A melatonina (MLT) é um hormônio responsável pela regulação dos ritmos circadianos, com ampla atuação na fisiologia animal, incluindo os seres humanos. Sua ação moduladora sobre o sistema imune possibilitou estudar seu efeito sobre a estimulação de monócitos na diferenciação em células dendríticas (DCs). Monócitos estimulados com MLT, durante a etapa de adesão de duas horas, apresentaram aumentada presença dos receptores para citocinas GM-CSF, IL-4 e TNF-a, necessários à geração de DCs in vitro. DCs geradas sob estímulo de MLT mostraram um aumento nas moléculas de membrana como CD40, CD80 e CD83. Foram detectadas as citocinas IL-6, IL-8 e IL-10 nos sobrenadantes de DCs imaturas, bem como IL-6, IL-8 e TNF-a para as DCs maduras. Lys estimulados por estas DCs mostraram um elevado índice de proliferação e detectou-se variação nas concentrações das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e IFN-g, dos sobrenadantes das co-culturas. O uso do inibidor da MLT, Luzindol mostrou tendência a inibição dos efeitos desse hormônio. / Melatonin (MLT) is a hormone responsible for the circadian rhythm regulation, with wide range of actions in animal physiology, including the human beings. Its modulatory action on immune system permited to study its effects on monocyte stimulation to differentiate into dendritic cells (DCs). Monocytes stimulated with MLT, kept for two hours adhesion time, presented enhanced cytokine membrane receptors for GM-CSF, IL-4, TNF-a, needed to in vitro DCs generation. DCs obtained by MLT stimuli show an enhanced presence of membrane molecules, as CD40, CD80 and CD83. The cytokines IL-6, IL-8 e IL-10 were present in the supernatants of imature DCs, as well the IL-6, IL-8 e TNF-a in mature DCs supernatants. Lymphocytes supernatants from DCs co-culture showed an enhanced proliferation index and, were detected a variation for IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e IFN-g cytokines. The MLT inhibitor Luzindole show a tendency to inhibition of this hormone.

Células dendríticas (DCs) são as responsáveis por orquestrar a resposta imunológica adaptativa através da estimulação de células T. Na imunoterapia do câncer, as DCs são um dos principais alvos de estimulação. Entretanto a maturação anormal destas pode interferir no resultado final da resposta imune. Neste estudo, analisaram-se os efeitos causados pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na maturação de DCs. Nas DCs maturadas em presença de VEGF, utilizando-se citoquímica, constatou-se alterações morfológicas, como número reduzido de dendritos e citoplasma basofílico; a análise de expressão gênica global por microarranjos de DNA mostrou grande variação da expressão de genes relacionados com adesão celular e citoesqueleto. Na avaliação funcional verificou-se redução da capacidade das DCs de ativar linfócitos. Juntos esses resultados sugerem que células expostas ao VEGF seriam menos especializadas. A compreensão do impacto do VEGF em mecanismos de maturação celular contribui para o entendimento da supressão imunológica nos tumores que secretam VEGF. / Dendritic cells (DCs) are in charge of orchestrating the adaptive immune response through T cells activation. DCs are the main target in cancer cell immunotherapy. However, DCs inadequate maturation interferes in the outcome of the immune response. In this study, were analyzed the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) on DCs maturation. DCs matured in the presence of VEGF, showed morphologic alterations such as reduced number of dendrites and basophilic cytoplasm by cytochemistry. Global gene expression assessed by DNA microarrays demonstrated broad variation in the expression of cell adhesion and cytoskeleton regulation-related genes. Functional studies detected the reduced capacity of VEGF-exposed DCs in the activation of lymphocytes. All together these results suggest that cells exposed to VEGF are less differentiated, a possible mechanism involved in the immune suppression caused by VEGF secreting tumors.

A enzima mieloperoxidase (MPO), presente em leucócitos da linhagem granulocítica e monocítica, tem papel fundamental na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem fortes evidências que alguns produtos gerados a partir de reações catalisadas por mieloperoxidase (MPO) tenham papel na sinalização celular. Dentre estes produtos, chama atenção o oxigênio singlete (1O2). Em fagócitos, esta ERO poderia participar tanto do processo de morte de patógenos, quanto da sinalização de eventos da inflamação. O nosso grupo de pesquisa trabalha com a hipótese de que a localização da MPO, e consequentemente, os sítios de produção de 1O2 definem a função da enzima e do 1O2. O interesse particular no 1O2 deve-se também ao fato de que sua detecção não é trivial e relativamente pouco é conhecido sobre sua produção por sistemas biológicos se comparado a outras EROs. Neste estudo trabalhamos com a questão da localização de MPO em neutrófilos e monócitos humanos e com a detecção de 1O2 através da utilização de sondas específicas. Nos experimentos realizados avaliamos a produção de 1O2 pela utilização da sonda 9,10 difenilantraceno (DPA) e também empregando o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE) como captador de 1O2. Apesar da proposta de uso do DPA revestindo partículas a serem fagocitadas ter sido feita anteriormente (Garcia F., mestrado concluído em 2006) houve dificuldades na utilização desta técnica que foram reconsideradas neste trabalho. Com esta sonda também obtivemos imagens em microscopia confocal, através da fluorescência do DPA e perda desta fluorescência após reação com 1O2. As análises dos resultados com a microscopia confocal em neutrófilos confirmam que 1O2 está sendo realmente formado no fagolissosomo, quando as células são ativadas por partículas opsonizadas. Em monócitos também houve a possibilidade de utilizar DPA como sonda para 1O2. Neste caso observamos um decréscimo mais lento da fluorescência quando comparado com neutrófilos e também um apagamento mais difuso da sonda. Acreditamos que as diferenças observadas, na formação de 1O2, para neutrófilos e mononucleares em microscopia confocal podem ser devido a diferentes formas de compartimentalização da enzima nestes dois tipos celulares. É possível que isto tenha uma função biológica específica, uma vez que, 1O2 parece ser um importante sinalizador no processo inflamatório. Dado o interesse na detecção de 1O2 em células do sistema imune, também utilizamos uma nova sonda, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE). A detecção neste caso é feita pelo monitoramento de um endoperóxido por HPLC. Os resultados obtidos com essa nova sonda demonstram-se mais satisfatórios quando comparados ao DPA, permitindo uma melhor detecção da produção de 1O2 por fagócitos. / The enzyme myeloperoxidase (MPO), present in leukocytes of granulocytic and monocytic lineage, plays a fundamental role in the production of reactive oxygen species (ROS). There is strong evidence that some products generated from reactions catalyzed by myeloperoxidase (MPO) have a role in cell signaling. Among these products, calls attention singlet oxygen (1O2). In phagocytes, ROS could participate in this process both the death of pathogens, the signaling events of inflammation. Our research group works on the assumption that the location of the MPO, and consequently, the production sites to define the role of 1O2 and 1O2 enzyme. The particular interest in the 1O2 is also due to the fact that its detection is not trivial and relatively little is known about its production by biological systems compared to other ROS. In this study we worked with the question of localization of MPO in human neutrophils and monocytes and the detection of 1O2 by using specific probes. In the experiments we evaluated the production of 1O2 by use of a probe 9.10 difenilantraceno (DPA) and also using the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE) 1O2 as a pickup. Although the proposed use of the DPA coating particles to be phagocytized have been made previously (F. Garcia, MA completed in 2006) hove difficulties in using this technique have been reconsidered in this work. With this probe also obtained images in confocal microscopy, by fluorescence of DPA and loss of fluorescence after reaction with 1O2. The analysis of results with confocal microscopy confirmed that in neutrophils 1O2 is actually being formed in fagolissosomo, when cells are activated by opsonized particles. Monocytes were also able to use DPA as a probe to 1O2. In this case we observe a slower decrease in fluorescence when compared with neutrophils and also a more diffuse effacement of the probe. We believe that the observed differences in the formation of 1O2 for neutrophils and mononuclear cells in confocal microscopy may be due to different forms of compartmentalization of the enzyme in these two cell types. It is possible that this has a specific biological function, since, 1O2 seems to be an important sign in the inflammatory process. Given the interest in the detection of 1O2 cells of the immune system, also used a new probe, the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE). The detection in this case is made by an endoperoxide monitoring by HPLC. The results obtained with this new probe show is more satisfactory when compared to the DPA, allowing better detection of 1O2 production by phagocytes.

