946;141 e expressaram mais &#945;-actina de músculo liso. A viscoelasticidade do citoesqueleto foi menor em células D, especialmente sobre o CG. Sobre fibronectina, células NIH-3T3 em HG apresentaram menos fibras de estresse e deficiência na retração da parte traseira. A expressão de miosinas IIA (MIIA), IIB (MIIB) e MRLC não foi alterada, mas a fosforilação de MII diminuiu. A distribuição de MIIB ficou mais difusa, enquanto MIIA não mudou. Células HG exerceram menor força sobre o substrato. A migração de fibroblastos em ambiente hiperglicêmico é deficiente, especialmente frente ao CG, em parte devido a uma redução da contratilidade celular. / We evaluated the effects of collagen glycation (GC) and high glucose concentrations on fibroblasts migration. Fibroblasts derived from control and diabetic rats (D) and NIH-3T3 cells were cultured under 5 mM or 30 mM glucose (HG). For glycation, glyoxylic acid was used. The GC showed lower tensile strength and elasticity. Fibroblasts migrated less in HG and over the GC. D cells did not move on GC, showed less &#946;141 integrin and a higher expression of smooth muscle &#945;-actin. The viscoelasticity of the cytoskeleton was lower in D cells, especially on the GC. On fibronectin, NIH-3T3 cells under HG had fewer stress fibers and showed impaired contraction at the rear, presenting long tails. The expression of myosin IIA (MIIA), IIB (MIIB) and MRLC has not changed, but the phosphorylation of MII decreased. The distribution of MIIB became more diffuse, while MIIA has not changed. Cells under HG exerted less force on the substrate. The migration of fibroblasts in hyperglycemic environment is impaired, especially on GC, partly due to a reduction of cell contractility.

O cristalino de vertebrados se origina a partir da invaginação do ectoderme que recobre a vesícula óptica. A invaginação epitelial em diversos modelos é causada pela constrição celular apical, mediada pela contração apical de actina e miosina II e regulada pela GTPase RhoA. Neste trabalho nós investigamos se a invaginação do cristalino em embriões de galinha ocorre devido à constrição celular apical e se este evento é controlado por RhoA. Actina filamentosa e miosina II são expressas na porção apical do cristalino durante a invaginação. Quando a polimerização de actina é inibida por Citocalasina D, o cristalino não invagina, sugerindo que a constrição celular apical poderia contribuir para a invaginação do cristalino. RhoA também é expressa durante o desenvolvimento do cristalino, mas a inibição de RhoA, por eletroporação da forma dominante-negativo, não impediu a invaginação do placóide do cristalino, não alterou a distribuição de miosina II na porção apical do cristalino nem sua ativação, indicando que a invaginação do cristalino independe de RhoA. / Vertebrate lens derives from invagination of the ectoderm that overlies optic vesicles. Epithelial invagination in many model systems is driven by apical cell constriction, mediated by actin and myosin II contraction regulated by GTPase RhoA. Here we investigate the possibility that chick lens placode invagination could also be driven by apical cell constriction and controlled by RhoA. We show that actin and myosin II are expressed at lens apical side during lens invagination. Actin polymerization inhibition by in ovo Cytochalasin D treatment prevents lens placode invagination, suggesting that lens placode invagination could be driven by apical cell constriction. RhoA GTPase is also expressed at apical portion of lens placode and during lens invagination. However, when we overexpressed by electroporation the dominant-negative RhoA in the pre-lens ectoderm invagination was not affected. Furthermore, dominant-negative RhoA didnt affect myosin II apical localization nor myosin II phosphorilation, indicating that in lens invagination this process is not regulated by GTPase RhoA.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-15T14:17:14Z No. of bitstreams: 1 Jaqueline Goes de Jesus. Estudo...2014.pdf: 4655999 bytes, checksum: 99ee2ef801cc69dd80d0a344e8f01be2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-15T14:18:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Jaqueline Goes de Jesus. Estudo...2014.pdf: 4655999 bytes, checksum: 99ee2ef801cc69dd80d0a344e8f01be2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T14:18:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaqueline Goes de Jesus. Estudo...2014.pdf: 4655999 bytes, checksum: 99ee2ef801cc69dd80d0a344e8f01be2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As ORFs I e IV do genoma do HTLV-1 codificam, respectivamente, as proteínas p12/p8 (acessória) e Tax (regulatória). p12/p8, de 99 aminoácidos, pode ser clivada em sua extremidade amino terminal gerando a proteína p8. A primeira clivagem proteolítica de p12 remove o sinal de retenção ao RE, enquanto a segunda clivagem, gera o produto de 8kDa, referido como p8. p12 localiza-se no sistema de endomembranes, residindo em RE e aparato de Golgi, enquanto p8 dirige-se para a membrana plasmática, onde é recrutada para a sinapse imunológica, através da ligação com o receptor de células T (TCR), além de participar da sinapse virológica e da formação de conduítes. A proteína Tax, por outro lado, atua como transativador transcricional do HTLV-1, sendo referida também na indução da expressão de diversos genes celulares, aumentando a proliferação e a migração das células infectadas. Na via de transporte de vesículas secretórias, vesículas produzidas como pós-Golgi são transportadas ao longo do citoesqueleto por motores celulares. A Miosina-Va, um motor não convencional, transporta diversos cargos, incluindo vesículas secretórias, vesículas sinápticas e de retículo endoplasmático. Outra proteína relacionada ao citoesqueleto é a Paxilina, que atua como molécula adaptadora nas adesões focais e cuja expressão está aumentada em indivíduos TSP-HAM. Na tentativa de compreender se Tax influencia no aumento da expressão de Paxilina e, paralelamente, se p8 trafega a partir de Golgi em direção à membrana, de maneira dependente de Miosina-Va, células de linhagem foram transfectadas, com o plasmídeo que expressa Tax ou com plasmídeos que expressam variantes da proteína p12 (pMEp12) fusionada a um tag de HA (hemaglutinina de influenza) e que expressam porções da Miosina-Va, incluindo a cauda completa neuronal conjugada com GFP (MyoVa FTNeu-eGFP), que funciona como dominante negativo e compete com a Miosina-Va constitutiva pelos seus ligantes intracelulares. A localização intracelular das proteínas foi realizada por ensaio de imunofluorescência indireta utilizando anticorpos contra a Paxilina ou contra o tag de HA e a cauda medial da Miosina-Va. Técnicas de microscopia confocal e obtenção de imagens foram realizadas utilizando o microscópio Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss Optical, Chester, Va.) e o software Adobe Photoshop CC. Surpreendentemente, nas células que expressavam Tax, a expressão de Paxilina, avaliada por imunofluorescência, foi menor, necessitando de novos ensaios para confirmação dos resultados. Em relação à p12/p8, foi observada a sua sub-localização celular como já descrito na literatura, apresentando-se na região perinuclear (RE e aparato de Golgi), e co-localização entre p12/p8 e Miosina-Va, embora apenas quando o dominante negativo MyoVa FTNeu-eGFP foi expresso simultaneamente com as variantes de p12, a localização de p12/p8 mostrou-se alterada, de pontos dispersos por todo o citoplasma e superfície celular para apresentar-se em forma de grumos agregados independentemente da variante de p12 expressa, sugerindo que a Miosina-Va desempenha um importante papel no tráfego de p8 partindo de Golgi até a superfície celular. / HTLV-1 ORFs I and IV encode respectively p12/p8 (accessory protein) and Tax (regulatory protein). The 99 amino acid p12 protein can be proteolytically cleaved at the amino terminus to generate the p8 protein. The first proteolytic cleavage removes the ER retention/retrieval signal at the amino terminus of p12, while the second cleavage generates the p8 protein. The p12 protein localizes to cellular endomembranes, within the ER and Golgi apparatus, while p8 traffics to lipid rafts at the cell surface and is recruited to the immunological synapse upon T-cell receptor (TCR) ligation, virological synapse and conduits. Tax on the other hand acts as viral transactivator and induces expression of many cellular genes, increasing proliferation and migration of infected cells. In secretory vesicle transport, vesicles produced as post-Golgi are moved along the cytoskeleton by motor proteins. The unconventional myosin motor, Myosin-Va, moves several cargoes including secretory vesicles, synaptic vesicles, and the endoplasmic reticulum. Another cytoskeleton associated protein is Paxillin, an adapter on focal adhesions which expression is increased in TSP-HAM patients. To understand if Tax play a role on increased expression of Paxillin and parallel if p8 traffics from Golgi apparatus to cell surface on a myosin-Va dependent manner, lineage cells were transfected with Tax plasmids or pMEp12 plasmids which express variants (p12WT, p12Δ29 and p12G29S) of the fusion protein of HTLV-1 p12 tagged with the influenza hemagglutinin (HA1) tag and with the Myo-Va plasmids including full-tail neuronal-eGFP conjugated (MyoVa FTNeu-eGFP) plasmid which expresses a negative dominant of myosin Va and competes for intracellular ligands with cellular putative myosin. Proteins intracellular localization were analyzed by indirect immunofluorescence assay using antibodies against Paxillin or the HA-tag and the Myo-Va protein. Confocal microscopy and image collection was performed by using a Zeiss LSM 780 microscope (Carl Zeiss Optical, Chester, Va.) with Adobe Photoshop CC software. Surprisingly in Tax-expressing cells Paxillin fluorescence was decreased requiring another assay to confirm this find. It was reported that p12 expression in Jurkat T, as previous described, was shown in perinuclear region which might be RE and Golgi apparatus and that p12/p8 and MyoVa proteins colocalizes in lineage cells, however only when MyoVa FTNeu-eGFP was simultaneously expressed with pMEp12 plasmids, p12/p8 localization showed to be altered from dots dispersed all over cytoplasm and cell surface to form cytoplasmic aggregates independently on variant of p12 expressed, suggesting that myosin Va plays an important role on traffics of p8 from Golgi to cell surface.

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:12:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_RodrigoWagnerAlves_M.pdf: 2186081 bytes, checksum: 2a1578159471f249151f3b90ca0b76fb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O treinamento físico pode promover adaptações benéficas ao músculo esquelético. Entretanto, o treinamento de alta intensidade associado com um tempo insuficiente de recuperação, similar às condições de sobretreinamento, pode ocasionar efeitos prejudiciais. Os fatores reguladores miogênicos (MRFs) e o fator de crescimento IGF-1 são importantes reguladores da massa muscular no treinamento físico. Neste contexto, testamos a hipótese que o treinamento de alta intensidade com curto tempo de recuperação, poderia influenciar a morfologia, as isoformas da cadeia pesada de miosina (MHC), e a expressão dos MRFs MyoD e Miogenina e do IGF-1, no músculo esquelético de ratos. Ratos Wistar machos (200-250g) foram divididos em 4 grupos: treinado 8 semanas (T8), controle 8 semanas (C8), treinado 12 semanas (T12) e controle 12 semanas (C12). Os grupos T8 e T12 realizaram um programa de treinamento resistido de alta intensidade (5 dias/semana), envolvendo sessões de saltos em uma cuba contendo água. Ao término de cada período, os animais foram sacrificados e o músculo plantar retirado e submetido às análises morfológica e histoquímica, análises das MHCs e expressão gênica da MyoD, Miogenina e IGF-1. Do início ao final do experimento todos os grupos aumentaram o peso corporal, no entanto, o grupo T12 foi estatisticamente menor em relação ao C12. Com relação à área de secção transversal, observou-se uma redução das fibras IIC e IIAD no grupo T8 e IIA e IID no grupo T12 em relação aos seus controles. O grupo treinado por 12 semanas apresentou um aumento da frequência das fibras IIBD e redução nas frequências das fibras I, IIA e IID, em relação ao grupo controle; esses dados ainda foram corroborados pela redução das isoformas MHCI e MHCIIa e aumento da MHCIIb. A MHCIId não mostrou diferença significativa. A expressão gênica do grupo T12 apontou uma diminuição da MyoD e um aumento do IGF-1 comparado com o grupo C12; já, a expressão da Miogenina foi semelhante entre os grupos. Estes dados mostram que o modelo utilizado, semelhante às condições do sobretreinamento, promoveu a atrofia muscular e a transição das fibras musculares para uma atividade contrátil mais rápida. Estes fatos podem estar associados a uma menor atividade das células satélites. Em adição, o aumento da expressão do IGF-1, decorrente do treinamento, pode ter ocorrido na tentativa de prevenir o processo atrófico. / Abstract: Physical training can promote beneficial changes in skeletal muscle. However, the high-intensity resistance training associated with insufficient recovery time may cause harmful effects. Myogenic regulatory factors (MRFs) and the growth factor IGF-1 are important mediators of muscle mass during physical training. In this context, we tested the hypothesis that high-intensity resistance training with short recovery time, similar to overtraining conditions, could influence the morphology, the myosin heavy chain (MHC) isoforms and the expression of MRFs MyoD and myogenin, and IGF-1 in skeletal muscle of rats. Male Wistar rats (200-250 g) were divided into 4 groups: trained 8 weeks (T8), control 8 weeks (C8), trained 12 weeks (T12) and control 12 weeks (C12). T8 and T12 groups were subjected to a high-intesnsity resistance training program (5 days/week), involving jumps sessions into water, carrying progressive overload equivalent to percentage of body weight. At the end of each period the animals were sacrificed and the plantaris muscles were removed and submited to morphological and histochemical analysis, myosin heavy chain (MHC) analysis and the gene expression of MyoD, Myogenin and IGF-1. From beginning to end of the experiment all groups increased body weight, however, in T12 body weight was lower compared to the C12. Regarding the cross-sectional area, there was a significant reduction of the IIC fibers and IIAD in T8 group and IIA and IID in T12 compared to their controls. The group trained by 12 weeks showed an increase in the IIBD, accompanied by a reduction in the I, IIA and IID muscle fibers frequency, compared to control group; these data have been corroborated by the reduction of MHCI and MHCIIa isoforms and increased of MHCIIb isoform. The MHCIId showed no significant differences. The gene expression of the T12 group showed a decrease in MyoD and an increase in IGF-1 compared with the C12 group; already, the expression of Myogenin was similar between groups. These data show that the model used, similar to the conditions of overtraining, promoted muscular atrophy and muscle fiber transition to a faster contractile activity. These facts may be associated with a lower activity of satellite cells. In addition, increased expression of IGF-1, due to training, may have occurred in an attempt to prevent the atrophic process. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O cristalino de vertebrados se origina a partir da invaginação do ectoderme que recobre a vesícula óptica. A invaginação epitelial em diversos modelos é causada pela constrição celular apical, mediada pela contração apical de actina e miosina II e regulada pela GTPase RhoA. Neste trabalho nós investigamos se a invaginação do cristalino em embriões de galinha ocorre devido à constrição celular apical e se este evento é controlado por RhoA. Actina filamentosa e miosina II são expressas na porção apical do cristalino durante a invaginação. Quando a polimerização de actina é inibida por Citocalasina D, o cristalino não invagina, sugerindo que a constrição celular apical poderia contribuir para a invaginação do cristalino. RhoA também é expressa durante o desenvolvimento do cristalino, mas a inibição de RhoA, por eletroporação da forma dominante-negativo, não impediu a invaginação do placóide do cristalino, não alterou a distribuição de miosina II na porção apical do cristalino nem sua ativação, indicando que a invaginação do cristalino independe de RhoA. / Vertebrate lens derives from invagination of the ectoderm that overlies optic vesicles. Epithelial invagination in many model systems is driven by apical cell constriction, mediated by actin and myosin II contraction regulated by GTPase RhoA. Here we investigate the possibility that chick lens placode invagination could also be driven by apical cell constriction and controlled by RhoA. We show that actin and myosin II are expressed at lens apical side during lens invagination. Actin polymerization inhibition by in ovo Cytochalasin D treatment prevents lens placode invagination, suggesting that lens placode invagination could be driven by apical cell constriction. RhoA GTPase is also expressed at apical portion of lens placode and during lens invagination. However, when we overexpressed by electroporation the dominant-negative RhoA in the pre-lens ectoderm invagination was not affected. Furthermore, dominant-negative RhoA didnt affect myosin II apical localization nor myosin II phosphorilation, indicating that in lens invagination this process is not regulated by GTPase RhoA.

A doença de Pompe (GSDII), autossômica recessiva, é causada pela deficiência da enzima lisossomal que degrada o glicogênio, -glucosidase ácida (GAA). O quadro clínico varia de acordo com a idade de início da doença, grau de progressão e envolvimento dos tecidos: predominantemente cardíaco e muscular esquelético na forma de início-precoce (FIP) e mais restrito no músculo esquelético na forma de início-tardio (FIT). A sobrevida média na FIP é de 9-12 meses. Com avanço dos métodos histológicos, histoquímicos e imunoistoquímicos intensificou-se a análise estrutural e funcional dos tipos de fibras musculares. O estudo da vascularização também é de importância pelo aporte nutricional e funcional das fibras. O objetivo do presente trabalho é analisar a correlação da distribuição do tipo de fibras com a forma de apresentação clínica da doença de Pompe, seu genótipo correspondente e a quantidade residual da enzima GAA. Analisou-se 10 biópsias musculares de pacientes FIP e 09 de FIT comparados com o grupo controle, pareados por idade e gênero. Os pacientes foram selecionados segundo dados clínicos e laboratoriais, sendo feito o seqüenciamento de toda parte codificante do gene e Western Blotting (WB) com anticorpo monoclonal 15362-157, cedido pela Genzyme (primário 1:200 e secundário 1:10.000). A confirmação do diagnóstico foi feita através da medida da atividade residual de GAA em papel filtro, da presença de miopatia vacuolar com grânulos PAS e fosfatase ácida positivos em biópsia muscular e pela presença de mutação no gene GAA. A reação de imunoistoquímica foi realizada para fibras tipo I (lenta), tipo II (rápida) e densidade capilar (ulex), utilizando anticorpos monoclonais, respectivamente: antimiosina lenta (1:80), anti-miosina rápida (1:40) da Novocastra e ulex da Vector (1:800). A contagem das fibras foi realizada por 2 observadores em todo fragmento do corte transversal da biópsia com auxílio de um programa semi-automatizado. Observou-se predomínio de fibras tipo II em ambos os gêneros na FIP e predomínio de fibras tipo I em mulheres e tipo II em homens, na FIT. Aumento da densidade capilar, em comparação com os controles, foi notada em ambas as formas IP e IT. Verificou-se em média 90% de fibras vacuoladas nos casos FIP com completa distorção da arquitetura, enquanto na FIT, a porcentagem de fibras vacuoladas foi variável (0-88%). Como alguns genes constitutivos influenciam na distribuição das fibras musculares, como o gene ACE, o polimorfismo deste gene foi analisado quanto aos genótipos I/I, D/D e I/D. Observou-se ausência de concordância entre o genótipo do ACE e a distribuição de fibras em 60% dos casos da FIP e FIT, atribuindo-se o resultado da distribuição do tipo de fibras como parte da patologia da doença de Pompe. A gravidade da doença variou inversamente com a quantidade de enzima residual, sendo compatível com o quadro clínico do paciente. A presença de mutação deletéria em ambos os alelos foi observada em 3/10 casos de IP, sendo que todos os 3 casos apresentaram ausência total de enzima no WB. Há maior envolvimento de fibras tipo II em GSDII, sem depleção da microcirculação muscular. Estudos demonstram que a remoção do depósito de glicogênio ocorre diferencialmente nos tipos de fibra, sendo menos eficiente nas fibras tipo II. O achado do presente estudo poderá ter implicações na resposta à recente terapêutica proposta por reposição enzimática. / The glycogen storage disease type II (GSDII), autosomal recessive disorder, is caused by the deficiency of GAA (acid -glucosidase) a lysossomal enzyme that degrades the glycogen. The clinical findings are in accordance to great variability of age onset, degree of disease progression and extent of tissue involvement: predominantly cardiac and skeletal muscle in the infantile form (I) and more restricted to the skeletal muscle in the late-onset form (LO). The average survival time of the infantile form is 9-12 months. With advances of the histological, histochemical and imunohistochemical methods structural and functional analysis of muscle fiber types were intensified. The study of the capillary density is also important for nutritional and functional aspects. The objective of the present work is to analyze the correlations of the fiber type distribution to clinical presentation, genotype and residual GAA enzymatic activity. We analyzed 10 muscle biopsies of infantile and 09 of late-onset patients and compared to age and gender matched controls. The patients were selected according to clinical and laboratorial data, molecular diagnosis by full gene sequencing, and Western Blotting (WB) with monoclonal antibody 15362-157, courtesy Genzyme Science Group (primary 1:200 and secondary 1:10.000). Diagnostic confirmation was made by GAA enzymatic measurement in DBS, presence of vacuolar myopathy in muscle biopsy, and presence of mutation in GAA gene. The imunohistochemical study was carried out by detection of type I (slow), type II (fast) fibers and capillaries, using monoclonal antibodies, respectively: anti-slow myosin (1:80), anti-fast myosin (1:40) (Novocastra) and ulex (1:800) (Vector). Morphometry was performed by 2 observers using a half-automatized program. Type II fiber predominance was observed in both gender in the infantile form, type I fiber predominance in women and type II predominance in men with LO. Increase of the capillary density, in comparison to controls was noticed in both forms. 90% of vacuolated fibers with complete distortion of fiber architecture were demonstrated in I cases, while in LO, the percentage of vacuolated fibers ranged from 0 to 88%. As some constitutive gene, like ACE, influence muscle fiber distribution, its polymorphisms I/I, D/D and I/D gene were analyzed. Absence of agreement was observed between ACE genotype and fiber type distribution in 60% of I and LO cases, which was attributed as consequence of Pompe disease pathology itself. The disease severity varied inversely to the amount of residual GAA enzymatic activity, being compatible with the patient clinical findings. The presence of deleterious mutation in both alleles was observed in 3/10 infantile cases, and all 3 presented total enzyme absence at WB. A greater fiber type II involvement was observed in GSDII, without decrease in muscle capillary density. Recent studies demonstrated that glycogen deposit removal occurs distinctively in different fiber types, being less efficient in type II fibers. The present findings might have implications in the reply to the recent proposed enzyme replacement therapy.

A doença de Pompe (GSDII), autossômica recessiva, é causada pela deficiência da enzima lisossomal que degrada o glicogênio, -glucosidase ácida (GAA). O quadro clínico varia de acordo com a idade de início da doença, grau de progressão e envolvimento dos tecidos: predominantemente cardíaco e muscular esquelético na forma de início-precoce (FIP) e mais restrito no músculo esquelético na forma de início-tardio (FIT). A sobrevida média na FIP é de 9-12 meses. Com avanço dos métodos histológicos, histoquímicos e imunoistoquímicos intensificou-se a análise estrutural e funcional dos tipos de fibras musculares. O estudo da vascularização também é de importância pelo aporte nutricional e funcional das fibras. O objetivo do presente trabalho é analisar a correlação da distribuição do tipo de fibras com a forma de apresentação clínica da doença de Pompe, seu genótipo correspondente e a quantidade residual da enzima GAA. Analisou-se 10 biópsias musculares de pacientes FIP e 09 de FIT comparados com o grupo controle, pareados por idade e gênero. Os pacientes foram selecionados segundo dados clínicos e laboratoriais, sendo feito o seqüenciamento de toda parte codificante do gene e Western Blotting (WB) com anticorpo monoclonal 15362-157, cedido pela Genzyme (primário 1:200 e secundário 1:10.000). A confirmação do diagnóstico foi feita através da medida da atividade residual de GAA em papel filtro, da presença de miopatia vacuolar com grânulos PAS e fosfatase ácida positivos em biópsia muscular e pela presença de mutação no gene GAA. A reação de imunoistoquímica foi realizada para fibras tipo I (lenta), tipo II (rápida) e densidade capilar (ulex), utilizando anticorpos monoclonais, respectivamente: antimiosina lenta (1:80), anti-miosina rápida (1:40) da Novocastra e ulex da Vector (1:800). A contagem das fibras foi realizada por 2 observadores em todo fragmento do corte transversal da biópsia com auxílio de um programa semi-automatizado. Observou-se predomínio de fibras tipo II em ambos os gêneros na FIP e predomínio de fibras tipo I em mulheres e tipo II em homens, na FIT. Aumento da densidade capilar, em comparação com os controles, foi notada em ambas as formas IP e IT. Verificou-se em média 90% de fibras vacuoladas nos casos FIP com completa distorção da arquitetura, enquanto na FIT, a porcentagem de fibras vacuoladas foi variável (0-88%). Como alguns genes constitutivos influenciam na distribuição das fibras musculares, como o gene ACE, o polimorfismo deste gene foi analisado quanto aos genótipos I/I, D/D e I/D. Observou-se ausência de concordância entre o genótipo do ACE e a distribuição de fibras em 60% dos casos da FIP e FIT, atribuindo-se o resultado da distribuição do tipo de fibras como parte da patologia da doença de Pompe. A gravidade da doença variou inversamente com a quantidade de enzima residual, sendo compatível com o quadro clínico do paciente. A presença de mutação deletéria em ambos os alelos foi observada em 3/10 casos de IP, sendo que todos os 3 casos apresentaram ausência total de enzima no WB. Há maior envolvimento de fibras tipo II em GSDII, sem depleção da microcirculação muscular. Estudos demonstram que a remoção do depósito de glicogênio ocorre diferencialmente nos tipos de fibra, sendo menos eficiente nas fibras tipo II. O achado do presente estudo poderá ter implicações na resposta à recente terapêutica proposta por reposição enzimática. / The glycogen storage disease type II (GSDII), autosomal recessive disorder, is caused by the deficiency of GAA (acid -glucosidase) a lysossomal enzyme that degrades the glycogen. The clinical findings are in accordance to great variability of age onset, degree of disease progression and extent of tissue involvement: predominantly cardiac and skeletal muscle in the infantile form (I) and more restricted to the skeletal muscle in the late-onset form (LO). The average survival time of the infantile form is 9-12 months. With advances of the histological, histochemical and imunohistochemical methods structural and functional analysis of muscle fiber types were intensified. The study of the capillary density is also important for nutritional and functional aspects. The objective of the present work is to analyze the correlations of the fiber type distribution to clinical presentation, genotype and residual GAA enzymatic activity. We analyzed 10 muscle biopsies of infantile and 09 of late-onset patients and compared to age and gender matched controls. The patients were selected according to clinical and laboratorial data, molecular diagnosis by full gene sequencing, and Western Blotting (WB) with monoclonal antibody 15362-157, courtesy Genzyme Science Group (primary 1:200 and secondary 1:10.000). Diagnostic confirmation was made by GAA enzymatic measurement in DBS, presence of vacuolar myopathy in muscle biopsy, and presence of mutation in GAA gene. The imunohistochemical study was carried out by detection of type I (slow), type II (fast) fibers and capillaries, using monoclonal antibodies, respectively: anti-slow myosin (1:80), anti-fast myosin (1:40) (Novocastra) and ulex (1:800) (Vector). Morphometry was performed by 2 observers using a half-automatized program. Type II fiber predominance was observed in both gender in the infantile form, type I fiber predominance in women and type II predominance in men with LO. Increase of the capillary density, in comparison to controls was noticed in both forms. 90% of vacuolated fibers with complete distortion of fiber architecture were demonstrated in I cases, while in LO, the percentage of vacuolated fibers ranged from 0 to 88%. As some constitutive gene, like ACE, influence muscle fiber distribution, its polymorphisms I/I, D/D and I/D gene were analyzed. Absence of agreement was observed between ACE genotype and fiber type distribution in 60% of I and LO cases, which was attributed as consequence of Pompe disease pathology itself. The disease severity varied inversely to the amount of residual GAA enzymatic activity, being compatible with the patient clinical findings. The presence of deleterious mutation in both alleles was observed in 3/10 infantile cases, and all 3 presented total enzyme absence at WB. A greater fiber type II involvement was observed in GSDII, without decrease in muscle capillary density. Recent studies demonstrated that glycogen deposit removal occurs distinctively in different fiber types, being less efficient in type II fibers. The present findings might have implications in the reply to the recent proposed enzyme replacement therapy.

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule