A malária é uma doença infecciosa que afeta principalmente populações de países pobres vivendo em áreas tropicais. É transmitida pela picada de insetos do gênero Anopheles. Seu agente infeccioso é um protozoário do gênero Plasmodium, quatro espécies infectam o ser humano, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, sendo a primeira a espécie mais letal. Não existe uma vacina para a doença e o tratamento é quimioterápico, fármacos como quinina, cloroquina, pirimetamina, sulfadoxina, atovaquona e artemisina são empregados. Entretanto, o uso prolongado desses fármacos, a monoterapia e a interrupção precoce do tratamento tem favorecido o surgimento e estabelecimento de plasmócitos resistentes, que sobrevivem apesar da administração do fármaco. Muitos dos mecanismos de resistência são resultantes de mutações pontuais, que podem alterar um ou mais resíduos de aminoácidos presentes na cadeia proteica, de forma que a afinidade de ligação entre fármaco e a proteína fica comprometida e a inibição não mais ocorre. Torna-se então necessário a pesquisa por novas moléculas que possam atuar como fármacos capazes de combater plasmócitos mutantes. A enzima dihidrofolato redutase de Plasmodium falciparum pertence à via do ácido fólico e é inibida pelos fármacos pirimetamina e cicloguanil. Mutações A16V/S108T tornam o parasita resistente ao cicloguanil e N51I/C59R/S108N/I164L à pirimetamina. Por meio de modelagem por homologia, geraram-se novas estruturas tridimensionais dessa enzima, com mutações sítio-dirigida em outros resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo. Realizou-se então estudo de docking utilizando-se essas estruturas modelo, procurando-se sugerir outros mutantes que também teriam baixa afinidade com os fármacos, podendo então originar possíveis plasmócitos resistentes. Selecionaram-se algumas das enzimas mutantes e se realizou um virtual screening com novas moléculas obtidas da base de dados NCI Diversity Set II para se procurar protótipos para novos fármacos. A enzima dihidrofolato redutase existe como uma molécula bifuncional ligada com a enzima timidilato sintase por meio de uma região de junção de 89 aminoácidos, realizou-se também virtual screening visando moléculas que interagissem com a região de junção que, segundo alguns autores, pode ser alvo para a ação de fármacos não competitivos. / Malaria is an infectious disease that affects mostly poor populations living in tropical areas. It is transmitted by bite of insects of genus Anopheles. Infectious agent is a protozoan of the genus Plasmodium, four species infect humans, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae and Plasmodium ovale, the first is the most lethal. There is no vaccine for the disease and the treatment is chemotherapy, drugs like quinine, chloroquine, pyrimethamine, sulfadoxine, atovaquone and artemisinin are employed. However, prolonged use of these drugs, monotherapy and early discontinuation of treatment has favored the emergence and establishment of resistant strains, which survive despite the administration of the drug. Many of resistance mechanisms are due to mutations that may alter one or more amino acid residues present in the protein chain, such that the binding affinity between the drug and the protein is compromised and not inhibition occurs. It then becomes necessary to search for new molecules that can act as drugs capable of fighting mutant strains. The Plasmodium falciparum’s dihydrofolate reductase enzyme belongs to the path of folic acid and is inhibited by drugs pyrimethamine and cycloguanil. A16V/S108T mutation becomes the parasite resistant to cycloguanil and N51I/C59R/S108N/I164L mutation to pyrimethamine. Through homology modeling, were generated new three-dimensional structures of this enzyme, with site-directed mutations in other amino acid residues present in the active site. Then docking study using these model structures was conducted, seeking to suggest other mutants that also have low affinity for inhibitors, which may then lead to possible strains resistant. We selected some of the mutant enzymes and conducted a virtual screening with new molecules obtained from the database NCI Diversity Set II to search prototypes for new drugs. The enzyme dihydrofolate reductase exists as a bifunctional molecule bound to the enzyme thymidylate synthase through a junction region of 89 amino acids, we also perform virtual screening targeting molecules that interact with the junction region, according to some authors, can be targeted for action of noncompetitive drugs. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Por meio da construção de sistemas paramétricas e dinâmicos, esta pesquisa propõe estudo experimental baseado em possibilidades de geração de formas e análise de suas variações. O aporte tem como inspiração o princípio de mutação (conceito que vem do contexto das ciências naturais e estudos do âmbito biológico), que introduz recursos interessantes para o desenvolvimento de metodologias, quando incorporado ao processo de criação, ensino e projeto, tendo em vista o universo do designe da arquitetura. A pesquisa defende também a relevância do fazer artesanal (analógico) e empírico, como procedimento e estratégia, em favor da construção do conhecimento, a ação mecânica (e orgânica) da mão, como instrumento que informa a mente e agencia possibilidades de intervenção e compreensão de processos. O trabalho baseia-se na proposição de derivações orientadas por regras (arbitrárias ou randômicas). Inicialmente, algumas \"imposições\" são preestabelecidas, posteriormente, flexibilizadas ou questionadas, abrindo espaço para o desenvolvimento de outras/novas variáveis. Ações/decisões que operam como dispositivos capazes de sugerir padrões invariáveis, garantindo certo controle, organização e sistematização. Manipulando, tridimensionalmente, linhas, planos e volumes, experimenta-se, fisicamente, formas geométricas e seus desdobramentos no espaço. Utilizando técnicas e materiais diversos, como tecido, cerâmica ou fundição, o início do processo parte de módulos geométricos (flexíveis) recortados em tecido e agregados através de costura. Alguns dos volumes gerados foram mergulhados em porcelana líquida e queimados em forno cerâmico, outros mergulhados em resina, látex ou parafina e uma única peça foi fundida em bronze. Testando limites e materialidade, investiga-se inflexões e deformações, rastros, memória física. Percebe-se relações/ações entre o bidimensional (forma plana original) e cada topologia resultante. O processo estabelece e corrompe sistemas, simultaneamente, observando como cada forma sugere, prenuncia ou se revela em outra. Descobre e estabelece relações, considera o que permanece ou persiste e o que se transforma, o que se afirma e o que se altera, permitindo a construção de uma possível linhagem ou o devi r de algum novo gênero. Sem expectativa de desfecho previamente dado, a busca de um resultado objetivo final não é a meta principal. / Through the construction of parametric and dynamic systems, the purpose of this research isto achieve an experimental study based on possibilities of generative forms and the analysis of their variations. The inspiration is to pursue the principie of mutation (concept that comes from the context of natural sciences and studies of the biological spectrum), that introduce interesting resources to the development of methodologies, when incorporated to creative process, teaching and project in itself, regarding the universe of architecture and design. This research also supports the relevancy of analogic and empirical craftwork, as strategy and procedure, in favour of knowledge construction, the mechanical (and organic) action of the hand, as an instrument that feeds the mind and opens possibilities of intervention and comprehension of processes. The work is sustained by the proposition of derivations based on rules (arbitrary or randomized). lnitially, some \"impositions\" are pre-determined, later released, or questioned, giving room to the development of other/new variables. Actions/decisions that operate as devices, suggesting variable patterns but assuring certain contrai, organization and system. Manipulating three-dimensionally, lines, plans and volumes, it is possible to experiment geometrical forms that unfold in space. Making use of diverse materiais and technics, like fabric, ceramic and casting. The process starts with (flexible) geometric modules, cut out of fabric and sewed together. Some of these volumes were immersed in liquid parcela in and fired in a ceramic kiln, others were immersed in resin, latex, o r wax, a unique piece was cast in bronze. Testing limits and materiality, we can investigate inflections and deformations, vestiges and physical memory. Relations/actions are understood between the two-dimensional (original flat shape) and each resulting topology. The process simultaneously establishes and corrupts systems, observing how each form suggests, foretells or reveals itself in a different one. Disclose and determinate relations, considering what remains or perseveres and what is transformed, what settles and what changes, allowing the construction of a possible lineage, or the becoming of some kind of new gender. No previous expectation of a final outcome is given and the quest for a specific target is not the main goal.