A tuberculose representa um sério problema de Saúde Pública para o Brasil e o mundo. Estima-se que cerca de um terço da população mundial seja infectado pelo bacilo, sendo que 95% destes indivíduos desenvolvem a forma latente da tuberculose. Dessa forma, encontrar um marco entre o que faz o bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) induzir no hospedeiro uma doença ativa ou sua forma latente tem sido o objeto de estudo de diferentes grupos de pesquisa. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi correlacionar mudanças na resposta imune desenvolvida por monócitos de pacientes em diferentes estágios da tuberculose pulmonar com alterações epigenéticas, e então com aspectos clínicos de cada estágio. Nosso estudo incluiu 17 pacientes com a doença ativa, 14 indivíduos com tuberculose latente e 16 controles não infectados. A partir de sangue periférico, foi coletado plasma para quantificação de citocinas, sCD163 e sCD14. Complementarmente, monócitos foram purificados para avaliação da ativação imune através da quantificação de citocinas e espécies reativas de oxigênio mediante estimulação in vitro com Mtb inativado por calor, bem como PCR array para detectar expressão de enzimas de repressão ou ativação epigenética entre os grupos e avaliação do padrão de metilação global. Pacientes com tuberculose ativa apresentaram níveis plasmáticos elevados de citocinas como IL-6, IP-10, TNF-, IL-12, bem como IL-5. Dentre as citocinas, TNF-, IL-5, IL-6 e IP-10 permitiram diferenciar indivíduos latentes dos pacientes com tuberculose ativa. Também demostramos que maior número de correlações entre as citocinas foi observado nos pacientes com a doença ativa, indicando um estado geral mais ativado do sistema imune. Níveis plasmáticos de sCD163 e sCD14 estavam elevados nos pacientes quando comparados com indivíduos latentes e controles, e poderiam também diferenciar a tuberculose ativa. Tais níveis aumentados correlacionam-se com o estado ativado de monócitos dos pacientes, que produzem maior quantidade de espécies reativas de oxigênio e tendem a produzir mais citocinas inflamatórias, como IL-6 e TNF-. Este perfil parece ser modulado por modificações epigenéticas, uma vez que monócitos de pacientes com tuberculose pareceram mostrar menor expressão de enzimas responsáveis por mudanças relacionadas à repressão e maior expressão de enzimas relacionadas à ativação da expressão gênica, bem como redução no padrão global de metilação do DNA genômico, sugerindo maior atividade destas células. Finalmente, uma vez que pacientes com tuberculose apresentaram níveis elevados de alguns mediadores, correlacionamos estes com o grau de lesão pulmonar, e consequentemente, com a gravidade da doença. Nós mostramos que dentre os marcadores, TNF- e sCD163 correlacionaram-se positivamente com a progressão da tuberculose. Assim, concluímos que em relação aos indivíduos controle e com TB latente, os pacientes com tuberculose ativa apresentam o sistema imune em maior estado de ativação, e ainda, que alterações epigenéticas podem ser as responsáveis pela modulação observada. Dentre os fatores aumentados nos pacientes, TNF-, IL-6, IP-10, IL-5, sCD163 e sCD14 podem diferenciar os pacientes com doença ativa dos demais indivíduos analisados, e ainda sCD163 e TNF- podem atuar como indicativos da gravidade da tuberculose. / Tuberculosis is a major public health problem for Brazil and worldwide. It is estimated that about one third of the world population is infected with the bacillus, and 95% of those individuals have the condition in the latent form. Thus, finding a hallmark between what makes the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) induces in the host an active disease or its latent form has been the subject of different research groups. In this context, the objective of this study was to correlate changes in the immune response developed by monocytes from patients at different stages of pulmonary tuberculosis with epigenetic alterations and then, with clinical aspects of each stage. Our study included 17 patients with active disease, 14 individuals with latent tuberculosis and 16 uninfected controls. From the peripheral blood, plasma was collected for cytokine and CD163s, sCD14 quantification. In addition, monocytes were purified to evaluation of the immune activation through cytokine and reactive oxygen species quantification upon in vitro stimulation with heat-killed Mtb, as well as PCR array for epigenetic repression or activation enzymes were performed to detect epigenetic changes between the groups and evaluation of the global methylation profile. We have shown that patients with active tuberculosis have increased plasma levels of cytokines such as IL-6, IP-10, TNF-, IL-12, as well as IL-5. Among these cytokines, TNF-, IL-5, IL-6 and IP-10 could differentiate latent-infected from TB patients. We also showed that patients with active disease presented higher number of correlations between plasma cytokines, indicating an activated state of the immune system. The plasma levels of sCD163 and sCD14 were more elevated in patients than latent and control individuals, and might differentiate TB active from these other groups. These increased levels of biomarkers correlate with the activated state of monocytes from patients, which produced raised quantities of reactive oxygen species and tended to produced more pro-inflammatory cytokines, such as IL-6 and TNF-. This profile seems to be modulated by epigenetic modifications, since monocytes from patients with tuberculosis seemed to show reduced expression of enzymes responsible for changes related to repression and enhanced expression of enzymes responsible for activation of gene expression, and in addition, these patients presented reduction in the percentage of global methylation of genomic DNA, suggesting increased activity of these cells when compared to the other groups. Finally, once tuberculosis patients presented increased levels of some mediators, we correlated these with the degree of lung injury, and consequently tuberculosis severity. We have showed that TNF- and sCD163 were correlated with disease progression in tuberculosis. In conclusion, we demonstrated that patients with active tuberculosis are more activated than the other groups, and epigenetic alterations might be responsible for these modulations, indicated by the alteration of the enzymes and methylation pattern analyzed. Among the cytokines/chemokines differentially expressed TNF-, IL-6, IP-10, IL-5 and monocyte activation markers, sCD163 and sCD14 could discriminate between active disease from others, and also sCD163 and TNF- could indicate tuberculosis severity.

Investigamos o agonista de Guanilato Ciclase solúvel, BAY 41-2272, como alternativa para compensar falhas nas funções de monócitos. Avaliamos in vitro o efeito do fármaco em células humanas de linhagem e de sangue periférico. O BAY, em células THP-1 e monócitos, aumentou a expressão de CD11b, CD18, CD14, TLR4, TLR2 e CD163 e induziu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-6 e IL-12p70. Além disso, o fármaco aumentou a expressão gênica (CYBB, CYBA e NCF2) e protéica (p67PHOX e gp91PHOX) da NADPH oxidase. Ainda, o BAY ativa a via do NF-kB (p65) (dependente de PKG). Mais importante, o fármaco aumentou a atividade microbicida de monócitos de pacientes com DGC e deficiência de MPO a S. aureus e C. albicans. Em animais, o BAY 41-2272 induziu intenso influxo de macrófagos para o peritônio e inflamação. Ainda, potencializou o espraiamento, atividade fagocítica, atividade microbicida, produção espontânea de óxido nítrico e de peróxido de hidrogênio induzida por PMA, em macrófagos peritoneais, aumentando a proteção dos animais desafiados com C. albicans. Em conjunto, nossos resultados confirmam o potencial do BAY 41-2272, ou sua via (GCs/PKG), como alternativa para o desenvolvimento de terapias contra infecções. / We investigated the soluble guanylate cyclase agonist, BAY 41-2272, as an alternative to compensate for failures in of monocytes function. We evaluated the in vitro effect of the drug on human cells lines and peripheral blood cells. The BAY increased expression of CD11b, CD18, CD14, TLR4, TLR2 and CD163 and induce the production of TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-6 and IL-12p70 in THP-1 cells and monocytes. Furthermore, the drug increased NADPH oxidase gene (CYBB, CYBA and NCF2) and protein (gp91phox and p67phox) expression. Also, BAY activates the PKG-dependent NF-kB pathway (p65). More importantly, the drug increased microbicidal activity against S. aureus and C. albicans of monocytes from patients with CGD and MPO deficiency. In animals, BAY 41-2272 induced intense influx of macrophages to the peritoneum and inflammation. BAY potentiated the spreading, phagocytic activity, microbicidal activity, spontaneous production of nitric oxide and PMA-induced hydrogen peroxide release by peritoneal macrophages, increasing host protection against C. albicans. Taken together, our results confirm the potential of BAY 41-2272, or its pathway (sGC / PKG), as an alternative for the development of therapies against infections.

