Orientador : Prof. Dr. Mário Antônio Navarro da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Entomologia). Defesa: Curitiba, 21/09/2016 / Inclui referências: f. 55-66 / Resumo: Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762), é considerado de grande importância epidemiológica por ser vetor dos vírus da dengue, da febre amarela, Chikungunya e Zika vírus. Está globalmente distribuído pelos trópicos e em todos os estados brasileiros. A utilização de controle químico resulta numa intensa pressão de seleção, ampliando a população de resistentes. Estudos envolvendo o monitoramento da resistência herdada por esta espécie, frente aos inseticidas, assim como o conhecimento da diversidade genética, podem subsidiar no delineamento de estratégias de controle desse vetor, podendo repercutir na redução do contato vetor hospedeiro. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a frequência das mutações kdr Val1016IIe e Phe1534Cys relacionadas com a resistência a piretróide e detectar a variação genética do gene NADH desidrogenase, subunidade 4 - ND4, do DNA mitocondrial de seis populações naturais de Ae. aegypti do Estado do Paraná Brasil: Alvorada do Sul, Marilena, Maringá, Nova Londrina, Paranavaí e São Carlos do Ivaí. Para avaliar a presença das mutações kdr foram genotipados 345 adultos de Ae. aegypti provenientes das seis populações do Paraná. Para a análise da variabilidade genética foram amostrados de 13 a 29 adultos de cada população, totalizando 120 adultos. Os resultados das populações avaliadas apresentaram polimorfismos simultâneos, no entanto a média da frequência da junção dos alelos mutantes 1016Ile + 1534Cys foi de 55%, indicando que metade das populações apresenta altos índices dos dois alelos mutantes. Com relação ao estudo da diversidade genética a análise mostrou a existência de 40 haplótipos e 44 sítios polimórficos polimorficos. O haplótipo H1 foi o mais frequente, representando 57,5% do total, não sendo detectado apenas na população de Alvorada do Sul. Os haplótipos obtidos para as populações do Paraná quando comparados com os disponíveis para América indicam uma relação com as populações provenientes da Amazônia Brasileira, Sudeste do Brasil, Peru, México e América do Norte. A diversidade genética foi reduzida, ; k = 0,655, Os testes de neutralidade não foram significativos, indicando que o polimorfismo genético está de acordo com o modelo neutro de mutações. A variação genética foi maior dentro das populações (86,28%), sendo a análise significativa (FST = 0,13) demonstrando estruturação genética. Conclui-se que as ações de controle do Ae. aegypti no Paraná utilizando piretróides devem ser avaliadas levando-se em consideração à presença significativa das mutações envolvidas no mecanismo de resistência. A variabilidade genética reduzida indica à intensa pressão de seleção ocasionada pela ação do controle químico, utilizado para combater o vetor, os valores sugerem uma redução no tamanho das populações embora positivo no curto prazo, podem resultar na perda de eficiência na repetição continuada do mesmo produto no controle químico do vetor. Palavras-chave: Canal de sódio voltagem dependente. Controle químico. Kdr Diversidade genética. ND4. / Abstract: Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762), is considered of great epidemiological importance being the vector of dengue virus, yellow fever, Chikungunya and Zika virus. It is globally distributed in the tropics, and all Brazilian states. The use of chemical control, results in an intense selection pressure, increasing the population of resistant. Studies involving the monitoring of resistance inherited by this species, compared to insecticides, as well as knowledge of genetic diversity, can support the development of this vector control strategies, which may cause the reduction of contact vector / host. Thus, this study aimed to evaluate the frequency of kdr mutations Val1016IIe and Phe1534Cys related to resistance to pyrethroid and detect the genetic variation of the NADH dehydrogenase gene, subunit 4 - ND4, the mitochondrial DNA of six natural populations of Ae. aegypti of Paraná Brazil: : Alvorada do Sul, Marilena, Maringá, Nova Londrina, Paranavaí and São Carlos do Ivaí. To evaluate the presence of kdr mutations were