Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-26T12:03:49Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Aline Michelle Barbosa Bafica.pdf: 3028179 bytes, checksum: 666e7950c3b0e2cf32d5a4eddeb77dfe (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T12:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Aline Michelle Barbosa Bafica.pdf: 3028179 bytes, checksum: 666e7950c3b0e2cf32d5a4eddeb77dfe (MD5) / Introdução: Neste estudo, nós avaliamos os efeitos de alguns antígenos do S. mansoni sobre a resposta imune induzida pelo antígeno solúvel de Leishmania (SLA) em células de pacientes com LC. Métodos: CMSP foram estimuladas in vitro com SLA e cultivadas na presença ou ausência dos antígenos recombinantes do tegumento do S. mansoni, Sm29 e SmTSP-2 e também do PIII, uma fração do antígenos solúvel do verme adulto do S. mansoni. As citocinas do padrão Th1, Th2 e regulatória foram medidas nos sobrenadantes das culturas, utilizando-se a técnica de ELISA sanduíche. Adicionalmente, CMSP foram marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos para a avaliação do fenótipo destas células, utilizando-se os anticorpos para marcação de CD4, CD8, CD25, CD28, CTLA-4 e Foxp3 em linfócito T e CD14, CD16, HLA-DR, CD80 e CD86 em monócitos. Para tanto se utilizou a técnica de citometria de fluxo e as análises foram feitas pelo programa FlowJo. Resultados: A adição dos antígenos do S. mansoni às culturas de CMSP resultou na redução dos níveis de IFN-γ em 37 a 50% dos pacientes. Embora, em menor extensão, os antígenos também foram capazes de diminuir a produção de TNF. Comparando os grupos de pacientes que tiveram ou não redução na produção de IFN-γ e TNF em culturas estimuladas com SLA, pela presença dos antígenos de S. mansoni, observou-se que não houve diferença significativa no número e tamanho das lesões e nem nos níveis basais de IFN-γ e TNF. Não houve também diferença significativa nos níveis de IL-10 e IL-5 em resposta aos antígenos de S. mansoni entre os grupos que apresentaram ou não redução na produção de IFN-γ e TNF em resposta aos antígenos do S. mansoni. Adicionalmente, foi observado que o uso do rSm29 nas culturas de CMSP de pacientes com LC resultou em diminuição da expressão de HLA-DR em monócitos não-clássicos (CD14+CD16++), no entanto a adição de PIII diminuiu a expressão desta molécula em monócitos clássicos (CD14++CD16-) e intermediários (CD14++CD16+). A adição do PIII e do rSmTSP-2 resultou na regulação da expressão de CD80 em monócitos não-clássicos e da expressão de CD86 em monócitos intermediários, respectivamente. Os antígenos rSmTSP-2 e PIII aumentaram a expressão de CTLA-4 em células TCD4+ e também expandiram a frequência de células regulatórias TCD4+CD25highFoxp3+. Conclusão: Os antígenos usados neste estudo, modularam a resposta pro-inflamatória induzida pelo SLA in vitro em um grupo de pacientes com LC, e os antígenos rSmTSP-2 e PIII foram capazes de diminuir o estado de ativação de monócitos e também aumentar a expressão de moléculas moduladoras em linfócitos T.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-03-09T12:47:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Michael Nascimento Macedo.pdf: 3741822 bytes, checksum: 30ce35fc01a94f4442ef1a3849bf8e7d (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-04-19T15:37:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Michael Nascimento Macedo.pdf: 3741822 bytes, checksum: 30ce35fc01a94f4442ef1a3849bf8e7d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-19T15:37:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_ Michael Nascimento Macedo.pdf: 3741822 bytes, checksum: 30ce35fc01a94f4442ef1a3849bf8e7d (MD5) / National Institute of Health (NIH); Capes / Introdução: A leishmaniose disseminada (LD) é uma forma emergente da infecção causada por Leishmania braziliensis, caracterizada por multiplas lesões cutâneas em diferentes partes do corpo. Os mecanismos que permitem a disseminação do parasito na LD ainda não estão bem esclarecidos. Monócitos/macrófagos tem um papel importante na resposta imune inata e o controle inicial da infecção por Leishmaniatem sido relacionado com a ativação de macrófagos e a morte dos parasitos. Entretanto, alguns estudos têm demonstrado queos macrófagos também participam da patogênese da leishmaniose