Orientadores: Antonio Condino Neto, Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_AnaCarolinade_D.pdf: 1227023 bytes, checksum: 25438a379e180eeb0d1972b464b909b0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: SIRP 'alfa'(Signal Regulatory Protein 'alfa') é um receptor que medeia funções inibidoras em fagócitos. Sua ativação e conseqüente fosforilação dos ITIMs ocorre pela ligação ao CD47 presente na membrana dos eritrócitos, e permite o recrutamento e a ativação de SHP-1, a qual desfosforila substratos específicos envolvidos na mediação de diversos efeitos fisiológicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da dexametasona (dexa) e de IFN?/TNFa sobre a expressão de SIRPa e SHP-1; a consequência desta regulação sobre a eritrofagocitose; e o nível de expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com anemia hemolítica autoimune (AHAI) antes e depois de corticoterapia. Monócitos de doadores sadios e células mielomonocíticas U937 foram cultivados por 48 horas com dexa (1µM) ou IFN? (100U/ml) e TNFa (1000U/ml), por 6 horas com Hemina® (30uM), ou por 72 horas com prednisolona (0,15 e 1mg/l). Monócitos foram isolados de pacientes com AHAI antes e depois da corticoterapia. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por PCR em Tempo Real, a expressão protéica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por Western Blotting, e a capacidade de eritrofagocitose foi determinada por microscopia. IFN? e TNFa, in vitro, promoveram o aumento da expressão gênica e protéica de SIRPa e a expressão gênica de SHP-1, em paralelo com a redução da capacidade de eritrofagocitose em monócitos normais. Em contrapartida, embora tenha aumentado a expressão gênica de SIRPa e SHP-1, dexa in vitro não alterou a expressão destas proteínas, assim como não alterou a capacidade de eritrofagocitose de monócitos normais. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi maior em monócitos de pacientes com AHAI em comparação a doadores sadios. Após corticoterapia, a expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com AHAI se mostrou similar a doadores sadios. Pacientes com AHAI estudados antes da corticoterapia apresentaram baixos níveis de hemoglobina e após corticoterapia esse índice de mostrou normal. A expressão gênica de SIRPa foi aumentada pela cultura de monócitos com hemina, mas a expressão de proteína permaneceu a mesma. Nossos resultados confirmam o papel fundamental da SIRPa na regulação da eritrofagocitose e sugere que a expressão de mRNA de SIRPa em monócitos de pacientes com AHAI antes de corticoterapia é aumentada pela liberação de heme, e que a redução da expressão gênica de SIRPa após corticoterapia se deve a um efeito indireto desta droga pela redução da eritrofagocitose e diminuição da disponibilidade de heme. / Abstract: SIRPa (Signal Regulatory Protein a) is an inhibitory receptor in phagocytes. Its activation and consequent phosphorylation of ITIMs occurs by the binding to CD47 on erythrocyte membrane, what allows SHP-1 recruitment, which dephosphorylates specific substrates involved in the mediation of several physiologic effects. The aim of this work was to determine the role of dexamethasone and IFN?/TNFa upon SIRPa and SHP-1 expression, and the consequence of this regulation over erythrophagocytosis; and to evaluate the regulation of SIRPa and SHP-1 in peripheral blood monocytes (PBM) of autoimmune hemolytic anemia (AIHA) patients before and after glucocorticoid (GC) therapy. PBM from healthy donors and U937 myelomonocytic cells were cultured for 48 hours with dexamethasone (1µM) or IFN? (100U/ml) and TNFa (1000U/ml), for 6 hours with Hemin (30uM), or for 72 hours with prednisolone (0.15 and 1mg/l). PBM were isolated from AIHA patients under GC therapy or not. SIRPa and SHP-1 gene expression was determined by Real Time PCR, SIRPa and SHP-1 protein level was determined by Western Blotting, and erythrophagocytosis was determined by microscopy. IFN? and TNFa increased SIRPa gene and protein expression and SHP-1 gene expression, in parallel with a decrease in erythrophagocytosis ability in PBM. On the other hand, although SIRPa and SHP-1 gene expression was significantly increased, dexamethasone did not alter SIRPa and SHP-1 protein expression, and did not alter erythrophagocytosis ability in monocytes. SIRPa and SHP-1 expression was significantly higher in PBM from AIHA patients compared to normal. After GC therapy, SIRPa and SHP-1 expression was similar in PBM of AIHA patients compared to healthy donors. AIHA patients studied before glucocorticoid therapy showed low hemoglobin and after glucocorticoid therapy the level of hemoglobin was normal. SIRPa gene expression was increased by culture with hemin, but protein expression remained the same. Our results confirm the key role of SIRPa in erythrophagocytosis regulation and suggest that SIRPa mRNA expression in AIHA patients before glucocorticoid therapy is increased by heme release, and the decrease of SIRPa gene expression after glucocorticoid therapy is due to an indirect effect of this drug by the reduction of erythophagocytosis and free heme availability. / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:20:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amoras_AnaLidiaBraga_D.pdf: 8619774 bytes, checksum: 0bd50b9b777f5d8e05904cfcafaf0d50 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Recentemente, demonstramos defeitos na fagocitose e quimiotaxia de monócitos em pacientes com agamaglobulinemia ligada ao X (ALX) e imunodeficiência comum variável (ICV). Existem poucos dados da expressão in vivo dos receptores para a região constante de imunoglobulina G (IgG) (FcyR) e receptores de complemento (RC) nesses pacientes. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão dos FcyR e RC nos monócitos de pacientes com ALX e ICV e compará-la com controles saudáveis. Amostras de sangue total foram obtidas de 10 pacientes com ALX, 12 com ICV e 18 controles saudáveis. O fenótipo dos monócitos foi determinado por citometria de fluxo de células marcadas com CD14+. A expressão dos receptores de superfície FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), CR1 (CD35) e CR3 (CD11b e CD18) foi medida através da determinação da proporção de células CD14+ para cada receptor e pela densidade do receptor. Comparado ao controle, observou-se uma porcentagem significantemente maior de monócitos CD16+ e CD35+ nos pacientes com ALX (P=0,002 e P=0,007, respectivamente). A expressão da intensidade de fluorescência relativa (IFR) do FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) foi significantemente mais baixa nos monócitos de pacientes com ICV em comparação aos controles (P=0,001 e P=0,035, respectivamente). Pacientes com ALX, que possuem redução na tirosina quinase de Bruton (Btk) mostraram porcentagens normais ou maiores de monócitos expressando CD16+ e CD35+. Esses resultados indicam que a expressão dos receptores Fc e complemento não são suficientes para o bom desempenho da função de fagocitose sugerindo que a deficiência fagocitária desses indivíduos pode resultar de defeitos nos mecanismos de transdução intracitoplasmática mediados por Btk. Além disso, a expressão reduzida de CD16+ e CD32+ nos monócitos de pacientes com ICV, que possuem Btk normal, sugere fortemente que a expressão dos receptores é independente de Btk e que a alteração dos receptores vistas nessepacientes pode ser responsável pela deficiência na função fagocitária dos monócitos desses pacientes. / Abstract: Recently we reported that monocyte phagocytosis and chemotaxis are impaired in X-linked agammaglobulinaemia (XLA) and common variable immunodeficiency (CVI) patients. Few data exist on the in vivo expression of receptors for the constant region of immunoglobulin (IgG) (FcgR) and complement receptors (CR) in these patients. The objective of this study was to investigate the expression of FcgR and CR on monocytes from XLA and CVI patients and compare it to that of healthy controls.Whole blood samples were obtained from 10 patients with XLA, 12 with CVI and 18 healthy controls.Monocyte phenotype was determined by flow cytometry with gating on CD14+ cells. Surface expression of FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) and FcgRIII (CD16), CR1 (CD35) and CR3 (CD11b and CD18) was measured by determination of the proportion of CD14+ cells positive for each receptor and by receptor density. Compared to controls, a significantly higher percentage of CD16 and CD35+ monocytes from XLA (P=0.002 and P=0.007, respectively) were observed. The relative fluorescence intensity (RFI) expression of FcyRII (CD32) and FcyRIII (CD16) were significantly lower on CVI monocytes compared to controls (P=0.001 and P=0.035, respectively). XLA patients, who have a reduction of Bruton's tyrosine kinase (Btk), showed normal or increased percentages of monocytes expressing Fcy and complement receptors. These results indicate that the expression of Fcy and complement receptors are not sufficient to a good perform of the phagocytosis function and suggests that the impaired phagocytosis observed in XLA patients could be due to defects of intracytoplasmatic transduction mechanisms Btk mediated. Furthermore, the reduced expression of CD16+ and CD32+ on monocytes from CVI patients, who have a normal expression of Btk, strongly suggests that the expression of these receptors is independent of Btk and the impaired phagocytosis observed in the CVI patients could be due the receptors alterations on the monocytes of these patients. / Doutorado / Pediatria / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-26T13:52:57Z No. of bitstreams: 2 Tese - Delson Jose da Silva - 2014.pdf: 4417980 bytes, checksum: 09ba5f6cc0d7b39ded36ffee59e305f4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-26T15:48:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Delson Jose da Silva - 2014.pdf: 4417980 bytes, checksum: 09ba5f6cc0d7b39ded36ffee59e305f4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T15:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Delson Jose da Silva - 2014.pdf: 4417980 bytes, checksum: 09ba5f6cc0d7b39ded36ffee59e305f4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Parkinson’s disease (PD) is as a neurodegenerative disorder caused by neuron loss in the substantia nigra, which produces dopamine. Evidences suggest that several inflammatory cytokines are enhanced in the brain and blood of patients presenting with PD. These cytokines might be induced by Toll-like receptor (TLR) activation. In peripheral blood, monocytes express TLR and may participate in the immunopathogenicity of neurodegenerative diseases. The objectives of this work were: carry out a literature review about neuroinflammation in PD; assess possible alterations in production of inflammatory cytokines in blood cultures of patients presenting with PD activated by TLR agonists; evaluate the percentages of the two main monocyte subpopulations, as well as TLR2 and TLR4 expression in these subpopulations in peripheral blood of patients presenting with PD. Patients presenting with PD (n = 31) and healthy individuals (n = 31), matched by gender and age, were evaluated and the patients were assessed regarding the severity of their neurological and psychiatric symptoms using the Hoen & Yahr scale (H&Y) and the Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS). Blood cultures were activated with TLR2 agonists (Pam3Cys), TLR4 (LPS), or TLR7/8 (R848). Cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-12p70, and IL-10) were Abstract 12 quantified in the serum and supernatant of blood cultures using Cytometer bead array. Monocytes (CD14+CD16– and CD14+CD16+) and TLR2 and TLR4 expression were identified using flow cytometry. Cytokine concentrations in the serum of patients and controls were similar and no significant association was found between cytokine concentrations and UPDRS scores. However, after activation of blood cultures of patients, a significant decreased response to TLR2 (TNF, IL-1β, IL-6, IL-10) and TLR7/8 (IL-6) agonists was observed. No correlation was observed between the concentrations of cytokines induced by TLR2 or TLR7/8 agonists and UPDRS scores. The percentages of monocytes CD14+CD16– and CD14+CD16+ did not significantly differ between patients and controls, and no alterations in TLR2 or TLR4 expressions were detected in these monocyte subpopulations in patients. The results indicate that leukocytes, especially monocytes, of patients presenting with PD show decreased capacity to respond to the activation via TLR2. This decrease may be associated with the previous activation of TLR2 in vivo, making the cells tolerant to new stimuli ex vivo. Assessing the activation of monocytes in peripheral blood, via TLR, may help the evaluation of the neurodegenerative/ neuroinflammatory process in PD, contributing to a better understanding of the pathophysiology of this disease. / A doença de Parkinson (DP) é uma afecção neurodegenerativa que ocorre devido à perda neuronal na substância negra, produtora de dopamina. Evidências sugerem que várias citocinas inflamatórias estão aumentadas no cérebro e no sangue de pacientes com DP. Essas citocinas podem ser induzidas por ativação dos receptores similares a Toll (Toll-like receptors, TLR). No sangue periférico, os monócitos expressam TLR e podem participar na imunopatogenia de doenças neurodegenerativas. Os objetivos deste trabalho foram: realizar uma revisão de literatura sobre neuroinflamação na DP; avaliar possíveis alterações na produção de citocinas inflamatórias em hemoculturas de pacientes com DP ativada por agonistas de TLR; avaliar as porcentagens das duas principais subpopulações de monócitos e a expressão de TLR2 e TLR4 nestas subpopulações no sangue periférico de pacientes com DP. Foram avaliados 31 pacientes com DP e 31 indivíduos sadios, pareados por gênero e idade, sendo os pacientes avaliados quanto à gravidade dos sintomas neurológicos e psiquiátricos utilizando-se as escalas H&Y (Hoen & Yahr scale) e UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale). As hemoculturas foram ativadas com agonistas de TLR2 (Pam3Cys), TLR4 (LPS) ou TLR7/8 (R848). As citocinas (TNF, IL-1β, IL-6, IL-12p70 e IL-10) foram quantificadas no soro e nos sobrenadantes das culturas utilizando citometria (Cytometer bead array). Os monócitos (CD14+CD16– e CD14+CD16+) e a expressão de TLR2 e TLR4 nestes foram identificados por citometria de fluxo. As concentrações de citocinas nos soros de pacientes e controles foram similares e não houve Resumo 10 associação significativa entre as concentrações das citocinas e os escores da UPDRS. No entanto, após ativação das hemoculturas dos pacientes, foi observada significativa resposta diminuída aos agonistas de TLR2 (TNF, IL- 1β, IL-6, IL-10) e de TLR7/8 (IL-6). Não foi observada correlação entre as concentrações de citocinas induzidas pelos agonistas de TLR2 ou de TLR7/8 e os escores de UPDRS. As porcentagens dos monócitos CD14+CD16– e CD14+CD16+ não diferiram significativamente entre os pacientes e os controles, e não foram detectadas alterações nas expressões de TLR2 ou TLR4 nestas subpopulações de monócitos nos pacientes. Os resultados indicam que os leucócitos, especialmente os monócitos, de pacientes com DP apresentam diminuída capacidade de resposta à ativação via TLR2. Essa diminuição pode estar associada à ativação prévia de TLR2 in vivo, tornando as células tolerantes a novos estímulos ex vivo. Avaliar a ativação de monócitos no sangue periférico, via TLR, pode auxiliar na avaliação do processo neurodegenerativo/neuroinflamatório na DP, contribuindo para a melhor compreensão da patofisiologia desta doença.