A síndrome de HIGM é uma imunodeficiência, caracterizada por níveis séricos normais ou elevados de IgM associados com baixos níveis de IgG, IgA e IgE. Neste estudo investigamos pacientes com HIGM autossômico recessivo. Selecionamos 15 pacientes com diagnóstico clínico sugestivo de AR-HIGM, 10 do sexo feminino, 05 do sexo masculino, onde onze são brasileiros, um é francês e três são turcos, com idades que variam de 2 a 40 anos. Todos os pacientes apresentam infecções recorrentes: 100% pneumonias, 80% otites médias agudas, 53% sinusites, 46% amigdalites, 40% diarréias 26% infecções urinárias, uma apresentou micobacteriose cutânea. Encontramos as seguintes mutações no gene AICDA: Pacientes EJ e GF, mutação missense na base 260 do cDNA (c.260G>C; p. Cys87Ser). Pacientes DA e RC apresentam defeito de splice, acarretando na deleção total do exon 4 do gene AICDA. Os pacientes estrangeiros foram previamente estudados para os genes AICDA, UNG e CD40, e nenhuma alteração foi encontrada. Neste caso, estudamos o gene INO80, e encontramos nos exons 04 (g.24012 G>A) e 26 (g.99976 G>T) do gene INO80, duas mutações missense em heterozigose no DNAg do paciente OD. O estudo molecular e genético é importante para a realização do diagnóstico diferencial, estratégia terapêutica e prognóstico dos casos. / HIGM syndrome is a rare immunodeficiency characterized by high or normal levels of serum IgM associated with low levels of IgG, IgA and IgE. We selected 15 patients with clinical diagnosis suggestive of AR-HIGM, 10 females, 05 males, where 11 are Brazilian, one is French and three are Turkish, with ages ranging from 2 to 40 years. All patients had recurrent infections: 100% pneumonia, 80% acute otitis media, 53% sinusitis, 46% tonsillitis, 40% recurrent diarrhea, 26% urinary tract infections, 20% stomatitis, and one patient presented a cutaneous mycobacteriosis. 20% of the patients had opportunistic infections: Mycobacterium marinum, Toxoplasma gondii, varicella-zoster virus, Pseudomonas aeruginosa, fungus, and Mycobacterium tuberculosis. As a result, we found two types of mutations in 4 diferent patients with no consanguinity. We found in AICDA gene the following mutations: Patients EJ and GF missense mutation in base 260 in cDNA, which results in a change of aminoacid (c.260G> C; Cys87Ser p.). Patients DA and RC showed a splice defect, resulting in a complete deletion of exon 4 in AICDA gene. All other patients were sequenced for AICDA, UNG and CD40 genes, and no changes were found. In this case, we studied the INO80 gene, and we found in exons 04 (g.24012 G> A) and 26 (g.99976 G> T) INO80 gene, two heterozygous missense mutations in DNAg of patient OD. Since these molecular genetic defects result in similar clinical features, molecular and genetic studies are important for the differential diagnosis, therapeutic strategy and prognosis of the cases.

Orientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Banca: Alexandre Naime Barbosa / Banca: André Martins / Resumo: A coinfecção HIV/VHC tornou-se um importante problema de saúde pública devido à possibilidade desses vírus agirem sinergicamente, acelerando a progressão da doença hepática relacionada ao VHC e podendo favorecer a proliferação do HIV. Apesar de estabelecido que a alta variabilidade genética do HIV gera mutações, conferindo ao vírus a capacidade de responder rapidamente as alterações da pressão seletiva exercida pelo sistema imunológico ou pela terapia antirretroviral (TARV), não é conhecido se a presença do VHC pode favorecer a emergência de variantes do HIV resistentes. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de mutações de resistência a inibidores de transcriptase reversa: Inibidores de Transcriptase Reversa análogo nucleosídeo ou nucleotídeo (ITRNs), Inibidores de Transcriptase Reversa não análogo nucleosídeo (ITRNNs); e inibidores de protease (IPs) em variantes de HIV circulantes em indivíduos coinfectados pelo VHC. Foram incluídos 19 pacientes coinfectados pelos vírus HIV/VHC, maiores de 18 anos, com carga viral plasmática do HIV de pelo menos 1.000 cópias de RNA/mL, atendidos no Ambulatório de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina de Botucatu e, no Hospital dia "Domingos Alves Meira". A genotipagem e o sequenciamento foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, UNESP, utilizando o Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Foram observados dois subtipos do HIV-1, B e F, sendo o subtipo B o mais freqüente, 94,74%. Para o VHC foram observados os genótipos 1 (94,74%) e 3 (5,26%). Todos os pacientes apresentaram mutações de resistência as classes avaliadas, tendo maior freqüência mutações associadas aos ITRNs como M184V em 57,89%. As mutações associadas aos ITRNNs mais freqüentes foram a K103N e G190A, presentes em 21,05% das amostras. As mutações principais ... / Abstract: HIV/HCV coinfection has become an important public health problem due to the possibility of these viruses act synergistically, which can accelerate the progression of liver disease related to HCV and may favor the spread of HIV. It is established that the high genetic variability of HIV generates mutations, giving the virus the ability to respond quickly to changes in selective pressure exerted by the immune system or by antiretroviral therapy (ART). It is not known whether the presence of HCV can promote the emergence of resistant variants of HIV. Thus, this study aimed to evaluate the profile of resistance mutations to classes of reverse transcriptase inhibitors: nucleoside and nucleotide analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs), non-nucleoside analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs), in circulating HIV variants in HCV coinfected individuals. In this study were included 19 HIV/HCV coinfected patients, over 18, with plasma HIV viral load of at least 1,000 RNA copies/mL. These patients were treated at the Ambulatory of Gastroenterology of the Faculty of Medicine of Botucatu and at the Day-Hospital "Domingos Alves Meira". Genotyping and sequencing were performed at the Laboratory of Molecular Biology of the Blood Center of Botucatu, Faculty of Medicine, UNESP, using the Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Two subtypes of HIV-1, B and F, were observed, but the subtype B was observed more often, 94.74%. It was observed HCV genotypes 1 (94.74%) and 3 (5.26%). All patients presented resistance mutations to the evaluated classes, and the mutations associated to NRTIs as M184V were observed more often (57.89%). The most common mutations associated to NNRTIs were K103N and G190A, present in 21.05% of the samples. The main mutations associated to IPs more frequent were M46I, I54V and V82A, with 15.78% ... / Mestre

Submitted by Thayane Maia (thayane.maia@uniceub.br) on 2016-05-05T21:29:54Z No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Heres Pires (heres.pires@uniceub.br) on 2016-07-18T15:18:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T15:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) Previous issue date: 2016-05-05 / O objetivo da pesquisa é analisar a incorporação do Foreign Account Tax Compliance Act - F.A.T.C.A. ao ordenamento jurídico brasileiro em face do conceito doutrinário e jurisprudencial brasileiro em matéria de sigilo bancário. F.A.T.C.A. é um conjunto de normas norte-americanas promulgadas em 18/03/2010 que alteram o Código Tributário daquele Estado, com produção de efeitos extraterritoriais (em outros Estados) em etapas. Nos termos das normas, são impostas às instituições financeiras estrangeiras obrigações pecuniárias e não-pecuniárias com exposição à riscos e custos jurídicos e operacionais. Dentre seus pontos mais polêmicos, está o encaminhamento automático de dados pessoais e de movimentação bancária à autoridade fiscal norte-americana (Internal Revenue Service – IRS). Em caso de descumprimento, as sanções vão desde a retenção dos tributos nos próprios saldos/investimentos bancários até o encerramento da conta bancária do titular. A despeito da assinatura de um Acordo Intergovernamental entre Brasil e EUA, a incorporação do instrumento poderá criar fatores de tensão e problemáticas institucionais, pois a quebra de sigilo bancário pelo Fisco no Brasil não é tema pacificado. O Supremo Tribunal Federal, Corte Constitucional competente para julgar a interpretação do sigilo bancário na qualidade de direito fundamental à privacidade erigido constitucionalmente posiciona-se pela prévia autorização judicial da „quebra‟ fazendária. No cenário global, as Instituições Financeiras, que serão impactadas pelas eventuais sanções, são impelidas à participação, tornando a aderência ao F.A.T.C.A. imperiosa, em paralelo à discussão jurídica acerca do tratamento nacional ao sigilo bancário. Sob o ponto de vista da política externa, a cooperação brasileira para o tema é também relevante, em razão do locus ocupado pelo país na composição de fóruns econômicos internacionais, como é o caso do Grupo dos Vinte (G-20) ou na participação de Comitês específicos e grupos de trabalho particulares que apontam para a convergência de posicionamentos que culminam na flexibilização do direito a médio e longo prazo em solo nacional. Esta realidade implica em: i) observar que, paralelo à clássica lógica de incorporação de normas jurídicas, há um rico e constante processo de interação da globalização econômica no qual se observa uma padronização internacional dos ordenamentos jurídicos nacionais; ii) esta realidade modifica e altera os sentidos constitucionais e normativos de instituitos jurídicos, no caso, o sigilo bancário, o qual mediante influxos internacionais, poderá sofrer nova interpretação de atores institucionais domésticos, podendo ser remodelado na jurisprudência, legislação e doutrina pátria. / http://repositorio.uniceub.br/retrieve/22925/61250044.pdf

Submitted by Gisely Teixeira (gisely.teixeira@uniceub.br) on 2018-05-12T15:15:42Z No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Fernanda Weschenfelder (fernanda.weschenfelder@uniceub.br) on 2018-05-14T18:29:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T18:29:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 61250044.pdf: 1343087 bytes, checksum: 405076c49057c9f3d8dffe41cc1982c7 (MD5) Previous issue date: 2015 / O objetivo da pesquisa é analisar a incorporação do Foreign Account Tax Compliance Act - F.A.T.C.A. ao ordenamento jurídico brasileiro em face do conceito doutrinário e jurisprudencial brasileiro em matéria de sigilo bancário. F.A.T.C.A. é um conjunto de normas norte-americanas promulgadas em 18/03/2010 que alteram o Código Tributário daquele Estado, com produção de efeitos extraterritoriais (em outros Estados) em etapas. Nos termos das normas, são impostas às instituições financeiras estrangeiras obrigações pecuniárias e não-pecuniárias com exposição à riscos e custos jurídicos e operacionais. Dentre seus pontos mais polêmicos, está o encaminhamento automático de dados pessoais e de movimentação bancária à autoridade fiscal norte-americana (Internal Revenue Service – IRS). Em caso de descumprimento, as sanções vão desde a retenção dos tributos nos próprios saldos/investimentos bancários até o encerramento da conta bancária do titular. A despeito da assinatura de um Acordo Intergovernamental entre Brasil e EUA, a incorporação do instrumento poderá criar fatores de tensão e problemáticas institucionais, pois a quebra de sigilo bancário pelo Fisco no Brasil não é tema pacificado. O Supremo Tribunal Federal, Corte Constitucional competente para julgar a interpretação do sigilo bancário na qualidade de direito fundamental à privacidade erigido constitucionalmente posiciona-se pela prévia autorização judicial da „quebra‟ fazendária. No cenário global, as Instituições Financeiras, que serão impactadas pelas eventuais sanções, são impelidas à participação, tornando a aderência ao F.A.T.C.A. imperiosa, em paralelo à discussão jurídica acerca do tratamento nacional ao sigilo bancário. Sob o ponto de vista da política externa, a cooperação brasileira para o tema é também relevante, em razão do locus ocupado pelo país na composição de fóruns econômicos internacionais, como é o caso do Grupo dos Vinte (G-20) ou na participação de Comitês específicos e grupos de trabalho particulares que apontam para a convergência de posicionamentos que culminam na flexibilização do direito a médio e longo prazo em solo nacional. Esta realidade implica em: i) observar que, paralelo à clássica lógica de incorporação de normas jurídicas, há um rico e constante processo de interação da globalização econômica no qual se observa uma padronização internacional dos ordenamentos jurídicos nacionais; ii) esta realidade modifica e altera os sentidos constitucionais e normativos de instituitos jurídicos, no caso, o sigilo bancário, o qual mediante influxos internacionais, poderá sofrer nova interpretação de atores institucionais domésticos, podendo ser remodelado na jurisprudência, legislação e doutrina pátria.

Introdução: O hipotireoidismo congênito possui prevalência de 1/4000 crianças nascidas vivas e pode ser causado por disgenesia tireoideana (80% dos casos) ou por defeitos de síntese hormonal (20% restantes). A disormonogênese tem sido associada a mutações nos genes: tireoglobulina, simportador sódio/iodo, tireoperoxidase, dual oxidase 2, e pendrina. A tireoglobulina é uma glicoproteína de 660KDa e funciona como matriz para a síntese dos hormônios tireoideanos. Até o momento 38 mutações inativantes, associadas a bócio e hipotireoidismo, foram identificadas no gene da tireoglobulina. Objetivos: Este estudo visou caracterizar mutações no gene da tireoglobulina em 13 pacientes brasileiros com bócio e hipotireoidismo congênito e verificar o efeito funcional da mutação A2215D identificada neste estudo. Casuística e Métodos: Foram estudados 13 pacientes com hipotireoidismo congênito por possível defeito de síntese de tireoglobulina. Foi utilizado DNA de sangue periférico de todos os pacientes e amostra de tecido da paciente portadora da mutação A2215D. Os métodos utilizados foram: amplificação e sequenciamento dos 48 exons e das junções exon/intron, transfecção de células de mamífero com plasmídeos contendo o cDNA da tireoglobulina mutada e não mutada, eletroforese de proteínas e hibridização com anticorpo específico, dosagem de tireoglobulina por fluoroimunoensaio indireto, quantificação de RNAm por PCR quantitativo em tempo real, imunohistoquímica, microscopia por coloração de hematoxilina/eosina e microscopia eletrônica e imunoeletrónica. Resultados: O defeito de síntese de tireoglobulina nos pacientes foi confirmado pela ausência de elevação do valor da tireoglobulina sérica 24 e 48hs após a aplicação de 0,45mg de TSH humano recombinante. No gene da tireoglobulina foram identificadas cinco mutações, sendo duas novas (Q2142X e IVS46-1G>A) e três já descritas na literatura (R277X, IVS30+1G>T e A2215D); 19 polimorfismos e 13 alterações em introns. Doze dos treze pacientes apresentaram mutações bialélicas (homozigose ou em heterozigose composta). O estudo funcional em células de mamíferos revelou diminuição da secreção da proteína mutada e no tecido do paciente portador da mutação A2215D mostrou: localização intracelular da tireoglobulina com ausência quase total no colóide; retículo endoplasmático rugoso de volume extremamente aumentado, presença de tireoglobulina dentro do retículo endoplasmático rugoso e baixo conteúdo de RNAm de tireoglobulina e da própria proteína. Também foram verificados baixo conteúdo de RNAm de genes tireoideanos (TPO, TTF1, PAX-8, NIS, receptor de TSH). Conclusão: Todas as mutações identificadas neste estudo explicaram o hipotireoidismo congênito diagnosticado nos pacientes. A mutação A2215D promoveu a retenção da proteína mutada dentro do retículo endoplasmático rugoso e diminuiu sua secreção para o colóide, ocasionando grave defeito de síntese hormonal e hipotireoidismo. A tireoglobulina endógena portadora da mutação A2215D poderia atuar como regulador da função tireoideana via supressão da expressão dos fatores de transcrição importantes na fisiologia da tireóide. / Introduction: Congenital hypothyroidism is one of the most common hereditary endocrine disorders, which affects 1:4000 newborns. Congenital hypothyroidism is caused by thyroid gland dysgenesis (80%) or inborn errors of thyroid hormone synthesis (20%). Genetic defects in thyroglobulin, pendrin, thyroperoxidase, dual oxidase 2, simporter sodium/iodine have been associated to dyshormonogenesis. Thyroglobulin is a large glycoprotein that functions as the matrix for thyroid hormone synthesis. At least 38 mutations in the TG gene have been identified in patients with thyroid dyshormonogenesis. Objectives: The aims of this study were to identify thyroglobulin gene mutations associated with congenital hypothyroidism in 13 Brazilian patients, and to determine the functional effect of the mutation A2215D identified in this study. Patients and methods: Thirteen patients with congenital hypothyroidism due to defective thyroglobulin synthesis were included. Peripheral blood DNA from all the patients and one thyroid tissue sample from a patient with the A2215D mutation were collected. Thyroglobulin exons and exons/introns borders were amplified by PCR and sequenced. Mammalian cells were transfected with expression vectors encoding mutated and non-mutated thyroglobulin cDNA. Immunoblots, determination of thyroglobulin concentrations, real time PCR to quantify mRNA expression, immunohistochemical analysis, hematoxilyn-eosin staining and electronic and immunogold microscopy were performed. Results Abnormal thyroglobulin synthesis and secretion was confirmed by the absence of a serum thyroglobulin elevation 24 and 48 hours after the stimulation with recombinant human TSH (0.45 mg). Molecular analysis revealed five mutations in the thyroglobulin gene, 2 novel (Q2142X and IVS46-1G>A) and three previously described mutations (R277X, IVS30+1G>T and A2215D); 19 polymorphisms and 13 intronic alterations. Biallelic mutations (homozygous or compound heterozygous) in the thyroglobulin gene were identified in twelve of thirteen patients. Functional studies in mammallian cells showed low secretion of the mutated thyroglobulin (A2215D). The complete analysis of the thyroid tissue from a patient with the A2215D mutation revealed: mutant thyroglobulin in the follicular cell but not in the lumen, marked dilatation of the endoplasmic reticulum, thyroglobulin immunopositivity in the endoplasmic reticulum and low concentration of thyroglobulin protein and mRNA. Furthermore, low mRNA levels of thyroid genes (TPO, TTF1, PAX-8, NIS, receptor de TSH) were detected. Conclusions: All the identified thyroglobulin gene mutations explained the congenital goiter hypothyroidism of the patients. The mutation A2215D promoted the retention of the mutant thyroglobulin in the endoplasmic reticulum, decreased the thyroglobulin secretion to the colloid resulting in an impairment of thyroid hormone synthesis and congenital hypothyroidism. The endogenous A2215D mutant thyroglobulin could be considered a regulator of follicular function mediated by the transcriptional suppression of thyroid genes.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Por muitos anos o fluconazol tem sido uma opção usual para tratamento de infecções por Candida. Entretanto, o uso indiscriminado desta terapia antimicótica tem favorecido o surgimento de microrganismos resistentes. A redução da afinidade da enzima alvo dos antifúngicos, 14--demetilase (ERG11p), tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência, caracterizado por mutações em seu gene codificante ERG11. Neste estudo, foi investigada a suscetibilidade ao fluconazol de 87 isolados de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e C. glabrata, com valores de MIC determinados através do método de microdiluição em caldo M27-A3 (CLSI, 2008); verificou-se que dezessete isolados apresentavam decréscimo da suscetibilidade ao fluconazol. A triagem de mutações foi realizada através da amplificação de quatro regiões do gene ERG11 com primers específicos delineados neste estudo, para cada espécie de Candida, seguida de análise pela técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado. Foram identificadas 217 mutações, incluindo 185 silenciosas e 32 por troca de sentido (que altera o aminoácido resultante). Estas últimas foram observadas em 19 isolados e 17 resíduos distintos, sendo 7 deles ainda não descritos anteriormente: L321F em C. albicans; K53M em C. krusei; Y221F, K344T, V362M e R371S em C. tropicalis; e R398I em C. parapsilosis. Confrontando os resultados entre a técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado, não houve associação direta entre as mudanças na migração eletroforética e alterações na seqüência nucleotídica do gene ERG11. Sugerimos que a freqüência elevada de alterações no gene ERG11 de Candida deve ser considerada no design de novos fármacos que visem a enzima ERG11p / For many years, fluconazole has been a usual option for treatment of Candida infections. However, the indiscriminate use of antimycotic therapy has favored the emergence of resistant organisms. The decrease in the affinity of the enzyme target of antifungal agents, 14--demethylase (ERG11p), has been described as an important mechanism of resistance, characterized by mutations in its encoding gene ERG11. In this study, we investigated the susceptibility to fluconazole of 87 strains of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei and C. glabrata with MIC values determined by broth microdilution M27-A3 (CLSI, 2008), found that seventeen isolates showed decreased susceptibility to fluconazole. Mutation screening was performed by the amplification of four regions of the ERG11 gene with specific primers designed in this study for each Candida species, followed by electrophoresis SSCP analysis and sequencing. We identified 217 mutations, including 185 silent mutations and 32 missense mutations. Missense mutations were observed in 19 isolates and 17 distinct residues, 7 of them still not described earlier: L321F in C. albicans, K53M in C. krusei; Y221F, K344T, V362M and R371S in C. tropicalis, and R398I in C. parapsilosis. Comparing the results between SSCP electrophoresis technique and sequencing, there was no direct association between changes in electrophoretic migration and changes in the nucleotide sequence of the ERG11 gene. We suggest that the high frequency of changes in ERG11 gene of Candida should be considered in the design of new drugs targeting the enzyme ERG11p

Orientador: José Paes de Oliveira Filho / Resumo: O Labrador Retriever (LR) é uma das principais raças caninas com maior predisposição à obesidade. Vários fatores, especialmente as inter-relações entre a alimentação, exercício e fatores sociais, influenciam a probabilidade de um cão se tornar obeso. Além disso, fatores genéticos são também responsáveis pela obesidade em cães, e no LR a mutação P187fs no gene pró-opiomelanocortina (POMC) está fortemente associada à obesidade. Não existem estudos prévios de prevalência da desta em LR no Brasil. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar esta mutação em cães da raça LR no Brasil. Dos 108 LR avaliados neste estudo, 59 eram de um estudo retrospectivo (composto por animais atendido no hospital veterinário e sem linhagem conhecida) e 49 eram de um estudo prospectivo (composto por 19 cães pet e 30 cães de assistência/resgate). Um questionário de risco de obesidade modificado foi aplicado nos tutores dos animais usados no estudo prospectivo. Fragmentos de DNA, contendo a região mutada, foram amplificados por PCR e submetidos ao sequenciamento gênico direto. A frequência alélica da mutação (21,3%) estava fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P < 0,05). Usando somente os dados dos animais de linhagem conhecida, o alelo mutado foi mais frequente no grupo de assistência/resgate que no grupo de pets (P < 0,01). Embora a mutação tenha aumentado a motivação pelo alimento em LR do grupo de assistência/resgate, outras variáveis, especialmente o frequente exercício, favoreceu a manutençã... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Labrador retriever (LR) is among the main breeds with the greatest predisposition to obesity. Several factors; especially the interrelationships between food management, exercise and social factors; influence the likelihood of a dog becoming obese. Furthermore, genetic factors are also responsible for obesity in dogs, and in LR, the mutation P187fs in pro-opiomelanocortin (POMC) gene is strongly associated with obesity. There is no knowledge of studies that have previously evaluated the prevalence of this mutation in Brazilian LR. Therefore, the objective of this study was to investigate this mutation in LR in Brazil. Of the 108 LR that were assessed in this study, 59 were from a previous study, composed by animals assisted in a veterinary hospital with unknown lineage, and 49 were from a prospective study, composed of 19 pet and 30 assistance/rescue LR dogs. The obesity risk and appetite questionnaire were applied, with some modifications, to tutors of the animals used in the prospective study. Fragments of the DNA, containing the mutated region, were amplified by PCR and submitted to direct gene sequencing. The mutated allele frequency (21.3%) was out of Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) (P < 0.05). Using only the data of animals with known lineage, the presence of the mutated allele was higher in the assistance/rescue dogs than pets (P < 0.01). Although the mutation has increased the food-motivation in the assistance/rescue dogs, other variables, especially frequent exe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre