O fosfato inorgânico é um composto essencial por estar relacionado com diversos processos metabólicos e biossíntese de moléculas relevantes à sobrevivência celular. Em bactéria são conhecidos dois tipos principais de transportadores específicos de fosfato inorgânico, o sistema Pit, de baixa afinidade, e o sistema Pst de alta afinidade, um ABC transportador, ativado sob carência de fosfato extracelular. A interação deste sistema com a fisiologia e patogênese de Streptococcus mutans, o principal agente etiológico da cárie dental, foi estudada neste trabalho. Os genes que codificam o sistema Pst de S. mutans UA159, estão organizados em um óperon policistrônico (pstS, C1, C, B, smu.1134 e phoU). A análise das sequências de aminoácidos das proteínas do sistema Pst de S. mutans com ortólogos do gênero Streptococcus, demonstrou maior identidade com bactérias da cavidade oral. Análise de prevalência do gene pstS, que codifica a proteína ligadora, demonstrou conservação entre todas as cepas laboratoriais e clínicas avaliadas. A deleção de pstS reduziu a capacidade de incorporação de ortofosfato que se refletiu na diminuição da taxa de replicação celular em meios com diferentes concentrações de fosfato inorgânico. A mutação também reduziu a capacidade da bactéria em aderir à superfícies abióticas e diminuiu sua hidrofobicidade de superfície, além de aumentar a resistência intrínseca a ácido. No entanto, não houve alteração na eficiência de transformação bacteriana. Por fim, o gene pstS de S. mutans foi clonado, expresso e a proteína purificada utilizada para obter anticorpos que inibiram o crescimento de S. mutans in vitro. Deste modo, segere-se que o sistema Pst é relevante na fisiologia e patogênese de S. mutans. / Inorganic phosphate is an essential compound related to several metabolic process and biosynthesis of molecules relevant to cellular survival. Bacteria are known to posses two main types of specific inorganic phosphate transporters, the low-affinity Pit system, and the high affinity Pst system, an ABC transporter family constituent, activated by extracellular phosphate starvation. The aim of this work was to study the role of Pst system in physiology and pathogenesis of Streptococcus mutans, the main etiological agent of dental caries. The genes of the Pst system of S. mutans UA159, are organized in a polycistronic operon (pstS, C1, C, B, smu.1134 and phoU). The amino acid sequence analysis of Pst proteins of S. mutans related to orthologs of Streptococcus genus, showed the highest identity value when compared to oral cavity bacteria. The PstS binding protein was present in all tested clinical and laboratory strains of S. mutans. The pstS mutant showed a decreased capacity of ortophosphate uptake which leaded to growth deficiency in different phosphate concentrations. The mutation also reduced the bacteria adherence to abiotic surfaces and the hydrophobicity of the cell surface, diverging from the increase the intrinsic acid resistance. Otherwise, there was no change in the bacterial transformation eficiency. Finally, the S. mutans pstS gene was cloned, expressed and the purified protein was used to obtain antibodies that inhibited the growth of S. mutans in vitro. Taking together, these results suggesting that the Pst transport system is relevant to S. mutans physiology and pathogenesis.

A doença de Wilson, moléstia hereditária, caracteriza-se pela deficiência de excreção de cobre pelo fígado, originária da mutação do gene ATP7B. As manifestações neurológicas na doença de Wilson são pleomórficas, observando-se distúrbios do movimento com início insidioso e em idade variável - geralmente na segunda ou terceira décadas de vida. Este estudo, dividido em duas partes, descreve as manifestações neurológicas iniciais em 119 pacientes com doença de Wilson (93 casos-índice e 26 familiares acometidos), avaliados entre 1963 e 2004 dos quais 109 foram através de análise retrospectiva dos prontuários médicos, enquanto aos 10 pacientes restantes se dispensou avaliação clínica prospectiva, a partir de 2002. O início dos sintomas ocorreu na média etária dos 19,4 anos (7-37), e o tempo médio do surgimento dos sintomas ao diagnóstico de 1,1 +/- 1,2 anos (0-5 anos). Entre as manifestações neurológicas mais freqüentes, observaram-se: disartria (91%), distúrbios da marcha (75%), risus sardonicus (72%), distonia (69%), rigidez (66%), tremor (60%) e disfagia (50%). A incidência das manifestações coréia e atetose, 16% e 14%, respectivamente, foi baixa. Manifestações atípicas incluíram convulsões (4,2%) e sinais piramidais (3%). A segunda parte do estudo trata da investigação do genótipo ATP7B em 41 pacientes e suas possíveis correlações com o fenótipo neurológico. Encontraram-se 23 mutações distintas, a mais comum das quais (p.A1135fs) com freqüência alélica de 31,7%. Expressiva associação (p<0,05) se deu entre essa mutação e a manifestação disfagia, ainda que limitada por amostra restrita de pacientes. Também sugestiva foi a associação entre a mutação p.A1135fs e quadros neurológicos precoces e graves. Este é o primeiro estudo a comparar o genótipo ATP7B com as manifestações neurológicas na doença de Wilson / Wilson disease, a rare inborn metabolic error, is characterized by deficient hepatic copper excretion, due to mutations in ATP7B gene. Neurological manifestations may vary, although there is commonly a movement disorder starting in the second or third decade of life. This study is divided in two parts, and it describes the neurological manifestations in 119 patients with Wilson disease (93 index cases and 26 affected family members), which were seen between 1963 and 2004 a retrospective analysis in 109 medical records and prospective clinical evaluation in 10 patients since 2002. The average age of symptoms onset was 19.4 years (ranging from 7 - 37 years), and the mean time between the first symptom and diagnosis was 1, 1 +/- 1, 2 years. The most frequent neurological manifestations observed were: dysarthria (91%), gait disturbance (75%), risus sardonicus (72%), dystonia (69%), rigidity (66%), tremor (60%), and dysphagia (50%). Less frequent manifestations were chorea (16%), and athetosis (14%). Rare neurological presentations were seizures (4,2%), and pyramidal signs (3%). In the second part of this study, we ascertain ATP7B genotype correlations with distinct neurological phenotypes in 41 Wilson disease patients. A total of 23 distinct mutations were detected, and the p.A1135fs frameshift had the highest allelic frequency (31.7%). An association between a p.A1135fs mutation and dysphagia was detected (p<0, 05), but the limited number of patients restricts valuable conclusions. This analysis also suggests an association between this mutation and early and severe neurological presentation. This present study is the first one to evaluate an ATP7B genotype correlation with specific neurological profile in Wilson disease

A Síndrome de Van der Woude (VWS) se caracteriza pela presença de fossetas congênitas no lábio inferior, associadas ou não à presença de fissura de lábio e/ou palato. Esta entidade é a forma sindrômica mais comum nos pacientes portadores de fissura labiopalatal, mesmo assim, ela é subdiagnosticada. Após o seqüenciamento do DNA, no ano de 2001, houve um aumento no interesse e no desenvolvimento de pesquisas na área de Genética Molecular Humana. Em 2002, pesquisadores identificaram no cromossomo 1, o gene IRF6 como sendo o responsável pela VWS. Neste trabalho, foram utilizados e analisados os prontuários de pacientes cadastrados e portadores da VWS do Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais - HRAC - USP, juntamente com seus familiares em primeiro-grau portadores de fissura de lábio e/ou palato, com ou sem fossetas, totalizando 22 pacientes. Foram realizados exames clínicos e radiográficos, medidas antropométricas, sialometria e heredograma de todos os pacientes. Os resultados obtidos foram confrontados com os dados resultantes do estudo genético e molecular realizado por LIMA (2005), em sua tese de Doutorado. Observamos que os achados bucais são bastante comuns no fenótipo da VWS, já que em nossa amostra tivemos 68,20% dos pacientes com alguma anomalia dentária do desenvolvimento e 45,45% dos portadores da síndrome apresentavam pelo menos ausência de um dente. Sendo assim, o cirurgião-dentista tem importância chave tanto no diagnóstico e na avaliação bucal, quanto no tratamento dos pacientes portadores da VWS. / The Van der Woude syndrome (VWS) is characterized by the presence of congenital lower lip pits associated or not to cleft lip and/or palate. This disorder is the most common syndrome affecting patients with cleft lip and palate; despite of that, it is underdiagnosed. After DNA sequencing in 2001, there was an increase in the interest and development of studies on Human Molecular Genetics. In 2002, investigators identified the gene IRF6 on chromosome 1 as being responsible for the VWS. The present study comprised analysis of records of patients with VWS registered at the Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies - HRAC - USP, as well as their first-degree relatives with cleft lip and/or palate without lip pits, adding up to 22 patients. Analysis comprised clinical and radiographic examinations, anthropometric measurements, salivary flow rate and genealogy of all patients. The results were compared with data on genetic and molecular investigations conducted in the PhD thesis of LIMA (2005). The oral findings in the present sample are very common in the phenotype of VWS, since 68.20% of patients had some type of developmental dental anomaly, and agenesis of at least one tooth was observed in 45.45% of patients. Therefore, dental professionals play a fundamental role in the diagnosis, oral examination and treatment of patients with VWS.

Submitted by Ana Paula Florentino Santos Pires (anapaulapires@fdv.br) on 2018-08-15T00:33:20Z No. of bitstreams: 1 CARLA RODRIGUES FERREIRA.pdf: 743632 bytes, checksum: a2af9561811859f3593528c5bdb05f52 (MD5) / Rejected by Ana Paula Galdino (repositorio@fdv.br), reason: a) não inserir ponto final após a indexação das palavras-chaves on 2018-08-15T11:59:14Z (GMT) / Submitted by Ana Paula Florentino Santos Pires (anapaulapires@fdv.br) on 2018-08-15T16:58:28Z No. of bitstreams: 1 CARLA RODRIGUES FERREIRA.pdf: 743632 bytes, checksum: a2af9561811859f3593528c5bdb05f52 (MD5) / Rejected by Ana Paula Galdino (repositorio@fdv.br), reason: a) Corrigir descrição de membro da banca - Carvalho Netto, Menelick de b) Corrigir referência bibliográfica da dissertação. (existe algum carácter "colado". Verificar) on 2018-08-15T19:35:34Z (GMT) / Submitted by Ana Paula Florentino Santos Pires (anapaulapires@fdv.br) on 2018-08-15T21:35:29Z No. of bitstreams: 1 CARLA RODRIGUES FERREIRA.pdf: 743632 bytes, checksum: a2af9561811859f3593528c5bdb05f52 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Galdino (repositorio@fdv.br) on 2018-08-17T17:57:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CARLA RODRIGUES FERREIRA.pdf: 743632 bytes, checksum: a2af9561811859f3593528c5bdb05f52 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CARLA RODRIGUES FERREIRA.pdf: 743632 bytes, checksum: a2af9561811859f3593528c5bdb05f52 (MD5) Previous issue date: 2007-03-23 / A presente pesquisa tem por escopo investigar a possibilidade de superação das cláusulas pétreas. Para tanto, recorre precipuamente à análise da linguagem e dos mecanismos informais de mudança na Constituição. Em atenção à Semiótica (Teoria geral dos signos), observa seus três planos: o sintático, o semântico e o pragmático, assim como os diferentes níveis de linguagem, para posteriormente, relacioná-los ao direito. Assevera que o direito é constituído por linguagem, e com ela trabalha a todo tempo, uma vez que recorre, sempre, à interpretação de seus preceitos. Do conceito de normas jurídicas, retira a idéia de que estas se consubstanciam nas proposições prescritivas, de forma que são extraídas do texto de direito positivo pelo intérprete. Com intuito de se adentrar no cerne da discussão, busca discorrer acerca da mutação constitucional por interpretação, que consiste em um processo de mudança informal da Constituição que altera o sentido de seu texto, deixando-o formalmente incólume. Enfatizando a investigação acerca da mutação constitucional por interpretação constitucional judicial, observa que os juizes e tribunais, quando aplicam a Constituição, criam direito (já que a atividade jurisdicional é enunciação), pois, a norma jurídica é a proposição, ou seja, a idéia suscitada na mente humana pelo texto legal, e não o próprio enunciado prescritivo. Dessa forma, temos que as cláusulas pétreas podem ser analisadas como enunciados prescritivos, configurando-se como verdadeiros obstáculos intransponíveis ao poder de reforma; e como proposições, caso em que podem ser suplantadas, desde que o intérprete respeite a elasticidade do texto normativo e não afronte o espírito da Constituição. Bastando, para tanto, que se dê nova significação aos seus enunciados, adequando-os às necessidades e aos anseios sociais. / The present research’s finality is to investigate the possibility of the petrified clauses’ overrule. For this, it recurs initially to the analysis of the language and of the informal mechanisms of alteration of the Constitution. The research, in attention to the Semiotics (the General Theory of the Signs), observes its three levels: the syntactic, the semantic and the pragmatic, as well as the different levels of language, to properly relate them to the Juridical Science. Also asseverates that the law system is constituted by the language, and that it works with the language all the time, since it recurs, always, to the interpretation of the language’s principles. Of the concept of the juridical norms, captures the idea that they consubstantiate in the prescriptive propositions, in such a way that they are extracted from the legal text by the interpreter. With the intent to enter in the discussion’s core, the research discourses about the constitutional mutation by interpretation, which consists in a process of informal change of the Constitution that modifies the meaning of its text, but letting it formally untouched. Emphasizing the investigation about the constitutional mutation by the judicial interpretation of the Constitution, observes that the judges and Courts, when applying the Constitution, create rights (once the jurisdictional activity is enunciation), for the juridical norm is the proposition, the idea generated in the human mind by the legal text, and not the legal text itself. In this way, we can conclude that the petrified clauses can be analyzed as legal text, configuring truly insurmountable obstacles to the reforming power; and as propositions, in which case they can be overruled, as long as the interpreter respects the inner elasticity of the normative text and do not affronts the spirit of the Constitution. In order to accomplish that, it’s only necessary to give new signification to the Constitution’s enunciations, adjusting them to the needs and the aspirations of the society.

Submitted by Leticia Alvarenga (leticiaalvarenga@fdv.br) on 2018-08-31T17:01:40Z No. of bitstreams: 1 RAFAEL HENRIQUE GUIMARÃES TEIXEIRA DE FREITAS.pdf: 880308 bytes, checksum: 73af24e07489bb4ae2de6901de4ff1f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Galdino (repositorio@fdv.br) on 2018-09-03T20:25:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RAFAEL HENRIQUE GUIMARÃES TEIXEIRA DE FREITAS.pdf: 880308 bytes, checksum: 73af24e07489bb4ae2de6901de4ff1f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-03T20:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RAFAEL HENRIQUE GUIMARÃES TEIXEIRA DE FREITAS.pdf: 880308 bytes, checksum: 73af24e07489bb4ae2de6901de4ff1f2 (MD5) Previous issue date: 2014-03-13 / Em um contexto de grande participação do Poder Judiciário no cenário político, o presente trabalho propõe-se a analisar a atuação do Supremo Tribunal Federal brasileiro na ocorrência do fenômeno da mutação constitucional. Para tanto, será realizada inicialmente digressão acerca do fenômeno da mutação constitucional, desde a constatação de sua existência, passando pelas principais contribuições de estudiosos sobre o tema na elaboração da classificação do instituto em categorias, com destaque para a que melhor se enquadra ao nosso sistema jurídico. Dentre as categorias delimitadas a análise dará ênfase à discussão crítica do legítimo papel do Supremo Tribunal Federal na ocorrência da mutação constitucional por interpretação traçando, para tanto, o limite de sua participação no contexto do Estado Democrático de Direito. Estabelecidas as premissas teóricas, serão analisados dois julgados do Tribunal Constitucional que trataram da efetivação de direitos e garantias fundamentais, quais sejam: o julgamento do RE 466.343/SP que decidiu pela inconstitucionalidade da prisão do depositário infiel (artigo 5º, inciso LXVII da CF) e a da ADI 4722/DF que equiparou as relações estáveis homoafetivas às heteroafetivas. Ao final, o presente trabalho propõe-se a concluir se nos aludidos julgamentos do Supremo Tribunal Federal ocorreu o fenômeno da mutação constitucional ou, ao contrario, trataram-se de decisões inconstitucionais. / In a context of great involvement of the judiciary in the political scenario, this paper proposes to analyze the performance of the Brazilian Supreme Court in the occurrence of the constitutional mutation. To do so, it will be initially performed digression on the phenomenon of constitutional mutation, since the discovery of its existence, through the main contributions of scholars on the subject in the development of the classification of the institute into categories, especially the one that best fits our legal system. Among the specific categories analysis will emphasize the critical discussion of the legitimate role of the Supreme Court in the occurrence of constitutional interpretation by mutation mapping, therefore, the limit of its participation in the context of a democratic state. Established the theoretical assumptions will be analyzed two rulings of the Constitutional Court dealt with the enforcement of fundamental rights and guarantees, which are: the trial of RE 466.343/SP which decided for the unconstitutionality of arrest of a unfaithful trustee (Article 5, paragraph LXVII of CF) and ADI 4722/DF that equalized stable homoaffectives relationships with the heteroaffetives ones. In the end, this paper proposes to conclude whether in the aforementioned rulings of the Supreme Court the phenomenon of constitutional mutation occurred or, on the contrary, they were unconstitutional decisions.

Orientador: Rafael Henrique Nóbrega / Resumo: A decisão se a gônada indiferenciada irá se desenvolver em um testículo ou um ovário é uma etapa crítica na diferenciação sexual dos vertebrados. Este processo consiste em uma complexa cascata gênica que culmina na diferenciação das células somáticas presente na gônada indiferenciada. Neste sentido, o hormônio anti-Mülleriano é um importante efetor nesta decisão. Estudos com o peixe medaka mutante hotei, no qual o receptor do Amh tipo 2 (amhrII) é mutado, mostram elevado índice gonadossomático, e reversão sexual de macho para fêmea. Com base nestas informações, acredita-se que o Amh possa regular o número de células germinativas e diretamente ou indiretamente este fato pode influenciar na decisão da gônada bipotencial em se tornar um testículo ou ovário. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi de se avaliar a sinalização do Amh durante a diferenciação sexual no medaka. Para tanto, estudos de perda de função gênica foram empregados, no qual o gene amh foi deletado através do sistema CRISPR/Cas9. Também foi avaliada a expressão dos genes que atuam na janela de diferenciação sexual por RT-qPCR. Inicialmente, identificamos dois tipos de mutação nos animais heterozigotos (amh (-/+) da F1. A mutação mais interessante foi a deleção de 759 pares de base entre os exons 6 e 7 que compreende parte dos domínios Amh_N e TGF-β. Na geração F2, os mutantes homozigotos amh (-/-) machos XY apresentaram 100% de reversão sexual para fêmeas fenotípicas. Além disso os animais amh (-/-) ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The decision whether the undifferentiated gonad will develop in a testicle or an ovary is a critical step in the sexual differentiation of vertebrates. This process consists of a complex genetic cascade that culminates in the differentiation of the somatic cells present in the undifferentiated gonad. In this context, the anti-Müllerian hormone is an important effector in this decision. Studies with the medaka hotei fish, in which the Amh type 2 receptor (amhrII) is mutated, show high gonadosomatic index, and sexual reversion from male to female. Based on this information, it is postulated that the Amh regulates the number of germ cells, and directly or indirectly this fact may influence the decision of the bipotential gonad to become a testicle or ovary. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the signaling of Amh during sexual differentiation in medaka. For that, studies of loss of gene function were employed, in which the amh gene was deleted through the CRISPR / Cas9 system. We also evaluated the expression of genes that act in the window of sexual differentiation by RT-qPCR. We initially identified two types of mutation in F1 heterozygous (amh -/+) animals. The most interesting mutation was the deletion of 759 base pairs between exons 6 and 7 which comprises part of the Amh_N and TGF-β domains. In the F2 generation, the homozygous amh (-/-) mutants XY males presented 100% of sexual reversion. In addition, the amh (-/-) animals presented gonadal hyper... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Klebsiella pneumoniae (KP) pertence à família Enterobacteriaceae e é frequentemente isolada em infecções nosocomiais, reportada globalmente como uma das mais importantes causas de bacteremias. O seu tratamento usual com β-lactâmicos foi posto a prova na década de 80, com o surgimento de cepas produtoras de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), e posteriormente com as carbapenemases, como sua principal representante Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), capazes de hidrolisar todos os β-lactâmicos. Apesar das limitadas opções, em geral as Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC (KP-KPC) apresentam susceptibilidade às polimixinas, aminoglicosídeos e tigeciclina, que são comumente aplicadas em regimes terapêuticos combinados, dependente dos perfis de sensibilidade ou resistência a estas drogas, mas dos quais ainda não há informações suficientes para a definição do tratamento mais adequado. A escassez de opções terapêuticas é um dos fatores que contribuem para os altos índices de mortalidade das infecções por K. pneumoniae, de cerca de 40%. Assim, se fazem necessárias avaliações dos perfis fenotípicos de isolados de KP-KPC e a caracterização da disseminação deste mecanismo de resistência, avaliando a presença de perfis clonais relacionados dentro da população. A partir deste cenário, os objetivos deste trabalho foram determinar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) frente à polimixina B (PMB), meropenem (MEM) e tigeciclina (TGC), os perfis de sensibilidade frente a outras drogas comumente utilizadas no tratamento destas infecções, assim como caracterizar molecularmente as amostras resistentes à PMB. Para a determinação das CIMs e dos perfis de susceptibilidade foram utilizadas as técnicas de microdiluição em caldo e disco-difusão, respectivamente, e o perfil molecular foi analisado através de técnica de macrorestrição de DNA seguida por PFGE. Foram incluídas neste estudo 158 amostras isoladas de corrente sanguínea, de quatro hospitais terciários de Porto Alegre. Destas 158 amostras, nenhuma foi sensível a MEM de acordo com o Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), 118 (74,7%) a PMB utilizando a recomendação do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), e 94 (59.5%) à TGC considerando EUCAST ou 137 (86.7%) de acordo com o Food and Drug Administration (FDA). Um total de 48 (30.4%), 28 (17.7%) e 16 (10.1%) isolados foram considerados sensíveis à amicacina (AMK) de acordo com CLSI, EUCAST e USCAST, respectivamente, e 11 (7.0%), 9 (5.7%) e 9 (5.7%) reportados como sensíveis à gentamicina (GEN) de acordo com CLSI, EUCAST e USCAST, respectivamente. Doxiciclina foi o antimicrobiano mais ativo (24, 60.0%) frente aos 40 (25,3%) isolados resistentes a PMB. Destes 40 isolados, 29(72.5%) foram caracterizados molecularmente sendo encontrados 18 clones, dos quais cinco perfis clonais foram identificados em mais de um hospital. Neste estudo, pudemos demonstrar um importante aumento nos níveis de resistência às polimixinas, acompanhado por um desafiador perfil de susceptibilidade frente as outras opções terapêuticas disponíveis, ainda que os índices de sensibilidade destas drogas variem de acordo com os pontos de corte de cada comitê. Quanto à caracterização molecular, a detecção de dezoito clones diferentes e a presença do mesmo perfil em mais de um hospital provavelmente estão associadas à emergência de resistência mediada por mutações, assim como a um processo de disseminação horizontal. / Klebsiella pneumoniae (KP) belongs to the family Enterobacteriaceae and is frequently isolated in nosocomial infections, reported globally as one of the most important causes of bacteremia. Its usual β-lactam treatment was challenged in the 1980s with the emergence of extended-spectrum β-lactamase producing (ESBLs) strains, and later with carbapenemases, as its main representative Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), capable of hydrolyze all β-lactam. Despite the limited options, KPC-producing Klebsiella pneumoniae (KPC-KP) are generally susceptible to polymyxins, aminoglycosides and tigecycline, which are commonly applied in combination therapy regimens depending on levels of sensitivity or resistance to these drugs, but of which there is still insufficient information to define the most appropriate treatment. The scarcity of therapeutic options is one of the factors that contribute to the high mortality rates of K. pneumoniae infections, of around 40%. Thus, it is necessary to evaluate the phenotypic profiles of KPC-KP isolates and the characterization of the dissemination of this resistance mechanism, evaluating the presence of related clonal profiles within the population. From this scenario, the objectives of this study were to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) against polymyxin B (PMB), meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) by broth microdilution and the susceptibility profiles to aminoglycosides and other drugs by disk-diffusion method, as well as to evaluate the molecular profile of KPC-KP isolates from four tertiary hospitals in Porto Alegre. A total of 158 samples were included in this study, where none were sensitive to MEM according to the Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), 118 (74.7%) to PMB using the recommendation of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), and 94 (59.5%) to TGC considering EUCAST or 137 (86.7% %) according to Food and Drug Administration (FDA). A total of 48 (30.4%), 28 (17.7%) and 16 (10.1%) isolates were considered susceptible to amikacin (AMK) according to CLSI, EUCAST and USCAST, respectively, and 11 (7.0%), 9 %) and 9 (5.7%) reported as sensitive to gentamicin (GEN) according to CLSI, EUCAST and USCAST, respectively. Doxycycline was also the most active antimicrobial (24, 60.0%) against 40 (25.3%) PMB resistant isolates. Of these 40 isolates, 29 (72.5%) were clonally related, resulting in 18 clones, where five profiles were identified in more than one hospital. In this study, we could demonstrate an important increase in the levels of resistance to polymyxins, accompanied by a challenging profile of susceptibility to other drugs, although the sensitivity indexes of the latter vary significantly according to the breakpoints of each committee. As for molecular characterization, the detection of eighteen different clones and the presence of the same profile in more than one hospital are probably associated with the emergence of resistance mediated by mutations, as well as a process of horizontal dissemination.

PROCESS algebras are a family of techniques used in formal specification and analysis of computer systems, specially when independent processes that perform and synchronize in parallel are concerned. The so-called concurrent systems. Circus is a process algebra that aggregates the expressiveness power for concurrent behaviors from CSP, along with the predicative data modelling aspects of Z. Recent publications have established a formal exhaustive symbolic testing theory for specifications modelled in Circus. Aiming to improve the feasibility of applying such tests in practical scenarios, it is convenient to look for criteria that reduces the number of test cases which, by the exhaustive nature of the approach, is often infinite. In the light of this, the work we present proposes the application of mutation testing techniques in Circus specifications, targeting the coverage of faults seeded by well-known mutation operators, along with operators designed with the particularities of the language in mind. Some contributions were produced in the pursuit of these goals, such as establishing a formal theory for mutation testing in Circus specifications and the implementation of a symbolic traces generator for the language. / ÁLGEBRAS de processos são uma família de técnicas de especificação e análise formal utilizadas em sistemas computacionais, especialmente em contextos de processos independentes, que atuam paralelamente e efetuam comunicação entre si. São os chamados sistemas concorrentes. Circus é uma álgebra de processos que agrega a capacidade de expressão de comportamentos concorrentes do CSP com a modelagem predicativa de dados da notação Z. Trabalhos recentes vêm estabelecer uma teoria para o teste simbólico exaustivo baseado em especificações modeladas em Circus. Com o objetivo de viabilizar a aplicação prática desses testes, é conveniente estudar critérios que reduzam o conjunto de casos de teste que, pela sua natureza exaustiva, torna-se frequentemente infinito. Neste sentido, o presente trabalho propõe a aplicação de técnicas de teste de mutação à partir de especificações Circus, visando a cobertura de falhas inseridas por meio de operadores de mutação já conhecidos, juntamente com operadores propostos especificamente para a linguagem. Algumas contribuições foram produzidas na busca destes objetivos, como o estabelecimento de uma teoria formal para a aplicação de teste de mutação em especificações Circus e a implementação de um gerador de rastros simbólicos para a mesma linguagem.

O ciclo de vida de Dictyostelium discoideum é composto de duas fases independentes. Durante o crescimento vegetativo, as amebas crescem isoladas até que a fonte de nutrientes seja esgotada. A carência nutricional induz sua entrada num processo de desenvolvimento, que inclui a parada do crescimento, a agregação das células e a formação de um organismo multicelular onde as células se diferenciam em esporos que sobrevivem as condições desfavoráveis. A proteína quinase YakA é requerida para a transição entre o crescimento e o desenvolvimento. YakA regula os níveis da PKA. Mutantes yakA- apresentam o crescimento acelerado, são deficientes no processo de agregação e são hiper-sensíveis a estresse oxidativo e nitrosoativo. Uma mutação em um segundo sítio em keaA, suprime a morte induzida por SNP (um gerador de óxido nítrico) no mutante yakA-. O papel de keaA foi determinado em resposta a estresse oxidativo, nitrosoativo e carênica nutricional. O gene keaA é necessário para o crescimento e desenvolvimento. Uma mutação em keaA confere resistência a estresse nitrosoativoloxidativo confirmando que uma mutação em keaA confere resistência a estresse. Um segundo supressor da morte induzida por SNP no mutante yakA- foi isolado pela mesma técnica de REMI e identificado como pkaC um regulador da resposta a estresse. YakA e PKA integradam a resposta a vários estresse em Dictyostelium. Os resultados indicam que a yakA regula a parada do ciclo celular em resposta a estresses através da modulação de keaA. keaA regula, por sua vez, a expressão da pkaC, um regulador chave da produção de cAMP e do processo de desenvolvimento. A interação gênica entre estes elementos é complexa e deve ser ajustada para permitir que as células sobrevivam a mudanças ambientais encontradas durante o seu ciclo de vida. / Dictyostelium discoideum\'s life cycle is composed of two phases. During the vegetative phase, amoebae grow as single cells until the nutrients are depleted. Starvation induces a developmental program where isolated amoebae adopt a multicellular mode of living and differentiate into spores to survive the harsh conditions. The protein Kinase YakA is required for the growth to development transition. YakA regulates the leveis of PKA. yakA null cells have a faster cell cycle, are aggregation deficient and are hypersensitive to nitrosoative/oxidative stress. A second-site mutation in keaA, supresses the death induced by SNP, a generator of nitric oxide. The role for keaA has been determined in response to oxidative, nitrosoative and nutrient starvation stresses. keaA is required for proper growth and development. The keaA- cells are more resistant to nitrosoative and oxidative stress confirming that a mutation in keaA confers stress resistance. A second supressor of the death induced by SNP in the mutant yakA- was isolated with REMI and identified pkaC as a regulator of the nitrosoative stress response. YakA and PKA may integrate the responses to several stresses in Dictyostelium. The results indicate that yakA regulates the cell cycle arrest in response to stress through the modulation of keaA. KeaA regulates the expression of pkaC, a key regulator of cAMP prodution and development. Genetic interactions among these elements is complex and must be finely tuned in the many environmental changes cells endure during the life cycle.

Introdução: Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 são responsáveis por cerca de 50% dos casos de câncer de mama e/ou ovário hereditários. Atualmente não conhecemos o perfil de mutações destes genes na população brasileira, com exceção de mutações fundadoras que ocorrem em grupos étnicos específicos. Objetivos: Detectar mutações e polimorfismos nos genes BRCA1 e BRCA2 em 73 pacientes com câncer de mama selecionadas para o teste genético. Casuística e métodos: Realizamos o sequenciamento direto e o teste de MLPA para os genes BRCA1 e BRCA2 em 73 indivíduos, sendo 63 pacientes com câncer de mama com risco maior ou igual a 10% de acordo com os critérios de Frank, Evans e BRCAPRO, dois pacientes com câncer de ovário e oito indivíduos saudáveis com forte histórico familiar de câncer ligado a mutações em BRCA1 e/ou BRCA2. Resultados: Encontramos 60 mutações no gene BRCA1: 13 alterações missense (incluindo a deletéria R71G), sete mutações sinônimas, uma mutação frameshift (a deletéria 5382insC), uma mutação nonsense (a deletéria R1751X), uma deleção in frame, uma alteração 3UTR e 36 variantes intrônicas. Em BRCA2 encontramos 57 mutações, entre as quais 26 mutações missense, uma alteração 5UTR, 11 mutações sinônimas, 14 variantes intrônicas, duas mutações nonsense (as deletérias R2318X e R3128X) e três mutações frameshift deletérias (5844del5, 6633del5 e 6610insTT). Nenhuma mutação foi detectada pelo teste de MLPA. Discussão e considerações finais: Nove de 73 indivíduos estudados são portadores de mutações deletérias, sendo que a mutação fundadora Ashkenazi 5382insC foi encontrada em duas pacientes não aparentadas e que outro grupo de pesquisa já reportou sua alta frequência numa população paulistana. As alterações de significado clínico desconhecido foram encontradas em toda a extensão dos genes BRCA1 e BRCA2 e são inúmeras. Algumas apareceram em somente uma paciente, o que nos leva a pensar que talvez uma ou algumas destas mutações tenham algum efeito patogênico, como a mutação 6610insTT, que gera uma proteína incompleta e foi encontrada em três gerações de uma família. A técnica de MLPA não detectou grandes rearranjos em ambos os genes, mostrando que este tipo de alteração genética não é freqüente em nossa coorte e que talvez esta seja uma característica mais prevalente em populações menos miscigenadas. Salientamos, portanto, a importância de ampliar este estudo e de estimular pesquisas futuras, visando um aconselhamento genético eficiente, com a diminuição do número de casos inconclusivos gerados pelas variantes de significado indeterminado e o acompanhamento clínico das famílias / Introduction: Mutation in BRCA1 and BRCA2 genes are responsible for more than 50% of hereditarian breast and ovarian cancer cases. Nowadays, we still dont know the Brazilian mutation profile for these genes, except when founder mutations occur in specific ethnic groups. Objetives: Detection of mutation and polymorphisms in BRCA1 and BRCA2 genes in 73 breast cancer patients selected for genetic testing. Casuistic and methods: we have realized direct sequencing of BRCA1 and BRCA2 in 73 patients, whose 63 have had breast cancer and showed at least 10% of risk according to Frank, Evans and BRCAPRO, two patients with ovarian cancer and eight healthy individuals of strong family history of cancer linked to mutations in BRCA1 and BRCA2. Results: We have found 60 mutations in BRCA1: 13 missense mutations (including the deleterious R71G), seven synonymous mutations, one frameshift mutation (the deleterious 5382insC), one nonsense mutation (the deleterious R1751X), one in-frame deletion, one 3UTR mutation and 36 intronic variants. In BRCA2 we have found 57 mutations: 26 missense mutations, one 5UTR mutation, 11 synonymous mutations, 14 intronic variants, two nonsense mutations (the deleterious R2318X and R3128X) and three frameshift mutations (5844del5, 6610insTT and 6633del5). No mutation was detected by MLPA technique. Discussion and final considerations: Nine of 73 studied individuals carry deleterious mutations. Among them, the Ashkenazi founder mutation 5382insC has been found in two unrelated patients and it was previously reported by another research group for its high prevalence on a population from São Paulo. Alterations of unknown clinical significance have been found all over BRCA1 and BRCA2 gene extension and are countless. Some of them are shown only in one patient, leading us to think that maybe one or a few might have a pathogenic effect, like 6610insTT, which leads to a BRCA2 incomplete protein and was shown in 3 generations of a family. MLPA technique have not detected large genomic rearrangements in both genes, showing that this kind of mutation is not frequent on our cohort and maybe this genetic alteration characterizes less miscigenated populations. So, we emphasize the importance of enlarge this study and stimulate future researches, aiming an efficient genetic counseling, decreasing inconclusive cases generated by unknown clinical significance variants, and follow up of affected families