cutânea (LC). A hipótese deste estudo é de que monócitos/macrófagos de pacientes com LD são mais susceptíveis à infecção por L. braziliensiscontribuindo para a disseminação da doença e produzem mais moléculas inflamatórias do que monócitos/macrófagos de pacientes com LC. Oobjetivodeste estudo foi caracterizar o comportamento de monócitos/macrófagos de pacientes com LD após a infecção com L. braziliensis. Material e métodos e Resultados: Monócitos do sangue periférico e macrófagos derivados de monócitos de pacientes com LD e LC foram infectados com L. braziliensisna proporção de 5:1 em diferentes períodos. O número de monócitos infectados e a carga parasitária foram determinados por microscopia óptica. A viabilidade das promastigotas foi avaliada através da contabilização das promastigotas móveis após três dias em meio de cultura Schneider. A determinação do burst oxidativo foi realizada através da oxidação da Dihidrorodamina 123 e avaliado porcitometria de fluxo. A produção de citocinas/quimiocinas foi avaliada através de ensaio imunoenzimático (ELISA).Resultados: Monócitos de pacientes com LD apresentaram um menor percentual de infecção e de carga parasitária nos ultimos períodos de infecçãoquando comparados com os monócitos de pacientes com LC. Entretanto o número de parasitos viáveis nos sobrenadantes de culturas de monócitos após 72 horas foi maior nos pacientes com LD quando comparado com pacientes com LC. A produção do burst oxidativo após a infecção com L. braziliensisfoi menor em monócitos de pacientes com LD comparados com monócitos de pacientes com LC. Entretanto, a produção de TNF, CXCL9 e CXCL10 foi maior em culturas de macrófagos de pacientes com LD. Foi observada uma forte correlação entre a produção de TNF por macrófagos e o número de lesões nos pacientes com LD. Conclusão: A proliferaçãode L. braziliensisem pacientes com leishmaniose disseminada está provavelmente associada com a baixa produção do burst oxidativo e as elevadas concentrações de moléculas inflamatórias produzidas por macrófagos de pacientes com LD podem contribuir para a patogênese da doença.

A análise da expressão da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), envolvida na regulação da resposta imune, em vacinas de células dendríticas (DCs) como imunoterapia para tratamento de indivíduos HIV+, pode fornecer informações sobre o perfil dessas células e auxiliar o aperfeiçoamento das técnicas atualmente utilizadas. A avaliação da expressão de IDO, por citometria de fluxo, foi realizada em monócitos e DCs de indivíduos sadios e HIV+. A expressão do RNAm de IDO foi analisada por PCR e a capacidade das DCs em estimular linfoproliferação e apresentar antígenos de HIV a linfócitos autólogos foi avaliada por ensaio de cocultivo. DCs ativadas de indivíduos HIV+ demonstraram expressão mais elevada de IDO tanto em relação às DCs imaturas quanto em relação às DCs dos indivíduos sadios. DCs foram capazes de induzir resposta proliferativa e polifuncional de linfócitos autólogos. Nossos resultados sugerem uma expressão diferencial de IDO entre indivíduos sadios e HIV+, indicando um importante papel da enzima no controle da resposta imune e na patogênese da AIDS. / The evaluation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) levels, a regulatory enzyme, in the context of DCs vaccines as a therapeutic alternative for the HIV+ patients, can bring information about DCs profiles that can improve current techniques of vaccine production. IDO expression was evaluated by flow cytometry in monocytes and DCs from healthy subjects and HIV+ patients. Expression of IDO mRNA was performed by real-time PCR and the ability in stimulate lymphoproliferation and presenting HIV antigens to autologous lymphocytes was evaluated in coculture assays. Comparison between immature and activated DCs showed an increased IDO expression in activated DCs in patients group. DCs derived from HIV+ patients showed an increased IDO expression when compared to healthy donors. DCs were able to induce lymphofoproliferation and polyfunctional response in autologous lymphocytes. Our results suggest a differential expression of IDO between health subjects and HIV+ patients, indicating an important role of IDO in the control of the immune response and in the HIV pathogenesis.

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:21:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tani_SergioMassayuki_M.pdf: 3275240 bytes, checksum: cc4115cf1f3cfbc43979ab57c10fcc10 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O sistema complemento apresenta imaturidade funcional em crianças mais jovens, com o sistema imune inato mais ativado em recém-nascidos e lactentes jovens. Infecções crônicas e oportunistas concomitantes, como na Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), causam disfunção na atividade fagocitária de células mononucleares. A atividade fagocitária de monócitos in vitro , por índice fagocitário (porcentagem de células com fagocitose efetuada em uma lâmina) e capacidade fagocitária (número de partículas fagocitadas em 100 células), foi estudada em 58 crianças soro-reversoras, separadas em faixas etárias, para zymosan não incubado, zymosan incubado com soro de doadores normais e do próprio paciente e com hemácias de carneiro incubadas com anticorpos de coelho antieritrócitos de carneiro, respectivamente para os receptores CR1, CR3 e Fc. Foram avaliados parâmetros hematológicos (hemograma completo), sistema T (TCD4+ e TCD8+), sistema B (níveis séricos de imunoglobulinas) e profilaxias com zidovudina e com sulfametoxazol e trimetoprima. Um grupo de crianças infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo I (HIV-1) foi utilizado como referência para comparações. A metodologia estatística constou de: análise descritiva com tabelas de freqüências, testes não paramétricos de Mann-Whitney e de Kruskal-Wallis, teste de correlação não linear com o coeficiente de Spearman. O nível de significância adotado foi de p<0,05. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Na comparação do índice fagocitário das crianças soro-reversoras para zymosan incubado com soro normal e do próprio paciente, pelas vias CR1 (CD35) e CR3 (CD11bCD18), foram observados valores menores (p=0,004 e p=0,001, no grupo total e p=0,027 e p=0,021, no grupo de crianças soro-reversoras maiores de 24 meses, respectivamente) em relação ao grupo de referência. Associações negativas: capacidade fagocitária de monócitos com zymosan não incubado, pela via das lectinas, com idade das crianças soro-reversoras (p=0,014); função fagocitária de monócitos para zymosan incubado com soro normal e do paciente, via receptores CR1 (CD35) e CR3 (CD11b CD18), pela ativação da via alternativa com zidovudina (Rs=-0,509; Rs=-0,344; Rs =-0,342; Rs=-0,328). Associações positivas: capacidade fagocitária de monócitos vias CR1 (CD35) e CR3 (CD11b CD18) e idade (p=0,026) e para níveis séricos de IgA (Rs=0,277). Valores de hemoglobina, leucócitos totais e TCD4+ foram menores (p<0,003, p<0,006 e p<0.004, respectivamente), e valores de TCD8+, IgA, IgG e IgM foram maiores (p<0,001) no grupo de referência. Nas crianças soro-reversoras, 55,2% receberam profilaxia com zidovudina e 79,3%, com sulfametoxazol e trimetoprima. O amadurecimento do sistema imune ocorreu com o aumento da idade e a atividade fagocitária de monócitos foi mais estimulada em crianças infectadas pelo HIV-1, na comparação com crianças soro-reversoras / Abstract: The complement system presents functional immaturity in young children and the innate immune system is more activated in newborns and infants. Chronics and opportunists infections, as well as Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), cause phagocytic activity¿s disfunction on the mononuclear cells. Monocyte function was evaluated in 58 exposed seroreverter children with an assay blood monocyte phagocytosis for zymosan and sheep red blood cells, mediated by the CR1, CR3 and Fc receptors, respectively. The zymosan assay was conducted with non-incubated zymosan and incubated zymosan with patient serum or serum from a normal blood donor pool. The phagocytic index (percentage of cells having phagocytosis on a slide) and the phagocytic capacity (number of phagocytes particles in a 100 cells counts) were determined. Complete blood count, lymphocyte subsets determination (TCD4+ and TCD8+), immunoglobulin levels (IgA, IgG and IgM) and prophylaxis with zidovudine and sulfametoxazol and trimetoprim were studied. The results were compared with the reference group (HIV-1 infected children). Seroreverter phagocytic index for incubated zymosan by CR1 (CD35) and CR3 (CD11bCD18) showed inferior results when compared to the reference group. Negative associations: phagocytic capacity with not-incubated zymosan, by lectin pathway activation with seroreverter children¿s age; and incubated zymosan on CR1 and CR3 receptors by activation of alternative pathway from complement system with zidovudine. Positive associations: phagocytic capacity by CR1 and CR3 receptors with seroreverter children¿s age and IgA serum levels. Seroreverter children presents higher values of hemoglobin, total leukocytes and TCD4+, and inferior values of TCD8+, IgA, IgG and IgM, when compared to the reference group. The immune system maturation occurred with age increased and the monocytes function was more stimulated in HIV-1 infected children / Mestrado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Antonio Condino Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:35:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_AnaCarolinade_M.pdf: 3393669 bytes, checksum: bc888c2b3e7a9f30a4d5b3c3677ca407 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os fagócitos, dentre eles, macrófagos, granulócitos e eosinófilos contêm uma NADPH oxidase associada à membrana, a qual produz superóxido e outros intermediários do oxigênio, os quais têm importante papel na defesa contra infecções. O colostro humano, além de suas propriedades nutricionais, é considerado uma importante fonte de fatores imunoprotetores para os neonatos. Os macrófagos do colostro constituem parte destes fatores imunoprotetores. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão do gene CYBB, que codifica a glicoproteína gp91-phox, em macrófagos do colostro humano, e compará-Ias às de monócitos do sangue periférico e células mielomonocíticas humanas THP-l. Tais células foram cultivadas com IFN-y e TNF-a durante 48 horas. A seguir, a liberação de superóxido foi determinada espectrofotometricamente por meio da redução do cito cromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase. A expressão do gene CYBB, que codifica o componente gp91-phox, foi determinada por meio de RT -PCR quantitativo-relativo. Nossos resultados mostram que a liberação espontânea de superóxido por macrófagos do colostro foi superior à de monócitos do sangue periférico. Contudo, ao serem estimulados com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a, macrófagos de colostro e monócitos do sangue periférico apresentam atividade NADPH oxidase equivalente. A liberação de superóxido por macrófagos do colostro e monócitos do sangue periférico foi sempre superior à de células THP-l, mesmo sendo estas, estimuladas com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a. Tais citocinas aumentaram a expressão relativa do gene gp91-phox em células THP-l, mas não em monócitos de sangue periférico e em macrófagos do colostro. Desta forma, após a cultura com as citocinas, as células THP-l passaram a apresentar expressão relativa do gene gp91- phox semelhante às outras duas populações, sem contudo, apresentar atividade NADPH oxidase equivalente, demonstrando que a atividade NADPH oxidase final na linhagem mielomonocítica humana é regulada em parte pela expressão do gene CYBB, é o produto de diferentes eventos do metabolismo celular e está relacionada ao estado de diferenciação celular / Abstract: Phagocytes like macrophages, granulocytes and eosinophils have a membrane-associated NADPH oxidase system, responsible for the production of superoxide and other oxygen reactive intermediates, considered critical factors for the defense against infections. The human colostrum is an important source of human macrophages. The aim of this work was to compare the NADPH oxidase activity and gp91-phox expression in 3 human myelomonocytic cell Unes: colostrum macrophages, the same mother' s blood monocytes, and THP-I cells. Specifically these cells were cultured with and without IFN-y and TNF-a during 48 hours. The assays included the spontaneous and PMA (30 nM)-induced superoxide release and the relative expression ofgp91-phox by RT-PCR. The principal results were: 1) Spontaneous superoxide release: Colostrum macrophages cultured in basal conditions release more superoxide than blood monocytes. IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release of blood monocytes. Colostrum macrophages were also stimulated by IFN-y and TNF-a but did not reach statistical significance. 2) PMA (30 nM)-induced superoxide release: IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release by blood monocytes, colostrum macrophages and THP-I cells. Colostrum macrophages and blood monocytes released much more superoxide than THP-I cells in all conditions. 3) Gp91-phox expression by relative RT-PCR analysis IFN-y and TNF-a did not interfere in gp91-phox relative expression of colostrum macrophages. IFN-y and TNF-a caused a discrete increase in gp91-phox expression of blood monocytes. IFN-yand TNF-a caused a dramatic increase in gp91-phox expression of THP-I cells. Overall, afier IFN + TNF incubation, THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes presented the same relative leveI of gp91-phox expression. Our conclusions were: The basal NADPH oxidase activity is higher in colostrum macrophages compared to blood monocytes. IFN-y and TNF-a drive blood monocytes to behave like colostrum macrophages. The NADPH oxidase activity of colostrum macrophages does not respond to IFN-yand TNF-a. Although IFN-y and TNF-a drive THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes to present the same relative leveI of gp91-phox expression, the 81 NADPH oxidase activity in macrophages and monocytes is much higher than in THP-I cells. Other factors in these more mature cells up-regulate the NADPH oxidase activity, providing strong and contrasting evidence that the NADPH oxidase activity in the human myelomonocytic lineage is regulated only in part by gp91-phox gene expression / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:57:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3045_1.pdf: 893604 bytes, checksum: dcb29f02762a14a1b36ddf5bdf7632cb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A desnutrição grave diminui a imunocompetência e com isso, aumenta a mortalidade infantil. Com o intuito de minimizar a morbimortalidade hospitalar, a OMS publicou diretrizes específicas para o tratamento de crianças com desnutrição grave. Portanto, supõe-se que na alta hospitalar os pacientes apresentem melhora da resposta imunológica. Esta dissertação originou o artigo intitulado Resposta imune de crianças desnutridas graves tratadas segundo o protocolo da OMS na fase hospitalar, atualmente submetido para publicação, e que está apresentado às páginas 25-42. O objetivo foi comparar reposta imune inata de crianças desnutridas graves internadas, tratadas segundo o protocolo da OMS, no momento da admissão e alta hospitalar. Para tal, foi realizado estudo experimental realizado com crianças menores de dois anos de idade, sendo 10 com desnutrição grave, e 10 crianças do grupo controle. O grupo desnutrido foi composto por pacientes internados no Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP) e submetidas ao protocolo da OMS. Foram excluídas as crianças portadoras do vírus HIV e aquelas reinternadas no período do estudo. Foi coletada uma amostra sanguínea na admissão e outra na alta hospitalar, sendo realizada análise do perfil leucocitário, índice de aderência, capacidade fagocitária e a produção de radicais livres (superóxido e óxido nítrico). Os pacientes com desnutrição grave apresentaram na admissão redução significativa da atividade fagocítica e produção de radicais oxidantes. Na alta hospitalar, foi observado melhora da função fagocitária e da liberação de óxido nítrico e superóxido, em relação à admissão hospitalar (p<0,005), entretanto, quando comparados ao grupo controle, os pacientes apresentaram valores reduzidos de linfócitos, assim como diminuição na produção de radicais livres. A partir destes resultados, foi observado que o tempo de hospitalização mostrou-se eficaz em restabelecer a atividade fagocitária, porém insuficiente em restaurar a atividade microbicida e o número de linfócitos

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-08-01T12:58:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-01T12:58:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O teste de detecção de pirogênio é preconizado nas farmacopeias como teste de segurança imprescindível para a avaliação da qualidade de produtos injetáveis. Os métodos alternativos ao teste de pirogênio em coelhos são o Teste de Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL) e o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Esses métodos ainda não podem substituir o teste em coelhos por completo, pois no caso do LAL os resultados podem não ser confiáveis quando a análise é realizada na presença de algumas substâncias interferentes com alto teor de lipídios e proteínas (encontrados nos medicamentos biológicos) e glucanas, além disso, o teste só detecta endotoxinas. Em relação ao MAT, já que o teste é sensível para todos os tipos de pirogênios e tem o mesmo mecanismo biológico responsável pela reação de febre em humanos, o Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) recomendou sua utilização desde que fique demonstrada a equivalência de seus resultados ao teste em coelhos, em conformidade com a regulamentação aplicável. Verifica-se assim, que a literatura carece de dados que envolvam a comparação entre a dose limite que causa febre em coelhos e a correspondência para o MAT relacionado ao ácido lipoteicóico (ALT), sendo assim, esse estudo tem como objetivo principal avaliar a utilização do MAT na detecção da contaminação de ALT de S. aureus em Cloreto de Sódio 0,9 % apirogênico artificialmente contaminado, através do estabelecimento de curva dose-resposta de ALT em coelhos; curva concentração-resposta de ALT para o MAT e avaliação em paralelo dos resultados obtidos utilizando ALT no teste em coelhos, LAL cromogênico e MAT. A resposta de febre foi observada a partir de 75.000 ng de ALT/Kg nos coelhos e no MAT para sangue criopreservado/IL-1β foi estabelecida em 50.000 ng/mL de ALT, ou 5,41 UEE/mL. O teste de LAL apresentou resultado falso-reativo a partir de 10.000 ng/mL de ALT. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações importantes sobre a comparação entre o teste de pirogênio em coelhos, MAT e LAL, contribuindo com dados para a validação do MAT, envolvendo outros pirogênios que não a endotoxina, e também para a aceitação deste teste pelos órgãos regulatórios no Brasil visando uma possível substituição do uso de animais, garantindo, assim, a segurança da saúde da população. / The pyrogenic test is preconized in the Pharmacopeias as a safety test indispensable for the quality of evaluation of injectable products. The alternative methods to the rabbit pyrogen test are the Limulus Amebocite Lysate (LAL) Test and the Monocyte Activation Test (MAT). These methods cannot replace the rabbit test completely yet, for in the case of LAL the results may not be reliable when the analysis is carried out in the presence of some interfering substances with high content of lipids and proteins (found in biological medicines) and glucans, moreover, the test only detects endotoxins. Concerning the MAT, since the test is sensitive to all types of pyrogens and has the same biological mechanism responsible for the fever reaction in humans, the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (Comitê de Coordenação Interagências sobre Validação de Métodos Alternativos - ICCVAM) have recommended its utilization provided that the equivalence of its results from the rabbit test, in conformity with the applicable regulation. It can be verified, then, that the literature lacks the data which involves the comparison between the limit dose that causes fever in rabbits and the consequence for the MAT related to the lipoteichoic acid (LTA), that being so, the aim of this study is mainly the utilization of MAT in the detection of the contamination of LTA of S. aureus in apyrogenic 0.9 % Sodium Chloride artificially contaminated, through the establishment of the dose-response curve of LTA in rabbits; concentration-response curve of LTA for the MAT and parallel evaluation of the results obtained by utilizing LTA in the test in rabbits, chromogenic LAL and MAT. The fever response was observed from 75.000 ng of LTA/Kg in rabbits and in MAT and for cryopreserved blood/IL-1β was established in 50.000 ng/mL of LTA, or 5,41 UEE/mL. The LAL test presented a false-positive result from 10.000 ng/mL of ALT. The results presented in this study provide important information on the comparison between the rabbit pyrogen test, MAT and LAL, contributing with data to the evaluation of MAT, involving pyrogens other than endotoxin, and also to the acceptance of this test by the regulatory organs in Brazil aiming at a possible animal substitution, and guaranteeing, then, the health security of the population.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2017-06-01T14:19:33Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3473301 bytes, checksum: 4d22636d8d38c872a66d2aa8bf1d2e3f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T14:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3473301 bytes, checksum: 4d22636d8d38c872a66d2aa8bf1d2e3f (MD5) Previous issue date: 2016-12-15 / Monocytes and macrophages represent keys components of the immune response. Based on the expression of LPS co-receptor CD14 and CD16 expression, FCγ III receptor, monocytes are classified into 3 subtypes: classical monocytes, which are CD14hiCD16-; intermediate monocytes, which are CD14hiD16+; and non-classical monocytes, CD14lowCD16+. AD is a chronic inflammatory cutaneous disease, with multifactorial etiology. Our group performed comparative analysis of monocytes subtypes through the study of the frequency and medium fluorescence intensity of surface molecules (HLADR, CCR5, CD80, CD86, PD1L) and cytokine (IL-6, TNF, IL10) in adults and children by using flow cytometry. The study was performed in two stages. First we compared the subtypes of monocytes from healthy adults and children, and then between healthy children and children with atopic dermatitis (AD). The role of monocyte activation and modulation of the inflammatory process is the subject of our investigation. The results of this study showed that: (1) the relative frequency of monocytes subtypes was similar in adults, healthy children and children with AD, with a predominance of classical monocytes; (2) Classical, intermediate and nonclassical monocytes of children with AD have higher HLA-DR expression when compared to those of healthy children, and monocytes of healthy children have higher expression than healthy adults; (3) adults, healthy children and DA children have higher frequency and expression of CCR5 in intermediate and nonclassical that in classical monocytes; (4) the frequency and expression of CD80 was higher in intermediate and nonclassical monocytes both in children and healthy adults and CD86 expression was more pronounced in intermediate monocytes, in these two groups, beyond wich the expression of CD80 and CD86 molecules on classical monocytes of children with AD was higher than in healthy children; (5) PD1L frequency in monocytes subtypes was similar in adults and children, however, there is a higher expression of this molecule in children classical monocytes when compared to healthy adults classical monocytes. In addition, atopic children have higher expression of this molecule on classical monocytes than healthy children; (6) intermediate and nonclassical monocytes of healthy adults and children have greater inflammatory activity than classical monocytes when evaluating the frequency and expression of IL-6 and TNF-α, contrary to what is observed in children with AD who have greater frequency and expression of IL-6 and TNF-α in classical monocytes compared to healthy children; (7) intermediate and nonclassical monocytes have increased IL10 production than classical monocytes in healthy adults and children. Thus, our results revealed that the relative monocytes frequency is constant in the three studied population groups, but the frequency and expression of surface molecules and cytokines presented significant peculiarities. Summarizing, healthy children have greater expression of HLA-DR molecule than healthy adults, and atopic children have greater expression than healthy children. Monocytes subtypes more involved inflammatory response in healthy adults and children are intermediate and nonclassical monocytes, while classical monocytes in atopic children are more involved in inflammatory response than the same subtype in healthy children. These findings revealed changes in the innate immunity of children with atopic dermatitis extremely important for understanding the pathophysiology of disease. / Os monócitos e macrófagos representam componentes fundamentais da resposta imune. Com base na expressão do co-receptor de LPS CD14 e na expressão do CD16, receptor FCγIII, os monócitos são classificados em 3 subtipos: monócitos clássicos, que são CD14hiCD16-; monócitos intermediários, que são CD14hiD16+; e monócitos não-clássicos, ou CD14lowCD16+. A DA é uma doença inflamatória cutânea crônica, de etiologia multifatorial. Nosso grupo realizou análise comparativa entre os subtipos monocitários por meio do estudo da frequência e da média de intensidade de fluorescência (MFI) de moléculas de superfície (HLA-DR, CCR5, CD80, CD86, PD1L) e da produção de citocinas (IL6, TNFα, IL10) em adultos e crianças utilizando a citometria de fluxo. A pesquisa foi executada em duas etapas. Primeiro comparamos os subtipos de monócitos entre adultos e crianças saudáveis e em seguida, entre crianças sadias e crianças portadoras de dermatite atópica (DA). O papel dos monócitos na ativação e modulação do processo inflamatório foi objeto da nossa investigação. Os resultados desse estudo mostraram que: (1) a frequência relativa dos subtipos de monócitos foi similar em adultos, crianças saudáveis e crianças portadoras de DA, com predomínio de monócitos clássicos; (2) monócitos clássicos, intermediários e não-clássicos de crianças atópicas apresentaram maior expressão de HLA-DR que os mesmos subtipos em crianças sadias e essas, que adultos sadios; (3) adultos, crianças saudáveis e crianças doentes apresentaram maior frequência e expressão de CCR5 em monócitos intermediários e monócitos não-clássicos; (4) a frequência e expressão do CD80 foi maior em monócitos intermediários e não clássicos tanto em crianças como em adultos saudáveis e a expressão de CD86 foi maior em monócitos intermediários desses dois grupos. Já a expressão das moléculas de CD80 e CD86 em monócitos clássicos de crianças portadoras de DA foi maior que em crianças saudáveis; (5) a frequência de PD1L nos subtipos de monócitos foi semelhante em adultos e crianças, entretanto, houve maior expressão dessa molécula em monócitos clássicos de crianças que em adultos saudáveis e crianças atópicas apresentaram maior expressão desta molécula em monócitos clássicos que crianças saudáveis; (6) monócitos intermediários e não-clássicos de adultos e crianças saudáveis apresentaram maior atividade inflamatória que monócitos clássicos ao se avaliar a frequência e expressão de IL-6 e TNF-α, ao contrário do que se observou em crianças com DA, que apresentaram maior frequência e expressão de IL-6 e TNF-α em monócitos clássicos que as crianças saudáveis; (7) monócitos intermediários e não-clássicos demonstraram maior produção de IL10 que monócitos clássicos em adultos e crianças saudáveis. Nossos resultados mostraram, portanto que a frequência relativa de monócitos é constante nos três grupos populacionais estudados, mas a frequência e expressão de moléculas de superfície e citocinas apresentam particularidades significativas. Em resumo, crianças atópicas apresentam maior expressão de HLA-DR que crianças saudáveis e essas, que adultos saudáveis. Os subtipos de monócitos mais envolvidos na resposta inflamatória em adultos e crianças sadias são monócitos intermediários e não-clássicos, enquanto monócitos clássicos de crianças atópicas são mais inflamatórios quando comparados ao mesmo subtipo em crianças saudáveis. Essas descobertas revelam alterações na imunidade inata de crianças portadoras de dermatite atópica de extrema importância para a compreensão da fisiopatologia da doença.

A enzima mieloperoxidase (MPO), presente em leucócitos da linhagem granulocítica e monocítica, tem papel fundamental na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem fortes evidências que alguns produtos gerados a partir de reações catalisadas por mieloperoxidase (MPO) tenham papel na sinalização celular. Dentre estes produtos, chama atenção o oxigênio singlete (1O2). Em fagócitos, esta ERO poderia participar tanto do processo de morte de patógenos, quanto da sinalização de eventos da inflamação. O nosso grupo de pesquisa trabalha com a hipótese de que a localização da MPO, e consequentemente, os sítios de produção de 1O2 definem a função da enzima e do 1O2. O interesse particular no 1O2 deve-se também ao fato de que sua detecção não é trivial e relativamente pouco é conhecido sobre sua produção por sistemas biológicos se comparado a outras EROs. Neste estudo trabalhamos com a questão da localização de MPO em neutrófilos e monócitos humanos e com a detecção de 1O2 através da utilização de sondas específicas. Nos experimentos realizados avaliamos a produção de 1O2 pela utilização da sonda 9,10 difenilantraceno (DPA) e também empregando o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE) como captador de 1O2. Apesar da proposta de uso do DPA revestindo partículas a serem fagocitadas ter sido feita anteriormente (Garcia F., mestrado concluído em 2006) houve dificuldades na utilização desta técnica que foram reconsideradas neste trabalho. Com esta sonda também obtivemos imagens em microscopia confocal, através da fluorescência do DPA e perda desta fluorescência após reação com 1O2. As análises dos resultados com a microscopia confocal em neutrófilos confirmam que 1O2 está sendo realmente formado no fagolissosomo, quando as células são ativadas por partículas opsonizadas. Em monócitos também houve a possibilidade de utilizar DPA como sonda para 1O2. Neste caso observamos um decréscimo mais lento da fluorescência quando comparado com neutrófilos e também um apagamento mais difuso da sonda. Acreditamos que as diferenças observadas, na formação de 1O2, para neutrófilos e mononucleares em microscopia confocal podem ser devido a diferentes formas de compartimentalização da enzima nestes dois tipos celulares. É possível que isto tenha uma função biológica específica, uma vez que, 1O2 parece ser um importante sinalizador no processo inflamatório. Dado o interesse na detecção de 1O2 em células do sistema imune, também utilizamos uma nova sonda, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE). A detecção neste caso é feita pelo monitoramento de um endoperóxido por HPLC. Os resultados obtidos com essa nova sonda demonstram-se mais satisfatórios quando comparados ao DPA, permitindo uma melhor detecção da produção de 1O2 por fagócitos. / The enzyme myeloperoxidase (MPO), present in leukocytes of granulocytic and monocytic lineage, plays a fundamental role in the production of reactive oxygen species (ROS). There is strong evidence that some products generated from reactions catalyzed by myeloperoxidase (MPO) have a role in cell signaling. Among these products, calls attention singlet oxygen (1O2). In phagocytes, ROS could participate in this process both the death of pathogens, the signaling events of inflammation. Our research group works on the assumption that the location of the MPO, and consequently, the production sites to define the role of 1O2 and 1O2 enzyme. The particular interest in the 1O2 is also due to the fact that its detection is not trivial and relatively little is known about its production by biological systems compared to other ROS. In this study we worked with the question of localization of MPO in human neutrophils and monocytes and the detection of 1O2 by using specific probes. In the experiments we evaluated the production of 1O2 by use of a probe 9.10 difenilantraceno (DPA) and also using the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE) 1O2 as a pickup. Although the proposed use of the DPA coating particles to be phagocytized have been made previously (F. Garcia, MA completed in 2006) hove difficulties in using this technique have been reconsidered in this work. With this probe also obtained images in confocal microscopy, by fluorescence of DPA and loss of fluorescence after reaction with 1O2. The analysis of results with confocal microscopy confirmed that in neutrophils 1O2 is actually being formed in fagolissosomo, when cells are activated by opsonized particles. Monocytes were also able to use DPA as a probe to 1O2. In this case we observe a slower decrease in fluorescence when compared with neutrophils and also a more diffuse effacement of the probe. We believe that the observed differences in the formation of 1O2 for neutrophils and mononuclear cells in confocal microscopy may be due to different forms of compartmentalization of the enzyme in these two cell types. It is possible that this has a specific biological function, since, 1O2 seems to be an important sign in the inflammatory process. Given the interest in the detection of 1O2 cells of the immune system, also used a new probe, the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE). The detection in this case is made by an endoperoxide monitoring by HPLC. The results obtained with this new probe show is more satisfactory when compared to the DPA, allowing better detection of 1O2 production by phagocytes.

Os alimentos desempenham papel fundamental na nutrição e também na imunidade, pois podem conter substâncias que interagem direta ou indiretamente com o sistema imune, principalmente o de mucosas. Alguns polissacarídeos não-amido (PNAs) originados de plantas, algas e fungos comestíveis podem modular a função imune, contribuindo para a manutenção da saúde. A banana apresenta composição monossacarídica da parede celular similar à de plantas com efeitos imunomoduladores, permitindo formular a hipótese de que os PNAs dessa fruta também tenham essas propriedades. Assim, o objetivo foi extrair, purificar e caracterizar PNAs hidrossolúveis da polpa de banana das cultivares Nanicão e Thap Maeo e testá-los em cultivos de macrófagos RAW 267.4, células THP-1, macrófagos diferenciados por PMA THP-1 e células HL-60 in vitro avaliando a ação imunomoduladora através da dosagem de citocinas, NO e ensaios de fagocitose. As frações hidrossolúveis foram caracterizadas quanto ao seu conteúdo monossacarídico e ligações por hidrólise enzimática, identificando homogalacturonanos, mananos, arabinogalactanos, xilogalacturonanos e galactoglucomananos. As frações foram testadas para ausência de endotoxinas e viabilidade celular por MTT. Foram estabelecidas as doses não-tóxicas e ensaiadas as concentrações de 10, 50 e 200 &#181;g.ml-1 das frações polissacarídicas para os testes in vitro. Não houve toxicidade para macrófagos e monócitos, enquanto que para a linhagem de células pro-mielóciticas de leucemia humana HL-60, as frações se mostraram citotóxicas. Houve aumento de atividade fagocítica nas frações WSP, UFP e HTP quando comparadas ao controle negativo de células, assim como a produção de citocinas inflamatórias como IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, além da quimiocina IL-8 nas células oriundas de THP-1 e diminuição nos marcadores TLR-2 com aumento de CD14 nas células THP-1, além do aumento do tamanho celular promovido pelas frações polissacarídicas mostrando diferenciação para série granulocítica. Portanto, PNAs de ambas as cultivares de banana possuem potencial imunomodulador seja inflamatório, anti-inflamatório ou de diferenciação de células THP-1 imaturas in vitro. / Food plays a major role in nutrition as in immunity, as they may contain substances that interact directly or indirectly with the immune system, especially those located on mucous membranes. Some non-starch polysaccharides (NSPs) originate from plants, algae, and edible fungi can modulate immune function, contributing to the maintenance of health. The banana presents cell wall monosaccharide composition like the other plant polysaccharides with immunomodulatory effects allowing to formulate the hypothesis that this fruit NSPs also have these properties. The objective was to extract, purify and characterize water-soluble banana pulp NSPs of Nanicão and Thap Maeo cultivars and test them in vitro on cell lineages of RAW 267.4 macrophages, PMA differentiated THP-1 macrophages, THP-1 monocytes, and HL-60, evaluating their immunomodulatory action by the dosage of cytokines, NO and phagocytosis assays. Water-soluble fractions were characterized as to their content and monosaccharide linkages by enzymatic hydrolysis, identifying homogalacturonans, mannans, arabinogalactans, xylogalacturonan, and galactoglucomannans in its composition. Fractions were tested for the absence of endotoxins and cell viability by MTT. Non-toxic concentrations doses of 10, 50 and 200 &#181;g.ml-1 of the polysaccharide fractions were established for in vitro testing. The NSPs fractions WSP, UFP, and HTP tested promoted an increase in phagocytic activity in THP-1 PMA derived macrophages compared to negative control cells, as well as the production of inflammatory cytokines such as IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6. An increase in the THP-1 CD14 cell receptor and decrease in CD33, CD123, CD11c and TLR-2 receptors were promoted by the banana polysaccharides. Besides, there was an increase in cell size showing cell differentiation towards granulocyte line and demonstrating that NSPs from both cultivars were immunomodulatory with a capacity of immature cell differentiation and proving that in vitro screening test is an efficient method to test other foodborne substances with immunomodulatory potential.