O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença. O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1, parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente a 5\' deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos. Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5\' do promotor basal de TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1 foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas experimentalmente / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among 31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1 noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested

As maiores taxas de incidência de câncer de mama ocorrem em mulheres idosas, que apresentam tumores com expressão de receptores de estrógeno e/ou progesterona, de baixo estadiamento e menor taxa de proliferação, se comparado com as jovens. Um dos fatores de predisposição ao câncer de mama é mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2, que podem compreender entre 5-10% das pacientes diagnosticadas. A grande maioria dos casos são ditos esporádicos, em que não há como estabelecer um único fator determinante. Dentre o escopo de possíveis causas estão as mutações somáticas, acumuladas no tecido mamário ao longo da vida. A identificação destas mutações permite melhor compreensão da carcinogênese e possibilita a criação de tratamentos cada vez mais personalizados. O gene PIK3CA, por exemplo, já está determinado como driver (responsáveis pela obtenção de vantagem seletiva de um determinado clone) para câncer de mama. As mutações patogênicas que ocorrem neste gene levam a ativação da via de Akt/mTOR, entre outras, que mantém o ciclo celular ativo. Um gene que vem sendo estudado recentemente é o PRKD1, cujas funções parecem estar ligadas à manutenção do fenótipo epitelial das células do tecido mamário. Assim, o objetivo desse trabalho identificar mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2, analisando também o histórico familiar para câncer de mama/ovário/próstata, e mutações somáticas no gene PRKD1 em pacientes pós menopausadas,. Foram incluídas quarenta e nove pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo em idade superior a 54 anos, que preenchessem critérios da NCCN (National Comprehensive Cancer Network) para Síndrome de Câncer de Mama e/ou Ovário Hereditário e tinham disponível um fragmento tumoral emblocado em parafina coletado na ausência de tratamento neo adjuvante. A extração de DNA foi realizada a partir do sangue periférico para sequenciamento de BRCA1 e BRCA2, realizado através da plataforma Ion Torrent(TM) ou pelo método de Sanger. Os resultados obtidos por Ion Torrent(TM) foram analisados, primeiramente, através da ferramenta online Ion Reporter e os de Sanger através do programa Mutation Surveyor v.3.20. Para a caractetização das variantes encontradas foram utilizados: os bancos de dados BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD e ClinVar além dos preditores in silico da conservação dos aminoácidos entre as espécies Polyphen-2, SIF, Provean e AlignGVGD e do preditor de efeito no splicing HSF e bancos de dados de frequência alélica ExAC, 1000 genomas e NHLBI GO Exome Sequencing Project, seguindo os critérios da American College of Medical Genetics and Genomics em conjunto com a Association for Molecular Pathology. Para caracterização de mutação somática do gene PRKD1 determinou-se duas regiões de maior importância para serem sequenciadas: Ser738/Ser742 e Ser910 que fosforilam o domínio quinase da proteína, ativando-o. Vinte e três amostras tumorais tiveram DNA extraído. Também foi realizada uma análise das informações sobre PRKD1 do banco de dados COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) e a construção de curvas de sobrevida (Kaplan-Meier) da expressão de PRKD1 utilizando a ferramenta online KM Plotter. A idade mediana das pacientes foi de 62 anos ao diagnóstico e de 64 anos na época de inclusão no estudo. A maioria tinha tumores de grau histológico II (63,27%), estádio clinico II (20%) e do subtipo luminal B (53,06%). Trinta e duas relataram parentes de primeiro grau afetados com câncer de mama/ovário/ próstata. Trinta e oito pacientes tiveram sequenciamento completo de BRCA1 e BRCA2 por Ion Torrent(TM) e onze tiveram sequenciamento parcial de BRCA1 e BRCA2 por Sanger. Variantes patogênicas foram encontradas em quatro pacientes (BRCA1=2/BRCA2=2). Uma nova variante missense foi identificada em BRCA2: c.3371A > G (p.Q1124R). Para o sequenciamento de PRKD1 quinze foram sequenciadas para Ser910 e de oito foi possível analisar o resultado. Nenhuma variante patogênica foi encontrada. Os dados obtidos sobre PRKD1 no COSMIC foram: de 2773 amostras, em apenas 15 (0,54%) foram identificadas mutações em PRKD1, 46% (7/15) provém de mulheres com idade superior a 55 anos e subtipo molecular Luminal. PRKD1 apresenta maiores frequência de mutação em câncer de intestino grosso (4,22%) e pele (4,02%). As curvas de sobrevida construídas no KM Plotter demonstram a alta expressão do gene parece ter impacto positivo na sobrevida das pacientes. Apesar da baixa frequência de mutações no PRKD1 este gene, outros dados demonstram que parece ter um papel de gene supressor de tumor no câncer de mama, que deve ser inibido de através de outros mecanismos como metilaçao de DNA / The highest rates of breast cancer incidence occur in elderly women, who present estrogen and / or progesterone receptor tumors, with a low clinical staging and lower proliferation rate compared to the young women. One of the factors predisposing to breast cancer is germline mutation in the BRCA1 or BRCA2 genes, which may comprise between 5-10% of the diagnosed patients. The vast majority of cases are said to be sporadic, in which there is no way to establish a single determining factor. Among the scope of possible causes are somatic mutations, accumulated in the breast tissue throughout life. The identification of these mutations allows a better understanding of carcinogenesis and enables the creation of increasingly personalized treatments. The PIK3CA gene, for example, is already determined as a driver (responsible for the selective advantage of a particular clone) for breast cancer. The pathogenic mutations that occur in this gene lead to the activation of Akt / mTOR pathway, among others, which keeps the cell cycle active. One gene that has recently been studied is PRKD1, whose functions seem to be linked to the maintenance of the epithelial phenotype of the mammary tissue cells. Thus, the objective of this work was to identify germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes, also analyzing the family history for breast / ovarian / prostate cancer, and somatic mutations in the PRKD1 gene in postmenopausal patients. Forty-nine patients diagnosed with ipsilateral ductal carcinomas over the age of 54 years who completed NCCN (National Comprehensive Cancer Network) criteria for Breast Cancer and / or Hereditary Ovarian Syndrome and had a tumor paraffin embedded in paraffin collected in the absence of neo adjuvant treatment available. DNA extraction was performed from the peripheral blood for sequencing of BRCA1 and BRCA2, performed through the Ion Torrent (TM) platform or by the Sanger method. The results obtained by Ion Torrent (TM) were first analyzed through the online tool Ion Reporter and those by Sanger through the program Mutation Surveyor v.3.20. The BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD and ClinVar databases were used in addition to the in silico predictors of amino acid conservation among Polyphen-2, SIF, Provean and AlignGVGD species and the effect predictor in the HSF splicing and allelic frequency databases ExAC, 1000 genomes and the NHLBI GO Exome Sequencing Project, following the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics in conjunction with the Association for Molecular Pathology. In order to characterize the somatic mutation of the PRKD1 gene, we determined two regions of greater importance to be sequenced: Ser738 / Ser742 and Ser910 that phosphorylate the protein kinase domain, activating it. Twenty-three tumor samples had DNA extracted. An analysis of PRKD1 information from the COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer) database and the construction of survival curves (Kaplan-Meier) for PRKD1 expression using the online KM Plotter tool was also performed. The median age of the patients was 62 years at diagnosis and 64 years at the time of inclusion in the study. Most of them had tumors of histological grade II (63.27%), clinical stage II (20%) and molecular subtype luminal B (53.06%). Thirty-two reported first-degree relatives affected with breast / ovarian / prostate cancer. Thirty-eight patients had BRCA1 and BRCA2 complete sequencing by Ion Torrent (TM) and eleven had BRCA1 and BRCA2 partial sequencing by Sanger. Pathogenic variants were found in four patients (BRCA1 = 2 / BRCA2 = 2). For PRKD1 sequencing, fifteen patients tumors were sequenced for Ser910 and in eight samples it was possible to analyze the result. No pathogenic variant was found. The data obtained on PRKD1 in COSMIC were: from 2773 samples, in only 15 (0.54%) mutations were identified in PRKD1, 46% (7/15) came from women aged over 55 years and had tumor molecular subtype Luminal. PRKD1 shows higher mutation frequency in cancer of the large intestine (4.22%) and skin (4.02%). The survival curves constructed in KM Plotter demonstrate the high expression of the gene seems to have a positive impact on the patients survival . Despite the low frequency of mutations in PRKD1 gene, other data demonstrate that it appears to play a role of tumor suppressor gene in breast cancer, which must be inhibited by other mechanisms such as DNA methylation

High-level language virtual machines (HLL VMs) have been playing a key role as a mechanism for implementing programming languages. Languages that run on these execution environments have many advantages over languages that are compiled to native code. These advantages have led HLL VMs to gain broad acceptance in both academy and industry. However, much of the research in this area has been devoted to boosting the performance of these execution environments. Few eorts have attempted to introduce features that automate or facilitate some software engineering activities, including software testing. This research argues that HLL VMs provide a reasonable basis for building an integrated software testing environment. To this end, two software testing features that build on the characteristics of a Java virtual machine (JVM) were devised. The purpose of the rst feature is to automate weak mutation. Augmented with mutation support, the chosen JVM achieved speedups of as much as 95% in comparison to a strong mutation tool. To support the testing of concurrent programs, the second feature is concerned with enabling the deterministic re-execution of Java programs and exploration of new scheduling sequences / Máquinas virtuais de linguagens de programação têm desempenhado um papel importante como mecanismo para a implementação de linguagens de programação. Linguagens voltadas para esses ambientes de execução possuem várias vantagens em relação às linguagens compiladas. Essas vantagens fizeram com que tais ambientes de execução se tornassem amplamente utilizados pela indústria e academia. Entretanto, a maioria dos estudos nessa area têm se dedicado a aprimorar o desempenho desses ambientes de execução e poucos têm enfocado o desenvolvimento de funcionalidades que automatizem ou facilitem a condução de atividades de engenharia de software, incluindo atividades de teste de software. Este trabalho apresenta indícios de que máquinas virtuais de linguagens de programação podem apoiar a criação de ambientes de teste de software integrado. Para tal, duas funcionalidades que tiram proveito das características de uma máquina virtual Java foram desenvolvidas. O propósito da primeira funcionalidade e automatizar a condução de atividades de mutação fraca. Após a implementação de tal funcionalidade na máquina virtual Java selecionada, observou-se um desempenho até 95% melhor em relação a uma ferramenta de mutação forte. Afim de apoiar o teste de programas concorrentes, a segunda funcionalidade permite reexecutá-los de forma determinística além de automatizar a exploração de que novas sequências de escalonamento

Since 2011 the prenatal diagnosis field has undergone a revolution with the introduction of a noninvasive prenatal test (NIPT) for genetic diseases relying on analysis of fetal cell-free DNA present in maternal plasma. Although available in Brazil, we rely on outsourcing the technology developed abroad or the test itself. Therefore, our objective was to develop and implement a comprehensive NIPT using high-coverage targeted next-generation sequencing to: 1) estimate fetal fraction; 2) determine fetal sex; 3) detect trisomy; 4) detect monogenic disease. We developed a robust and accurate model (r2= 0.994, p-value < 2.2e-16) for fetal fraction estimation based on distribution of SNP minor allele fraction (MAF). We used Z-score for fetal sex determination (100% accuracy) and trisomy detection of chromosomes 21 (T21) and 18 (T18), achieving a sensitivity of 100% (95% CI: 63.06% - 100.00%) and a specificity of 98.53% (95% CI: 92.08% - 99.96%) for T21, and 40% (95% CI: 5.27% - 85.34%) and 98.59% (95% CI: 92.40% - 99.96%) for T18. For monogenic disease detection (skeletal dysplasia) we performed variant analysis, with 71% (5/7) of detection rate. To our knowledge, this is the first work to integrate all analysis in one single test, and to perform monogenic disease detection without using parental genotype. We showed in this work that it is possible to implement such techniques in our country, using available resources and/or engaging in collaboration with reference research groups abroad. It shows the potential of developing internal technologies, and applying it to other noninvasive fields, such as cancer and organ rejection diagnostic and monitoring / Desde 2011 a área de diagnóstico pré-natal sofreu uma revolução com a introdução de teste pré-natal não-invasivo (NIPT) de doenças genéticas, que se baseia na análise de DNA fetal livre de células presente no plasma materno. Apesar de estar disponível no Brasil, nós dependemos em terceirizar a tecnologia desenvolvida no exterior, ou o teste em si. Sendo assim, nosso objetivo foi desenvolver e implementar um teste NIPT abrangente utilizando sequenciamento de nova geração de alta cobertura targeted para: 1) estimar fração fetal; 2) determinar sexo fetal; 3) detectar trissomia; 4) detectar doença monogênica. Nós desenvolvemos um modelo robusto e preciso (r2= 0.994, p-value < 2.2e-16) para estimativa de fração fetal baseado na distribuição da fração alélica de SNPs. Nós utilizamos Z-score para determinação de sexo fetal (100% de precisão) e detecção de trissomia dos cromossomos 21 (T21) e 18 (T18), atingindo uma sensibilidade de 100% (95% IC: 63.06% - 100.00%) e especificidade de 98.53% (95% IC: 92.08% - 99.96%) para T21, e 40% (95% IC: 5.27% - 85.34%) e 98.59% (95% IC: 92.40% - 99.96%) para T18. Para detecção de doença monogênica (displasia esquelética) nós realizamos análise de variante, com uma taxa de detecção de 71% (5/7). Até onde sabemos, este é o primeiro trabalho a integrar todas as análises em um único teste, e a realizar detecção de doença monogênica sem utilizar genótipo parental. Nós mostramos neste trabalho que é possível implementar essas técnicas no nosso país, utilizando recursos disponíveis e/ou desenvolvendo colaborações com grupos referência internacionais. Isto demonstra o potencial de desenvolver tecnologias internas, e aplicá-las à outras áreas não-invasivas, como diagnóstico e monitoramento de câncer e rejeição de transplante

Talassemias são as mais comuns desordens monogenéticas em humanos; são caracterizadas pela presença de anemia microcíticas e hipocrômicas que resultam da redução ou ausência na síntese de uma ou mais cadeias globínicas. No Brasil a beta-talassemia tem importante significado clínico e sua ocorrência pode ser explicada como conseqüência da grande mistura étnica. A beta-talassemia é extremamente heterogênea e mais de 200 mutações têm sido descritas causando diferentes graus de anemia. Essas mutações são regionalmente específicas e cada país possui seu grupo de alterações característico. No estado homozigoto são classificadas clinicamente como major e no estado heterozigoto como intermédia e minor. Os pacientes com talassemia intermédia podem não apresentar sintomas clínicos, mas constatam-se características laboratoriais específicas. A avaliação dos índices hematológicos, dosagens dos parâmetros bioquímicos e dos valores das hemoglobinas fetal e HbA2 em combinação com o entendimento das possíveis interações gênicas são os procedimentos recomendados para o diagnóstico laboratorial. O objetivo deste estudo foi determinar a presença de mutações em pacientes que utilizam a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade São Paulo (DLC-HC-FMUSP) e que apresentavam perfil laboratorial sugestivo para beta-talassemia. Estudou-se a região do gene da globina em onde estão descritas as mutações mais freqüentes para nosso meio através da técnica de PCR, e posterior seqüenciamento para identificação das mutações. As mutações observadas na população avaliada (N=40), em ordem crescente de freqüência foram: Codon 39 (CT), IVS-I-110 (GA), IVS-I-1(GA), IVS-I-5 (GC), IVS-I-6 (TC), IVS-I-Exon-II (GA), Exon-II-IVS-II (GA), Stop Cd 6 (GT), Stop Cd15 (GA), Del C Cd 44 e 5UTR+20. Os primeiros quatro genótipos representaram 82,5% das mutações observadas neste trabalho. O uso combinado dos índices hematimétricos, parâmetros bioquímicos e avaliação das características morfológicas das hemácias demonstraram eficiência no rastreamento de pacientes portadores de beta-talassemia, assintomáticos A técnica do PCR e posterior processo de seqüenciamento demonstraram elevada eficiência na determinação das alterações moleculares no grupo de pacientes avaliados. / Thalassemias are the most common monogenic disorders in humans; are characterized by hypochromic and microcytic anemia arising from the reduction or absence in the synthesis of one or more chains globínicas. In Brazil, beta-thalassemia has important clinical significance and its occurrence can be explained as a result of the large ethnic mix. The beta-thalassemia is extremely heterogeneous and more than 200 mutations have been described causing varying degrees of anemia, these mutations are regionally specific and each country has its characteristic group of amendments. In the homozygous state are clinically classified as major and the heterozygous state as intermediate and minor. Patients with thalassemia can not present interim clinical symptoms, but have characteristics specific laboratory. The evaluation of hematologic indices, strengths and biochemical parameters of fetal hemoglobin and HbA2 values in combination with an understanding of possible interactions genes, are the recommended procedures for laboratory diagnosis. The purpose of this study was to determine the presence of mutations in patients who use the Division of Central Laboratory of the Hospital of the Faculty of Medicine of the University Sao Paulo (DLC-HCFMUSP) who presented suggestive profile laboratory for beta-thalassemia. It was studied the region of the gene of beta globin where they are frequently described the changes to our region through the PCR technique, and subsequent sequencing to identify the mutations. Of the 40 patients evaluated were found the following changes: Codon 39 (CT), IVS-I-110 (GA), IVS-I-1 (GA), IVS-I-5 (GC), IVS-I-6 (TC), IVS-I-Exon-II (GA), Exon-II-IVS-II (GA), Stop Cd 6 (GT), Stop Cd15 (G A), Del Cd 44 and 5UTR+20. The first four genotypes accounted for 82.5% of mutations observed in this study. The combined use of hematologic indices, biochemical parameters and evaluation of morphological characteristics of red blood cells demonstrated efficiency in the tracking of patients with beta- thalassemia, asymptomatic. The technique of PCR and subsequent process of sequencing demonstrated high efficiency in determining the molecular changes in the group of patients evaluated.

O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição genotípica e mutações no genoma do vírus da hepatite B (VHB) em um grupo de pacientes co-infectados pelo VHB e vírus da imunodeficiência humana (HIV). Foram incluídos pacientes AgHBs +/HIV+ , atendidos em um ambulatório de referência para pacientes infectados pelo HIV, na cidade de São Paulo. Para a detecção dos marcadores sorológicos para infecção pelo VHB utilizou-se técnica de ELISA através de kits comerciais. A detecção do DNA-VHB foi realizada através de nested-PCR e sua quantificação foi realizada por COBAS AMPLICOR. De acordo com a literatura, a infecção pelo VHB no Brasil varia de 0,4 a 8,5%. Os genótipos de VHB, as mutações na região do core, BCP, pré-core e na região da polimerase foram determinados por seqüenciamento. Cinqüenta e nove pacientes foram incluídos neste estudo e cinqüenta e seis pacientes relatavam uso prévio de lamivudina ou tenofovir. A presença do DNA-VHB foi detectada em 22 pacientes AgHBs positivos. A identificação dos genótipos foi realizada em 16 pacientes e a distribuição dos genótipos do VHB foi: A (12-75%); G (2-13%), D (1-6%) e F (1-6%). Em 10 dos pacientes com viremia presente para DNA-VHB, foram observadas mutações na região da polimerase (rtL180M + rtM204V, rtV173L + rtL180M + rtM204V) e no gene do envelope (sI195M, sW196L, sI195M/sE164D). Mutações na região do BCP (A1762T, G1764A) e do pré-core (G1896A) foram identificados em quatro pacientes. Em conclusão, entre os pacientes analisados observou-se uma alta prevalência de mutações associadas a resistência à lamivudina e associadas a resistência a anti-HBs. O genótipo G, raramente descrito em nosso meio, foi também observado nesse grupo de pacientes. / The objective of this study was to evaluate the genotype distribution and genomic mutations of hepatitis B virus (HBV) among a group of HIVHBV co-infected patients from an AIDS outpatient clinic in São Paulo. HBV serological markers were detected by commercially available enzyme immunoassay kits. HBV DNA was detected by using an in-house nested PCR and quantified by COBAS AMPLICOR. HBV genotypes, basal core promoter (BCP) / pre-core / core region and surface / polymerase genes mutations were determined by sequencing. Among the 59 patients included in this study, 56 reported previous use of lamivudine or tenofovir. According to the literature HBV infection in Brazil varies from 0,4 to 8,5%. HBV DNA was detected in 16/22 patients and the genotypes distribution was A (n=12, 75%); G (n=2, 13%); D (n=1, 6%), and F (n=1, 6%). In 10 patients with viremia, lamivudine-resistance mutations in the polymerase gene (rtL180M + rtM204V, rtV173L + rtL180M + rtM204V) were found, accompanied by changes in the envelope gene (sI195M, sW196L, and sI195M/sE164D). Mutations in the BCP and pre-core regions were identified in 4 patients. In conclusion, genotype G, rarely seen in Brazil, was observed in this group of patients. A high prevalence of mutations associated with lamivudine-resistance accompanied by mutations associated with anti-HBs resistance was also found among these patients.

Introdução: O hipotireoidismo congênito é a causa mais comum de retardo mental evitável em crianças, sua incidência varia de 1:2000 a 1:3000 nascidos vivos. É estimado que 15-20% dos casos de HC são conseqüentes de falhas na síntese dos hormônios tireoidianos. Entre as alterações genéticas mais freqüentes destaca-se o defeito na atividade da tireoperoxidase. Objetivos: rastrear mutações em duas pacientes com HC, com defeito parcial de incorporação de iodeto e verificar o efeito funcional de alterações do gene da tireperoxidase. Casuística e métodos: duas pacientes com HC, bócio e diagnóstico molecular não conhecido. Amostras de sangue periférico e de tecido tireoidiano das pacientes e amostras de DNA de indivíduos controles. Sequenciamento dos genes TPO, DUOX2 e DUOXA2. Análise da expressão gênica de TPO, TG, NKX2.1, PDS, PAX8, NIS e rTSH por PCR bem tempo real. Avaliação da expressão de luciferase sob controle do promotor da TPO e avaliação da atividaede da TPO do tecido as pacientes. Resultados: Nas pacientes foi identificada a alteração -95G>T, em homozigose, na região promotora da TPO. Verificamos diminuição da atividade enzimática da TPO no tecido tireoideano das pacientes e diminuição da expressão do RNAm desse gene. Também se encontrou diminuída a expressão dos genes NKX2.1 e PAX8. Já os genes TG, rTSH, PDS, NIS, a expressão do RNAm apresentou-se aumentada. A análise funcional da alteração -95G>C não mostrou diminuição da expressão do gene repórter. Conclusão: O HC das pacientes deve-se a diminuição da atividade enzimática da TPO, contudo alterações de sequência não foram encontradas no gene da TPO que expliquem a diminuição da atividade. Alterações epigenéticas ou nos introns no gene da TPO poderiam explicar o HC das pacientes. / Introduction: Congenital hypothyroidism is the most common cause of preventable mental retardation in children, its incidence varies from 1:2000 to 1:3000 live births. It is estimated that 15-20% of cases of CH are consistent failures in the synthesis of thyroid hormones. Among the most frequent genetic changes highlight the defect in the activity of thyroid peroxidase. Objectives: Identify mutations in two patients with CH and partial defect in iodide incorporation and verify the functional effect of changes in gene tireperoxidase. Methods: Two patients with CH, goiter and molecular diagnosis unknown. Samples of peripheral blood and thyroid tissue of patients and DNA samples from control subjects. Sequencing of the TPO gene, DUOX2 and DUOXA2. Analysis of gene expression of TPO, TG, NKX2.1, PDS, PAX8, NIS and TSHr by real time. Evaluation of the expression of luciferase under control of the promoter of TPO and TPO activity evaluation of the patients tissue. Results: The patients were identified change-95G> T homozygous, in the promoter region of TPO. We observed decrease in enzymatic activity of TPO in thyroid tissues of patients and decreased RNAm expression of this gene. Also found decreased expression of genes NKX2.1 and PAX8. Since the genes TG, TSHr, PDS, NIS mRNA expression presented increased. Functional analysis of the change -95G>T showed no descrease in reporter gene expression. Conclusion: The CH of patients due to decreased enzymatic activity of TPO, but changes were not found in the sequence of TPO gene to explain the decrease in activity. Epigenetic alterations in introns or in the TPO gene could explain the HC patients

As distrofias musculares tipo cinturas (DMC) incluem um grupo heterogêneo de doenças genéticas, caracterizadas por degeneração progressiva da musculatura esquelética pélvica e escapular, cuja herança pode ser autossômica dominante (DMC1) ou autossômica recessiva (DMC2). As formas dominantes são relativamente raras, compreendendo menos que 10% dos casos. Até o momento foram mapeados 8 locos para DMC1, (DMC1A-H), onde 3 genes já foram identificados (DMC1A-C) e 17 locos para DMC2 (DMC2A-Q), onde 16 genes já foram identificados. No presente estudo, identificamos uma família uruguaia (família 1) com 11 indivíduos afetados por DMC, distribuídos em 3 gerações, com um padrão de herança autossômico dominante. Os objetivos desse trabalho foram: mapear e refinar o loco gênico associado a uma manifestação familiar de DMC1, verificar se há co-localização da região mapeada com outras formas de DMC1 descritas na literatura e, apontar genes candidatos na região mapeada e triar mutações. Foi realizado estudo de ligação, no qual mapeou-se o loco para essa doença na região 4q13-q24 com Lod score de valor máximo 4.78 para o marcador D4S414. A região foi delimitada entre os marcadores D4S392 e D4S1572. A análise da região redefiniu o loco em 4q21.22-21.23, com uma redução de 33 Mb para 4Mb. Esse loco compreende a DMC1G (família 2), descrita anteriormente pelo nosso grupo. A triagem de mutação, realizada em amostras de afetados das duas famílias, nos permitiu encontrar uma alteração Thr141Iso no exon 5 do gene FAM175A apenas nos pacientes da família 2. Essa mesma alteração foi encontrada em 1 dos 500 controles testados, o que não nos permite excluir esse gene como um candidato para DMC1G já vez que essa frequência foi inferior a 1%. O fato dessa alteração não ter sido vista na família 1 também não nos permite excluí-lo, pois foi sequenciada apenas a região exônica e a metodologia utilizada também não nos permite verificar deleções nem duplicações. Estudos mais detalhados precisam ser realizados a fim de elucidar: (1) se a alteração desse gene é a causadora dessas DMCs ou, (2) se excluído esse gene, poderia ser o responsável. / Limb girdle muscular dystrophy (LGMD) include a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive degeneration of skeletal muscles of the pelvic and scapular girdles, whose inheritance may be autosomal dominant (LGMD1) or autosomal recessive (LGMD2). The dominant forms are relatively rare, comprising less than 10% of cases. So far eight loci were mapped for LGMD1 (LGMD1A-H), where three genes have been identified (LGMD1A-C) and 17 loci for LGMD2 (LGMD2A-Q), with 16 identified genes. In this study, we analised a family from Uruguay (family 1) with 12 individuals affected by LGMD, with an autosomal dominant pattern distributed in three generations. The objectives of this study were: to map and refine the gene locus associated with a familial DMC1, check for co-location of the mapped region to other forms of DMC1 described in the literature and, to point candidate genes mapped in the region and to screen mutations. A linkage study was conducted, and we mapped the locus for this disease in the region 4q13-q24 with a maximum Lod score of 4.78 for marker D4S414. The region was defined between markers D4S392 and D4S1572. The analysis of the region has redefined the locus to 4q21.22-in 21:23, a reduction from 33 Mb to 4 Mb. This site includes LGMD1G (family 2), previously described by our group. Mutation screening, performed on samples of affected pacients from both families, allowed us to find a modification Thr141Iso in exon 5 on FAM175A gene only in patients of family 2. This same alteration was found in one of the 500 controls tested but does not allow us to exclude this gene as a candidate for LGMD1G since that frequency was less than 1%. The fact that this change was not seen in a family 1 does not allow us to exclude it either because only the exonic region was sequenced and the methodology used does not allow us to detect deletions or duplications. More detailed studies should be conducted to elucidate: (1) whether the alteration found in this gene is the cause of these DMCs, or (2) if not this gene, which could be the one responsible.

O câncer colorretal está entre as principais neoplasias malignas sendo a quarta causa de morte por câncer no mundo e a terceira no Brasil. Mutações nos genes APC, DCC, K-RAS e TP53 foram originalmente associadas com a progressão do câncer colorretal (CCR) esporádico. Entretanto, estudos de genoma completo e exoma têm revelado outros genes relacionados com o CCR. Como consequência dessas mutações, um conjunto de genes alteram sua expressão modulando vias gênicas em cada estágio da progressão tumoral. Nesse sentido, há um grande esforço para definir assinaturas gênicas que auxiliem na classificação dos tumores quanto ao diagnóstico e prognóstico dos pacientes. Portanto, o objetivo deste projeto foi analisar a expressão gênica em escala genômica de amostras de adenoma e adenocarcinoma colorretal visando identificar novos marcadores genéticos ligados a transição adenoma-adenocarcinoma. Para isso, dez amostras pareadas de adenoma e adenocarcinoma do mesmo paciente foram submetidas à análise de expressão gênica pela técnica de microarranjos. Análises de bioinformática, revelaram uma assinatura de 689 genes diferencialmente expressos (fold-change>2, p<0.05), que permitiram a classificação genética entre o adenoma e o adenocarcinoma. Oitos genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 e RETNLB) foram escolhidos para validação com base na sua função e valor de expressão no tecido tumoral. A análise in silico dos genes hiperexpressos realizada no programa MetaCore (análise de dados e vias gênicas) destacou diversas vias gênicas ligadas à tumorigênese, incluindo as de adesão celular e Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM), importantes na fase avaçada da progressão tumoral. O gene ETV4 foi selecionado para realização dos ensaios funcionais em virtude de seus altos níveis de expressão nas dez amostras de adenocarcinoma e participação nos mecanismos de proliferação celular e no TEM. Ensaios in vitro de siRNA para o gene ETV4 resultou na diminuição da proliferação celular e no potencial clonogênico da linhagem HT29. Adicionalmente, foram investigadas mutações nos genes APC, K-RAS e TP53, nas amostras pareadas de adenoma, adenocarcinoma, tecido normal e sangue periférico dos dez pacientes. Todos os pacientes apresentaram mutação germinativas nos três genes. No entanto, apenas os genes K-RAS (40%) e TP53 (30%) apresentaram mutações somáticas e patogênicas, exclusivamente nos adenocarcinomas. Esses resultados demonstraram que, na nossa coorte, mutações nos genes TP53 e K-RAS podem estar contribuindo para a progressão em uma parcela do câncer colorretal do tipo esporádico. Em resumo, o presente estudo aponta que o gene ETV4 pode contribuir para ativar o mecanismo de proliferação celular em adenocarcinoma colorretal. Além disso, o estudo demonstra a importância da combinação da análise de mutação com o perfil de expressão para melhor compreensão da base molecular do câncer colorretal. / Colorectal cancer is among the main malignant neoplasia, it is the fourth leading cause of death in the world and the third in Brazil. Mutations in APC, DCC, KRAS and TP53 genes have been originally associated with the progression of sporadic colorectal cancer (CRC). However genome wide and exome studies have revealed other genes related to CRC. As a consequence of these mutations, a set of genes alters their expression modulating gene pathways in every stage of tumor progression. In this regard, there is great effort to define gene signatures that help to classify tumors in relation to patients diagnosis and prognosis. Therefore, the objective of this project was to analyze gene expression in genomic scale of colorectal adenoma and adenocarcinoma samples aiming to identify new genetic markers linked to adenoma- adenocarcinoma transition. For this purpose, ten paired adenoma and adenocarcinoma samples of the same patient were subjected to gene expression analysis by microarrays technique. Bioinformatics analyses revealed a signature of 689 genes differentially expressed (fold-change>2, p<0.05), which allowed the genetic classification between adenoma and adenocarcinoma. Eight genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 and RETNLB) were chosen for validation based on their function and expression value in tumor tissue. In silico analysis of hyperexpressed genes, done in the program MetaCore (data analysis and gene pathways), highlighted diverse gene pathways linked to tumorigenesis, including the ones of cell adhesion and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), important in the advanced phase of tumor progression. ETV4 gene was selected for functional assays due to its high expression levels in the ten samples of adenocarcinoma and due to its participation in cell proliferation mechanisms and in EMT. In vitro siRNA assays for ETV4 gene resulted in the decrease of cell proliferation and in the clonogenic potential of HT29 line. In addition, mutations in APC, KRAS and TP53 genes were investigated in paired samples of adenoma, adenocarcinoma, normal tissue, and peripheral blood from ten patients. All patients showed germline mutations in the three genes. However, only KRAS (40%) and TP53 (30%) genes showed somatic and pathogenic mutations, exclusively in adenocarcinomas. These results demonstrated that, in our cohort, mutations in TP53 and KRAS genes might be contributing to progression in a portion of sporadic-type colorectal cancer. In summary, the present study points out that ETV4 gene might contribute to activate cell proliferation mechanism in colorectal adenocarcinoma. Moreover, the study demonstrates the importance of combining the mutation analysis with expression profile in order to better understanding the molecular basis of colorectal cancer.

A produção brasileira de carne de frango tem uma grande importância econômica no mundo todo devido principalmente aos avanços do melhoramento genético. O surgimento de novas tecnologias de sequenciamento (sequenciamento de nova geração) tem se tornado uma ferramenta poderosa, pois por meio da identificação de SNPs (polimorfismo de nucleotídeo único) e INDELs (deleções/inserções) possibilita a adição de novas informações ao melhoramento genético. A deposição de músculo, em especial o músculo de peito, é uma das características que mais merecem destaque por causa da sua importância nutricional e econômica. Sendo assim o objetivo deste trabalho foi ressequenciar o genoma de 18 aves de duas linhagens distintas experimentais e identificar SNPs e INDELs em uma região de QTL no cromossomo 2 da galinha associado anteriormente com deposição de músculo do peito, além de caracterizar variantes potencialemente funcionais e propor mutações candidatas para estudos futuros. Para isso, dezoito galinhas de duas diferentes linhagens experimentais (corte e postura), ambas desenvolvidas pela Embrapa Suíno e Aves, foram sequenciadas pela plataforma de nova geração da Illumina. SNPs e INDELs foram identificados por meio de ferramentas de bioinformática em uma região de QTL no cromossomo 2 da galinha (105.848.755-112.648.761 pb) que foi previamente associada com deposição de músculo de peito. O sequenciamento dos 18 animais gerou em torno 2,7 bilhões de reads e após a filtragem por qualidade foram mantidas 77% das reads. Em seguida, as reads foram alinhadas ao genoma referência (Gallus_gallus-4.0, NCBI) pela ferramenta Bowtie2 e gerou em média 10,6X de cobertura de sequenciamento na região-alvo. , Foram identificados 722.832 SNPs e 63.727 INDELs para os 18 animais por meio do programa SAMtools, e após uma filtragem rigorosa, foram mantidos 77% dos SNPs (n=558.767) e 60% das INDELs (n=38.402). Com base nas variantes únicas para os 18 animais (85.765 SNPs e 7.824 INDELs) foi realizada a anotação funcional por meio da ferramenta ANNOVAR. Dentre os SNPs não sinônimos (n=153) e stopgain (n=3), 15 foram classificados como deletérios. Um dos SNPs deletérios que já foi depositado em banco de dados foi identificado no gene RB1CC1, que tem sua função relacionada ao desenvolvimento do músculo de peito. Utilizando a ferramenta DAVID foi possível analisar 37 genes relacionados aos SNPs não sinônimos, stopgain, INDELs frameshift e não frameshift. Dentre estes genes, três (DTNA, RB1CC1 e C-MOS) foram selecionados por terem suas funções relacionadas ao desenvolvimento muscular e suas mutações foram analisadas. Sendo assim, futuros estudos podem ser realizados nestes genes candidatos e nas mutações identificadas, por meio de análises de associação e validação em populações comerciais, permitindo assim uma melhor explicação o efeito do QTL estudado. / The Brazilian chicken meat production has a great economic importance in worldwide mainly due to advances in breeding. The emergence of new techniques of sequencing (nextgeneration sequencing) becomes a powerful tool because through identification of SNPs (single nucleotide polymorphism) and INDELs (deletions/insertions) allows the addition of new information for genetic improvement. The muscle deposition, particularly the breast muscle, is one of the features that are most noteworthy because of its nutritional and economic importance. Therefore the aim of this study was to perform the genome resequencing of 18 chicken from two distinct experimental lines and identify SNPs and INDELs in a QTL region on chromosome 2 previously associated with breast muscle, and characterize the variants to identify potentially function ones and propose candidate mutations for future studies. To achieve these objectives, eighteen chickens of two different experimental lines (broiler and layer), both developed by Embrapa Swine and Poultry were sequenced by Illumina next-generation platform. SNPs and INDELs were identified by bioinformatic tools in a QTL region on chicken chromosome 2 (105,848,755-112,648,761 bp) which was previously associated with breast muscle deposition. Sequencing of the eighteen animals generated around 2.7 billion of reads, and 77% of the reads were retained after filtering. The reads were aligned against the chicken genome reference (Gallus_gallus-4.0, NCBI) by Bowtie2 tool resulting in a 10.6X coverage across the target region. Using SAMtools, 722,832 SNPs and 63,727 INDELs were identified in the all individuals, and after a stringent filtration, 77% of SNPs (n=558,767) and 60% of INDELs (n=38,402) were maintained. Based on unique variants for all the animal (85,765 SNPs and 7,828 INDELs) were performed the functional annotation by ANNOVAR tool. Among the non-synonymous SNPs (n=153) and stopgain (n=3), fifteen were predicted like a deleterious mutation. One of deleterious SNPs has already deposited in public database, and it was identified in RB1CC1 gene, which function is related to breast muscle development. Using the DAVID tool was possible to analyze the 37 genes related to the non-synonymous SNPs, stopgain, frameshift and non-frameshift INDELs. Among these genes, three (DTNA, RB1CC1 and C-MOS) were selected due their functions related to muscle development and their mutations were analyzed. Therefore, further association studies can be performed with these candidate genes and their mutations, and also validation in commercial populations, allowing a better explanation of QTL effects.