Orientador: Flávio Henrique Caetano / Banca: Ana Maria Costa Leonardo / Banca: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti / Resumo: O presente estudo teve como objetivo analisar os leucócitos circulantes em microscopia de luz e eletrônica e sua distribuição sazonal, além de procurar estabelecer o período de renovação celular desses leucócitos, e principalmente de caracterizar os fagócitos mononucleares do sangue de tartaruga, e sua capacidade de fagocitose frente a material inerte. Neste trabalho utilizou-se seis tartarugas Phrynops hilarii, originárias de ilhas do estuário do rio Guaíba Porto Alegre (RS), que estavam ambientadas em nosso biotério. A coleta de sangue foi realizada em todos os períodos sazonais, por punção de vasos laterais do pescoço e coletados em tubos de ensaio heparinizados. Foram realizados esfregaços sanguíneos, corados com Leishmann e Giemsa, contando-se quinhentas células de cada animal e após a obtenção dos dados, foi aplicado o teste estatístico de Bonferroni. Para a análise autorradiográfica foi injetado 1000μCi / kg de thymidine-H A. Para microscopia eletrônica processamos a nata leucocitária obtida por meio de centrifugação do sangue, para a analise citoquímica incubamos com citidina-5'-monofosfato, betaglicerofosfato de sódio, Trimetafosfatase, para averiguar a resposta fagocitária utilizamos 0,01% de carvão coloidal.Os resultados mostram que os leucócitos de Phrynops hilarii tem descrição de leucócitos semelhantes às outras espécies, somente os basófilos e linfócitos não sofreram alterações em sua distribuição sazonal. Todos os leucócitos com exceção dos basófilos apresentaram renovação celular após sete dias. Caracterizamos monoblasto, promonócito, monócitos e macrófago no sangue circulante bem como a capacidade dos fagócitos mononucleares de fagocitar células mortas e materiais inerte. / Abstract: The aim of this study was to analyze the leukocytes in the blood using electronic and light microscopy and their seasonal distribution, also to characterize the leukocyte cells replacement and mainly to characterize the mononuclear phagocytes in the blood and their phagocytic capacity. In this study, it was used six turtles (Phrynops hilarii), caught at the Guaíba river estuary, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil and lodged for 1 week at the Central Animal House, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. Blood was obtained during the seasonal periods by puncturing the lateral vessels of the neck. The blood samples were stained by Leishmann and Giemsa, counting five hundred cells in each animal. After the obtained data, it was applied the Bonferroni test as statistical method. For the autoradiographic analysis, it was injected in the circulating blood 1000 μCi/kg of 3Hthymidine. For electronic microscopy, it was processed the leukocyte substrate by circulating blood centrifugation. For cytochemical analyses, blood smears were air dried, post-fixed in 4% formalin and submitted to the determination of the following enzyme activities: acid phosphatases (β-g1ycerophosphatase and citidine-5′-sodium monophosphatase), and trimetaphosphatase. The results showed that the leukocytes of Phrynops hilarii have the leukocytes description similar to the other species, only the basophiles and lymphocytes did not suffer alterations in their seasonal distribution. All the leukocytes, in exception of the basophiles showed cells replacement after seven days. It was characterized the monocytes and macrophages in the circulating blood as well as the phagocytes capacity. / Doutor

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Érika Nakaira Takahagi / Banca: Leandro Gustavo de Oliveira / Resumo: Monócitos do sangue periférico de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia encontram-se ativados endogenamente e secretam níveis elevados de radicais livres e citocinas inflamatórias. Este trabalho teve como objetivo avaliar se o estado inflamatório de monócitos, observado na pré-eclâmpsia, está associado à polarização da subpopulação de monócitos de perfil M1 no sangue periférico, correlacionando a expressão de receptores de superfície CD64, TLR2, TLR4, CD163 e CD206 com a produção de citocinas. Foram estudadas 90 gestantes, sendo 30 normotensas e 60 portadoras de pré-eclâmpsia, pareadas pela idade gestacional. Monócitos de sangue periférico obtidos de gestantes normais ou com pré-eclâmpsia foram cultivados por 18h na ausência ou presença de lipopolissacáride de Escherichia coli (LPS) ou de peptidoglicano (PG) de bactéria Gram-positiva. A expressão de receptores presentes na superfície da subpopulação de monócitos inflamatórios M1 (TLR2, TLR4 e CD64) e de monócitos supressores M2 (CD163 e CD206) foi detectada por de citometria de fluxo, empregando-se anticorpos