Ao longo do processo de progressão tumoral, se observa alteração na expressão de glicoconjugados contendo oligossacarídeos N-ligados. Uma das formas mais comuns de glicosilação aberrante observada em células transformadas e em tumores humanos é representada por (poli)lactosaminas presentes em oligossacarídeos N-ligados. Estes glicanos são ligantes de galectina-3. Com o objetivo de identificar a expressão e distribuição dos ligantes de galectina-3 associados a processos fisiopatológicos, como a transformação maligna, desenvolvemos uma proteína quimérica, a galectina-3 conjugada a fosfatase alcalina (Gal-3/FA). Observamos que a Gal-3/FA possui a mesma especificidade de galectina-3 e que pode ser usada como sonda em ensaios de overlay e ensaios de imunoistoquímica. Entre os ligantes de galectina-3 identificamos a ?1 integrina, mediador de processos biológicos dependentes da interação célula-matriz como a migração celular. Linhagens de células de origem mesenquimal derivadas de tumores induzidos com metilcolantreno de animais selvagens (linhagens S11 e S12) e nulizigoto (linhagem ?12) para o gene da galectina-3 foram estabelecidas. Avaliamos a capacidade migratória dessas células e os nossos resultados mostraram que células que expressam galectina-3 são mais migratórias em superfícies de laminina-1. Este dado sugere que a galectina-3 seja um modulador positivo do processo de migração celular em superfícies de laminina-1. No entanto, o mecanismo pelo qual a galectina-3 medeia esse processo não é conhecido. Células que possuem fenótipo mais migratório apresentam um estado intermediário de adesão. Nós observamos que a galectina-3 se encontra nos complexos focais. Na presença de galectina-3 observamos diminuição de FAK fosforilado e recrutamento da fosfatase SHP-2 para os complexos focais. A diminuição de FAK fosforilado no lamelipódio leva ao turnover dos complexos focais e ao aumento da migração celular. Analisamos também a via de sinalização e observamos que a galectina-3 não ativa PAK. Contudo, o inibidor de PI3quinase, wortmanina, inibiu o efeito pró-migratório de galectina-3. Esses dados reforçam a noção do papel de galectina-3 na modulação do processo de migração de fibroblastos transformados, funcionando como uma molécula / Altered expression of cell surface N-linked oligosaccharides are often associated with malignant transformation of cells. One of the most common forms of aberrant glycosylation in transformed cells and human tumors is the highly elevated ?1,6 branching of N-linked oligosaccharides caused by increased expression of N-acetylglucosaminytransferase V (Mgat5). Galectin-3, a ?-galactoside binding protein, binds preferentially to poly-N-acetyllactosamines, which are the products of Mgat5. In order to exploit this hallmark of cancer cells, we have developed a tool for in situ identification of these tumors associated glycoconjugates. Human galectin-3 was fused to bacterial alkaline phosphatase, generating a hybrid molecule displaying both the carbohydrate binding properties of galectin-3 and enzymatic activity of alkaline phosphatase (Gal-3/FA). Gal-3/FA has the same fine of galectin-3 which was confirmed in direct binding assays. The tool presented herein was therefore useful for several immunoenzymatic assays, and will allow to establish whether the expression pattern of galectin-3 ligands have any physiological or clinical significance. We have identified ?1 integrin as a galectin-3 ligand. ?1 integrins are the actual effector of cell adhesion and migration. We have established cell lines from methylcholantrene-induced sarcomas from both wild type and galectin-3 null mice. In this system, galectin-3 null cells were less migratory than control cells in laminin-1. When galectin-3 was transiently expressed in galectin-3 null sarcoma cells, it inhibited cell adhesion to laminin-1 and stimulate the migratory response to laminin-1. The addition of exogenous galectin-3 also enhanced the migratory capacity of ?12 cells in a carbohydrate dependent way. Galectin-3 was found in focal contacts of ?12 cells where it may interact with many glycoproteins containing polyllactosamines on the cell surface. Here we showed that ?1 integrins are among them. Exogenously added galectin-3 led to a decrease in phosphorylated-FAK in lamellipodia and increased the recruitment of Shp-2 phosphatase of migrating cells. The effect of galectin-3 in migration was not dependent on the activation of the p21-activated kinase (PAK). Wortmannin inhibited the increased migration elicited by galectin-3, suggesting the involvement of the PI3-kinase signaling in the galectin-3 pathway. We propose that extracellular galectin-3 bound ?1integrins and disrupted the focal adhesion plaque, thus favoring cell migration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-01-28Bitstream added on 2014-06-13T20:36:12Z : No. of bitstreams: 1 costa_mmtm_me_araca.pdf: 412338 bytes, checksum: 5199132768adb8d8b70a2790ca26b60c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi investigar a migração celular induzida pelo hidróxido de cálcio para bolha de ar subcutânea em camundongos. Observou-se que a migração de neutrófilos ocorreu de maneira dose-dependente, alcançando o pico de migração 96 horas após a injeção do estímulo. Esta migração foi inibida com o pré-tratamento dos animais com indometacina (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) e dexametasona (1mg/Kg), diferentemente, o MK886 (1mg/Kg) foi inefetivo neste processo. Constatou-se também que os animais estimulados com hidróxido de cálcio apresentaram um aumento significativo na liberação de citocinas e quimiocinas (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa). O pré-tratamento com meloxican ou aminoguanidina inibiu a liberação de KC, MIP-2, IL1ß, mas não de TNFa. O pré-tratamento com Tioglicolato a 3% aumentou cerca de 167% a população de macrófagos na bolha de ar subcutânea, entretanto, não alterou a migração de neutrófilos. Pôde-se concluir que a migração de neutrófilos para bolha de ar subcutânea induzida pelo hidróxido de cálcio, em camundongos, foi dependente de KC, MIP-2, IL1ß e TNFa, sendo a liberação destes mediadores independente de mastócitos e de macrófagos. / The aim of this study was to investigate the cellular migration induced by calcium hydroxide to air-pouch in mice. It was observed that the migration developed dependently to the doses and achieved the peak 96 hours after the stimulation. Neutrophil migration was inhibited with the pre-treatment with indometacin (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) and dexamethasone (1mg/Kg). Differently, MK886 (1mg/Kg) was ineffective in this process. It was seen that the animals stimulated with calcium hydroxide showed an increase of cytokines and chymiokines (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa) release. Pre-treatment with meloxican or aminoguanidine inhibited KC, MIP-2, IL1ß release, but not TNFa. Release of TNFa was not dependent of prostaglandines and nitric oxide because it was not inhibited by aminoguanidine and meloxican. Pretreatment with Tioglocolate 3% increased 167% the macrophage population in the air-pouch. However, it did not change neutrophil migration. It was possible to conclude that the neutrophil migration to the air-pouch induced by calcium hydroxide in mice was dependent on KC, MIP-2, IL1ß, TNFa and prostaglandins and it was not dependent on the mast cells and macrophages.

Ao longo do processo de progressão tumoral, se observa alteração na expressão de glicoconjugados contendo oligossacarídeos N-ligados. Uma das formas mais comuns de glicosilação aberrante observada em células transformadas e em tumores humanos é representada por (poli)lactosaminas presentes em oligossacarídeos N-ligados. Estes glicanos são ligantes de galectina-3. Com o objetivo de identificar a expressão e distribuição dos ligantes de galectina-3 associados a processos fisiopatológicos, como a transformação maligna, desenvolvemos uma proteína quimérica, a galectina-3 conjugada a fosfatase alcalina (Gal-3/FA). Observamos que a Gal-3/FA possui a mesma especificidade de galectina-3 e que pode ser usada como sonda em ensaios de overlay e ensaios de imunoistoquímica. Entre os ligantes de galectina-3 identificamos a ?1 integrina, mediador de processos biológicos dependentes da interação célula-matriz como a migração celular. Linhagens de células de origem mesenquimal derivadas de tumores induzidos com metilcolantreno de animais selvagens (linhagens S11 e S12) e nulizigoto (linhagem ?12) para o gene da galectina-3 foram estabelecidas. Avaliamos a capacidade migratória dessas células e os nossos resultados mostraram que células que expressam galectina-3 são mais migratórias em superfícies de laminina-1. Este dado sugere que a galectina-3 seja um modulador positivo do processo de migração celular em superfícies de laminina-1. No entanto, o mecanismo pelo qual a galectina-3 medeia esse processo não é conhecido. Células que possuem fenótipo mais migratório apresentam um estado intermediário de adesão. Nós observamos que a galectina-3 se encontra nos complexos focais. Na presença de galectina-3 observamos diminuição de FAK fosforilado e recrutamento da fosfatase SHP-2 para os complexos focais. A diminuição de FAK fosforilado no lamelipódio leva ao turnover dos complexos focais e ao aumento da migração celular. Analisamos também a via de sinalização e observamos que a galectina-3 não ativa PAK. Contudo, o inibidor de PI3quinase, wortmanina, inibiu o efeito pró-migratório de galectina-3. Esses dados reforçam a noção do papel de galectina-3 na modulação do processo de migração de fibroblastos transformados, funcionando como uma molécula / Altered expression of cell surface N-linked oligosaccharides are often associated with malignant transformation of cells. One of the most common forms of aberrant glycosylation in transformed cells and human tumors is the highly elevated ?1,6 branching of N-linked oligosaccharides caused by increased expression of N-acetylglucosaminytransferase V (Mgat5). Galectin-3, a ?-galactoside binding protein, binds preferentially to poly-N-acetyllactosamines, which are the products of Mgat5. In order to exploit this hallmark of cancer cells, we have developed a tool for in situ identification of these tumors associated glycoconjugates. Human galectin-3 was fused to bacterial alkaline phosphatase, generating a hybrid molecule displaying both the carbohydrate binding properties of galectin-3 and enzymatic activity of alkaline phosphatase (Gal-3/FA). Gal-3/FA has the same fine of galectin-3 which was confirmed in direct binding assays. The tool presented herein was therefore useful for several immunoenzymatic assays, and will allow to establish whether the expression pattern of galectin-3 ligands have any physiological or clinical significance. We have identified ?1 integrin as a galectin-3 ligand. ?1 integrins are the actual effector of cell adhesion and migration. We have established cell lines from methylcholantrene-induced sarcomas from both wild type and galectin-3 null mice. In this system, galectin-3 null cells were less migratory than control cells in laminin-1. When galectin-3 was transiently expressed in galectin-3 null sarcoma cells, it inhibited cell adhesion to laminin-1 and stimulate the migratory response to laminin-1. The addition of exogenous galectin-3 also enhanced the migratory capacity of ?12 cells in a carbohydrate dependent way. Galectin-3 was found in focal contacts of ?12 cells where it may interact with many glycoproteins containing polyllactosamines on the cell surface. Here we showed that ?1 integrins are among them. Exogenously added galectin-3 led to a decrease in phosphorylated-FAK in lamellipodia and increased the recruitment of Shp-2 phosphatase of migrating cells. The effect of galectin-3 in migration was not dependent on the activation of the p21-activated kinase (PAK). Wortmannin inhibited the increased migration elicited by galectin-3, suggesting the involvement of the PI3-kinase signaling in the galectin-3 pathway. We propose that extracellular galectin-3 bound ?1integrins and disrupted the focal adhesion plaque, thus favoring cell migration.

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiao_MunirRegini_M.pdf: 7191608 bytes, checksum: f8a5e81d9fd9e880ec841934fe773e2d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A participação de células produtoras de IL-17 (Th17) na resposta imunológica contra infecções causadas por fungos tem sido recentemente objeto de grande interesse. A principal função da IL-17 é a ativação e atração de neutrófilos para o local de infecção. Lesões de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante no Brasil, são caracterizadas por um infiltrado inflamatório rico em neutrófilos. Entretanto, neutrófilos de pacientes com PCM apresentam uma resposta fungicida diminuída, quando comparada à observada em indivíduos saudáveis. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com IL-17 e IL-23 sobre a atividade fungicida, bem como sobre a capacidade migratória e inflamatória de neutrófilos. Neutrófilos de indivíduos saudáveis e de pacientes com a forma adulta multifocal da doença foram isolados e estimulados com citocinas recombinantes (rh-IL17 e/ou rh-IL23). Após o estímulo as células foram avaliadas quanto a expressão de receptores de quimiocinas (CXCR1 e CXCR2) e moléculas de adesão (CD54 e CD62L). Os neutrófilos também foram avaliados quanto a sua capacidade de adesão em Células Endoteliais Pulmonares Humanas (HLEC), sua resposta migratória a diferentes concentrações de CXCL8 e sua capacidade fungicida, e sobre a produção de H2O2, matriz metaloproteinase 9 (MMP-9) e citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-? e IL-1?). Os resultados demonstraram que células estimuladas com IL-17 e/ou IL-23 apresentaram uma expressão aumentada de receptores de quimiocina e moléculas de adesão, associadas com uma capacidade aumentada de adesão e migração. Além disso, observamos que neutrófilos estimulados com ambas as citocinas exibiram uma antifúngica diminuída relacionada com produção diminuída de H2O2, ao lado de uma produção aumentada de MMP-9, IL-6 e IL-1?. Os dados obtidos nos permitem concluir que citocinas relacionadas à resposta Th17 (IL-17 e IL-23) podem desempenhar um papel importante na contenção da infecção causada pelo P. brasiliensis, uma vez que predominam em sua forma mais branda e localizada, a forma adulta. Essas citocinas poderiam atuar de forma semelhante àquela observada em outras infecções fúngicas, induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico inato. Apesar de sua importância, a produção crônica dessas citocinas, e sua atuação sobre os neutrófilos, podem induzir uma resposta inflamatória exacerbada que em última instância seria responsável pela destruição tecidual observada principalmente nas formas crônicas da doença / Abstract: The participation of IL-17 producing cells in the immune response to fungi has been recently described. The main function of IL-17 is the activation and attraction of neutrophils to infection sites. Lesions of patients with paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Brazil, are characterized by an inflammatory infiltrate rich in neutrophils, that shows an impaired fungicidal activity when compared to cells from healthy individuals. The aim of this study was to evaluate the effect of IL-17 and IL-23 on the fungicidal activity, as well as on the migratory and inflammatory ability of neutrophils. Neutrophils from healthy controls and patients with the multifocal adult form of PCM were isolated and stimulated with rhIL-17 and/or rhIL-23. Stimulated cells were evaluated for their expression of chemokine receptors (CXCR1 and CXCR2), and adhesion molecules (CD54 and CD62L), as well as, for their capacity of adhesion on Human Lung Endothelial Cells (HLEC) and for their migratory ability in response to CXCL8. We also evaluated the effect of these cytokines treatment on fungicidal activity and on the production of H2O2, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and inflammatory cytokines (IL-6, TNF-alpha and IL-1-beta). Neutrophils exposed to IL-17 and/or IL-23 increased their expression of CXCR1 and CXCR2 and adhesion molecules, which were associated with an increased adhesive and migratory capacity. Furthermore, the treatment of neutrophils with IL-17 and IL-23 had a suppressive effect on their fungicidal activity, characterized by a diminished production of H2O2, but increased their production of MMP-9 and inflammatory cytokines. These data indicate that Th17 related cytokines (IL-17 and IL-23) can participate in the initial resistance to the infection caused by P. brasiliensis, once they are predominant in the milder and localized form of the disease, the adult form. As in other fungal infections, IL-17 (and IL-23) can induce a local inflammatory response and the activation of innate immune cells. However, when chronically produced these cytokines can induce an exacerbated inflammatory response, mainly acting on neutrophils, which can be responsible for the tissue damage observed in the chronic form of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Maria Heloísa de Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - UniversidadeEstadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amarante_FernandaGambogiBraga_D.pdf: 4196475 bytes, checksum: 56f21492faf4255d8c10af9a3b41018c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Pacientes com a forma juvenil da paracoccidioidomicose (PCM) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada por teste de hipersensibilidade do tipo tardio negativo e proliferação linfocitária deficiente a antígenos do fungo e pela produção de citocinas do tipo TH2 como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-?. Além disso, um aspecto comum desta forma da doença é o número elevado de eosinófilos no sangue periférico, que retorna a valores normais após o tratamento antifúngico. O papel dos eosinófilos na PCM nunca foi investigado. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade funcional de eosinófilos de 15 pacientes com a forma juvenil da PCM. Para tanto eosinófilos isolados do sangue periférico de pacientes (antes e durante o tratamento antifúngico) e de doadores sadios (controles) foram avaliados quanto a: capacidade quimiotática em resposta ao RANTES, eotaxina e IL-5; capacidade de adesão a células endoteliais pulmonares; expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos (CD80, CD86, MHC de classe II, TLR-2 e TLR-4), de moléculas de adesão (CD11a, CD11b, CD49d e CD54), de receptores de IgE (CD23 e FC?RI?), marcadores de ativação (CD69) e do receptor CCR3; atividade fungicida direta contra leveduras de P. brasiliensis e expressão gênica de citocinas, quimiocinas e proteínas de grânulos. Também foi realizada a dosagem dos níveis séricos de constituintes dos grânulos citotóxicos (MBP, EPO, ECP e EDN) e das quimiocinas CCL5, eotaxina, CXCL9, CXCL10 em pacientes antes e durante o tratamento antifúngico e controles. Biópsias de linfonodos e fígados dos pacientes foram analisadas quanto a expressão de RANTES, eotaxina, MBP, IL-25 e IDO. Os resultados mostraram eosinofilia periférica em 86,7% dos casos, altos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis e concentração sérica elevada de proteína C reativa. A resposta quimiotática à eotaxina, a adesão a HLECs e a expressão do RNAm para IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 e CXCL8 foi maior nos eosinófilos de pacientes comparados aos controles. Eosinófilos de pacientes, assim como de controles, foram capazes de matar leveduras de P. brasiliensis. Maior frequência de eosinófilos CD69+ e TLR2+ e menor frequência de eosinófilos CD80+, MHC de classe II+, TLR-4+, CD23+ e CD11a+ foi observada em pacientes comparado aos controles. O acompanhamento dos pacientes durante o tratamento antifúngico mostrou a redução número de eosinófilos do sangue periférico, da concentração sérica de proteína C reativa, dos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis, dos níveis séricos de proteínas citotóxicas e quimiocinas, além de aumento da capacidade migratória em resposta à eotaxina. Adicionalmente, eosinófilos de pacientes apresentam redução da expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos, de ativação, de moléculas de adesão, do receptor de IgE CD23 e do receptor CCR3 durante o tratamento antifúngico. Nas lesões causadas pelo fungo em linfonodos e fígado foi detectada marcação positiva para MBP, eotaxina, RANTES, IL-25 e IDO. Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar que os eosinófilos dos pacientes com a forma juvenil da PCM encontram-se ativados (alta expressão do CD69) e poderiam estar contribuindo para a intensa resposta inflamatória que caracteriza a fase inicial da forma juvenil da PCM e prejudica a resposta de eliminação do fungo. Após o tratamento antifúngico, observou-se uma diminuição dos parâmetros analisados, exceto a capacidade quimiotática dos eosinófilos que aumentou devido, provavelmente, a redução de inibidores da quimiotaxia como o CXCL9 e CXCL10 / Abstract: Patients with juvenile form of paracoccidioidomycosis (PCM) have a depressed cellular immune response as shown by negative delayed-type hypersensitivity, suppressed lymphocyte proliferation to P. brasiliensis antigens, and production of TH2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-?. Furthermore, a common feature of this disease is the large number of eosinophils in the peripheral blood that returns to normal values after antifungal treatment. The role of eosinophils in PCM has never been investigated. This study aimed to evaluate the phenotypic and functional characteristics of eosinophils of 15 patients with the juvenile form of PCM. Eosinophils of patients isolated from peripheral blood (before and during the antifungal treatment) and of healthy donors (controls) were evaluated for: chemotactic response to RANTES, eotaxin and IL-5; adhesion to human lung endothelial cells (HLECs); expression of antigen recognition and presentation molecules (CD80, CD86, MHC class II, TLR2 and TLR-4), adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD49d and CD54), IgE receptors (CD23 and FC?RI?), activation marker (CD69) and CCR3; direct fungicidal activity against P. brasiliensis yeast cells and gene expression of cytokines, chemokines and protein granules. We also assessed serum levels of granules cytotoxic molecules (MBP, EPO, ECP and EDN) and chemokines (CCL5, eotaxin, CXCL9, CXCL10) in patients before and during the antifungal treatment and controls. Lymph nodes and liver biopsies of patients were stained for RANTES, eotaxin, MBP, IL-25 and IDO. The results showed peripheral eosinophilia in 86.7% of cases, high titers of antibodies to P. brasiliensis and high concentration of C-Reactive Protein. The chemotactic response to eotaxin, adhesion to HLECs and expression of mRNA for IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 and CXCL8 was higher in eosinophils of patients than in controls. Eosinophils of patients as well as of controls were able to kill P. brasiliensis yeast cells. A higher frequency of eosinophil CD69+ and TLR2+ and lower frequency of eosinophil CD80+, MHC class-II+, TLR-4+, CD23+ and CD11a+ was found in patients compared to controls. Patient's follow-up showed a reduction in the number of eosinophils in peripheral blood, serum concentration of C-Reactive protein, anti-P. brasiliensis antibodies, serum levels of cytotoxic proteins and chemokines, in addition to increased migration capacity. Moreover, eosinophils of patients exhibited reduced expression CD80, MHC class-II, TLR-4, CD23, CD11a, CD11b, CD23, CD69 and CCR3 during the antifungal treatment. Immunohistochemistry staining showed strong expression of MBP, eotaxin, RANTES, IL-25 and IDO in liver and lymph nodes biopsies from PCM patients. In conclusion, this study demonstrated that eosinophils are strongly activated (high CD69 expression) and could contribute to the intense inflammatory response that characterize the initial phase of juvenile form of PCM response and impairs the elimination of the fungus. After antifungal treatment, there was a decrease of all parameters except the chemotactic ability of eosinophils which increased, probably due to reduction of inhibitors of chemotaxis such as CXCL9 and CXCL10 / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

As células T Natural Killer (NKT) são linfócitos que expressam o rearranjo V24V11 com TCR invariante e reconhecem glicolipídeos como o alfagalactosilceramida (-GalCer) apresentado no contexto da molécula MHC-não clássica chamada CD1d. As NKT são divididas em subgrupos distintos: os fenótipos CD4+ e CD4- em camundongos e humanos, e CD8+ e CD4-CD8- em humanos. Após estímulo, as NKT secretam citocinas Th1 e Th2. A frequência das NKT representa menos de 1% da população de linfócitos T no sangue periférico humano. O objetivo deste trabalho é primeiro, identificar a frequência, o fenótipo e a função da população de células NKT nos grupos de indivíduos saudáveis de procedências distintas. Segundo, avaliar a influência da idade, gênero e país de moradia na frequência das NKT, incluindo suas subpopulações, no sangue periférico; Terceiro, verificar se há variabilidade ou não na apresentação da molécula CD1d. Quarto, verificar se há alteração na função das NKT utilizando o estímulo -GalCer e por fim, verificar o perfil das NKT quanto ao seu estado de ativação e migração celular quando submetidas a expansão. As amostras são provenientes de São Paulo, Brasil; São Francisco, Estado Unidos da América e Estocolmo, Suécia. Os parâmetros imunológicos foram analisados por citometria de fluxo. Demonstramos que o grupo de São Paulo, não apresentou maiores valores de linfócitos T CD3+, no entanto, apresentou valores significantes de células NKT V24+/V11+. Não estabelecemos a expressão dos marcadores de ativação e migração nas NKT. Estabelecemos, no grupo de São Paulo, a capacidade funcional das NKT que expressaram IFN- e TNF- assim como de expansão, sob estímulo de -GalCer. Os resultados sugerem que vários fatores podem alterar a quantidade das células NKT na periferia. Mais estudos devem ser endereçados para esclarecer melhor estes fatos / Natural Killer T cells (NKT cells) are lymphocytes that express the invariant TCR rearrangement V24V11 and recognize glycolipid as alpha-galactosylceramide (-GalCer) presented in conjunction with a non-MHC pathway molecule named CD1d. The NKT cells are divided into distinct subsets: the CD4+ and CD4- phenotype in mice and humans and the CD8+ and CD4-CD8- phenotype in humans. After stimulation, the NKT secrete Th1 and Th2 cytokines. The frequencies of NKT cells represent <1% of the population of T lymphocytes in human peripheral blood. The objective of this study is to 1) identify the frequency, phenotype and function of NKT cell population in groups of healthy individuals from different racial/ethnic origins, 2) evaluate the influence of age, gender and country of residence on the frequency of NKT cells/subpopulations, 3) investigate the variability of presentation of the CD1d molecule, 4) investigate the functional variability of NKT cells using -GalCer stimulation, and 5) study the activation and migration profile of NKT cells after expansion. Immunologic parameters of clinical samples from Sao Paulo, Brazil; San Francisco, California and Stockholm, Sweden were analyzed by flow cytometry. We demonstrate that the São Paulo group does not have an elevated number of CD3+ T lymphocytes, but does have significantly more NKT V24+/V11+ cells. We have not yet determined expression of NKT markers for activation and migration. Thus, we have shown that among sample obtained in São Paulo, there is increased functional capacity of IFN- and TNF--expressing NKT cells along with NKT cells expansion under stimulation with the -GalCer. These results suggest that there are several factors that can modulate NKT cell number and function in the peripheral blood and additional studies are needed to further clarify these findings

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:33:03Z No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) Previous issue date: 2012-10-31 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / ATP e outros nucleotídeos são liberados para o meio extracelular por vias reguladas ou pela perda da integridade de membrana. Uma vez fora da célula, esses compostos podem ativar receptores P2: P2X (receptores ionotrópicos) e P2Y (receptores acoplados a proteínas G). Além disso, O receptor P2X7 é um importante membro da família P2X, já que sua ativação pode levar a abertura de um poro membranar que permite a passagem de moléculas de até 900 Da. Os eosinófilos são as principais células efetoras em respostas alérgicas e estão associados com diversos processos fisiológicos e patológicos. Nesse trabalho investigamos a expressão de receptores P2 e suas funções em eosinófilos. Nesse contexto, nosso primeiro passo foi investigar a expressão e funcionalidade dos receptores P2X por patch clamping. Nossos resultados sugerem a presença de P2X1, de P2X2 e de P2X7. Em seguida, avaliamos por microfluorimetria a funcionalidade dos receptores P2Y, e verificamos com base na ordem de potência a possível presença de P2Y2, de P2Y4, de P2Y6 e de P2Y11. Além disso, confirmamos nossos dados por imunofluorescência. Realizamos também ensaios de migração in vitro e in vivo, para verificar se os nucleotídeos extracelulares poderiam atrair eosinófilos. O ATP foi capaz de induzir a migração dos eosinófilos, enquanto a suramina, um bloqueador P2, aboliu esse efeito, tanto in vitro, utilizando transwell, como in vivo, utilizando um modelo de pleurisia alérgica em ratos. Em seguida, avaliamos o possível papel da panexina-1 como poro associado ao receptor P2X7. Nesse trabalho utilizamos inibidores de hemicanais em experimentos de patch clamp e em ensaios de permeabilização de corante. Os resultados indicam que os inibidores de hemicanais não bloquearam a geração de corrente ou a captação de corante após a ativação do receptor P2X7 em macrófagos de ratos e camundongos. Demonstramos que eosinófilos de rato expressam receptores P2X e P2Y por imunofluorescência. Além disso, demonstramos que a ativação de receptores P2 pode aumentar a migração de eosinófilos in vitro e in vivo. Além disso, foi demonstrado que inibidores de panexina-1 não bloqueiam a captação do corante ou a corrente gerada pela ativação do receptor P2X7. Os nossos resultados demostraram que panexina-1 não é o poro associado ao receptor P2X7 em macrófagos / ATP and other nucleotides are released from cells through regulated pathways or following the loss of plasma membrane integrity. Once outside the cell, these compounds can activate P2 receptors: P2X ionotropic receptors and G protein-coupled P2Y receptors. . Additionally, P2X7 receptor is an important member of the P2X family of ionotropic receptor as its activation opens a non-selective pore allowing the passage of molecules up to 900 Da. Eosinophils represent major effector cells in the allergic inflammatory response and they are, in fact, associated with several physiological and pathological processes. Here we investigate the expression of P2 receptors and roles of those receptors in murine eosinophils. In this context, our first step were to investigate the expression and functionality of the P2X receptors by patch clamping, our results suggest the presence of P2X1, P2X2 and P2X7. Next we evaluate by microfluorimetry the expression of P2Y receptors, our results based in the ranking order of potency suggests the presence of P2Y2, P2Y4, P2Y6 e P2Y11. Moreover, we confirmed our findings by immunofluorescence assays. We also did in vitro and in vivo migration assays to verify whether nucleotides could attract eosinophil. ATP increased migration of eosinophils, while suramin a P2 blocker abolished this effect in both in vitro, using trasnwell, and in vivo, using a model of rat allergic pleurisy. Next, we evaluated the putative role of pannexin-1 as the pore associated to the P2X7 receptor. We used hemichannels inhibitors in patch clamp and dye uptake experiments. The results indicate that they do not interfere with current generation or dye uptake after activation of P2X7R in rat and mouse macrophages. We have demonstrated that rat eosinophils express P2X and P2Y receptors by immunofluorescence. In addition, the activation of P2 receptors can increase migration of eosinophils in vitro and in vivo. Moreover, we demonstrated that specific inhibitors of pannexin-1 did not interfere with the dye uptake or current generated by the P2X7 activation. Our results showed that pannexin-1 is not the pore associated to the P2X7 receptor in macrophages.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:26:36Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-24T13:34:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leucemia/linfoma linfoblástico de células T (LLL-T) é um processo patológico resultante de proliferações malignas de precursores de células T em diferentes estágios de desenvolvimento. Como os blastos de LLL-T apresentam características de precursores de células T normais, moléculas envolvidas na migração destas células podem estar envolvidas da migração e saída de blastos de LLL-T no curso da doença. Nesse sentido, foi descrito que o receptor 1 de esfingosina-1-fosfato (S1P1) é essencial para a saída de timócitos do timo. Nós observamos anteriormente que células de pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) e linfoma linfoblástico de células T (LL-T) expressam o receptor S1P1, assim como três linhagens celulares (MOLT-4, Jurkat e CEM) que representam esta doença. Baixas concentrações de S1P induzem a quimiotaxia destas células, mas não altas concentrações de S1P, e esta migração é dependente do S1P1 e de polimerização de actina. Entretanto nossos dados também indicam que outros receptores de S1P podem estar envolvidos nesse processo. No presente estudo, avaliamos a expressão e o papel dos receptores de S1P na migração de precursores de células T neoplásicas. Nós observamos que as linhagens celulares acima descritas expressam não só S1P1, mas outros receptores de S1P. MOLT-4 expressa preferencialmente S1P1, S1P3 e S1P5, Jurkat expressa S1P1 e S1P3, enquanto CEM expressa todos os receptores de S1P, com exceção de S1P2 Verificamos ainda que altas concentrações de S1P induzem a fugotaxia da célula CEM e que este processo é dependente do S1P1. Em contrapartida, nossos dados mostram que a migração celular induzida por baixas concentrações de S1P induz não só a quimiotaxia, mas também a quimiocinese desta célula. Além disso, observamos que o S1P3, único receptor expresso comumente por estas células, não está envolvido na quimiotaxia dos blastos de LLA-T. S1P ativa ainda as vias de sinalização de AKT e ERK, mas não de Rac1, e a ativação destas vias parece ser mediada pelo S1P1. No entanto, baixas e altas concentrações de S1P ativam estas vias de forma distinta. Altas concentrações de S1P parecem induzir uma ativação mais tardia de AKT e ERK, enquanto uma diminuição na atividade de Rac1 é observada. Nossos dados sugerem que S1P1 regula diferencialmente a migração dos blastos de LLA-T, dependendo da concentração de S1P no meio. Desta forma, a interação S1P/S1P1 deve ser considerada como possível estratégia terapêutica, visando a prevenção da disseminação dos blastos que pode ser resultante da quimiotaxia ou da fugotaxia / T-cell lymphoblastic leukemia and lymphoma (T-LLL) is a pathologic process resulting from malignant proliferations of T-cell precursors at different stages of development. As T-LLL lymphoblasts present similar characteristics of normal T-cell precursors, molecules involved on the migration of these cells might also be associated with migration and homing of T-LLL blasts. In this context, sphingosine-1- phosphate receptor 1 (S1P1) has been described as essential for thymocyte egress from the thymus. We previously observed that patient\2019s cells with T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and T-cell lymphoblastic lymphoma (T-LL) express S1P1, as well as three T-ALL cell lines (MOLT-4, Jurkat, and CEM). Low S1P concentrations induce chemotaxis of T-ALL cell lines, but high S1P concentrations do not. This migration mediated through S1P1 and actin polymerization events. However, our data suggests that other S1P receptors might be involved in this process. Herein, we evaluate the expression and role of S1P receptors in the migration of neoplastic T-cell precursors. We observed that this cell lines expressed not only S1P1, but also other S1P receptors. MOLT-4 preferentially expressed S1P1, S1P3 and S1P5 Jurkat mainly expressed S1P1 and S1P3 and CEM expressed all S1P receptors, except for S1P2. We also verified that high S1P concentrations induced CEM fugetaxis and this process is dependent on S1P1. In contrast, low S1P concentrations induced not only chemotaxis but also chemokinesis. Furthermore, S1P3, the only receptor expressed commonly by these cells lines, was not involved in chemotactic responses. Moreover, S1P activated AKT and ERK signaling pathways, but it was not able to activate Rac1, and activation of these signaling pathways seems to be S1P1-dependent. However, low and high S1P concentrations activated these signaling pathways in different ways. High S1P concentrations activated AKT and ERK later than low S1P concentrations and resulted in decreased Rac1 activity. Together, our results suggest that S1P1 regulates differentially T-ALL blast migration depending on S1P concentrations on the medium. Accordingly, immune intervention upon this ligand/receptor interaction may be envisioned as a potential therapeutic strategy for preventing the spread of blasts, which can result from chemotaxis or fugetaxis process

As células T Natural Killer (NKT) são linfócitos que expressam o rearranjo V24V11 com TCR invariante e reconhecem glicolipídeos como o alfagalactosilceramida (-GalCer) apresentado no contexto da molécula MHC-não clássica chamada CD1d. As NKT são divididas em subgrupos distintos: os fenótipos CD4+ e CD4- em camundongos e humanos, e CD8+ e CD4-CD8- em humanos. Após estímulo, as NKT secretam citocinas Th1 e Th2. A frequência das NKT representa menos de 1% da população de linfócitos T no sangue periférico humano. O objetivo deste trabalho é primeiro, identificar a frequência, o fenótipo e a função da população de células NKT nos grupos de indivíduos saudáveis de procedências distintas. Segundo, avaliar a influência da idade, gênero e país de moradia na frequência das NKT, incluindo suas subpopulações, no sangue periférico; Terceiro, verificar se há variabilidade ou não na apresentação da molécula CD1d. Quarto, verificar se há alteração na função das NKT utilizando o estímulo -GalCer e por fim, verificar o perfil das NKT quanto ao seu estado de ativação e migração celular quando submetidas a expansão. As amostras são provenientes de São Paulo, Brasil; São Francisco, Estado Unidos da América e Estocolmo, Suécia. Os parâmetros imunológicos foram analisados por citometria de fluxo. Demonstramos que o grupo de São Paulo, não apresentou maiores valores de linfócitos T CD3+, no entanto, apresentou valores significantes de células NKT V24+/V11+. Não estabelecemos a expressão dos marcadores de ativação e migração nas NKT. Estabelecemos, no grupo de São Paulo, a capacidade funcional das NKT que expressaram IFN- e TNF- assim como de expansão, sob estímulo de -GalCer. Os resultados sugerem que vários fatores podem alterar a quantidade das células NKT na periferia. Mais estudos devem ser endereçados para esclarecer melhor estes fatos / Natural Killer T cells (NKT cells) are lymphocytes that express the invariant TCR rearrangement V24V11 and recognize glycolipid as alpha-galactosylceramide (-GalCer) presented in conjunction with a non-MHC pathway molecule named CD1d. The NKT cells are divided into distinct subsets: the CD4+ and CD4- phenotype in mice and humans and the CD8+ and CD4-CD8- phenotype in humans. After stimulation, the NKT secrete Th1 and Th2 cytokines. The frequencies of NKT cells represent <1% of the population of T lymphocytes in human peripheral blood. The objective of this study is to 1) identify the frequency, phenotype and function of NKT cell population in groups of healthy individuals from different racial/ethnic origins, 2) evaluate the influence of age, gender and country of residence on the frequency of NKT cells/subpopulations, 3) investigate the variability of presentation of the CD1d molecule, 4) investigate the functional variability of NKT cells using -GalCer stimulation, and 5) study the activation and migration profile of NKT cells after expansion. Immunologic parameters of clinical samples from Sao Paulo, Brazil; San Francisco, California and Stockholm, Sweden were analyzed by flow cytometry. We demonstrate that the São Paulo group does not have an elevated number of CD3+ T lymphocytes, but does have significantly more NKT V24+/V11+ cells. We have not yet determined expression of NKT markers for activation and migration. Thus, we have shown that among sample obtained in São Paulo, there is increased functional capacity of IFN- and TNF--expressing NKT cells along with NKT cells expansion under stimulation with the -GalCer. These results suggest that there are several factors that can modulate NKT cell number and function in the peripheral blood and additional studies are needed to further clarify these findings

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2018-02-23T18:26:15Z No. of bitstreams: 2 Jose_santos2017.pdf: 2362954 bytes, checksum: 3cd8da60eb3efb9e2ed240ef51fa9a23 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-23T18:26:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Jose_santos2017.pdf: 2362954 bytes, checksum: 3cd8da60eb3efb9e2ed240ef51fa9a23 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lung cancer is highly lethal and smoking is an important risk factor. Non-small cell tumor is the most common, less aggressive type of lung carcinoma and treatment involves surgery, chemotherapy, and radiation therapy. However, late diagnosis, due to the absence of signs and symptoms in the early stages of the disease, makes the survival rate low. In this sense, the search for new chemical substances with characteristics of selectivity, effectiveness and low toxicity have been investigated in the treatment of cancer. Studies show that sericin, a protein extracted from silkworm cocoons, exhibits anti-tumor and anticarcinogenic activity in colon and skin cancer cells, stimulating apoptosis and disrupting the cell cycle, and protecting normal cells against oxidative stress and lipid peroxidation . Thus, the therapeutic potential of sericin has raised interest in evaluating its effect on non-small cell lung cancer cell line. The studies were conducted in culture, where the effects of silk protein were evaluated: on cell viability, by neutral red assays and tetrazolium - MTT cytotoxicity; in the apoptotic potential, with annexin-5 and Alexa Fluor® and Propidium Iodide assays; and in cell migration by the Wound Healing model assay. Low doses of sericin were able to increase lysosomal viability, reduce mitochondrial viability, increase apoptosis and cell migration, while high doses of sericin exponentially reduced cell migration and did not alter the rate of apoptosis / necrosis of cancer cells. Sericin is a biomaterial that causes biological effects on the cell line tested, and can be used to increase lysosomal viability, reduce mitochondrial function, increase apoptosis at low doses and inhibit high-dose cell migration. / O câncer de pulmão apresenta alta letalidade e o fumo se constitui como um importante fator de risco. O tumor de células não pequenas é o tipo de carcinoma pulmonar mais comum, menos agressivo e o tratamento envolve cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Entretanto, o diagnóstico tardio, em função da ausência de sinais e sintomas nos estágios iniciais da doença, faz com que a taxa de sobrevivência seja baixa. Nesse sentido, a busca de novas substâncias químicas com características de seletividade, de efetividade e de baixa toxicidade tem se refletido em pesquisas que investigam o uso dessas substâncias no tratamento do câncer. Estudos mostram que a sericina, proteína extraída dos casulos do bicho-da-seda, apresenta atividade antitumoral e anticarcinogênica em células cancerosas de cólon e de pele, estimulando a apoptose e interrompendo o ciclo celular, além de proteger células normais contra estresse oxidativo e peroxidação lipídica. Assim, o potencial terapêutico da sericina suscitou o interesse em avaliar seu efeito em linhagem celular de câncer de pulmão do tipo células não pequenas. Os estudos foram conduzidos em cultura, em que foram avaliados os efeitos da proteína da seda: na viabilidade celular, por meio de ensaios pelo vermelho neutro e de citotoxicidade com o tetrazólio - MTT; no potencial apoptótico, com ensaios com anexina-5 e Alexa Fluor® e Iodeto de Propídio; e na migração celular, ensaio com o modelo Wound Healing. Baixas doses de sericina foram capazes de aumentar a viabilidade lisossomal, reduzir a viabilidade mitocondrial, aumentar a apoptose e a migração celular, enquanto altas doses de sericina reduziram exponencialmente a migração celular e não alteraram a taxa de apoptose/necrose das células cancerosas. A sericina é um biomaterial que provoca efeitos biológicos na linhagem celular testada, e pode ser utilizada para aumentar a viabilidade lisossomal, reduzir a função mitocondrial, aumentar a apoptose em baixas doses e inibir a migração celular em doses altas.