genotyped 345 of Ae. aegypti from the six populations of Paraná. For the analysis of genetic variability were sampled 13-29 adult population each, totaling 120 adults. The results of the evaluated populations showed simultaneous polymorphisms, however the average frequency of the junction mutant alleles 1016Ile + 1534Cys was 55%, indicating that half of the population has high levels of both mutant alleles. Regarding the study of genetic diversity analyzes showed 40 haplotypes and 44 polymorphics. The Haplotype H1 was the most frequent, accounting for 57.5% of the total, not being detected only in the population of Alvorada do Sul. The haplotypes obtained for the populations of Paraná when compared with those available to America indicates a relationship with the population from Brazilian Amazon, southeast Brazil, Peru, Mexico and North America. Genetic diversity was low, h = 0.301; = 0.005; k = 0.655, neutral tests were not significant, indicating that the polymorphism is according to the model of neutral mutations. Genetic variation was greater within populations (86.28%), with meaningful analysis (FST = 0.13) demonstrating genetic structure. It is concluded that the control actions of Ae aegypti at Parana using pyrethroids must be evaluated taking into consideration the significant presence of mutations involved in resistance mechanism. The limited genetic diversity indicates the intense selection pressure caused by the action of chemical control, used to combat the vector, values suggest a reduction in size of the population although positive in the short term, can result in loss of efficiency in the continuous repetition of the same product in vector chemical control. Keywords: sodium channel voltage dependent. Chemical control. Kdr Genetic diversity. ND4.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Submitted by Antonio Geraldo Couto Barreto (ppgms@ufba.br) on 2013-11-04T14:01:42Z No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2013-11-04T17:16:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T17:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / INTRODUÇÃO: A doença de Fabry (DF) é um erro inato do metabolismo dos glicoesfingolípidos devido à deficiência da atividade da enzima α-galactosidase A; é ligada ao cromossomo X e pacientes do sexo masculino geralmente apresentam sintomas clássicos. Não há mutações comuns para este gene; mais de 600 mutações já foram descritas no Human Gene Mutation Database. OBJETIVO: O objetivo deste estudo é relatar todas as mutações e alterações polimórficas observadas nos membros de cinco famílias com a doença de Fabry do estado da Bahia-Brasil. MATERIAL E MÉTODOS: Um total de 48 pacientes com suspeita de DF foi encaminhado para avaliação no Serviço de Genética Médica do Hospital Universitário Professor Edgard Santos durante o período de janeiro de 2009 a dezembro de 2011. Os 14 pacientes (06 homens/08 mulheres) com diagnóstico de Doença de Fabry envolvidos neste trabalho são acompanhados no Ambulatório de Erros Inatos do Metabolismo do Hospital Professor Edgard Santos - Universidade Federal da Bahia. Eles pertencem a cinco famílias (I, II, III, IV e V) não relacionadas. O gene GLA foi analisado através da amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase) e sequenciamento de ambas as cadeias de DNA de toda a região codificadora e de regiões nas junções entre éxons e íntrons. Para todos os pacientes do sexo masculino e alguns do sexo feminino foi realizada a medida da atividade da enzima α-galactosidase em gota de sangue seca através da espectrometria de massa em tandem. RESULTADOS: Quatro diferentes mutações causadoras de DF foram encontradas e todas elas já foram relatadas previamente. Duas das cinco famílias compartilham a mesma mutação (p.A156D). Nas famílias I e V (ambas com mutação p.A156D) foi encontrado o mesmo polimorfismo (c.1000-22C> T), mas uma outra diferente variação foi encontrada apenas na Família I. DISCUSSÃO: Apesar do pequeno número de pacientes envolvidos neste estudo, este trabalho é o mais completo em análise de polimorfismos do gene GLA, incluindo todos os pacientes diagnosticados com a doença de Fabry do estado da Bahia-Brasil. A análise de alterações polimórficas sugere que duas das cinco famílias têm uma mesma origem ancestral. Mais estudos para avaliar esta hipótese estão ocorrendo neste momento, através da análise de haplótipos.

Mutações germinativas no gene TP53 estão associadas com a Síndrome de Li-Fraumeni e sua variante, a Síndrome de Li-Fraumeni-Like, ambas doenças autossômicas dominantes caracterizadas pela predisposição a múltiplos tumores em idade precoce. Recentemente p53 foi descrita como uma proteína com funções antioxidantes, atuando na manutenção da estabilidade genômica. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar parâmetros de estresse oxidativo em sangue periférico de indivíduos portadores da mutação germinativa TP53 p.R337H em comparação com indivíduos não portadores da alteração. Foi verificado que a atividade eritrocitária da enzima GPx, uma importante defesa antioxidante, diferiu significativamente entre portadores e não portadores da mutação, com um aumento da atividade nos primeiros (p=0.048). O conteúdo de grupamentos carbonila e de malondialdeído, indicadores de dano à proteína e a lipídios, respectivamente, também foram significativamente maiores no grupo dos portadores (p=0.04 e p<0.0001). Por fim, indivíduos portadores da mutação apresentaram um aumento no estado antioxidante total, mas uma diminuição no conteúdo de ácido ascórbico em plasma. Nossos resultados apontam para alterações da função antioxidante de p53 em indivíduos portadores da mutação germinativa TP53 p.R337H, independentemente da idade e do diagnóstico prévio de um tumor. Estas alterações podem estar diretamente relacionadas à predisposição ao câncer neste grupo de pacientes. / Germline mutations in the TP53 gene are the underlying genetic defect of Li-Fraumeni Syndrome (LFS) and its variant, Li-Fraumeni-like (LFL) Syndrome, autosomal dominant disorders characterized by predisposition to multiple early-onset cancers. More recently, p53 is emerging as an important player in redox metabolism and important enzymes involved in defenses against oxidative stress have shown to be regulated by p53, including glutathione peroxidase 1 (GPX1) and mitochondrial superoxide dismutase 2 (SOD2). The aim of the present study was to investigate the redox profile parameters in blood of p.R337H mutation carriers and non-carriers individuals. A total of 34 individuals were included in the study and they were divided in two groups: mutation carriers (C) (n=17) and non-carriers (NC) (n=17). Erythrocyte GPx activity, an important enzymatic antioxidant defense, differed significantly between carriers and non carriers, with an increased activity in the latter (p = 0.048). Plasma Carbonyl content, an indicative of protein damage related to ROS overgeneration, was also increased in carriers (p = 0.04). Furthermore, an association between malondialdehyde (MDA, a lipidic peroxidation product) levels and mutation status was found in plasma. Mutation carriers had a four-fold increase in MDA levels (C= 40.20 ± 2.84, NC=160.5 ± 3.64, p < 0.0001) when compared to non carriers. Finally, mutation carriers showed an increased total antioxidant status (TAS), but a decrease in the Vitamin C content in plasma, when compared to non-carriers. Our findings suggest that TP53 p.R337H mutation carriers present an imbalance in oxidative metabolism parameters, which could be directly related to the pathophysiological mechanisms of cancer predisposition in these individuals.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-08-14T16:28:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1205386 bytes, checksum: be5edb791c18d8a1f1e0e5e3522a98bf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T16:28:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1205386 bytes, checksum: be5edb791c18d8a1f1e0e5e3522a98bf (MD5) Previous issue date: 2017-03-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O aumento de dióxido de carbono (CO 2) na atmosfera durante as últimas décadas tem despertado crescente interesse na função desse gás no crescimento e desenvolvimento das plantas. Apesar da conhecida associação entre concentração de CO 2 elevada e o crescimento das plantas, seus efeitos na regulação do metabolismo primário coordenado pelas giberelinas (GA) são, ainda, pouco conhecidos. Neste trabalho, procuramos compreender o papel da concentração de CO 2 elevada em plantas de tomate com reduzido nível de GA em diferentes estádios de crescimento. Para isso planta mutante gib-1 e plantas tratadas com o inibidor da biossíntese de GAs, paclobutrazol (PAC) foram submetidas à concentração de CO 2 ambiente (400 μmol CO 2 mol^-1 ar) e elevada (750 μmol CO 2 mol^-1 ar) aos 21 e 35 dias após a germinação. A inibição do crescimento pelo reduzido nível de GA foi revertida quando as plantas foram submetidas à concentração de CO 2 elevada aos 21 dias após a germinação. O estímulo da A e o aumento nos níveis de carboidratos contribuem para o estímulo do crescimento sob concentração de CO 2 elevada mesmo sob deficiência de GAs. A capacidade da concentração de CO 2 elevada em restaurar o crescimento das plantas é um reflexo da flexibilidade metabólica dessas plantas diante de uma situação que estimule o crescimento. Contudo, este estímulo pode estar restrito a uma fase do crescimento/desenvolvimento das plantas, visto que, quando submetidas á concentração de CO 2 elevada aos 35 DAG, plantas controle e com reduzido nível de GAs não alteraram seu crescimento. / The increase of carbon dioxide (CO 2) in the atmosphere during the last decades has aroused interest in the function of this gas in the growth and development of plants. Despite the known association between high CO 2 concentration and plant growth, its effects on the regulation of primary metabolism coordinated by gibberellins (GA) are still poorly understood. In this work, we aimed to understand the role of high concentration of CO 2 in tomato plants with reduced GA content at different stages of growth. For this purpose, gib-1 mutant and plants treated with paclobutrazol (PAC), GA biosynthesis inhibitor, were submitted either to ambient (400 μmol CO2 mol^-1 ar) and to elevated (750 μmol CO2 mol^-1 ar) CO 2 at 21 and 35 days after germination (DAG). Inhibition of growth by the low GA content was reverted by elevated CO 2 concentration at 21 DAG. The stimulation of A and the increase in carbohydrate levels contribute to the growth in elevated CO 2 concentration, even under low GA regime. The ability of the elevated CO 2 concentration to restore the plant growth is a reflection of the metabolic flexibility in face of a situation that stimulates growth. However, the growth stimulation is restricted to a stage of plant growth / development, since plants with low GA content submitted to elevated concentration of CO 2 at 35 DAG did not alter their growth.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A APOBEC3G (A3G) tem sido descrita como um fator celular que inibe a replicação do HIV-1. Durante a transcrição reversa, a A3G promove a desaminação de citidinas para uracilas nas fitas negativas de DNA viral, induzindo hipermutação de guaninas para adeninas nas fitas positivas. O HIV-1 contra-ataca esse efeito pela atividade da proteína viral Vif, que neutraliza complexos A3G através de um mecanismo de degradação proteassômica. Apesar de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) terem sido descritos ocorrendo ao longo do gene A3G, seus efeitos sobre a progressão da infecção pelo HIV-1 não são claros. Este estudo tentou estabelecer, na população brasileira, a freqüência de 7 SNPs descritos anteriormente e seu impacto na carga viral e contagem de células T CD4+, em associação com a presença de hipermutação no gene da integrase. Além disso, foi analisada a diversidade genética do gene vif a fim de estabelecer sua associação com o estado clínico e os polimorfismos da A3G. Foram analisadas 400 amostras provenientes de indivíduos infectados pelo HIV-1 que não foram submetidos a tratamento antiretroviral. Os SNPs na A3G foram detectados por resequenciamento. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram utilizados modelos baseados em códons para estudar o processo evolutivo do gene vif, a partir de 156 sequências do subtipo B do HIV-1. A hipermutação foi investigada utilizando o corante Bisbenzamida-PEG durante a eletroforese em gel de agarose. Os géis foram analisados utilizando o software Image J e de acordo com a posição das bandas, quando comparados aos controles, as amostras foram categorizadas. Foi verificado que brasileiros e europeus têm freqüências genotípicas similares no gene A3G. A análise também revelou que os polimorfismos na maioria dos loci da A3G não tiveram qualquer influência na carga viral e contagem de células T CD4+. A análise das amostras em gel de agarose com HA-Yellow encontrou 36% de hipermutação. Notavelmente, códons sob o efeito de epistasia no gene vif foram associados com os níveis de células T CD4+. As análises baseadas em filogenia revelaram que os polimorfismos na A3G e a hipermutação tiveram um impacto insignificante na taxa de mutação neutra no gene vif. No entanto, códons sob selecção positiva foram detectados no gene vif entre as regiões MKSLVK e YRHHY, e nas regiões de interação com a BC-Box e Cullin5-Box. Estas regiões são envolvidas na degradação de Vif induzida por complexos A3G. Em conclusão, foi observado que a evolução do vif é parcialmente explicada pela resposta adaptativa otimizada para neutralizar a atividade da A3G, o que demonstra a plasticidade evolutiva do HIV-1 para se adaptar aos genes com função antiviral do hospedeiro. / APOBEC3G (A3G) has been described as a cellular factor that inhibits replication of HIV-1. During reverse transcription, A3G promotes deamination of cytidine to uracil in the minus strand viral DNA, inducing hypermutation of guanines to adenines in plus strand DNA. The HIV-1 counters this effect by the activity of the viral protein Vif, which counteracts A3G complexes through a mechanism of proteasome degradation. Although some single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been described occurring along the A3G gene, its effects on the progression of HIV-1 are unclear. This study attempted to establish, in the Brazilian population, the frequency of seven SNPs previous described and their impact on viral load and CD4 cell count, in association with the presence of hypermutation in the integrase gene. In addition, we analyzed the genetic diversity of the vif gene to establish its association with clinical status and polymorphisms of A3G. We analyzed 400 samples from drug naïve infected HIV-1 patients. SNPs were detected by resequencing. Bioinformatic tools for HIV-1 sequences analyses were used for studying the evolutionary process of gene vif. Hypermutation has been investigated using the dye-PEG Bisbenzimide in agarose gel electrophoresis. The gels were analyzed using Image J software and according to the position of the bands, when compared to controls, the samples were categorized. It was found that Brazilians and Europeans have similar genotype frequencies in the A3G gene. The analysis also revealed that the polymorphisms in most loci of A3G had no impact on viral load and CD4 + T cells counts. Analysis using agarose gels with HA-Yellow found that 36% of all samples ware hypermutated. Notably, the codons under epistasis influence in the vif gene were associated with levels of CD4 + T cells. The phylogenetic-based analysis revealed that A3G polymorphisms and hypermutation had insignificant impact in the rate of neutral mutation in vif gene. However, codons under positive selection were detected between the MKSLVK and YRHHY regions and within the BC-Box and the Cullin5-Box of vif gene. These regions are involved in the degradation of Vif-induced A3G complexes. In conclusion, we observed that the evolution of vif is partly explained by the optimized adaptive response to counteract A3G activity, which demonstrates evolutionary plasticity of HIV-1 to adapt to host genes with antiviral function. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-05-26T04:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333237.pdf: 2953007 bytes, checksum: d47a19328ddecfa298f35cb142d3e1bd (MD5) Previous issue date: 2014 / O milho MON810 tem inserido em seu genoma o gene truncado cry1Ab oriundo da bactéria B. thuringiensis (Bt). O gene cry1Ab produz a proteína inseticida Cry1Ab que confere à planta resistência aos insetos da ordem Lepidoptera. Mas a inserção do gene cry1Ab no milho MON810 foi incompleta, dado que parte da região 3' da construção original não foi integrada no genoma do milho, incluindo o terminador NOS. Neste contexto, o principal objetivo foi detectar as possíveis interações da proteína Cry1Ab com as proteínas endógenas de milho. Neste estudo foram utilizadas folhas de milho MON810 no estádio V2 para a caracterização da proteína Cry1Ab e a detecção de possíveis proteínas ligadas à Cry1Ab. Na caracterização da Cry1Ab, foi quantificada a proteína Cry1Ab no limbo e na bainha das folhas por DAS-ELISA, mostrando que o conteúdo da proteína Cry1Ab no limbo (55,56 ± 6,54µg Cry1Ab/g massa fresca) foi seis vezes maior do que na bainha (10,29 ± 2,42µg /g massa fresca). Para a extração da proteína Cry1Ab os protocolos de Mekawi e Gruber resultaram em maior rendimento de extração da proteína Cry1Ab. Os extratos protéicos de milho MON810 foram analisados por Western Blot. O ensaio evidenciou quatro bandas imunorreativas de 70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa correspondentes à proteína Cry1Ab, embora em alguns dos extratos foram detectadas bandas imunorreativas maiores do que 120 kDa em vez da proteína Cry1Ab ativa (70 kDa e 65 kDa). No ensaio de imunoprecipitação foram identificadas 49 proteínas de milho coimunoprecipitadas com a proteína Cry1Ab. De forma similar, o ensaio de Ligand blot mostrou que a proteina Cry1Ab poderia estar ligada com proteinas do milho, especialmente uma de 18 kDa, presente tanto nas plantas transgênicas ou na isolinha. Em conclusão, este estudo encontrou (i) evidencia da interação entre a proteína Cry1Ab e proteínas do milho; (ii) variação na quantidade de proteína Cry1Ab em distintas partes da folha e (iii) quarto formas moleculares distintas (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa) da proteína Cry1Ab, ao invés de uma como indicado pela empresa proponente da tecnologia.<br> / Abstract: The MON810 maize has a truncated version of the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis inserted into its genome. The cry1Ab gene produces the insecticidal protein Cry1Ab that confers on the maize resistance to insects of the order Lepidoptera. The construct used in the genetic transformation of MON810 maize contained the CaMV 35S promoter, the hsp70 intron, the cry1Ab gene and the NOS terminator. However, a truncation at the 3 end of the cry1Ab gene led to the complete loss of the NOS terminator, and insertion of cry1Ab gene was incomplete. In this context, the aim of this work was to detect possible interactions of Cry1Ab protein with endogenous protein maize. This study used MON810 leaves (stage V2) to characterize the Cry1Ab protein and to detect possible interaction of Cry1Ab with endogenous maize proteins. To characterize the Cry protein, it was quantified in lamella and sheath by DAS-ELISA. Cry1Ab protein concentration in lamella (55.56 ± 6,54µg Cry1Ab / g fresh weight) was six times greater than the sheath (10.29 ± 2,42µg / g fresh weight). For the extraction of the Cry1Ab protein, five extraction protocols were compared. The protocols of Mekawi and Gruber gave the highest extraction yields of the Cry1Ab protein. The protein extracts of transgenic maize were analyzed by Western blot. The analysis revealed four immunoreactive bands immunoreactive (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa and 34 kDa) corresponding to the Cry1Ab protein, although in some extracts, immunoreactive bands greater than 120 kDa were detected instead of the active Cry1Ab protein (70 kDa and 65 kDa). In addition, in the immunoprecipitation assay there were 49 co-imunoprecipitated proteins from maize with the Cry1Ab protein. Similarly, Ligand blot assay showed that the Cry1Ab protein could be binding with maize proteins, especially an 18 kDa protein which was present in both transgenic and isogenic maize. In conclusion, it was found (i) evidence of interaction between Cry1Ab protein and corn proteins; (ii) variation in the amount of Cry1Ab in distinct part of the leaves, and (iii) four distinct molecular form (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa), instead one indicated by the proponent of the technology.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-05-30T21:42:25Z No. of bitstreams: 1 Aline Cristina Andrade M. EStudo molecular de proteínas estruturadas....pdf: 1507991 bytes, checksum: e5a153c8832e560bcf10d060a63bb47c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T21:42:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aline Cristina Andrade M. EStudo molecular de proteínas estruturadas....pdf: 1507991 bytes, checksum: e5a153c8832e560bcf10d060a63bb47c (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1, HTLV-1, é conhecido, principalmente, por ser o agente etiológico de uma síndrome neurológica denominada TSP/HAM. Os fatores que definem a manifestação de doença ainda não foram completamente esclarecidos. As glicoproteínas do envelope são altamente conservadas entre os isolados do HTLV-1, no entanto, substituições nucleotídicas na região gênica que codifica para estas proteínas, podem influenciar tanto na infectividade viral como na replicação do vírus. A gp46 possui domínios funcionais já associados à inibição da formação do sincício, à transmissão célula-célula e à produção de anticorpos, enquanto que a gp21 apresenta domínios que permitem a fixação dela à membrana plasmática da célula hospedeira. O HBZ, por sua vez, é relacionado à regulação positiva de fatores de transcrição importantes para o ciclo celular, além de suprimir a transcrição viral mediada por TAX. Estudos recentes revelam correlação entre os níveis dos transcritos do HBZ e a severidade da manifestação da TSP/HAM. Pelo exposto, o objetivo principal do trabalho foi buscar possíveis biomarcadores virais nos diferentes perfis clínicos: assintomáticos e TSP/HAM definidos. Nossos resultados revelaram que a mediana da carga proviral dos indivíduos assintomáticos (ASS) (n = 5) e TSP/HAM (n = 5), foi semelhante (316.227 cópias/106 PBMC). Da caracterização da gp46, obtivemos 146 clones virais: 70 (ASS) e 76 (TSP/HAM). A caracterização molecular revelou uma diversidade genética de 0,4% e 0,6% nos indivíduos ASS e TSP/HAM, respectivamente. Identificamos 5 mutações com freqüência acima de 20% entre os clones de cada grupo. Apenas a mutação S35L foi exclusiva de clones do grupo ASS, três mutações (F14S, N42H, G72S) foram exclusivas de clones do grupo TSP/HAM e apenas uma mutação V247I foi encontrada em clones de ambos os grupos com diferença estatística (p = 0,0014). Apenas a mutação G72S está presente em um domínio funcional (53-75aa) previamente identificado. Tal domínio foi o segundo domínio mais divergente entre os indivíduos TSP/HAM, sendo o RBD o mais divergente em ambos os grupos. Análises físico-químicas revelaram que o alelo mutante para a posição 14 é mais hidrofílico e flexível, e menos antigênico, para as posições 42 e 247, respectivamente. Foi possível identificar 23 e 16 epítopos ligantes de alelos de HLA classe I e II, respectivamente nos domínios 175-209aa e 53-75aa, respectivamente. A análise de domínios potenciais revelou a presença dos mesmos sítios de modificação pós-traducional com diferentes freqüências entre os grupos. Identificamos a troca de estrutura em coil para folha beta na predição da estrutura secundária para as mutações S35L e G72S. Da caracterização molecular da gp21 dispomos apenas de 08 sequências, obtidas de PCR direto, de 4 de indivíduos ASS e 4 de indivíduos TSP/HAM. A análise molecular identificou apenas uma mutação (Y477H) em 7 seqüências. Da caracterização de 10 sequências, obtidas de PCR direto do HBZ, foi possível identificar duas mutações (S9P e T95I), em 100% das sequências, e uma terceira mutação R112C em 66,7% e 25% das sequências oriundas de indivíduos ASS (n = 6) e TSP/HAM (n = 4), respectivamente. A mutação R112C pode ser responsável pela mutação P34L na proteína p12 (ORF-1 de pX). 7 Concluímos, portanto, a observação de 5 mutações mais freqüentes, na gp46, e que estão associadas ao perfil de variação dentro de cada hospedeiro, já que, com exceção da mutação V247I, as demais mutações foram exclusivas de clones de um único hospedeiro. Uma única mutação foi encontrada na gp21 e em relação ao HBZ foi possível identificar 3 mutações sendo que nenhuma delas tinha sido descrita na literatura. Não foi possível associar nenhuma das mutações encontradas ao perfil clínico devido ao reduzido número de indivíduos incluídos no estudo. No entanto, sugerimos que novos estudos sejam conduzidos, para expandir o entendimento da diversidade molecular dessas proteínas, com o aumento no número de indivíduos avaliados, e sobretudo porque acreditamos no potencial destas mutações sugerimos também a avaliação funcional delas.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP / O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... / The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... / FAPESP: 11/50801-4