O desenvolvimento do câncer está associado a falhas no sistema imune. Investigamos como o microambiente tumoral de mama afetaria a diferenciação de monócitos. Observamos que a alta frequência de macrófagos (M&Phi;) CD163+ associou-se à baixa sobrevida das pacientes e a um baixo infiltrado de células T CD3+ nos tumores. Sobrenadantes obtidos da dilaceração des tumores (SNDil) induziram a diferenciação de monócitos para M&Phi; CD163highIL-10high, os quais suprimiram células T CD4+. O fenótipo CD163highIL-10high associou-se a altos níveis de M-CSF, TGF-&beta; e VEGF nos tumores. Monócitos circulantes de pacientes falharam em diferenciar-se em M1-M &Phi;; deram origem à DCs capazes de induzir alta frequência de células T reguladoras (Tregs) e produziram altos níveis de citocinas anti-inflamatórias sob ativação por LPS. Em conclusão, o microambiente tumoral favorece a diferenciação de M&Phi; CD163highIL-10high supressivos e afeta sistemicamente o potencial de diferenciação de monócitos de pacientes. / Cancer development is associated with failures in the immune system. We investigated here if breast tumor microenvironment affect the differentiation of monocytes. We observed that the high frequency of macrophages (M&Phi;) CD163+ was associated with poor patients survival and a low infiltration of CD3+ T cells in tumors. Supernatants obtained from dilacerated tumors (SNDil) skewed the differentiation of monocytes into CD163highIL10high M&Phi;, which suppressed CD4+ T cells. The CD163highIL-10high phenotype was associated with high levels of M-CSF, TGF-&beta; and VEGF in tumors. Circulating monocytes from patients failed to differentiate into M1-M&Phi;; gave rise to DCs able to induce high frequency of regulatory T cells (Tregs) and produced high levels of anti-inflammatory cytokines under LPS activation. In conclusion, the tumor microenvironment promotes the differentiation of suppressive CD163highIL10high M&Phi; and affects the potential of differentiation of patients\' monocytes systemically.

A abordagem imunoterapêutica do câncer tem sido cada vez mais explorada. Entre os fatores que a tornam atraente, mas também a limitam, está o uso de material antigênico do próprio paciente. Assim, pretendeu-se estabelecer condições de extração e amplificação de mRNA tumoral, como fonte renovável de antígenos. Pretendeu-se avaliar também a eficácia da vacina, com o uso de monócitos transfectados com RNA tumoral total para mimetismo das células tumorais. Diferentes concentrações (0,1 mg a 10 mg) de RNA total de SK-BR-3 e diferentes tempos (12, 24 e 48 h) foram usados para transfecção. Na avaliação do potencial linfo-estimulador dos monócitos foi usado o ensaio de proliferação linfocitária e a secreção de citocinas durante a co-cultura. Como resultado viu-se que monócitos transfectados se tornaram mais ativados e foram capazes de induzir linfoproliferação. Esses resultados indicaram ser possível o desenvolvimento de um método para avaliação das respostas celulares induzidas contra células tumorais em pacientes com câncer que foram vacinados. / The cancer immunotherapeutic approach has been increasingly exploited. Among the factors that make it attractive, but also limited, is the use of patient antigenic material. Thus, we propose to establish conditions for extraction and amplification of mRNA tumor, as renewable source of antigens. It is also intended to assess the vaccine effectiveness, using monocytes transfection with total tumor RNA for mimicry the tumor cells. Different concentrations (0.1 to 10 mg) of SK-BR-3 total RNA and different times (12, 24 and 48 h) were used in transfection. To assess the lympho-stimulator potential of transfected monocytes was used the test of lymphocyte proliferation, and cytokines secretion during co-culture. The result was that transfected monocytes became more activated and were able to induce lymphoproliferation. These results indicated that the development of a method for evaluating cellular responses induced against tumor cells in cancer patients who were vaccinated is possible.