monoclonais específicos, marcados com fluorocromos. Os resultados foram expressos como média da intensidade de fluorescência. Além disso, a produção de citocinas pró-inflamatórias associadas a padrão M1 (TNF-, IL-12p70 e IL-23) e anti-inflamatória, associada a perfil M2 (IL-10) foi avaliada no sobrenadante de cultura de monócitos pela técnica de ELISA. Os resultados foram analisados por testes não paramétricos, com nível de significância de 5%. A expressão de CD64 e TLR4 em monócitos, não estimulados, de gestantes com pré-eclâmpsia foi significativamente maior, enquanto a expressão de CD163 e CD206 foi significativamente menor em relação às gestantes normotensas, sugerindo a expressão de um perfil M1 de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Monocytes from peripheral blood of pregnant women with preeclampsia are endogenously activated and secrete high levels of free radicals and inflammatory cytokines. This work aimed to evaluate whether the inflammatory state of monocytes observed in preeclampsia is associated with the polarization of monocyte to M1 profile in peripheral blood, correlating the expression of surface receptors CD64, TLR2, TLR4, and CD163 and CD206 with cytokine production. We studied 90 pregnant women, 30 normotensive and 60 with preeclampsia, matched for gestational age. Peripheral blood monocytes obtained from normotensive pregnant or preeclamptic pregnant women were cultured for 18h in the absence or presence of Escherichia coli lypopolysacharide (LPS) or peptidoglycan (PG) of Gram-positive bacteria, and the expression of surface receptors on M1 inflammatory monocyte subpopulation (TLR2, TLR4 and CD64) and M2 suppressor monocyte subpopulation (CD163 and CD206) were evaluated by flow cytometry, using specific monoclonal antibodies, labeled with fluorochromes. The values were expressed as the mean fluorescence intensity. Moreover, the production of proinflammatory cytokines associated with M1 profile (TNF-, IL-12p70 and IL-23) and the anti-inflammatory cytokine associated with M2 profile (IL-10) were evaluated in the monocyte supernatant of culture by enzyme immunoassay. Results were analyzed using nonparametric tests with significance level set at 5%. The expression of CD4 and TLR4 on non-stimulated monocytes, from women with preeclampsia was significantly higher, while the expression of CD163 and CD206 was significantly decreased compared with normotensive pregnant women, suggesting the predominance of monocyte M1 profile. Endogenous production of TNF-, IL-12p70 and IL-23 by monocytes was increased, while synthesis of IL-10 was lower in women with... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Banca: Silvio Alencar Marques / Banca: Mário Léon Silva Vergara / Banca: Anamaria Mello Miranda Paniago / Banca: Gil Bernard / Resumo: Não há estudos publicados que tenham comparado itraconazol (ITC), associação sulfametoxazol-trimetoprim (cotrimoxazol - CMX) e ITC seguido de CMX (ITC/CMX), no tratamento da paracoccidioidomicose (PCM). Este estudo foi realizado para comparar eficácia, efetividade, segurança e tempos necessários para se alcançar cura clínica e sorológica em pacientes com PCM tratados com ITC ou CMX, antifúngicos mais utilizados nessa micose. Foi conduzido um estudo quasi-experimental em 177 pacientes com diagnóstico confirmado ou provável de PCM, virgens de tratamento ou com doença reativada e há pelo menos seis meses sem antifúngicos. Foram consideradas duas fases no tratamento: 1) inicial ou de ataque, mantido até se obter cura clínica e normalização da velocidade de hemossedimentação; 2) complementar, mantido até obtenção da cura sorológica. A comparação de médias foi feita pelo teste de Mann-Whitney, a de freqüências pelo teste do chi-quadrado e das variáveis em função do tempo pelas curvas de Kaplan-Meier e regressão de Cox, utilizando-se p≤0,05 para indicação de diferenças significantes. No tratamento de ataque, 47 pacientes tratados com ITC e 130 que receberam CMX não revelaram diferença de eficácia e efetividade, mas foi menor o tempo de cura clínica para os que receberam ITC que os tratados com CMX (105 vs 159 dias; p=0,001), em especial pacientes com forma crônica. No tratamento complementar, eficácia e efetividade foram similares nos três tratamentos, porém o tempo de cura sorológica foi menor com ITC (161 dias) e CMX (495 dias) do que com ITC/CMX (881 dias) [p=0,02]. Os preditores independentes de menor tempo de cura sorológica foram tratamento com ITC [razão de risco = 6,61; IC95% (2,01- 21,75)] e CMX [razão de risco = 5,11;IC95% (1,91-13,67)]). A prevalência de efeitos colaterais foi menor com ITC (6,4%) do que com CMX (20,0%; p=0,03). Este estudo revelou ... / Abstract: Not available / Doutor

Orientador: José Maurício Sforcin / Banca: Marjorie de Assis Golim / Banca: Marilia Afonso Rabelo Buzalaf / Banca: Maria Terezinha S. Peraçoli / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: A cárie e a doença periodontal são doenças infecciosas que refletem falha no equilíbrio da microbiota bucal, e seus agentes podem ser transmissíveis. A clorexidina tem sido utilizada como agente antimicrobiano no combate à carie, porém seu uso é controverso devido à ocorrência de efeitos colaterais. Assim, tem sido incansável a busca de novos produtos com atividade antimicrobiana e com menor efeito colateral. A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diversas partes das plantas, e se destaca por suas propriedades biológicas e farmacológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia. Neste projeto, visamos comparar a própolis com um agente antimicrobiano (clorexidina), bem como a combinação própolis/clorexidina, diretamente sobre Streptococcus mutans ou sobre a ação de monócitos humanos contra esta bactéria. Para tal, monitoramos a qualidade do produto odontológico elaborado à base de própolis em relação à sua estabilidade e possível contaminação durante 120 dias. Avaliamos o efeito do produto sobre S. mutans, determinando a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima, bem como seu efeito sobre monócitos humanos, avaliando a expressão de receptores celulares, a via de sinalização do NF-kB, a produção de citocinas pró- e antiinflamatórias, e a atividade bactericida de monócitos contra este agente causador da cárie. Tomados em conjunto, os dados evidenciaram que o produto apresentou-se palatável e livre de contaminantes, além de inibir o crescimento de S. mutans. Este produto pode favorecer o reconhecimento de antígenos por monócitos, ativar a via de sinalização do NF-kB e aumentar a atividade bactericida de monócitos humanos contra S. mutans. Ademais, o produto também desempenhou papel anti-inflamatório quanto à produção de citocinas, o que pode trazer benefícios no tratamento de doenças... / Abstract: The caries and periodontal disease are infectious diseases, reflecting failure to balance the oral microbiota, whose agents can be transmitted. Chlorhexidine has been used as anti-caries agent, but its use is controversial due to the occurrence of side-effects. Thus, there is a need to search for new products with antimicrobial activity and fewer side-effects. Propolis is a resinous product produced by bees from different parts of the plants, and stands out for its biological and pharmacological properties, and the application possibility in the pharmaceutical and food industry. In this project, we aimed to investigate propolis, an antimicrobial agent (chlorhexidine) and the combination propolis/chlorhexidine, directly on S. mutans and the action of human monocytes against this bacteria. The quality of propolis-based odontological product was analysed with regard to its stability and possible contamination for 120 days. We evaluated the effect of this product on S. mutans determining the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, and its effect on human monocytes, evaluating cell receptors expression, the NF-kB signaling pathway, the production of pro- and anti-inflammatory cytokines, and the bactericidal activity of these cells against S. mutans. Together, data showed that propolis/chlorhexidine in combination was palatable and contaminant-free, besides inhibiting the growth of S. mutans. The product may favor the recognition of antigens by human monocytes, activate the NF-kB signaling pathway and increase the bactericidal activity of monocytes against S. mutans. Also, the combination played an anti-inflammatory role in cytokine production, what can be beneficial in the treatment of periodontal diseases. The findings open perspectives for further research, denoting the practical application of this research and its implications for the pharmaceutical industry / Doutor

Orientador: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Alexandre Salgado Basso / Banca: Alexander Batista-Duharte / Resumo: A fagocitose, por células dendríticas (CD), de células apoptóticas (CA) infectadas induz a produção de TGF-β, IL-6 e IL-23, propiciando um microambiente com condições ideais para diferenciação de células Th17. Recentes resultados obtidos por nosso grupo demonstram que a fagocitose, por CD, de células apoptóticas infectadas resulta também na produção de altos IL- 1 e PGE2. A presença destes mediadores solúveis foi capaz de induzir a diferenciação de células Th17, in vitro, no entanto, a inibição da síntese de PGE2, pelo tratamento com inibidor não seletivo da COX (Indometacina), resultou no aumento da porcentagem destes linfócitos. Neste estudo foi avaliado o efeito da fagocitose de células apoptóticas infectadas com Escherichia coli (CA+Ec) na diferenciação de células Th17 in vivo e o efeito de PGE2 neste processo. A instilação de animais com CA+Ec, induziu a produção das citocinas IL-6, IL-1β e TGF-β no pulmão, o que sugere que a presença de CA+Ec é capaz de gerar um microambiente favorável para induzir a diferenciação Th17. A instilação de CA+Ec promoveu a diferenciação de células Th17, assim como a produção de IL-17. Porém, o tratamento com inibidor de COX resultou no aumento na porcentagem e no número de células Th17 no pulmão. A presença destas células resultou no aumento na porcentagem de neutrófilos no tecido pulmonar que parece refletir na diminuição da carga bacteriana recuperada do pulmão, quando comparado com animais que não receberam o tratamento. Assim, o conjunto destes resultados sugere que a fagocitose de CA+E. coli promove a diferenciação de células Th17. No entanto, a secreção de PGE2, pela fagocitose destas CA+Ec suprime a diferenciação e/ou migração de células Th17 para o pulmão, levando a inibição do recrutamento de neutrófilos e aumento da suscetibilidade às infecções pulmonares. / Abstract: The phagocytosis of infected-apoptotic cells (iAC) by dendritic cells (DC) induces the production of TGF-β, IL-6 and IL-23, providing a microenvironment to Th17 cell differentiation. Recent data obtained in our group showed that the phagocytosis of infected- apoptotic cells by CD also results in high levels of IL-1β and PGE2. The presence of these soluble mediators was able to induce the differentiation of Th17 cells, in vitro. However, the inhibition of PGE2 synthesis, by non-selective COX inhibitor (indomethacin), result the increase of percentage of Th17. In this study, it was evaluated the effect of phagocytosis of infected-apoptotic cells (AC+E. coli) during the Th17 cell differentiation, in vivo, and the effect of PGE2 in this process. The inoculation of AC+ Ec (in.) into lung induced the production of IL-6, IL-1β and TGF-β in lung, suggesting that the presence of AC+Ec is able to induce a microenvironment favorable to Th17 cell differentiation. The instillation of AC+Ec induced the differentiation of Th17 cells. However, the treatment of the animals with COX inhibitor resulted in an increase in the percentage, and number, of Th17 cells in the lung. The presence of these cells increased in the percentage of neutrophils in the lung and that apparently reflect in bacterial clearance from the lung, compared to animals that received no treatment. Taken all together, the phagocytosis of AC+Ec promotes the Th17 cell differentiation. However, the production of PGE2 by efferocytosis suppresses the differentiation and / or migration of Th17 cells to the lungs, impair the recruitment of neutrophils and increase the susceptibility to lung infections. / Mestre

Orientador: Dionei Ramos / Banca: Luiz Carlos Marques Vanderlei / Banca: Renata Calciolari Rossi / Resumo: Introdução: O tabagismo é considerado uma doença crônica e pode ter uma relação direta com doenças mentais, como a ansiedade e depressão. Além de, poder ocasionar alterações na composição corporal, inflamatórias, metabólicas, musculares e cardiorrespiratórias, promovendo o surgimento de doenças metabólicas, cardiovasculares e respiratórias. Objetivos: Avaliar os níveis de ansiedade e depressão e a relação entre carga tabágica com marcadores inflamatórios e metabólicos, composição corporal, força muscular, capacidade cardiorrespiratória e o risco de desenvolvimento de doenças metabólicas e cardiovasculares em tabagistas. Métodos: Estudo transversal, com tabagistas avaliados independente do sexo, com idade entre 18 a 60 anos. A avaliação foi composta de obtenção de dados de identificação pessoal, investigação de histórico tabagístico e critérios clínicos de dependência física à nicotina. Foram aplicados questionários referentes ao grau de dependência à nicotina (Fagerström), questionário socioeconômico e níveis de ansiedade e depressão (HADS). Foram realizados os seguintes testes: espirometria, dinamometria, bioimpedância, coleta de sangue venoso periférico e teste cardiopulmonar em esteira. Resultados: Foi encontrada associação entre tabagismo e ansiedade (p = 0,003) e depressão (p <0,001) mesmo após ajustes para fatores de confusão (tabagismo e ansiedade: OR sexo: 2,01; OR idade: 2,56; OR escolaridade: 2,25; OR nível socioeconômico: 2.26; tabagismo e depressão: OR sexo: 4.80;... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Smoking is a chronic disease and may be directly related to mental illness, such as anxiety and depression. Besides being able to cause changes in the body composition, inflammatory, metabolic, muscular and cardiorespiratory, promoting the emergence of metabolic, cardiovascular and respiratory diseases. Objective: To evaluate the levels of anxiety and depression and the relation between smoking load with inflammatory and metabolic markers, body composition, muscle strength and cardiorespiratory capacity and risk of developing metabolic and cardiovascular diseases in smokers. Methods: Cross-sectional study with smokers evaluated regardless of sex, aged between 18 and 60 years. The evaluation consisted of obtaining personal identification data, smoking history investigation and clinical criteria of physical dependence to nicotine. Questionnaires related to the degree of dependence on nicotine (Fagerström), socioeconomic questionnaire and levels of anxiety and depression (HADS) were applied. The following tests were performed: spirometry, dynamometry, bioimpedance, peripheral venous blood collection and cardiopulmonary treadmill test. Results: It was found an association between smoking and anxiety (p = 0.003) and depression (p <0.001) even after adjusting for confounding factors (smoking and anxiety: OR gender: 2.01; OR age: 2.56; OR schooling: 2, 25 OR, socioeconomic level: 2.26, smoking and depression: OR sex: 4.80; OR age: 3.13; OR education: 1.82; OR socioecon... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O vírus ZIKA pertence ao gênero Flavivírus e diversos trabalhos têm demonstrado que a infecção por esse vírus está associada com o desenvolvimento de anomalias congênitas fetais e doenças neurológicas como casos de microcefalia e de síndrome de Guillan-Barré. Com intuito de entender os mecanismos imunológicos de controle da replicação viral e na patogênese da doença, o objetivo do trabalho foi estabelecer um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV em animais imunocompetentes e investigar a migração de leucócitos para o sistema nervoso central durante a infecção por esse vírus. Os animais C57BL/6 infectados por ZIKV apresentaram um aumento da carga viral no sistema nervoso central (SNC) após 24 horas de infecção e uma redução significativa após 48 e 72 horas de infecção. No entanto, os animais deficientes do receptor de IFN tipo I (IFNAR-/-) apresentaram uma alta carga viral após 48 e 72 horas de infecção. Nossos dados mostram que os animais IFNAR-/- são altamente suscetíveis a infecção com 100% de mortalidade na fase aguda da doença, enquanto os animais C57BL/6 são resistentes a infecção com 100% sobrevida por mais de 30 dias de infecção. A infecção com ZIKA induziu o recrutamento de duas subpopulações de monócitos CD11b+Ly6Chi e CD11b+Ly6Clo para o SNC de maneira dependente da sinalização de IFN tipo I. Uma vez que, os animais C57BL/6 apresentaram um aumento de monócitos no SNC após 48 horas de infecção, enquanto que os animais IFNAR-/- apresentaram o recrutamento dessas células somente após 72 horas de infecção. De maneira interessante, o recrutamento dos monócitos culminou com um aumento da expressão das citocinas IL-6 e IL-18 no SNC de animais C57BL/6, enquanto que a expressão dessas citocinas não foi encontrada no SNC de animais IFNAR-/-, sugerindo a importância da via de sinalização de IFN tipo I para a produção dessas citocinas. E por fim, demostramos que a migração dos monócitos para SNC de animais infectados com vírus ZIKA é dependente da produção de CCL2 produzida no cérebro de animais infectados e da expressão dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Uma vez que, animais deficientes para CCR2 (CCR2-/-) e CCR5 (CCR5-/-) apresentaram uma redução da frequência dos monócitos CD11b+Ly6Chi para o SNC em comparação aos animais C57BL/6 após a infecção. De maneira geral, nossos dados mostram que os animais C57BL/6 são resistentes à infecção por ZIKV, uma vez que a via de sinalização de IFN do tipo I está envolvida no recrutamento de monócitos inflamatórios para SNC e consequente controle da replicação viral. O desenvolvimento de um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV abre perspectivas para o entendimento dos mecanismos de controle da replicação viral e sobre a patogênese da doença. / The ZIKA virus belongs to the genus Flavivirus, several studies have demonstrated that the infection by this virus is associated with the development of fetal congenital anomalies and neurological diseases, such as microcephaly and Guillan-Barré syndrome. In order to elucidate the immunological mechanisms of the viral replication control and the disease pathogenesis, the study aim was to establish an experimental model of ZIKV infection in immunocompetent animals and investigate the leukocytes migration to the central nervous system during this virus infection. ZIKV infected C57BL/6 animals demonstrated an increased viral load in the central nervous system (CNS) after 24 hours of infection and a significant reduction after 48 and 72 hours of infection. However, type I INF receptor deficient mice (IFNAR-/-) had a high viral load after 48 and 72 hours of infection. Our data demonstrated that IFNAR-/- animals are highly susceptible to infection with 100% mortality during the acute phase of the disease, while C57BL/6 mice are resistant with 100% survival for more than 30 days of infection. ZIKA infection induced the recruitment of two monocytes subpopulation CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6Clo to the CNS in a dependent manner of type I INF signaling. C57BL/6 mice showed an increase of monocytes in the CNS after 48 hours of infection, whereas IFNAR-/- mice recruited these cells only after 72 hours of infection. Interestingly, the monocytes recruitment culminated in an increased expression of IL-6 and IL-18 in C57BL/6 mice CNS, while these cytokines expression was not observed in the CNS of IFNAR-/- animals, thus suggesting the importance of type I INF signaling pathway for these cytokines production. Finally, we have demonstrated that the monocytes migration to the CNS from animals infected with ZIKA virus is dependent of CCL2 production in the brain of infected animals, as well as the expression of the chemokine receptors CCR2 and CCR5. Given that CCR2 (CCR2-/-) and CCR5 (CCR5-/-) deficient animals demonstrated a frequency reduction of CD11b+Ly6Chi monocytes to the CNS compared to C57BL/6 mice after infection. Overall, our data demonstrate that C57BL/6 animals are resistant to ZIKV infection, since the type I INF signaling pathway is involved in the inflammatory monocytes recruitment to the CNS and subsequent viral replication control. The development of an experimental model of ZIKV infection open perspectives for the understanding of viral replication control mechanisms and disease pathogenesis.

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Estomatite protética associada a Cândida (EPC), a lesão mais frequente em usuários de próteses removíveis, principalmente os idosos, caracteriza-se por uma inflamação da mucosa bucal que suporta a prótese. Está fortemente associada com Candida Albicans, bem como com fatores locais e sistêmicos, como a deficiência da resposta imune. Os monócitos são importantes na resposta protetora contra o fungo, produzindo citocinas que recrutam e ativam leucócitos. Existem alterações funcionais dessas células com o avanço da idade. Não foi possível encontrar na literatura dados referentes à função imunomodulatória dos monócitos de idosos com EPC. O presente trabalho pretendeu avaliar a produção de citocinas por essas células, estimuladas in vitro com C. albicans, obtidas do sangue periférico de idosos usuários de prótese total superior (PTS) com EPC, comparando-se com idosos usuários de PTS sem EPC, e com idosos e jovens não usuários de PTS. Os monócitos isolados foram cultivados em placas de cultura de 24 poços, na ausência ou presença de lipopolissacarídeo (LPS) ou C. albicans ATCC 90028 morta pelo calor. Após 18 horas, o sobrenadante foi coletado e submetido ao ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA) para dosagem das citocinas pró- inflamatórias fator de necrose tumoral- (TNF-), interleucina-6 (IL-6), IL-1, CXCL8 e proteína quimiotática de monócito (MCP-1), e anti-inflamatórias IL-10 e fator transformador de crescimento- (TGF-). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão dos valores obtidos para cada grupo, e foram analisados por meio de testes estatísticos não-paramétricos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os resultados demonstraram, de uma forma geral, alterações nos monócitos oriundos dos idosos com EPC, em comparação aos outros grupos: menor produção espontânea de CXCL8 e de MCP-1; menores níveis de TNF-, de IL-6, de IL-1, de CXCL8, de MCP-1 e de IL-10, após estímulo com LPS; e menor produção de TNF- e de IL-6, após estímulo com C. albicans. Comparando-se idosos e jovens, independente da presença de EPC, os resultados revelaram alterações nos monócitos dos idosos: uma menor produção de TGF-, espontânea e após estímulo com C. albicans. Em conclusão, a disfunção na produção in vitro de citocinas pró e anti-inflamatórias pelos monócitos de idosos com EPC pode representar um aspecto adicional associado à suscetibilidade ao desenvolvimento e à persistência da EPC. Ainda, a disfunção nos monócitos dos grupos de idosos, quanto à produção in vitro de TGF-, pode representar aspectos referentes à imunossenescência. / Candida-associated denture stomatitis (DS), the most frequent lesion among denture wearers, especially the elderly, is characterized by inflammation of the denture-bearing mucosa. It is strongly associated with Candida albicans, as well as with local and systemic factors, such as impaired immune response. Monocytes are important in the protective immune response against the fungus, by the production of cytokines that recruit and activate leukocytes. There are functional changes of these cells with advancing age. No data were found in the literature concerning the immunomodulatory function of these phagocytes in elderly patients with DS. This study aimed to evaluate the cytokine production by monocytes, challenged in vitro with C. albicans, obtained from peripheral blood of elderly denture wearers with DS, compared with elderly denture wearers without DS and elderly and young non-denture wearers. The isolated monocytes were cultivated in 24-well flat-bottomed culture plates, in the absence or presence of lipopolysaccharide (LPS) or heat-killed C.albicans ATCC 90028. After 18 hours, the supernatant was collected and submitted to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6), CXCL8, IL-1, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and anti-inflammatory cytokines IL-10 and transforming growth factor- (TGF-). The results are expressed as mean ± standard deviation of the values obtained for each group, and were analyzed using nonparametric statistical tests; p values <0.05 were considered statistically significant. The results demonstrated, in general, changes in monocytes from the elderly with DS, as compared to other groups: lower spontaneous production of CXCL8 and MCP-1; lower levels of TNF-, IL-6, IL-1, CXCL8, MCP-1 and IL-10 after stimulation with LPS; and reduced production of TNF- and IL-6 after stimulation with C. albicans. Comparing young and old, regardless of the presence of DS, the results revealed changes in the monocytes of the elderly: a lower production of TGF-, spontaneous and after stimulation with C. albicans. In conclusion, the dysfunctional in vitro production of pro- and anti-inflammatory cytokines by monocytes from elderly patients with EPC may represent an additional aspect associated with susceptibility to the development and to the persistence of DS. Still, the dysfunction in monocytes of elderly groups, regarding the in vitro production of TGF-, may represent aspects related to immunosenescence.

A fotobiomodulação (PBM) utiliza a luz nas porções do espectro visível e infravermelho para estimular a produção de trifosfato de adenosina (ATP), síntese de ácidos nucleicos, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e proliferação celular, promovendo resultados teraupêuticos benéficos, como a aceleração do reparo tecidual, analgesia e ativação de células do sistema imune. Deste modo, a presente pesquisa visou elucidar os efeitos da PBM sobre monócitos humanos in vitro, a fim de possivelmente estimular o burst oxidativo e, consequentemente, potencializar a defesa imune celular contra micro-organismos, além de analisar a expressão gênica em nível de RNA mensageiro (mRNA) de CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 e SOD1 em macrófagos derivados destas células. Neste contexto, culturas primárias de monócitos humanos foram irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® (MMO, São Carlos, SP, Brasil), operando com potência de 40mW, área de feixe de 0,04cm2, densidade de potência de 1W/cm2 e doses independentes de 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Após isto, as células foram submetidas ao ensaio de quimioluminescência para avaliação do burst oxidativo e quantificação da produção de ROS intracelulares e extracelulares. Ensaio da atividade microbicida foi realizado contra o fungo Candida albicans. Como controles positivo e negativo, utilizou-se o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e o diphenyleneiodonium (DPI), respectivamente. A viabilidade celular foi verificada por meio do reagente azul de Trypan. Adicionalmente, os monócitos humanos irradiados foram cultivados por 72 horas, a fim de observar a diferenciação destas células em macrófagos mediante estímulos relacionados a macrófagos ativados pela via clássica (M1) (LPS e Candida albicans) e a macrófagos ativados pela via alternativa (M2) (M-CSF). O RNA total foi extraído de cada grupo experimental e submetido à transcrição reversa e PCR em tempo real. GAPDH foi utilizado como controle endógeno e a expressão relativa de cada gene foi calculada utilizando o método 2-ΔCt. A produção de nitrito (NO2) também foi mensurada através da reação de Griess. Os resultados obtidos foram analisados por ANOVA e teste de Tukey ao nível de significância de 5%. Para dados com variâncias desiguais, utilizou-se o Kruskal-Wallis e pós-teste de Newman-Keuls. Desta forma, os monócitos irradiados apresentaram um aumento significativo na produção de ROS intracelulares e extracelulares comparativamente ao grupo controle (P < 0,001), sendo o comprimento de onda de 660nm e a dose de 400J/cm2, os parâmetros que mais se destacaram (P < 0,001). Como consequência deste perfil funcional elevado dos monócitos irradiados, a capacidade fungicida dos mesmos contra Candida albicans mostrou-se bastante aumentada (P < 0,001). Além disso, observou-se que a PBM (660nm; 400J/cm2) não causou danos à viabilidade celular dos monócitos nos dias subsequentes à irradiação laser. A análise da expressão gênica revelou que a PBM (660nm; 400J/cm2) aumentou significativamente a expressão da citocina pró-inflamatória TNF-α pelos monócitos irradiados (P = 0,0302), aproximando-os de uma resposta imune Th1. Complementarmente, um aumento significativo na produção de NO2 pelos monócitos irradiados também foi observado (P < 0,05). Portanto, a PBM, como empregada neste estudo, foi capaz de aumentar a geração de ROS e NO2, intensificar a atividade microbicida contra Candida albicans e aumentar a expressão de TNF-α, sugerindo uma modulação da PBM na indução de agentes pró-inflamatórios relacionados ao perfil funcional de M1. Vislumbramos em um futuro próximo, a reprodução desses resultados em monócitos humanos in vivo, colaborando no tratamento de candidoses orais, por exemplo. / Photobiomodulation (PBM) comprises the use of light within the visible and infrared spectrum to stimulate the production of adenosine triphosphate (ATP), nucleic acid synthesis, generation of reactive oxygen species (ROS) and cell proliferation, thus promoting beneficial therapeutical results, such as the acceleration of tissue repair, analgesia and activation of cells of the immune system. In that way, the present research aimed to elucidate the effects of PBM on human monocytes in vitro by possibly stimulating the oxidative burst of these cells and, consequently, enhancing the cellular immune defense against microorganisms, in addition to analyzing the gene expression at the messenger RNA (mRNA) level of CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 and SOD1 in macrophages derived from these cells. Thus, primary cultures of human monocytes were irradiated with an InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® diode laser (MMO, São Carlos, SP, Brazil), operating with power of 40mW, beam area of 0.04cm2, power density of 1W/cm2 and independent doses of 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Cells were then submitted to the chemiluminescence assay for oxidative burst evaluation and quantification of intracellular and extracellular ROS production. A microbicidal activity assay was performed against the fungus Candida albicans. As positive and negative controls, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and diphenyleneiodonium (DPI) were used, respectively. Cell viability was verified by Trypan blue reagent. Besides, irradiated human monocytes were cultured for 72 hours in order to observe the differentiation of these cells into macrophages by stimuli related to macrophages activated by the classical pathway (M1) (LPS and Candida albicans) and macrophages activated by the alternative pathway (M2) (M-CSF). Total RNA was extracted from each experimental group and submitted to reverse transcription and real-time PCR. GAPDH was used as endogenous control and the relative expression of each gene was calculated using the 2-ΔCt method. The production of nitrite (NO2) was also measured by the Griess reaction. The results obtained were analyzed by ANOVA and Tukey's test at a significance level of 5%. For data with unequal variances, Kruskal-Wallis and Newman-Keuls post-test were used. In that way, irradiated monocytes presented a significant increase in intracellular and extracellular ROS production compared to the control group (P < 0.001). The wavelength of 660nm and the dose of 400J/cm2 were the most relevant parameters (P < 0.001). As a consequence of this high functional profile of the irradiated monocytes, the fungicidal capacity of the monocytes against Candida albicans was shown to be greatly increased (P < 0.001). In addition, it was observed that PBM (660nm; 400J/cm2) did not cause damage to the cell viability of monocytes in the days following laser irradiation. Analysis of the gene expression revealed that PBM (660nm; 400J/cm2) significantly increased the expression of the proinflammatory cytokine TNF-α by the irradiated monocytes (P = 0.0302), bringing them closer to a Th1 immune response. Additionally, a significant increase in NO2 production by irradiated monocytes was also observed (P < 0.05). Therefore, PBM, as employed in this study, was able to increase ROS and NO2 generation, enhance microbicidal activity against Candida albicans and increase TNF-α expression, suggesting a modulation of PBM in the induction of related pro-inflammatory agents to the functional profile of M1. We envisage in a near future, the reproduction of these results in human monocytes in vivo, which would collaborate to the treatment of oral candidoses, for example. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES