O carcinoma renal de células claras é o tumor renal maligno mais frequentemente diagnosticado nos adultos. Uma série de defeitos genéticos tem sido observada no tecido tumoral renal e tais achados podem estar envolvidos na gênese ou progressão desses tumores. Alterações metabólicas e genéticas da mitocôndria são fatores que contribuem para muitas doenças humanas, incluindo o câncer. Objetivo: Estabelecer método para extração mitocondrial sem contaminação pelo DNA nuclear; verificar se existe contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs) no sequenciamento do genoma mitocondrial no carcinoma renal de células claras. Métodos: Para o estudo foram selecionados quatro pacientes portadores de carcinoma renal de células claras. Após a cirurgia obtivemos de cada paciente um fragmento de tumor e um fragmento de parênquima renal sem comprometimento neoplásico, as amostras de cada paciente foram extraídas de forma que ao final pudéssemos obter quatro amostras de DNA, sendo duas com isolamento da mitocôndria e duas sem o isolamento da mitocôndria. As amostras obtidas foram submetidas às seguintes análises genéticas: Sequenciamento completo do mtDNA; Reação em cadeia da polimerase para avaliação da contaminação do mtDNA obtido com isolamento da organela por DNA nuclear; avaliação do número de cópias do mtDNA (depleção) e patogenicidade das mutações. Resultados: Com os resultados obtidos neste estudo podemos afirmar que é possível a realização da extração do DNA mitocondrial sem a contaminação do genoma nuclear; e que o DNA mitocondrial extraído de maneira clássica do DNA total não apresentou contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs). / Clear cell renal carcinoma is the most frequently diagnosed malignant renal tumor in adults. A number of genetic defects have been observed in renal tumor tissue and such findings may be involved in the genesis or progression of these tumors. Metabolic and genetic changes in mitochondria are contributing factors to many human diseases, including cancer. Objective: To establish a method for mitochondrial extraction without nuclear DNA contamination; check for contamination by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs) in the sequencing of the mitochondrial genome in clear cell renal carcinoma. Methods: Four patients with clear cell renal carcinoma were selected for the study. After surgery, we obtained from each patient a tumor fragment and a renal parenchyma fragment without neoplastic involvement, the samples from each patient were extracted so that in the end we could obtain four DNA samples, two with mitochondrial isolation and two without the mitochondria isolation of mitochondria. The obtained samples were submitted to the following genetic analyzes: Complete sequencing of mtDNA; Polymerase chain reaction to evaluate the contamination of mtDNA obtained with organelle isolation by nuclear DNA; evaluation of mtDNA copy number (depletion) and pathogenicity of mutations. Results: With the results obtained in this study we can affirm that it is possible to perform mitochondrial DNA extraction without contamination of the nuclear genome; and that the mitochondrial DNA extracted from the classical DNA of the total DNA was not contaminated by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs).

As doenças cardiovasculares lideram as causas de morte em vários países, inclusive no Brasil, sendo a insuficiência cardíaca (IC) uma das enfermidades mais frequentes. Estudos epidemiológicos e de genética têm demonstrado associações entre a origem étnica dos indivíduos e o desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares. O presente estudo teve como objetivo avaliar a relação entre haplogrupos mitocondriais e ancestralidade genômica no desenvolvimento da IC. Foram avaliados 503 pacientes com IC e 188 controles saudáveis. Os haplogrupos mitocondriais foram obtidos pela análise da região controle do DNA mitocondrial (mtDNA) e o estudo de ancestralidade genômica foi realizado pela análise de 48 marcadores autossômicos informativos de ancestralidade (AIMs) tipo INDEL. As análises estatísticas foram realizadas com o uso de regressão logística, construção de curvas de Kaplan-Meier e utilizando o método estatístico de log-rank (Mantel-Cox). Os resultados dos AIMs evidenciaram contribuições semelhantes de ancestralidade genômica entre os grupos de pacientes e controles, evidenciando a não estratificação populacional da amostra. A comparação dos haplogrupos mitocondriais entre os dois grupos revelou uma associação dos haplogrupos africanos com risco aumentado (p=0,015; OR 1,56) para o desenvolvimento da IC, enquanto que os haplogrupos ameríndios foi associado a um menor risco (p=0,043; OR 0,71). As análises realizadas apenas dentro do grupo de pacientes revelaram que 74,6% dos indivíduos se autodeclararam como brancos. As etiologias encontradas com maior frequência na nossa amostra foram a hipertensiva (28,6%) e a isquêmica (28,4%). A análise de mtDNA evidenciou que pacientes pertencentes aos haplogrupos africano apresentaram risco aumentado para o desenvolvimento da IC nas etiologias chagásica (p=0,012; OR 2,32) e hipertensiva (p=0,003; OR 2,05). Evidenciou também que pacientes dos haplogrupos africanos, principalmente da etiologia isquêmica, desenvolveram IC mais cedo que os demais, e que os pacientes com esses haplogrupos da etiologia valvar apresentaram maior sobrevida no período avaliado. A análise dos AIMs demonstrou que, na etiologia hipertensiva, a maior contribuição da ancestralidade genômica africana conferiu risco aumentado (p=0,002; OR 6,07), enquanto que a maior contribuição de ancestralidade genômica europeia conferiu risco diminuído (p=0,001; OR 0,16) para o desenvolvimento da IC; os pacientes com maior contribuição de ancestralidade genômica ameríndia apresentaram maior sobrevida no período de 4 anos. O uso de marcadores autossômicos e do DNA mitocondrial fornece estimativas mais precisas da ancestralidade de um indivíduo e/ou população, enquanto que a autodeclaração de cor de pele fornece indiretamente informações importantes sobre aspectos socioeconômicos e culturais. Assim, seria interessante a utilização, especialmente em populações miscigenadas, de uma construção tridimensional de análise, que poderia fornecer dados mais informativos e complementares em estudos de associação entre etnia e fenótipos e/ou doenças complexas / Cardiovascular diseases are the leading cause of death in many countries, including Brazil, being the heart failure (HF) one of the most common diseases. Epidemiological and genetic studies have shown associations between the ethnic origin of individuals and the development of various cardiovascular diseases. The aim of this study was to evaluate the relationship between mitochondrial haplogroups and genomic ancestry in the development of HF. We evaluated 503 patients with HF and 188 healthy controls. The mitochondrial haplogroups were obtained by analysing the control region of mitochondrial DNA (mtDNA) and the study of genomic ancestry was conducted by the analysis of 48 autosomal ancestry informative markers (AIMs) INDEL type. Statistical analyzes were performed using logistic regression, construction of the Kaplan-Meier and using the log-rank test (Mantel-Cox). The results of AIMs showed similar contributions of genomic ancestry among the patients and controls groups, indicating no population stratification of the sample. Comparing mitochondrial haplogroups between the groups, we observed that african haplogroups show increased risk (p=0.015, OR 1.56) of development of the HF, while ameridian haplogroup was associated with a reduced risk (p=0.043, OR 0.71). The analysis carried out only within the group of patients showed that 74.6% of individuals self-declared as white. The etiologies found with greater frequency in our sample were hypertension (28.6%) and ischemic (28.4%). Analysis of mtDNA showed that patients belonging to african haplogroup have increased risk of the development of HF in chagasic (p=0.012, OR 2.32) and hypertensive etiologies (p=0.003, OR 2.05). It also showed that patients of african haplogroups, specially of ischemic etiology, developed HF earlier than others, and the patients with this haplogroup of valvular etiology had better survival in the study period. AIMs analysis showed that in hypertensive etiology, the major contribution of african genomic ancestry conferred increased risk (p=0.002, OR 6.07), while the major contribution of european genomic ancestry conferred decreased risk (p=0.001, OR 0 16) to the development of HF; patients with higher contribution of amerindian genomic ancestry had better survival within 4 years. The use of autosomal markers and mtDNA provides more accurate estimates of ancestry of an individual and/or population, while the self-declared ethnicity, indirectly provides important information about socioeconomic and cultural aspects. Thus, it would be interesting to use, especially in admixed populations, the construction of a three-dimensional analysis, which could provide more informative and complementary data in studies of association between ethnicity and phenotypes and/or complex diseases

Mourella caerulea, popularmente conhecida como mirim-de-chão ou bieira, e Plebeia nigriceps, comumente chamada mirim nigriceps, são meliponíneos ocorrentes no sul do Brasil, polinizadores de plantas nativas e cultivadas. M. caerulea está principalmente relacionada ao bioma Pampa e seu hábito de nidificação é subterrâneo. P. nigriceps nidifica em frestas de rochas e muros, sendo encontrada tanto no Pampa como em Mata Atlântica. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade populacional destas duas espécies, através de três metodologias: a morfometria geométrica de asa, perfil de hidrocarbonetos cuticulares e sequenciamento de fragmentos de genes mitocondriais. Foram coletadas operárias de 24 colônias de M. caerulea em cinco localidades de sua distribuição natural e 53 colônias de P. nigriceps em oito localidades no estado do Rio Grande do Sul. Para análise do padrão de venação da asa, foram marcados 13 marcos anatômicos na asa anterior direita de cinco a 20 operárias por colônia. A análise genética foi realizada avaliando um fragmento do gene Citocromo Oxidase I em M. caerulea, e Citocromo B em P. nigriceps. A análise morfométrica demonstrou estruturação dos grupos com separação estatisticamente significativa (<0,0001) entre as localidades de M. caerulea. As distâncias morfométricas estão correlacionadas com a distância geográfica, e coerentes com regiões fisiográficas do bioma Pampa. A análise dos perfis de hidrocarbonetos distinguiu colônias de diferentes localidades, mas suas distâncias não apresentaram correlação com as distâncias geográficas. Foram encontrados seis haplótipos, todos exclusivos, com diversidade nucleotídica de 0,01631e uma diversidade haplotípica (Hd) de 0,74. Para P. nigriceps, as análises morfométricas apresentaram diferenças significativas entre localidades e correlação com as distâncias geográficas e biomas. A análise dos perfis de hidrocarbonetos distinguiu colônias de diferentes localidades, mas suas distâncias não apresentaram correlação com as distâncias geográficas. Foram encontrados 17 haplótipos, todos exclusivos, com diversidade nucleotídica de 0,0147 e diversidade haplotípica (Hd) de 0,94. A presença de diversos haplótipos exclusivos, perfis morfométricos e de hidrocarbonetos cuticulares em populações pertencentes a diferentes biomas indicam a necessidade de uma atenção especial para estas populações no momento da definição de estratégias de conservação das espécies. Uma especial atenção às abelhas da espécie Mourella caerulea, que além de ser uma espécie representante única de um gênero monoespecífico, apresenta grandes distâncias populacionais entre os indivíduos de todas as localidades amostradas. / Mourella caerulea and Plebeia nigriceps are two stingless bees with occurrence in the South region of Brazil. The first is commonly known as mirim-de-chão or bieira and the second is known as mirim nigriceps. Both species are important pollinators of native flora and crops. M. caerulea is related to Pampa biome and place nests on the ground. P. nigriceps occurs in both Pampa biome and Atlantic Rain Forest. This thesis had the objective of to evaluate the population variability of these species through three techniques: geometric morphometrics of wing, cuticular hydrocarbons (CHC) profiles and sequencing of fragments from mitochondrial DNA genes. We collected workers from 24 colonies for M. caerulea from five localities, and 53 colonies of P. nigriceps from eight localities in Rio Grande do Sul State. For the geometric morphometrics analysis, we used 13 landmarks plotted in the right forewing of five to 20 workers per nest. The fragments of mtDNA genes used for the molecular approach were from Cytochrome Oxidase I for M. caerulea and Cytochrome B for P. nigriceps. The morphometric approach discriminated the populations of M. caerulea from different localities (<0,0001). The morphometric distances are correlated to geographic distances and go along with the physiographic regions of Pampa biome. CHC profiles differentiated the colonies of M. caerulea from different localities, but chemical distances are not in agreement with geographic distances. We found six haplotypes (all exclusives) with a nucleotide diversity of 0.01631 and a haplotype diversity (Hd) of 0.74. For P. nigriceps, morphometric analysis was significant separating localities and in accordance with the geographic distances and biomes. CHC distinguished the colonies, but there was no significant correlation between this result and the geographic distances or biomes. mtDNA revealed 17 haplotypes (all exclusives) with a nucleotide diversity of 0.0147 and a haplotype diversity (Hd) of 0.94. The discovery of different exclusives haplotypes, the morphometric and CHC profiles when comparing population belonging to different biomes indicate that we need to give a particular attention for these species at the moment of create conservation strategies for both biomes from Rio Grande do Sul. M. caerulea deserves a special concern once it is the only species of the monospecific genera, and its populations are distant between themselves.

Entre le XIème et le XVIème siècle, la Mer des Indes fut le théâtre de nombreux mouvements populationnels aux fins essentiellement commerciales ou coloniales. Madagascar se trouve à la croisée des mondes asiatiques et africains. La côte sud-est malgache a vu l'arrivée de plusieurs migrations : la dernière, probablement vers la fin du XVème siècle, serait celle des Antemoro dont une partie d'entre eux se réclame d'une origine arabe et se rattache à La Mecque. L'éthnie des Antemoro a fait l'objet de nombreuses études anthropologiques et linguistiques. Néanmoins, le débat sur l'origine des migrants fait toujours l'objet d'hypothèses contradictoires. Leurs origines génétiques pourraient ainsi être l'Arabie, l'Afrique de l'Est, l'Inde ou encore l'Asie du Sud-Est à une époque où ces régions étaient déjà islamisées. Ce travail a consisté à étudier la diversité génétique d'une population Antemoro afin d'apporter des éléments de réponse à la question de leur origine biologique. Ce projet interdisciplinaire a pour objectif de mettre en relation l'anthropologie culturelle et sociale avec l'anthropologie biologique. Le polymorphisme du chromosome Y a été étudié afin de rechercher les origines des lignées paternelles par l'analyse de 17 marqueurs microsatellites ainsi que des mutations ponctuelles de l'ADN de la partie non recombinante du chromosome Y. De même, la variabilité génétique des lignées maternelles a été analysée par séquençage des régions hypervariables I et II de l'ADN mitochondrial, et par la définition de polymorphismes bialléliques dans sa région codante. Nous avons mis en évidence la présence de deux haplogroupes du chromosome Y chez certains groupes Antemoro, qui les différencient de la diversité habituellement rencontrée dans les populations malgaches. Bien que la majeure partie des Antemoro entre dans la diversité observée en Afrique sub-Saharienne et en Asie du Sud-Est, quelques haplotypes, des lignées paternelles, les lieraient au Moyen-Orient. Les lignées maternelles, quant à elles, ne les différencient pas de celles des autres populations malgaches. L'isolat génétique formé par certaines « pseudo-castes » Antemoro confirme bien l'isolat culturel. Ce travail apporte une nouvelle vision de la diversité génétique humaine à Madagascar. / Between the 11th and 16th century, the Indian Ocean was the scene of many population movements notably for commercial and colonial purposes. Madagascar is located at the crossroads of the Asian and African continents. Several migrations have occurred in this region; the last one during the late 15th century involved the Antemoro population who claimed an Arabian origin in Mecca. Many anthropological and linguistic studies have been carried out on this ethnic group, but the origin of these migrants remains contentious. It is uncertain whether their origins were in Arabia, East Africa, India or Southeast Asia, when these regions were Islamized. In this study we assessed the genetic diversity of an Antemoro population from villages between Manakara and Vohipeno, to determine their biological origin. The aim of our interdisciplinary study was to link cultural and social anthropology with biological anthropology. Y-chromosome polymorphisms were studied by analyzing 17 microsatellites markers and some SNPs in the non-recombining region of the Y-chromosome to determine the biological origins of the paternal lineages. In addition, genetic variability of maternal lineages was analyzed by sequencing hypervariables regions I and II, and by defining bi-allelic polymorphisms in the coding region of mitochondrial DNA. We found two Y-chromosome haplogroups in some Antemoro groups that differentiated them from the typical genetic variability found in other Malagasy populations. Although most of the Antemoro showed a genetic diversity similar to that observed in sub-Saharan Africa and Southeast Asia, few haplotypes associated to paternal lineages linked them to the Middle East. Maternal lineages did not differ from those found in other Malagasy populations. The genetic isolate formed by some Antemoro groups confirmed their cultural isolation. This study provides a new view of the human genetic diversity in Madagascar.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leonardo Mariano Reis.pdf: 8263558 bytes, checksum: d4842ddc6615e7587ee43da1794b8d63 (MD5) Previous issue date: 2013-03-18 / Abstract of the First Chapter Objective: The objective was to make a wide review of the literature about the genetic aspects of glaucoma, with a highlight at the works dealing with mitochondrial DNA. Methods: Bibliographical research was carried out accessing the sites Scopus, Science Direct, PubMed, Scirus, Scielo and Google. Books, theses and dissertations were also used at the research. Results: The works brought to evidence that there is a relation between certain polymorphisms in mitochondrial DNA and a higher loss of retinal ganglion cells, which leads to the development of Glaucoma, especially Primary Open Angle Glaucoma. Conclusion: Higher incidence of Primary Open Angle Glaucoma (POAG) in afro-descendants is justified by the mitochondrial haplotypes, since it was observed a higher susceptibility of POAG in individuals of the L haplogroups, who are exactly the ones of African origin. It could also justify, based on mitochondrial inheritance, the major incidence of POAG in the maternal lineages, more frequent than paternal inheritance. Abstract of the Second Chapter Objective: To quantify the volume of the scientific production about Primary Open Angle Glaucoma and Mitocohndrial DNA and assess which are the main institutions of research; verify the contribution of the authors that most published about the subject; list the main journals with their Impact Factor; compare the countries and other bibliometric results. Methods: Bibliographical research about mitochondrial DNA and Primary Open Angle Glaucoma was carried out accessing the site Scopus. Then, search with the keywords mitochondrial DNA and glaucoma in all fields for publications until august of 2012 was performed. Finally, data was tabulated and the descriptive statistics was done, with the principal data, as: authors that published about mitochondrial DNA and Primary Open Angle Glaucoma; journals that had works about the subject; Research Centers and Universities that most published; countries where the researchs were performed. Results: The works brought to evidence the influences of certain polymorphisms in mitochondrial DNA at the development of Primary Open Angle Glaucoma. Statistics showed that theese articles have increased in the last few years, though yet confined, mostly, to some centers of research and concentrated in selected researchers in ophthalmology of developed countries. In Brazil, we do not have any article published about the issue, yet. Conclusion: 98 works were listed, until august of 2012, carried out in 30 countries, with higher concentration in the United States and England, but also with contributions of the Arabic world: Qatar and Saudi Arabia. There were more publications in the following journals: Molecular Vision, Investigative Ophthalmology and Visual Science, Archives of Ophthalmology, British Journal of Ophthalmology, Experimental Eye Research, Journal of Glaucoma and Progress in Retinal and Eye Research. More studies about the subject must be encouraged, for they are extremely important to the elucidation of the genetic causes of glaucoma and for the development of new therapies aiming not only the reduction of intraocular pressure. / RESUMO DO CAPÍTULO I Objetivo: O objetivo foi fazer uma ampla revisão de toda a literatura sobre os aspectos genéticos do glaucoma, com enfoque nos trabalhos que envolvem pesquisa com DNA mitocondrial. Métodos: A pesquisa bibliográfica foi realizada por meio das bases de dados: Scopus, Science Direct, PubMed, Scirus, Scielo e pelo sítio de busca Google. Foi feito também levantamento através de livros, dissertações e teses. Resultados: Os trabalhos evidenciaram que há alguma correlação de determinadas linhagens de DNA mitocondrial com maior perda de células ganglionares da retina, o que acaba levando ao desenvolvimento do glaucoma propriamente dito, sobretudo do glaucoma primário de ângulo aberto. Conclusão: Explica-se a maior incidência de glaucoma primário de ângulo aberto em indivíduos afrodescendentes a partir de haplótipos mitocondriais, uma vez que houve maior susceptibilidade ao glaucoma primário de ângulo aberto em haplótipos pertencentes aos grupos L, que são justamente os de origem africana. Também poder-se-ia justificar, a partir da herança mitocondrial, a maior incidência de glaucoma primário de ângulo aberto quando a linhagem materna apresenta a doença, bem mais frequente do que a herança paterna. RESUMO DO CAPÍTULO II Objetivo: Quantificar o volume da produção científica que relaciona o DNA mitocondrial com o Glaucoma Primário de Ângulo Aberto e avaliar quais são as principais instituições; verificar a contribuição dos autores que mais produziram publicações sobre o assunto; listar os principais veículos com os respectivos Fatores de Impacto; comparar os países que mais fizeram trabalhos sobre o tema e outros resultados bibliométricos. Métodos: A pesquisa bibliográfica de trabalhos envolvendo DNA mitocondrial e Glaucoma Primário de Ângulo Aberto foi realizada por meio da base de dados do sítio Scopus. Foi feito o levantamento a partir das palavras-chaves Mitochondrial DNA e Glaucoma em todos os campos para publicações até agosto de 2012. Finalmente, realizada a tabulação dos dados obtidos e a estatística descritiva, com o principais dados como: autores que publicaram sobre o assunto DNA mitocondrial e glaucoma; revistas e outras publicações que tiveram trabalhos relacionados com o tema; Centros de Pesquisa e Universidades que mais publicaram e países onde foram realizados os estudos sobre DNA mitocondrial e glaucoma. Resultados: Os trabalhos evidenciaram a influência de determinados polimorfismos de DNA mitocondrial no desenvolvimento do Glaucoma Primário de Ângulo Aberto. A estatística mostrou que esses estudos têm aumentado sobremaneira ao longo dos últimos anos, mas ainda se encontram confinados, na maior parte, a alguns centros de pesquisa e concentrados em seletos grupos de autores na área da oftalmologia em países desenvolvidos. No Brasil, ainda não temos pesquisas publicadas sobre o assunto até o momento. Conclusão: Foram listados 98 trabalhos até agosto de 2012, realizados em 30 países, com maior concentração nos Estados Unidos e Inglaterra; mas também com contribuições do mundo árabe: Arábia Saudita e Catar. Esses estudos foram mais publicados nas revistas: Molecular Vision, Investigative Ophthalmology and Visual Science, Archives of Ophthalmology, British Journal of Ophthalmology, Experimental Eye Research, Journal of Glaucoma e Progress in Retinal and Eye Research. Mais estudos sobre o assunto devem ser encorajados pois são de fundamental importância para a elucidação das causas genéticas do glaucoma e para o desenvolvimento de novas terapias que não visem tão somente a diminuição da pressão intraocular.

INTRODUÇÃO: A forma clássica de encefalomiopatia mitocondrial associada à mutação do DNA mitocondrial m.3243A>G é a Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (síndrome de MELAS). Entretanto, o espectro de manifestações clínicas dos indivíduos que apresentam essa mutação é bastante amplo. OBJETIVO: Descrever o espectro clínico, laboratorial e de imagem de pacientes com doença mitocondrial decorrente da mutação m.3243A>G. MÉTODOS: Estudo descritivo retrospectivo de uma série de casos de pacientes com a mutação m.3243A>G em seguimento no ANEM/HCFMRP-USP. Os dados clínicos e informações sobre exames complementares foram coletados através de revisão sistemática dos prontuários médicos dos pacientes selecionados. Os exames de neuroimagem foram revisados juntamente com neurorradiologista experiente para descrição das lesões encontradas. RESULTADOS: No período compreendido entre maio de 2000 e maio de 2015, a mutação m.3243A>G foi pesquisada em um total de 817 pacientes, em DNA extraído de células do sangue periférico (n= 441), de fragmentos de biópsia de músculo esquelético (n= 293), de ambos (n= 82) e mais raramente de células do sedimento urinário (n=1). Dentre esses, 16 indivíduos de 12 famílias apresentaram a referida mutação, resultando em uma taxa de detecção da mutação de 1,96% nessa população. Foram incluídos no estudo 12 indivíduos de 9 famílias que estavam em seguimento no nosso serviço. Os achados mais comuns nesta série foram em ordem de frequência: sinais de miopatia, transtornos neurocomportamentais, epilepsia, endocrinopatias, ataxia cerebelar, migrânea, episódios semelhantes a AVC, vômitos recorrentes, distúrbios de condução cardíaca, neuropatia periférica e sinais de disautonomia, mioclonias, surdez neurossensorial, cegueira cortical, comprometimento ocular, e proteinúria. Em nossa série, identificamos que cinco pacientes foram classificados com a forma clássica de MELAS, dois apresentaram CPEO associada a outros sintomas como transtornos psiquiátricos e diabetes mellitus. Os demais pacientes apresentavam características clínicas que não configuravam uma síndrome clinica definida. Além das lesões semelhantes a AVC, as lesões reveladas por neuroimagem mais frequentes nessa população foram alteração de sinal dos núcleos da base, atrofia encefálica e alteração de sinal da substância branca, sendo igualmente prevalentes entre os pacientes com a síndrome clássica de MELAS e os pacientes que não apresentaram lesões semelhantes a AVC. Dos pacientes com MELAS, 100% apresentaram pico anômalo de lactado e 60% redução do NAA à espectroscopia de prótons; enquanto que entre os pacientes sem lesões semelhantes a AVC essas alterações foram encontradas em dois e em um paciente Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G 8 respectivamente. Nós identificamos o achado inédito de azoospermia associada à mutação m.3243A>G. Essa é a maior série de casos de pacientes brasileiros com a mutação m.3243A>G até o momento. CONCLUSÃO: O amplo espectro de apresentação clínica e de neuroimagem é uma característica notável entre os pacientes com a mutação m.3243A>G do DNAmt. Essa desordem deve ser considerada em pacientes com evidência de sinais e sintomas que sugiram acometimento multissistêmico. / INTRODUCTION: The classic form of mitochondrial encephalomyopathy associated with m.3243A>G mutation is the Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS syndrome). However, the spectrum of clinical manifestations of patients with this mutation is quite wide. OBJECTIVE: To describe the clinical, laboratory and imaging spectrum of patients with mitochondrial disease due to m.3243A>G mutation METHODS: A retrospective descriptive study of a series of cases of patients with the m.3243A>G mutation in follow-up in ANEM/HCFMRP-USP. Clinical data and information about additional tests were collected through systematic review of medical records of selected patients. Neuroimaging studies were reviewed with supervision of experienced neuroradiologist and the lesions were described. RESULTS: Between May 2000 and May 2015, the mutation m.3243A>G was evaluated in a total of 817 patients, on DNA extracted from peripheral blood (n = 441), skeletal muscle biopsy samples (n = 293), both (n = 82) and more rarely urinary sediment cells (n = 1). We founded 16 individuals 12 families with the mutation, resulting in a mutation detection rate of 1.96 % that population. 12 individuals from nine families, who were following at our service, were included in this study. The most common findings in this series were in order of frequency: myopathy signs, neurobehavioral disorders, epilepsy, endocrine disorders, cerebellar ataxia, migraine, stroke-like episodes, recurrent vomiting, cardiac conduction disorders, peripheral neuropathy and signs of dysautonomia, myoclonus, sensorineural deafness, cortical blindness, uveitis, and proteinuria. In our series, we found that five of the patients were classified with the classical MELAS syndrome, two patients had CPEO associated with other symptoms such as psychiatric disorders and diabetes mellitus. The remaining patients had other features of mitochondrial disease not consistent with another recognised syndrome. In addition to stroke-like lesions, the more frequent lesions revealed in neuroimaging studies were deep gray matter changes, brain atrophy and white matter changes. These changes had similar prevalences between the patients with the classic syndrome of MELAS and patients who did not have stroke-like lesions. All patients with classical MELAS have lactate peak and 60% of them have reduction of NAA at spectroscpopy; while these changes were found in two and one patient respectively, in the group of patients without stroke-like lesions. We identified azoospermia in one paciente with classic MELAS, a finding not previously associated with m.3243A>G. At moment, this is the largest Brazilian case series of patients with the m.3243A>G mutation. Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G 10 CONCLUSION: The wide spectrum of clinical presentation and neuroimaging is a notable feature among patients with the mutation m.3243A> G mtDNA. This disorder should be considered in patients with evidence of signs and symptoms suggestive of multisystem involvement.

Hipertensão arterial (HA) ou pressão alta é uma doença com elevação crônica da pressão arterial (PA) e uma das maiores causas de óbitos no mundo. Há diferença sexual na HA. Receptores Toll-Like (TLRs) ativados induzem inflamação, situação presente na HA. Avaliamos o papel do DNA mitocondrial (DNAmit), que ativa TLR9 e é liberado por necrose celular, na reatividade de aortas de ratos hipertensos (SHR) machos e fêmeas. Estudamos a incubação do DNAmit na reatividade à acetilcolina, nitroprussiato de sódio (NPS), noradrenalina e fenilefrina (Fe), na expressão de TLR9, MyD88, ERK e eNOS e na concentração de IL-6, TNF-&#945;, IL-10 e EROs. O conteúdo de DNAmit no soro e a PA foram maiores em machos SHR versus outros grupos. Em aortas de machos SHR o DNAmit alterou a reatividade ao NPS e Fe, &#8593;ERK e o DNAmit+Fe potencializou a ERK e &#8593;IL-6, TNF-&#945; e IL-10. Nas fêmeas SHR o DNAmit &#8595;ERK, TNF-&#945; e o aumento de EROs induzido por Fe. Portanto, há diferença sexual na modulação da resposta vascular de SHR pelo DNAmit. Tratamento similar da HA para homens e mulheres deve ser reavaliado. / Arterial hypertension (AH) or high blood pressure is a disease with chronic blood pressure (BP) elevation and one of the major causes of death in world. There is sexual difference in AH. Activated Toll-Like receptors (TLRs) induce inflammation, a condition present in AH. We evaluated the role of mitochondrial DNA (mtDNA), which activates TLR9 and is release by cellular necrosis, in aorta reactivity of male and female hypertensive rats (SHR). We studied mtDNA incubation in acetylcholine, sodium nitroprusside (SNP), noradrenaline and phenylephrine (Phe) reactivity, in TLR9, MyD88, ERK and eNOS expression and in IL-6, TNF-&#945;, IL-10 and ROS concentration. Serum mtDNA content and BP were higher in males SHR versus other groups. In male SHR aorta the mtDNA modified the reactivity to SNP and Phe, &#8593;ERK and mtDNA+Phe potentiated ERK and &#8593;IL-6, TNF-&#945; and IL-10. In females SHR the mtDNA &#8595;ERK, TNF-&#945; and the increase in ROS induced by Phe. Thus, there is sexual difference in mtDNA modulation of SHR vascular response. Similar AH treatment for men and women might be reevaluated.

Les mitochondries jouent un rôle majeur dans le métabolisme de l'ATP des cellules eucaryotes. Le maintien de l'ADN mitochondrial (ADNmt) est fondamental pour la production d'énergie chez les organismes aérobie stricte. De grandes délétions de ADNmt sont à l'origine d'anomalies mitochondriales entrainant des maladies chez l'homme. Plusieurs gènes nucléaires impliqués dans le métabolisme de l’ADNmt ont été identifiés et caractérisés chez l'homme. Cependant, l’ensemble des facteurs et leurs activités requis pour le maintien de l'ADNmt reste largement inconnu. L'identification de ces facteurs et la détermination de leurs activités dans des systèmes modèles simples peuvent contribuer à l’étude du maintien de l'ADNmt et à la compréhension des mécanismes induisant des délétions de l’ADNmt chez l'homme. Le champignon filamenteux Podospora anserina est un modèle d'étude du maintien de l’ADNmt. Chez P. anserina, l’accumulation de délétions région-spécifiques de l’ADNmt (Δmt) est corrélée à la présence de la mutation AS1-4 dans le gène nucléaire codant la protéine cytosolique ribosomale S15. L'altération de la protéine S15 pourrait modifier la traduction de transcrits codant des protéines impliquées dans le maintien de l'ADNmt et indirectement causer l'accumulation des Δmt. Par une approche globale (translatome), nous avons analysé l’ensemble des transcrits associés aux ribosomes AS1-4 en cours de traduction. A partir des données obtenues, deux gènes candidats, PaIML2 et PaYHM2 potentiellement impliqués dans le maintien de l'ADNmt, ont été identifiés et étudiés. L'analyse fonctionnelle a été principalement développée pour PaYHM2. La protéine PaYHM2 partage 68% d’identité avec la protéine mitochondriale bi-fonctionnelle Yhm2 de levure, impliquée dans le transport de métabolites dans la mitochondrie et possèdant un domaine de liaison à l'ADN. J'ai démontré que le gène PaYHM2 est essentiel pour P. anserina, un organisme aérobie stricte et que la protéine PaYHM2 est mitochondriale. Par mutagénèse, j'ai montré que c'est la fonction de transport qui est essentielle à la survie du champignon et non pas la putative capacité à se lier à l'ADN. Les résultats obtenus suggèrent également que PaYHM2 participe au métabolisme de l'acétyl-CoA chez P. anserina. / Mitochondria play main role as adenosine triphosphate (ATP)-energy factories of the eukaryotic cells. To ensure energy production, mitochondrial DNA (mtDNA) maintenance is essential for all obligate-aerobe eukaryotic organisms. Large-scale mtDNA deletions are major causes of mitochondrial dysfunction in human diseases. Several nuclear genes implicated in mtDNA metabolism were identified and characterized in human. Nuclear-encoded factors and their activities required for mtDNA maintenance are, however largely unknown. Identification of these factors and discovery of their activities in simple model systems can contribute to the comprehension of mtDNA maintenance and of the mechanisms leading to mtDNA deletions in human. The filamentous fungus Podospora anserina is a useful model system for studying mtDNA maintenance. An S15 cytosolic ribosomal protein mutant in P. anserina, named AS1-4 mutant, shows a positive correlation with the accumulation of specific large mtDNA deletion (Δmt) at the time of death. Alteration of S15 protein might modify translation of transcripts encoding proteins related to mtDNA maintenance and indirectly cause Δmt accumulation. Polysome profiling (called translatome), a global approach giving genome-wide informations about modified transcripts on translation, was performed on AS1-4 mutant. From the data of this translatome, two candidate genes potentially related to mitochondrial DNA maintenance, the PaIML2 gene and PaYHM2 gene has been identified and functionally analyzed. The function of the PaYHM2 gene has been especially characterized in this project. This gene encodes a protein sharing 68% of identity with yeast Yhm2, a bi-functional protein as a mitochondrial carrier and as a protein with DNA-binding activity. I demonstrated that the PaYHM2 gene is essential for P. anserina, an obligate-aerobe organism and that the PaYHM2 protein localizes to mitochondria. Through mutagenesis approach, I showed that the transport function decides the essentiality of mitochondrial carrier PaYHM2 while the putative DNA binding activity of PaYHM2 protein is important for P. anserina. Furthermore, I found that the function of PaYHM2 probably participates in the cytosolic acetyl-CoA metabolism.

La caractérisation des réseaux trophiques est nécessaire pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes et les mécanismes impliqués dans leur stabilité. Il est parfois difficile de déterminer les régimes alimentaires notamment pour des espèces discrètes et difficiles à observer comme les grands carnivores. Cependant, ces espèces jouent un rôle clé dans les écosystèmes dont elles influencent le fonctionnement et la biodiversité. Ainsi, connaitre le régime alimentaire des grands prédateurs avec précision est essentiel pour établir des stratégies de conservation. Diverses méthodes basées sur le monitoring, l'analyse d'échantillons invasifs ou non ont été utilisées pour étudier les régimes alimentaires. Elles sont généralement biaisées ou peu résolutives. Les méthodes basées sur l'identification des fragments d'ADN dans les fèces ont le potentiel de fournir une meilleure information, notamment dans le cadre d'une approche métabarcoding. Il s'agit de caractériser simultanément l'ensemble des espèces dont l'ADN est présent dans un échantillon environnemental, en utilisant les Nouvelles Techniques de Séquençage. Dans ce cas, les amorces universelles nécessaires pour amplifier toutes les proies potentielles amplifient également l'ADN du prédateur s'il y a proximité taxonomique (par exemple mammifères). Ainsi les produits PCR obtenus à partir des fèces sont essentiellement composés d'ADN du prédateur et ne reflètent pas l'ensemble du régime alimentaire. L'utilisation d'un oligonucléotide de blocage limitant spécifiquement l'amplification de l'ADN du prédateur peut résoudre ce problème. Nous avons développé une méthode de ce type basée sur l'utilisation d'amorces universelles pour les vertébrés (amplifiant la région 12SV5) et d'oligonucléotides de blocage. Bien que non quantitative, cette méthode s'est montrée robuste, adaptée à l'étude de prédateurs à très large spectre de proies, et très résolutive pour identifier les proies au niveau du genre et de l'espèce. Nous l'avons appliquée à l'étude du régime alimentaire du chat léopard (Prionailurus bengalensis) qui s'est avéré très diversifié (mammifères, oiseaux, amphibiens et poissons) dans les deux populations du Pakistan étudiées. Avec la même approche, nous avons démontré la réalité du conflit entre l'homme et le léopard commun (Panthera pardus) dont le régime est presque exclusivement composé d'animaux domestiques. Enfin, nous avons pu proposer des actions de conservations pertinentes après avoir montré que le régime de la très menacée panthère des neiges (Panthera uncia) est principalement composé d'ongulés sauvages. / Information on food webs is central to understand ecosystem functioning. It also provides information of ecosystem stability by evaluating the resource availability and use. Obtaining information on the diet can be critical especially when dealing with elusive carnivores, which are difficult to observe. However, these large carnivores are keystone species that influence the ecosystem through trophic cascades and maintain biodiversity. Thus, precise knowledge of their diet is a prerequisite for designing conservation strategies of these endangered species. Direct and indirect monitoring as well as invasive and non-invasive approaches that have been used to study the diet are either biased or have a low resolution. The DNA-based analysis of feces is an alternative method that may provide better information. It can be implemented through a metabarcoding approach, which is the simultaneous identification of multiple species from a single environmental sample containing degraded DNA by using Next Generation Sequencing. In this case, the use of universal primers for vertebrates amplifying all potential prey also amplifies the predator DNA when it belongs to a close taxon (e.g. mammals). Thus, the PCR products obtained from feces extracts will mainly consist of predator sequences and may not represent the full diet. The use of oligonucleotides specifically blocking the amplification of the predator DNA may overcome this problem. We have developed such a method based on the concomitant use of a universal primer pair (12SV5, amplifying all vertebrates) and blocking oligonucleotides for identifying the prey DNA fragments from predators feces. Even if the method developed is not quantitative, it is robust and adequate for studying predator with a very large dietary range and has a better resolution than traditional methods for identifying prey at the genus or species level. This methodology has been applied to characterize the highly eclectic diet (mammals, birds, amphibians and fishes) of two Northern-Pakistani populations of leopard cat (Prionailurus bengalensis). With the same approach, we demonstrated the importance of the Human-leopard conflict in Pakistan, due to the almost exclusive consumption of domestic animals by the common leopard (Panthera pardus). We could also highlight relevant conservation issues for the highly endangered and cryptic snow leopard (Panthera uncia), based on the fact that it mainly fed on wild ungulates.

Resumo: Com os objetivos de elucidar a origem genética do suíno casco-de-burro e de contribuir para sua conservação, realizou-se uma caracterização genética em 110 animais, oriundos das regiões Nordeste (NE), Centro-Oeste (CO) e Sudeste (SE), usando-se duas classes de marcador molecular e análises citogenéticas. Foram encontrados 13 haplótipos mitocondriais entre os cascos-de-burro, sendo que apenas um foi comum às três subpopulações (NE, CO e SE). O valor médio da diversidade haplotípica e o da nucleotídica na população total foram 0,61 e 0,05 respectivamente. Por meio do DNA mitocondrial, as subpopulações de casco-de-burro apresentaram menor distância genética da população da raça portuguesa bísara. No entanto o haplótipo mais frequente nos cascos-de-burro e o único comum a todas as subpopulações pertence à raça ibérica. A variabilidade genética média obtida por meio dos 25 microssatélites na população total foi: número de alelo = 9,8; conteúdo de informação polimórfica = 0,73; heterozigose esperada = 0,69; heterozigose observada = 0,58; consaguinidade (Fis) = 0,15; e apenas seis loci apresentaram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Considerando-se a divisão da população nas três subpopulações – que, por meio do DNA nuclear, estiveram mais próximas da população duroc e da bísara –, os valores observados para os índices de fixação foram: 0,10 para Fis, 0,09 para Fst e 0,18 para Fit. Os cascos-de-burro possuem o número diploide 2n = 38, não sendo verificado miscigenação com o javali. Os resultados demonstram origem genética ibérica para os cascos-de-burro, com posterior introgressão alélica das raças internacionais importadas no século passado / Abstract: With the purpose of elucidating the genetic origin of Brazilian Mulefoot pigs and to contribute to their conservation, 110 animals from Northeast (NE), Central- West (CW), and Southeast (SE) Brazil were characterized using two molecular marker classes and cytogenetic analysis. A total of 13 mitochondrial haplotypes was found, but only one was common to the three subpopulations (NE, CW, SE) of Brazilian Mulefoot pigs. The total population presented mean haplotype and nucleotide diversity values of 0.61 and 0.05, respectively. Mitochondrial DNA analysis showed that the Brazilian Mulefoot pig subpopulations presented the shortest genetic distance from the Portuguese Bísara breed. However, the most frequent haplotype found in the Brazilian Mulefoot population, and the only one common to all subpopulations belongs to the Ibérica breed. The mean genetic variability of the total population, obtained using 25 microsatellites, was: allele number = 9.8; polymorphic information content = 0.73; expected heterozygosity = 0.69; observed heterozygosity = 0.58; inbreeding = 0.15; and only six loci displayed Hardy-Weinberg equilibrium. Considering the three studied subpopulations – which were closer to the Bísara and Duroc populations, based on nuclear DNA – the values observed for the fixation indexes were: 0.09 for Fis, 0.10 for Fst, and 0.18 for Fit. Brazilian Mulefoot pigs have a diploid number of 2n = 38, which indicates that there is no interbreeding with wild boars. The results demonstrate that the genetic origin of Brazilian Mulefoot pigs is Iberian, with later allele introgression from foreign breeds imported during the 20th century / Orientador: Jeffrey Frederico Lui / Coorientador:Carlos Manuel M. Santos Fonseca / Coorientador: Maria Aparecida Cassiano Lara / Banca: Sandra Aidar de Queiroz / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Samuel Rezende Paiva / Banca: Eucleia Primo Betioli Contel / Doutor