Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, Fábio Rossi Torres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_DanielaAguiar_D.pdf: 4993968 bytes, checksum: b0d9bcf5acf25db217c9dedcd7aa4bbc (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As malformações do desenvolvimento cortical (MDC) são distúrbios resultantes de defeitos na embriogênese do córtex cerebral e estão entre as principais causas conhecidas de atraso do desenvolvimento e epilepsia. Dentre os principais tipos de MDC podemos citar a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro lissencefalia/heterotopia subcortical em banda (LIS/HSB) e a esquizencefalia. Alterações moleculares em genes que atuam em mecanismos que vão desde o controle da divisão celular até a migração neuronal foram identificadas como responsáveis pela etiologia de vários tipos de MDC. Tais descobertas, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do córtex cerebral e doenças relacionadas, fornecem informações importantes para um melhor diagnóstico e tratamento dos pacientes. Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi analisar do ponto de vista molecular um grande grupo de pacientes com MDC. A casuística foi composta por um grupo de 107 pacientes: 27 possuem HNP, 33 são afetados por LIS/HSB e 47 possuem esquizencefalia. Em um primeiro momento, foi realizada triagem de mutações de ponto em genes candidatos (FLNA, DCX, LIS1, EMX2, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8) por sequenciamento (Sanger). Posteriormente, a técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi utilizada para detectar variações estruturais em regiões candidatas, incluindo os genes FLNA, DCX e LIS1. Finalmente, a técnica de SNP-Array foi utilizada para análise das variações no número de cópias alélicas em regiões genômicas de alguns pacientes (copy number variation - CNV). Todas as mutações de ponto encontradas nas sequencias de DNA foram verificadas em um grupo de 200 indivíduos controles. Através do sequenciamento, foram identificadas três alterações patogênicas localizadas nos genes FLNA e DCX, através do MLPA foram encontradas seis alterações estruturais patogênicas nos genes FLNA, DCX e LIS1. Os ensaios de SNP-Array permitiram a identificação de vários CNVs com potencial deletério, incluindo 12 pacientes com 17 novas CNVs ainda não descritas na literatura. Tais CNVs envolvem vários potenciais genes candidatos para as MDC, incluindo os genes TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 e HAUS7. Concluindo, nossos resultados mostram uma baixa frequência de mutações em genes candidatos previamente relacionados às MDC, somente 2.8% (n=3/107) dos pacientes possuem variantes deletérias nas sequencias dos genes analisados e 18% (n=6/33 testados) dos pacientes analisados possuem alterações estruturais em regiões candidatas. Porém, através da abordagem genômica para identificação de variações estruturais, foram identificadas vá-rias regiões/genes candidatos potencialmente envolvidos com a etiologia das MDC (12/40= 30%). Nossos dados mostram que as MDC apresentam grande heterogeneidade genética, porém uma proporção significativa dos pacientes possuem variações estruturais que podem ser identificadas pela técnica de SNP-Array / Abstract: Malformations of cortical development (MCD) are disorders resulting from defects in the embryogenesis of the cerebral cortex and are one of the most important causes of developmental delay and epilepsy. The main types of MCDs are periventricular nodular heterotopia (PNH), lissencephaly/subcortical band heterotopia spectrum (LIS/SBH) and schizen-cephaly. Mutations in genes acting in mechanisms ranging from control of cell division to neuronal migration were identified as responsible for several types of MCDs. These advances not only improved our understanding about the mechanisms involved in the development of the cerebral cortex but have also provided relevant information that can be used for better diagnosis and management of patients. In this scenario, the main objective of this study was to access and perform a comprehensive molecular genetics study in a large cohort of patients with MCD. We have studied a total of 107 patients with MCDs divided in the following groups: 27 with PNH, 33 with LIS/SBH and 47 with schizencephaly. We first searched for sequence variations in candidate genes (FNLA, DCX, LIS1, EMX2, TU-BA1A, TUBB2B and TUBA8) using the Sanger sequencing method. Subsequently, we checked for structural variants in FLNA, DCX and LIS1 using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) technique. Finally, we took a genomic approach by using single nucleotide polymorphism (SNP)-array technology to studied copy number variations (CNV) in some patients. All sequence variants found were subsequently verified in a group of 200 control individuals. Our results showed 3 pathogenic sequence variants in FNLA and DCX, as well as 6 pathogenic structural variants detected by MLPA in FLNA, LIS1 and DCX. SNP-array technique detected 17 genomic regions, in 12 patients, containing new CNVs. These CNVs involve a number of potential new candidate genes for MCDs, including: TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 and HAUS7. In conclusion, our results show a low frequency of mutations in candidate genes previously associated with MCDs, only 2.8% (n=3/107) of our patients have deleterious sequence variants and 18% (n=6/33) have abnormal structural variants in candidate regions. However, by using a genomic approach to look for CNVs we were able to identify several candidate regions/genes that have the potential to be involved in MCDs (12/40= 30%). Our data show that MCDs are genetic heterogeneous; however, it seems that a significant proportion of patients have structural abnormalities that can be identified by SNP-array technology / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3520_1.pdf: 2089848 bytes, checksum: ce399cd21571e603ce8338019a00fc4f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A exposição freqüente a sangue e derivados é uma importante rota para transmissão do vírus da hepatite B (HBV), portanto pacientes hemodialisados apresentam um alto risco para a aquisição do mesmo devido ao tratamento de rotina. Em muitos países, a transmissão do vírus da hepatite B tem sido controlada em centros de hemodiálise, devido à utilização das precauções universais, práticas de controle da infecção e vacinação freqüente nos pacientes susceptíveis. Todavia algumas unidades apresentam pacientes com infecção oculta para o HBV, variando de 0 a 58% em algumas regiões do mundo. Os objetivos desse trabalho foram identificar infecção oculta para o HBV e os fatores de riscos para a infecção em pacientes hemodialisados de 5 clínicas da cidade de Recife/PE, no período de agosto de 2006 a agosto de 2007. A população estudada foi constituída por 780 pacientes, com média de idade de 50 ± 15,1 e de ambos os sexos. Os hemodialisados, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, foram submetidos a uma entrevista para aquisição de dados epidemiológicos. Foram coletados antes do tratamento hemodialítico, 10 mL de sangue pela fistula. As amostras foram encaminhadas em tempo hábil de 4 horas ao laboratório para processamento e armazenamento a - 80°C até o momento de realização dos testes. O ELISA foi realizado para pesquisa dos marcadores sorológicos (anti-HBc total, HBsAg e anti-HBs). Os soros que apresentaram negatividade para o anti-HBc total e HBsAg foram organizados em pools . As amostras anti-HBc total positiva e os pools foram submetidas à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa do DNA viral. As reações positivas foram seqüenciadas para a identificação do genótipo e para análise de mutação para a região S do vírus. As informações foram armazenadas e analisadas no Epiinfo 6.0., para posterior análise univariada e multivariada das variáveis estudadas. A soroprevalência para o anti-HBc total, HBsAg e anti-HBs foi de 29,4% (229/780), 3,3% (26/780) e 66,2% (135/203), respectivamente e o DNA viral foi encontrado em 2,2% (17/780) das amostras. Em dois pacientes anti-HBc total + anti-HBs reagentes e em um paciente com anti-HBc total isolado foram encontrados o DNA-HBV, observando uma infecção oculta de 0,4% (3/752). O genótipo A foi encontrado em 81,25% (13/16), o genótipo D em 12,5% (2/16) e o genótipo F em 6,25% (1/16) das amostras HBsAg positivas. Os genótipos verificados nos pacientes com infecção oculta foram o A (2/3) e D (1/3). Nenhuma mutação foi encontrada nas seqüências virais analisadas. As variáveis sexo, idade, tempo de hemodiálise e quantidade de transfusões é que estão mais estreitamente associadas com a soropositividade para o anti-HBc total. Os marcadores sorológicos avaliam bem a infecção pelo HBV, porém deve-se ter sempre o respaldo de testes moleculares para a verificação de infecções ocultas, pois evidencia pacientes que para a clínica são considerados negativos e na verdade albergam o vírus, podendo disseminar o vírus aos demais

Orientador: Iscia Lopes Cendes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T09:24:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gonsales_MarinaCoelho_M.pdf: 1544021 bytes, checksum: 7e7c28938a8217bf6f94e975f8778683 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Dentre as epilepsias infantis, destacam-se a epilepsia mioclônica grave da infância (EMGI) e a epilepsia mioclônico-astática (EMA), as quais constituem os fenótipos mais graves do espectro da epilepsia generalizada com crises febris plus (EGCF+). Outra síndrome epiléptica importante é a epilepsia benigna da infância com espículas centro- temporais (EBIECT), que se destaca por ser a mais comum na infância. Avanços nos estudos de genética molecular levaram à descoberta de um gene responsável pelo espectro de fenótipos da EGCF+, o gene SCN1A, e um locus candidato para EBIECT na região 15q14. Os objetivos deste projeto foram realizar triagem de mutações em genes candidatos em pacientes com as epilepsias mencionadas e estabelecer possíveis correlações genótipo- fenótipo. Os genes estudados foram o SCN1A para EMGI e EMA e os genes CHRM5, CHRNA7 e CX36, localizados na região cromossômica 15q14, para EBIECT. A triagem de mutações foi realizada por meio da técnica de Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) e posterior sequenciamento automático dos fragmentos alterados. Foram estudados nove pacientes com EMGI, 12 com EMA e 27 com EBIECT. A análise de mutações no gene SCN1A revelou seis alterações potencialmente deletérias: as substituições c.829T>C, c.971A>C e c.5434T>C, que resultam em troca de resíduo de aminoácidos na proteína codificada, a inserção c.3719_3720insGATA, que promove alteração na matriz de leitura, e as alterações IVS4+1G>A e IVS8+3G>T, que se localizam em possíveis sítios doadores de splicing. As alterações foram encontradas apenas em pacientes com o fenótipo mais grave, a EMGI, nos quais ocorreram crises em vigência de febre baixa. A análise de mutações nos pacientes com EBIECT não revelou alterações potencialmente deletérias nos genes estudados. Com base nos resultados deste trabalho, podemos concluir que pelo fato de variantes potencialmente deletérias terem sido encontradas no gene SCN1A apenas em pacientes com EMGI, isso levanta a hipótese de que outro gene esteja envolvido na etiologia de EMA nos demais pacientes. O gene CHRM5 não parece estar envolvido com a etiologia de EBIECT em nossa amostra de pacientes. Também não foram encontradas alterações potencialmente deletérias nos genes CHRNA7 e CX36, mas os mesmos ainda não podem ser totalmente excluídos como envolvidos em EBIECT. / Abstract: Among the childhood epilepsies one important sub-group is the spectrum of generalized epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+), which includes severe syndromes such as severe myoclonic epilepsy of infancy (SMEI) and myoclonic astatic epilepsy (MAE). Another important epileptic syndrome is benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes (BCECTS), which is of particular interest for being the most common childhood epilepsy. Advances in molecular genetic studies led to the discovery of the SCN1A gene, responsible for the spectrum of GEFS+, and a candidate locus for BCECTS in the 15q14 region. The main objectives of this project were to screen candidate genes for mutations in a cohort of patients diagnosed with the epilepsies mentioned above, and to established genotype-phenotype correlations. We studied the SCN1A gene in patients with SMEI and MAE; and CHRM5, CHRNA7, and CX36 genes, located within the candidate region on chromosome 15q14, in patients with BCECTS. Mutation screening was performed using the denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) technique, with subsequent automatic sequencing of the altered fragments. We investigated 9 patients with SMEI, 12 with MAE and 27 with BCECTS. Analysis of the SCN1A gene revealed 6 potentially deleterious variants: substitutions c.829T>C, c.971A>C and c.5434T>C, leading to amino acid residue substitutions; insertion c.3719_3720insGATA, which promotes a frameshift; and alterations IVS4+1G>A and IVS8+3G>T, which possibly modify splicing donor sites. We found alterations only in patients with the most severe phenotype, SMEI, who had seizures during low temperature fever occur. Mutation analysis in patients diagnosed with BCECTS did not reveal potentially deleterious variants for the genes studied. As a result of our study, we can conclude that we only found potentially deleterious variants in the SCN1A gene among the patients studied. The fact that they were identified only in patients with SMEI provides evidence that another gene is likely to be involved in the etiology of MAE. The CHRM5 gene does not seem to be involved in the etiology of BCECTS in our patients. Even though no evidences supporting the pathologic role of CHRNA7 and CX36 genes were found, we still can not exclude them as involved in BCECTS. / Mestrado / Neurociencias / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T21:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LucianaPuglieseda_M.pdf: 3815168 bytes, checksum: ffcaf6b4e7787d8b4fd4365accf237c7 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A proteína S humana é uma glicoproteína plasmática vitamina K-dependente que age como cofator não enzimático da proteína C ativada na Via Anticoagulante da Proteína C. Além disso, a proteína S desempenha um papel independente da proteína C ativada inativando os fatores V e X ativados. A concentração plasmática da Proteína S é regulada por uma proteína de ligação que atua na Via Clássica do Complemento, a C4b. A proteína C4b forma complexos inativos com aproximadamente 60% da proteína S total, e somente a proteína S na sua forma livre pode exercer sua atividade de cofator da proteína C ativada. A deficiência hereditária de proteína S é uma causa comum de trombose venosa recorrente, e ocorre pela diminuição da atividade anticoagulante da proteína S. É uma doença relativamente rara e tem padrão de herança autossômico dominante o gene que controla a produção- da proteína S (PROS1) está localizado no cromossomo 3, próximo à região do centrômero, na posição 3p11.1 - 3q11.2. É constituído por 15 exons e 14 introns, abrangendo uma região de mais de 80 kb, que origina um mRNA de 3,5 a 4,0 kb. Nesta mesma região do cromossomo 3 há um pseudogene (PROS2) que possui 97% de homologia com a região codificadora do gene ativo. De acordo com um "database" de mutações no gene da proteína S, publicado em 1997 por GANDRILLE et aI., foram descritas 71 diferentes mutações de ponto sendo 19,8% mutações missense, 65,3% mutações missense, 12,8% mutações em sítio de "splicing" e 2% aboliam o codon de terminação natural da proteína. Foram também descritas 16 diferentes inserções/deleções e duas grandes deleções. Um total de doze polimorfismos raros foram descritos, incluindo o polimorfismo Heerlen, além de um polimorfismo freqüente, o dismorfismo neutro CCA/CCG. Os métodos de SSCP e CSGE possibilitam o rastreamento rápido e eficaz de mutações. O seqüenciamento de DNA permite a determinação precisa da alteração molecular responsável pela doença. No presente trabalho, estes métodos foram empregados no estudo do gene da proteína S (PROS1) de 8 pacientes com deficiência de proteína S que apresentaram trombose espontânea. Outras deficiências que predispõem à trombose foram avaliadas e não detectadas nestes pacientes. Com o emprego dessa estratégia metodológica foi possível detectar e identificar sete mutações de ponto em quatro dos oito pacientes estudados, incluindo uma mutação silenciosa, além de um polimorfismos em outro paciente. Das mutações encontradas somente uma foi detectada pelo método de SSCP. Considerando-se o quadro clínico/laboratorial dos pacientes estudados e a análise familiar, os resultados deste estudo sugerem que as mutações identificadas seriam responsáveis pela deficiência hereditária de proteína S. A identificação das mutações e sua correlação com o quadro clínico dos pacientes estudados neste trabalho contribuem para a compreensão da relação estrutura-função desta proteína. Também foram determinadas as freqüências, em diferentes grupos da população brasileira (recém-nascidos, caucasóides, negróides, índios e pacientes com trombose) do polimorfismo Heerlen e do dismorfismo neutro CCA/CCG. Os resultados obtidos nos diferentes grupos estudados, para polimorfismo Heerlen, não diferiram significativamente dos descritos anteriormente na literatura por BERTINA et aI., 1990. Este polimorfismo não foi identificado em nenhum dos pacientes estudados. As freqüências alélicas do dismorfismo neutro CCA/CCG não diferiram significativamente dos descritos na literatura por DIEPSTRATEN, et aI., 1991 e GANDRILLE et aI., 1995. Nossos resultados revelaram que na população negróides pode ter ocorrido um grau de miscigenação, já que a freqüência de heterozigotos foi elevada. A população indígena, apesar de ser considerada um isolado genético, mostrou um predomínio do genótipo heterozigoto. O polimorfismo CCA/CCG também foi empregado para análise de segregação nas famílias com deficiência de proteína S, e mostrou-se informativo em três famílias analisadas / Abstract: Human protein S is a plasmatic vitamin-K dependent glicoprotein that acts as a non-enzimatic cofactor of activated protein C in the protein C anticoagulant pathway. In addition to this protein S has an independent role that activated protein C, which is to inactivate factors Va and Xa. The plasmatic concentration of protein S is regulated by a C4b binding protein that acts on the Complement Classical Pathway. C4b protein forms inactive complexes with approximately 60% of total protein S, and only the free form of protein S its can act as a cofactor of activated protein C. The hereditary deficiency of protein S is a common cause of recurrent venous thrombosis, and occurs due to the decrease of the anticoagulant activity of protein S. It is a relatively rare disease and it has a dominant autossomic hereditary patteFI1. The gene which controls the production of protein S (PROS1) is Ipcated in chromosome 3, near the centromer region at position 3p11.1 - 3q11.2. It is formed by 15 exons and 14 introns comprising a region of over 80kb, which originates a mRNA of 3,5 to 4,0 kb. In this same region of chromosome 3 there is a pseudogene (PROS2) which is 97% homologous to the codifying region of the active gene. According to the protein S gene mutation database published by GANDRILLE et aI., 71 different point mutations were described, 19.8% were nonsense mutations, 65,3% were missense mutations, 12,8% were splice site mutations, and 2% abolished the natural codon termination of the protein. Sixteen different insertions/deletions and two large deletions were also described. A total of twelve rare polymorphisms were described including the Heerlen polymorphism and a frequent polymorphism, the neutral dimorphism CCA/CCG. The SSCP and CSGE analysis permit the quick and efficient screening of the mutations. Direct DNA sequencing permit the precise determination of the molecular alteration responsible for the disease. In this study these methods were used in the study of protein S gene (PROS1) of eight patients with protein S deficiency which presented spontaneous thrombosis. Other deficiencies which predispose to thrombosis were evaluated but were not detected. With the use of this methodology it was possible to detect and identify seven point mutations in four of the eight patients studied, including a silent mutation in addition to a polymorphism in another patient. Of the mutation found only one was detected by the SSCP method. Considering the clinical and laboratory data of the patients studied, together with the analysis of the family, the results of this study suggest that the mutations identified are responsible for the hereditary protein S deficiency. The identification of the mutations and its correlation to the clinical data of the patients studied contribute to the comprehension of the structural-functional relation of this protein. The frequencies of the Heerlen polymorphism and the neutral dimorphism CCA/CCG, in different groups of the Brazilian population (newborns, caucasoides, Black population, Indians and patients with thrombosis) were also determined. The results obtained in the different groups studied, for Heerlen polymorphism, did not differ significantly from those described previously in the literature by BERTINA et al, 1990. This polymorphism was not identified in any of the patients studied. The allelic frequencies of the neutral dismorphism CCA/CCG do not differ significantly from those described in literature by DIEPSTRATEN, et aI., 1991 and GANDRILLE et aI., 1995. Our results revealed that the miscigenation may have occurred in the Black population, in spite of being considered as a genetic isolate, showed a predomination of the heterozygous genotype. The CCA/CCG polymorphism was also used to analyze the segregation in families with protein S deficiency and was informative in three families that were analyzed. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Neste trabalho, realizou-se a análise molecular do gene CFTR em indivíduos com e sem características sugestivas de fibrose cística (FC), em diferentes grupos populacionais do Estado do Maranhão e do Pará, com o objetivo de determinar a freqüência das mutações DF508, G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X, consideradas as mais comuns do gene CFTR, e do polimorfismo 4002A/G (localizado no exon 20, o mesmo da mutação W1282X). Em dois isolados afro-brasileiros verificou-se, também, a freqüência da mutação 3120+1GÕA, cuja prevalência está aumentada em populações de origem africana. A freqüência da deleção DF508 foi de 0,8%, enquanto a das mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X foi de 0% entre os 180 indivíduos da população miscigenada do Maranhão. Nessa amostra, a freqüência do polimorfismo 4002A/G foi de 8,3%, tendo sido encontrado tanto em heterozigose (24) quanto em homozigose (03). Entre os 37 indivíduos de origem caucasóide (ascendência portuguesa) do isolado populacional de Santa Flor (Bequimão-MA), DF508 teve uma freqüência de 5,4%. Nenhuma das outras 5 mutações foi identificada nessa amostra. Quanto ao polimorfismo 4002A/G, a freqüência foi de 4,1%, tendo ocorrido apenas em heterozigose. Nenhuma das 6 mutações mais comuns do gene CFTR foi detectada nos remanescentes de quilombos do Pontal (54 indivíduos) e do Cajual (39 indivíduos), assim como a mutação 3120+1GÕA também não foi encontrada entre esses negróides do Maranhão. Já o polimorfismo 4002A/G teve uma freqüência de 23,15% no Pontal e de 9% no Cajual. A comparação das freqüências da mutação DF508 nos 4 grupos (população miscigenada do Maranhão; Santa Flor-Bequimão, MA; Pontal-Bequimão, MA; Cajual-Alcântara, MA) mostra diferenças significativas entre a amostra tri-híbrida e os caucasóides de Santa Flor, e entre estes e os negróides do Pontal. Essa elevada freqüência de DF508 em Santa Flor pode ser explicada pelo princípio do Efeito do Fundador, considerando-se que este isolado populacional é descendente de portugueses. Uma freqüência menor nos indivíduos miscigenados seria devida à contribuição étnica do índio e do negro africano. Considerando-se a origem étnica da população do Maranhão e dos isolados populacionais aqui estudados, não é surpreendente que as mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X não tenham sido identificadas na população normal. Uma possível explicação para a ausência da mutação 3120+1GÕA nos remanescentes de quilombos seria a região africana da qual vieram os negros para o Maranhão. Na amostra de 21 pacientes maranhenses e 19 araenses, (brancos, miscigenados e negros), a reqüência de DF508 foi de 7,1% (sendo um homozigoto e o outro heterozigoto) e 18,4% (dois homozigotos e três heterozigotos), respectivamente, enquanto a das mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X foi de 0%. A ausência dessas mutações nos afetados é compatível com os achados populacionais. A comparação entre os indivíduos maranhenses e os paraenses não mostrou diferença significativa, portanto a freqüência total de DF508 nessa amostra de suspeitos de FC foi de 12,5%. Esta freqüência está diminuída tanto em relação às populações caucasóides (66%), quanto à encontrada até então para os brasileiros com FC (48,8%). As causas disso seriam: a origem étnica dessa amostra; os pacientes com FC estariam sendo subdiagnosticados ou diagnosticados incorretamente como FC. A comparação da freqüência de DF508 entre os grupos normais a da amostra de suspeitos de FC mostra uma semelhança entre esta última e Santa Flor (comunidade descendente de portugueses). Considerase importante, então, a triagem dessa mutação nesses dois grupos para diagnóstico e aconselhamento genético em famílias com afetados. Além disso, apesar da baixa freqüência de DF508 na população miscigenada e na de suspeitos de FC, ela tem importância na triagem de pacientes maranhenses e paraenses, pois os indivíduos que tiveram um diagnóstico mais conclusivo apresentaram a mutação. O polimorfismo 4002A/G foi detectado em todas amostras de indivíduos normais para FC, mas tem freqüência aumentada em Pontal, inclusive quando se compara a freqüência de Pontal (23,1%) com a da Europa (2,9%). Talvez esse polimorfismo seja mais comum em populações negróides. Entre os pacientes maranhenses e paraenses, o polimorfismo 4002A/G teve freqüências respectivas de 2,4% e 5,3%. Como as duas amostras são estatisticamente semelhantes, a freqüência total foi de 3,7%. A análise estatística mostrou que as freqüências do polimorfismo 4002A/G foi semelhante entre todos os grupos analisados, com exceção de Pontal, onde a freqüência dessa variante encontra-se aumentada. A origem étnica e a ausência de FC poderiam explicar esta diferença. Na amostra do Pontal, todos os indivíduos são negros e normais para FC.

Orientadores: Fabíola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T21:37:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_PauladeMelo_D.pdf: 6042513 bytes, checksum: b12134db0721f177eb0c2116e7fdf5e2 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas (NMP) apresentam como característica comum a ocorrência de proliferação celular exacerbada, mantendo a capacidade de diferenciação mieloide terminal. Em parcela significativa dos casos, a ativação da proliferação celular ocorre pelo aumento da atividade tirosinoquinase de proteínas específicas. Entretanto, a heterogeneidade molecular observada nos pacientes e as respostas clínicas insatisfatórias observadas em parte dos casos com os tratamentos vigentes sugerem que mecanismos adicionais, como interações proteicas não descritas e novas mutações, possam estar envolvidos na fisiopatologia destas neoplasias. Neste trabalho, objetivamos estudar as vias de ativação tirosinoquinase em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) (subprojeto 1), e em mastocitose sistêmica (subprojeto 2). O foco principal do subprojeto 1 consistiu em avaliar, em NMP, a associação JAK2/IRS2, previamente descrita em células não hematológicas após estímulo, bem como o envolvimento de IRS2 em vias de proliferação celular e apoptose. Utilizamos modelos de linhagens celulares leucêmicas humanas com JAK2 mutado (JAK2V617F) e JAK2 selvagem (JAK2WT), submetendo-as a inibição gênica por shRNA entregue por lentivírus e ao tratamento com o inibidor seletivo de JAK1/2 ruxolitinib. As células foram então submetidas à avaliação da viabilidade celular por MTT, e da apoptose por citometria de fluxo (anexina V/PI e caspase-3) e por imunobloting (caspase-3 clivada). A expressão do mRNA de IRS2 foi avaliada por PCR em tempo real em amostras de células CD34+ de sangue periférico de 99 pacientes com diagnóstico de PV, TE e MFP, e em 28 doadores normais. Através de imunoprecipitação e microscopia confocal, observamos a associação constitutiva entre JAK2 e IRS2 nas células JAK2V617F, mas não nas células JAK2WT. Em células JAK2V617F, a inibição de IRS2 por lentivírus diminuiu significativamente a fosforilação de STAT5, reduziu a viabilidade celular, aumentou as taxas de apoptose, e potencializou os efeitos de ruxolitinib. Não houve mudanças nas taxas de viabilidade celular e apoptose nas células JAK2WT inibidas para IRS2. A expressão do mRNA de IRS2 foi significativamente maior nos pacientes com TE em relação aos doadores normais, e em pacientes com NMP portadores da mutação JAK2V617F em relação aos pacientes com JAK2WT. Estas evidências sugerem que IRS2 possa participar das vias de sinalização celular nas NMP através de interação direta com JAK2. A inibição farmacológica de IRS2, isoladamente ou em conjunto com ruxolitinib, é ferramenta potencial no tratamento de pacientes com PV, TE e MFP. No subprojeto 2, nosso objetivo consistiu em investigar mutações no gene KIT em um caso de mastocitose sistêmica familiar seguido em nosso serviço, em que mãe (caso 1) e filha (caso 2) apresentavam extensa infiltração cutânea e da medula óssea por mastócitos, bem como avaliar a sensibilidade dos mastócitos neoplásicos ao tratamento com os inibidores de tirosinoquinase (ITK) imatinibe, dasatinibe e PKC412. Através de sequenciamento por Sanger, identificamos a mutação KITK509I em células de medula óssea total, CD3+ de sangue periférico e mucosa oral de ambas pacientes. Os pais do caso 1 apresentaram KIT selvagem. O tratamento in vitro por 4, 8 ou 12 dias de células totais de medula óssea dos casos 1 e 2 com os ITK avaliados resultou em menor viabilidade celular, avaliada por MTT, e em redução da fosforilação de P70S6K com todas as drogas testadas. Entretanto, apenas o imatinibe evidenciou resposta consistente na indução de apoptose. Foi iniciado tratamento dos casos 1 e 2 com imatinibe 400mg/dia via oral. Três meses após o início, houve normalização da pele e da medula óssea; após dois anos de seguimento, as pacientes mantêm-se em remissão. Embora rara, a mutação KITK509I deve ser pesquisada em todos os casos de mastocitose sistêmica familiar. O imatinibe pode ser considerado como droga de primeira escolha nestes casos / Abstract: The BCR-ABL1 negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by increased cellular proliferation with preserved terminal myeloid differentiation. In most cases, the activation of cell proliferation is caused by an increased tyrosine kinase activity of specific proteins. However, patients' molecular heterogeneity and the incomplete clinical responses observed in part of the cases using the current treatments suggest that additional mechanisms, such as unknown protein interactions and new mutations, can be involved in the pathophysiology of MPN. In this study, our main goal was to investigate tyrosine kinase activation pathways in polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) (subproject 1), and in systemic mastocytosis (subproject 2). The focus of subproject 1 consisted in the investigation of JAK2/IRS2 association in MPN, already described in non-hematological cells following extrinsic stimulus, and in evaluating IRS2 function in MPN cell proliferation and apoptosis. JAK2 wild-type (JAK2WT) and JAK mutated (JAK2V617F) human leukemia cell lines were transduced with lentivirus-mediated shRNA targeting IRS2, and treated with vehicle (DMSO) or with the selective JAK1/2 inhibitor ruxolitinib. Cells were then submitted to evaluation of cell viability (MTT) and apoptosis (anexin V/PI and caspase-3 by flow cytometry, and cleaved caspase-3 by immunoblotting). IRS2 mRNA expression was evaluated by real time quantitative PCR in CD34+ peripheral blood cells of 99 patients with PV, ET and PMF, and in 28 healthy donors. Through immunoprecipitation/immunobloting and confocal microscopy, we observed the constitutive JAK2/IRS2 association in JAK2V617F cells, but not in JAK2WT cell lines. In JAK2V617F, IRS2 silencing significantly decreased phospho-STAT5, reduced cell viability, induced apoptosis, and potentiated the effects of ruxolitinib treatment. No differences in cell viability and apoptosis ratios were observed in IRS2 silenced JAK2WT cells. IRS2 mRNA expression was significantly higher in ET patients when compared to healthy donors, and in patients harboring JAK2V617F mutation in relation to JAK2WT. These evidence suggest that IRS2 participate in MPN cell signaling pathways through its interaction with JAK2. IRS2 pharmacological inhibition, alone or in combination with ruxolitinib, may be a potential tool in the treatment of PV, ET and PMF patients. In subproject 2, our main goal was to seek for KIT mutations in a case of systemic familial mastocytosis, followed in our outpatient clinics, in which the mother (case 1) and the daughter (case 2) had extensive skin and bone marrow infiltration by mast cells. Also, we aimed to evaluate in vitro sensitivity of neoplastic mast cells to the treatment with the tyrosine kinase inhibitors (TKI) imatinibe, dasatinibe and PKC412. Using Sanger sequencing analysis, we identified the KITK509I mutation in total bone marrow, peripheral blood CD3+ and oral mucosa cells in both patients. The parents of case 1 had wild type KIT. The in vitro treatment of total bone marrow cells of cases 1 and 2 with TKI for 4, 8 and 12 days resulted in reduced cell viability, as evaluated by MTT, and in reduced phosphorylation of P70S6K for all tested drugs. However, only imatinibe consistently induced apoptosis in both cases. Patients were started on imatinibe 400mg orally per day. Three months following imatinibe treatment, there was a complete reversion of skin and bone marrow mast cells infiltration; after two years of follow-up, cases 1 and 2 remain in complete remission of the systemic mastocytosis. Although rare, KITK509I mutation should be investigated in all cases of familial systemic mastocytosis. Imatinibe is a good first choice for the treatment of these cases / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emilia Oliveira Alves Costa.pdf: 2624347 bytes, checksum: 633de56159a2dded5fb51871dbe9fd21 (MD5) Previous issue date: 2010-01-12 / The Brazilian radiological accident that occurred in 1987, in Goiânia, it was a terrible radiation episode. As a consequence, hundreds of people were contaminated due to the Cesium-137 radiation. Recently, many studies had shown that genome instabilities, such as, mutations, chromosomal aberrations, micronuclei formation and microsatellite instability and a delay on cellular death are usually reported on mammal cells exposed to ionizing radiation, being considered as a manly risk to humans. Mutations can be spontaneous, and the occurrence is dependent on the organism, or, induced, being associated to mutagenic exposition. Ionizing radiations are an example of physical and mutagenic agents that could harm the cell repair and could cause the development of many types of cancer. The evaluation of the biological effects of the ionizing radiation, in somatic and germline cells, with a consequent determination of the radio-induced mutations, it is extremely important to estimate the genetic risks, manly in population exposed to radiation. The analyses of repetitive DNA sequences have been demonstrated that such sequences are prone to high rates of spontaneous mutations. The minisatellites and microsatellites have been used to demonstrate the induction of germline mutation rates on mouse, humans, among others organisms. The aim of the present study was to analyze the frequency of microsatellite alterations to determine the mutation rates occurred in germ cells of the parents exposed to the ionizing radiation of the Cesium-137. The studied group was constitute of 10 families of individuals accidentally exposed to Cesium-137 and by the control group constituted by 645 healthy individuals who carried out paternity tests on 2009. We found only one mutation of paternal origin in the D8S1179 locus on the exposed group, being the mutation rate of 0.003. In the control group, we found 01 mutation on D16S539 loci and on D3S1358; 02 mutations on Penta E locus; 04 mutations on D21S11 locus and 03 mutations on FGA locus, comprising a total of 11 mutations and a mutation rate of 0.0009. In such context, we did not find significant differences (p= 0.15), indicating a possible exposure effect on the mutation rates of the STR loci, in the group accidentally exposed to Cesium-137. / O acidente radiológico de Goiânia em 1987 foi um grave episódio de contaminação por radioatividade ocorrido no Brasil. Como conseqüência foram contaminadas centenas de pessoas através das radiações emitidas pelo césio 137. Recentemente, vários estudos têm mostrado que instabilidade no genoma, como por exemplo, mutações, aberrações cromossômicas, formação de micronúcleos, instabilidade de microssatélites e atraso na morte celular são comumente relatadas em células de mamíferos expostos à radiação ionizante, sendo consideradas como o principal fator de risco em humanos para o câncer. As mutações podem ser espontâneas, sendo a freqüência de ocorrência dependente do organismo, ou ainda, induzida, podendo ser ocasionadas pela exposição a agentes mutagênicos. As radiações ionizantes são exemplos de agentes físicos e mutagênicos que podem levar ao comprometimento dos mecanismos de reparo celular e ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer. Avaliar os efeitos biológicos da radiação ionizante, em células somáticas e germinativas, com conseqüente determinação da taxa de mutações radioinduzidas, é extremamente importante para a estimativa de riscos genéticos, principalmente em populações expostas à radiação. Análises de seqüências repetitivas de DNA têm demonstrado que estas seqüências são sujeitas a altas taxas de mutações espontâneas. As seqüências minissatélites e microssatélites têm sido usadas para demonstrar satisfatoriamente a indução de mutação germinativa em camundongos, humanos, dentre outros organismos. O objetivo do presente estudo foi analisar a freqüência de alterações em microssatélites para determimar a taxa de mutações ocorridas em células de linhagem germinativa dos progenitores expostos à radiação ionizante do Césio-137. O grupo exposto foi constituído por 10 famílias do grupo 2 e o grupo controle por 645 indivíduos provenientes de exames de vínculo genético realizados em 2010. Foi encontrada um mutação de origem paterna no locus D8S1179 com uma taxa de mutação de 0,003. No grupo controle, foram encontradas 01 mutação no loci D16S539 e no loci D3S1358; 02 mutações no locus Penta E; 04 mutações no locus D21S11 e 03 mutações no locus FGA, compreendendo um total de 11 mutações e uma taxa de mutação de 0,0009. Nesse contexto, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p= 0,15) indicando o efeito da exposição e taxa de mutação em locos STR no grupo acidentalmente exposto ao Césio-137.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença. O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1, parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente a 5\' deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos. Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5\' do promotor basal de TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1 foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas experimentalmente / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among 31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1 noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested

High-level language virtual machines (HLL VMs) have been playing a key role as a mechanism for implementing programming languages. Languages that run on these execution environments have many advantages over languages that are compiled to native code. These advantages have led HLL VMs to gain broad acceptance in both academy and industry. However, much of the research in this area has been devoted to boosting the performance of these execution environments. Few eorts have attempted to introduce features that automate or facilitate some software engineering activities, including software testing. This research argues that HLL VMs provide a reasonable basis for building an integrated software testing environment. To this end, two software testing features that build on the characteristics of a Java virtual machine (JVM) were devised. The purpose of the rst feature is to automate weak mutation. Augmented with mutation support, the chosen JVM achieved speedups of as much as 95% in comparison to a strong mutation tool. To support the testing of concurrent programs, the second feature is concerned with enabling the deterministic re-execution of Java programs and exploration of new scheduling sequences / Máquinas virtuais de linguagens de programação têm desempenhado um papel importante como mecanismo para a implementação de linguagens de programação. Linguagens voltadas para esses ambientes de execução possuem várias vantagens em relação às linguagens compiladas. Essas vantagens fizeram com que tais ambientes de execução se tornassem amplamente utilizados pela indústria e academia. Entretanto, a maioria dos estudos nessa area têm se dedicado a aprimorar o desempenho desses ambientes de execução e poucos têm enfocado o desenvolvimento de funcionalidades que automatizem ou facilitem a condução de atividades de engenharia de software, incluindo atividades de teste de software. Este trabalho apresenta indícios de que máquinas virtuais de linguagens de programação podem apoiar a criação de ambientes de teste de software integrado. Para tal, duas funcionalidades que tiram proveito das características de uma máquina virtual Java foram desenvolvidas. O propósito da primeira funcionalidade e automatizar a condução de atividades de mutação fraca. Após a implementação de tal funcionalidade na máquina virtual Java selecionada, observou-se um desempenho até 95% melhor em relação a uma ferramenta de mutação forte. Afim de apoiar o teste de programas concorrentes, a segunda funcionalidade permite reexecutá-los de forma determinística além de automatizar a exploração de que novas sequências de escalonamento

As maiores taxas de incidência de câncer de mama ocorrem em mulheres idosas, que apresentam tumores com expressão de receptores de estrógeno e/ou progesterona, de baixo estadiamento e menor taxa de proliferação, se comparado com as jovens. Um dos fatores de predisposição ao câncer de mama é mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2, que podem compreender entre 5-10% das pacientes diagnosticadas. A grande maioria dos casos são ditos esporádicos, em que não há como estabelecer um único fator determinante. Dentre o escopo de possíveis causas estão as mutações somáticas, acumuladas no tecido mamário ao longo da vida. A identificação destas mutações permite melhor compreensão da carcinogênese e possibilita a criação de tratamentos cada vez mais personalizados. O gene PIK3CA, por exemplo, já está determinado como driver (responsáveis pela obtenção de vantagem seletiva de um determinado clone) para câncer de mama. As mutações patogênicas que ocorrem neste gene levam a ativação da via de Akt/mTOR, entre outras, que mantém o ciclo celular ativo. Um gene que vem sendo estudado recentemente é o PRKD1, cujas funções parecem estar ligadas à manutenção do fenótipo epitelial das células do tecido mamário. Assim, o objetivo desse trabalho identificar mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2, analisando também o histórico familiar para câncer de mama/ovário/próstata, e mutações somáticas no gene PRKD1 em pacientes pós menopausadas,. Foram incluídas quarenta e nove pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo em idade superior a 54 anos, que preenchessem critérios da NCCN (National Comprehensive Cancer Network) para Síndrome de Câncer de Mama e/ou Ovário Hereditário e tinham disponível um fragmento tumoral emblocado em parafina coletado na ausência de tratamento neo adjuvante. A extração de DNA foi realizada a partir do sangue periférico para sequenciamento de BRCA1 e BRCA2, realizado através da plataforma Ion Torrent(TM) ou pelo método de Sanger. Os resultados obtidos por Ion Torrent(TM) foram analisados, primeiramente, através da ferramenta online Ion Reporter e os de Sanger através do programa Mutation Surveyor v.3.20. Para a caractetização das variantes encontradas foram utilizados: os bancos de dados BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD e ClinVar além dos preditores in silico da conservação dos aminoácidos entre as espécies Polyphen-2, SIF, Provean e AlignGVGD e do preditor de efeito no splicing HSF e bancos de dados de frequência alélica ExAC, 1000 genomas e NHLBI GO Exome Sequencing Project, seguindo os critérios da American College of Medical Genetics and Genomics em conjunto com a Association for Molecular Pathology. Para caracterização de mutação somática do gene PRKD1 determinou-se duas regiões de maior importância para serem sequenciadas: Ser738/Ser742 e Ser910 que fosforilam o domínio quinase da proteína, ativando-o. Vinte e três amostras tumorais tiveram DNA extraído. Também foi realizada uma análise das informações sobre PRKD1 do banco de dados COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) e a construção de curvas de sobrevida (Kaplan-Meier) da expressão de PRKD1 utilizando a ferramenta online KM Plotter. A idade mediana das pacientes foi de 62 anos ao diagnóstico e de 64 anos na época de inclusão no estudo. A maioria tinha tumores de grau histológico II (63,27%), estádio clinico II (20%) e do subtipo luminal B (53,06%). Trinta e duas relataram parentes de primeiro grau afetados com câncer de mama/ovário/ próstata. Trinta e oito pacientes tiveram sequenciamento completo de BRCA1 e BRCA2 por Ion Torrent(TM) e onze tiveram sequenciamento parcial de BRCA1 e BRCA2 por Sanger. Variantes patogênicas foram encontradas em quatro pacientes (BRCA1=2/BRCA2=2). Uma nova variante missense foi identificada em BRCA2: c.3371A > G (p.Q1124R). Para o sequenciamento de PRKD1 quinze foram sequenciadas para Ser910 e de oito foi possível analisar o resultado. Nenhuma variante patogênica foi encontrada. Os dados obtidos sobre PRKD1 no COSMIC foram: de 2773 amostras, em apenas 15 (0,54%) foram identificadas mutações em PRKD1, 46% (7/15) provém de mulheres com idade superior a 55 anos e subtipo molecular Luminal. PRKD1 apresenta maiores frequência de mutação em câncer de intestino grosso (4,22%) e pele (4,02%). As curvas de sobrevida construídas no KM Plotter demonstram a alta expressão do gene parece ter impacto positivo na sobrevida das pacientes. Apesar da baixa frequência de mutações no PRKD1 este gene, outros dados demonstram que parece ter um papel de gene supressor de tumor no câncer de mama, que deve ser inibido de através de outros mecanismos como metilaçao de DNA / The highest rates of breast cancer incidence occur in elderly women, who present estrogen and / or progesterone receptor tumors, with a low clinical staging and lower proliferation rate compared to the young women. One of the factors predisposing to breast cancer is germline mutation in the BRCA1 or BRCA2 genes, which may comprise between 5-10% of the diagnosed patients. The vast majority of cases are said to be sporadic, in which there is no way to establish a single determining factor. Among the scope of possible causes are somatic mutations, accumulated in the breast tissue throughout life. The identification of these mutations allows a better understanding of carcinogenesis and enables the creation of increasingly personalized treatments. The PIK3CA gene, for example, is already determined as a driver (responsible for the selective advantage of a particular clone) for breast cancer. The pathogenic mutations that occur in this gene lead to the activation of Akt / mTOR pathway, among others, which keeps the cell cycle active. One gene that has recently been studied is PRKD1, whose functions seem to be linked to the maintenance of the epithelial phenotype of the mammary tissue cells. Thus, the objective of this work was to identify germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes, also analyzing the family history for breast / ovarian / prostate cancer, and somatic mutations in the PRKD1 gene in postmenopausal patients. Forty-nine patients diagnosed with ipsilateral ductal carcinomas over the age of 54 years who completed NCCN (National Comprehensive Cancer Network) criteria for Breast Cancer and / or Hereditary Ovarian Syndrome and had a tumor paraffin embedded in paraffin collected in the absence of neo adjuvant treatment available. DNA extraction was performed from the peripheral blood for sequencing of BRCA1 and BRCA2, performed through the Ion Torrent (TM) platform or by the Sanger method. The results obtained by Ion Torrent (TM) were first analyzed through the online tool Ion Reporter and those by Sanger through the program Mutation Surveyor v.3.20. The BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD and ClinVar databases were used in addition to the in silico predictors of amino acid conservation among Polyphen-2, SIF, Provean and AlignGVGD species and the effect predictor in the HSF splicing and allelic frequency databases ExAC, 1000 genomes and the NHLBI GO Exome Sequencing Project, following the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics in conjunction with the Association for Molecular Pathology. In order to characterize the somatic mutation of the PRKD1 gene, we determined two regions of greater importance to be sequenced: Ser738 / Ser742 and Ser910 that phosphorylate the protein kinase domain, activating it. Twenty-three tumor samples had DNA extracted. An analysis of PRKD1 information from the COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer) database and the construction of survival curves (Kaplan-Meier) for PRKD1 expression using the online KM Plotter tool was also performed. The median age of the patients was 62 years at diagnosis and 64 years at the time of inclusion in the study. Most of them had tumors of histological grade II (63.27%), clinical stage II (20%) and molecular subtype luminal B (53.06%). Thirty-two reported first-degree relatives affected with breast / ovarian / prostate cancer. Thirty-eight patients had BRCA1 and BRCA2 complete sequencing by Ion Torrent (TM) and eleven had BRCA1 and BRCA2 partial sequencing by Sanger. Pathogenic variants were found in four patients (BRCA1 = 2 / BRCA2 = 2). For PRKD1 sequencing, fifteen patients tumors were sequenced for Ser910 and in eight samples it was possible to analyze the result. No pathogenic variant was found. The data obtained on PRKD1 in COSMIC were: from 2773 samples, in only 15 (0.54%) mutations were identified in PRKD1, 46% (7/15) came from women aged over 55 years and had tumor molecular subtype Luminal. PRKD1 shows higher mutation frequency in cancer of the large intestine (4.22%) and skin (4.02%). The survival curves constructed in KM Plotter demonstrate the high expression of the gene seems to have a positive impact on the patients survival . Despite the low frequency of mutations in PRKD1 gene, other data demonstrate that it appears to play a role of tumor suppressor gene in breast cancer, which must be inhibited by other mechanisms such as DNA methylation