Dorstenia asaroides Hook. é um erva perene, conhecida como carapiá, utilizada na medicina popular contra uma variedade de enfermidades. Este estudo teve como objetivo obter e caracterizar o perfil fitoquímico de frações orgânicas (hexânica, acetato e clorofórmica) do extrato de rizomas de D. asaroides, bem como avaliar o efeito in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 (multiplicação, potencial acidogênico e biofilme) e analisar a citotoxicidade destas frações. Os extratos estudados foram obtidos a partir do extrato bruto (rizomas tratados com etanol). A fração hexânica (FrH) revelou a presença de ácidos graxos e/ou seus ésteres metílicos ou etílicos, além de um esteróide, campesterol e triterpenos. A fração acetato (FrA) é composta principalmente de furanocumarina e um triterpeno, já a fração clorofórmica (FrC) é composta pelas furanocumarinas: isopsoraleno e/ou psoraleno e bergapteno. As frações que apresentaram maior valor de inibição do potencial acidogênico foram FrH e FrA, ambas com 100% de inibição na concentração de 12,5mg/mL. A concentração inibitório mínima (CIM) para FrH e FrC foi igual a 80µg/mL, e 50µg/mL para FrA. Nos estudos de biofilme, verificou-se que a partir de 3h de incubação S. mutans foi capaz de aderir a superfícies de vidro e aço inoxidável, formando biofilme em 9h de incubação com populações médias de 3,41 Log de UFC/cm2 nas lâminas de vidro e de 4,84 Log de UFC/cm2 nas lâminas de aço inoxidável. Os melhores resultados de controle de biofilme foram obtidos com a fração FrA, a qual apresentou diferenças significativas em relação ao controle. As frações hexânica e acetato não se mostraram citotóxicas em concentrações inferiores a 6,25µg/mL. Já para a fração clorofórmica, não houve citotoxicidade em concentrações menores que 25µg/mL. Os resultados obtidos com as frações FrH, FrA e FrC do extrato de rizomas de D. asaroides mostram-se promissores, uma vez que apresentaram potencial anticariogênico sobre S. mutans. / Dorstenia asaroides Hook. (Moraceae), a plant occurring endemically in Africa and Central and South America, is used in medicinal plant therapy. In this study, we analyzed the chemical compounds from the hexane fraction (HFr), chloroform fraction (CFr) and ethyl acetate fraction (EFr). These fractions were obtained from crude extracts of the rhizomes of D. asaroides. The antimicrobial activity against S. mutans, the acid inhibition properties, the effect on S. mutans biofilm formed on a glass surface and cytotoxicity were also evaluated. Phytochemical analysis of these organic fractions from the extract of D. asaroides rhizomes revealed the presence of substances with known antimicrobial activity, such as campesterol, triterpenes and coumarins. Both the MIC and MBC values for the HFr and CFr are 80µg/mL, and for the EFr 50µg/mL. Among the fractions tested, the fractions with the highest value of inhibition of the acidogenic potential were HFr and EFr, with 100.3% and 105.3% inhibition, respectively, at a concentration of 12.5mg/mL. The treatment of biofilms was statistically significant for all three fractions at the highest concentrations tested compared with the control (biofilm at 12 hours). The results for EFr were particularly pronounced, showing significant differences at all concentrations. The HFr and EFr were not cytotoxic at concentrations below 6.25g/mL. CFr was not cytotoxic at concentrations less than 25g/mL. Thus, the fractions have shown a substantial anticariogenic activity against S. mutans and further studies are needed to fully elucidate properties of these fractions.

A glutamina e o glutamato são aminoácidos importantes no metabolismo bacteriano. A captação desses aminoácidos ocorre por meio de transportadores ativos do tipo ABC. No presente estudo avaliamos os sistemas de captação de glutamina/glutamato em Streptococcus mutans. Análises in silico revelaram a presença de dois operons que codificam sistemas de transporte de glutamina/glutamato: o operon gln, composto pelos genes e um segundo operon putativo composto pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. Por meio de mutagênese sítio-específica foi possível obter a deleção do operon constituído pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. O mutante (linhagem KG1) obtido apresentou redução na captação de glutamato e glutamina. O mesmo ocorreu em relação ao mutante deficiente no operon gln. O mutante KG1 apresentou maior capacidade de adesão a superfícies abióticas. Os resultados obtidos revelaram que tanto o operon gln como o operon definido pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c estão envolvidos na captação de glutamina e glutamato pelo S. mutans. / Glutamine and glutamate are important amino acids for bacteria metabolism. Their uptake occurs via active transporter systems of the ABC family. On the present study we evaluate the glutamine/glutamate transport systems of Streptococcus mutans. In silico analysis revealed the presence of two polycistronic operons related to transport of glutamine/glutamate: the gln operon and a putative operon composed by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c genes. A mutant deleted on the smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c was successfully obtained by site-direct mutagenesis (KG1 strain), which demonstrated an impairment on glutamine and glutamate uptake, as shown by the mutant deleted on the gln operon. The KG1 strain demonstrated a gain on the abiotic surface adhesion The results revealed that both, gln operon and the operon consisted by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c, are involved to the internalization of glutamine and glutamate on S. mutans.

O fosfato inorgânico é um composto essencial por estar relacionado com diversos processos metabólicos e biossíntese de moléculas relevantes à sobrevivência celular. Em bactéria são conhecidos dois tipos principais de transportadores específicos de fosfato inorgânico, o sistema Pit, de baixa afinidade, e o sistema Pst de alta afinidade, um ABC transportador, ativado sob carência de fosfato extracelular. A interação deste sistema com a fisiologia e patogênese de Streptococcus mutans, o principal agente etiológico da cárie dental, foi estudada neste trabalho. Os genes que codificam o sistema Pst de S. mutans UA159, estão organizados em um óperon policistrônico (pstS, C1, C, B, smu.1134 e phoU). A análise das sequências de aminoácidos das proteínas do sistema Pst de S. mutans com ortólogos do gênero Streptococcus, demonstrou maior identidade com bactérias da cavidade oral. Análise de prevalência do gene pstS, que codifica a proteína ligadora, demonstrou conservação entre todas as cepas laboratoriais e clínicas avaliadas. A deleção de pstS reduziu a capacidade de incorporação de ortofosfato que se refletiu na diminuição da taxa de replicação celular em meios com diferentes concentrações de fosfato inorgânico. A mutação também reduziu a capacidade da bactéria em aderir à superfícies abióticas e diminuiu sua hidrofobicidade de superfície, além de aumentar a resistência intrínseca a ácido. No entanto, não houve alteração na eficiência de transformação bacteriana. Por fim, o gene pstS de S. mutans foi clonado, expresso e a proteína purificada utilizada para obter anticorpos que inibiram o crescimento de S. mutans in vitro. Deste modo, segere-se que o sistema Pst é relevante na fisiologia e patogênese de S. mutans. / Inorganic phosphate is an essential compound related to several metabolic process and biosynthesis of molecules relevant to cellular survival. Bacteria are known to posses two main types of specific inorganic phosphate transporters, the low-affinity Pit system, and the high affinity Pst system, an ABC transporter family constituent, activated by extracellular phosphate starvation. The aim of this work was to study the role of Pst system in physiology and pathogenesis of Streptococcus mutans, the main etiological agent of dental caries. The genes of the Pst system of S. mutans UA159, are organized in a polycistronic operon (pstS, C1, C, B, smu.1134 and phoU). The amino acid sequence analysis of Pst proteins of S. mutans related to orthologs of Streptococcus genus, showed the highest identity value when compared to oral cavity bacteria. The PstS binding protein was present in all tested clinical and laboratory strains of S. mutans. The pstS mutant showed a decreased capacity of ortophosphate uptake which leaded to growth deficiency in different phosphate concentrations. The mutation also reduced the bacteria adherence to abiotic surfaces and the hydrophobicity of the cell surface, diverging from the increase the intrinsic acid resistance. Otherwise, there was no change in the bacterial transformation eficiency. Finally, the S. mutans pstS gene was cloned, expressed and the purified protein was used to obtain antibodies that inhibited the growth of S. mutans in vitro. Taking together, these results suggesting that the Pst transport system is relevant to S. mutans physiology and pathogenesis.

Streptococcus mutans (S. mutans) é considerado o principal agente etiológico da cárie dentária e estudos acerca de sua virulência têm sido realizados com o intuito de compreender melhor os mecanismos de patogenia da doença. Dentre outros fatores, a virulência dessa espécie bacteriana está relacionada a sua habilidade em produzir proteína ligante de glucano tipo A (GbpA) e mutacinas, proteínas que desempenham importante papel na adesão celular e colonização da superfície dentária. Desta forma, o objetivo da presente pesquisa foi analisar, geneticamente, esses fatores de virulência de S. mutans e verificar sua relação com a persistência e transmissão de genótipos entre os membros de oito famílias brasileiras. Foram utilizados 392 isolados clínicos de S. mutans obtidos a partir da saliva de 20 indivíduos adultos cárie-ativos. Os microrganismos foram previamente identificados e genotipados em um estudo anterior que avaliou sua transmissibilidade e estabilidade ao longo do tempo. As amostras estocadas a -86°C foram reativadas por semeadura em diferentes meios de cultura (ágar sangue e ágar Mitis Salivarius Bacitracina Sacarose) e repicadas em caldo de Infusão de Cérebro e Coração. Após extração do DNA cromossômico bacteriano foram realizadas análises genético-moleculares, por meio da reação em cadeia da polimerase, visando a detecção nas amostras dos genes envolvidos na produção de GbpA (gbpA) e codificadores dos tipos I, II, III e IV de mutacinas (mutAI, mutAII, mutAIII e mutAIV). Os dados obtidos foram analisados por meio das estatísticas descritiva e inferencial, utilizando-se os testes de Qui Quadrado, Odds Ratio (OR) e exato de Fisher, a um intervalo de confiança de 95% (IC95%) e nível de significância de 5%. Os genes gbpa, mutAI, mutAII, mutAIII e mutAIV foram detectados, respectivamente, em 77,3%, 12,5%, 51%, 16,6% e 89,8% dos isolados de S. mutans considerados viáveis (N=392). A virulência do S. mutans apresentou associação com sua transmissão (P<0,001) e estabilidade (P=0,011), sendo que os genótipos mais virulentos apresentaram aproximadamente três vezes mais chance de serem transmitidos (OR=3,07; IC95% 2,02 - 4,66) e aproximadamente duas vezes mais chance de persistirem na cavidade bucal dos indivíduos (OR=2,06; IC95% 1,17 - 3,63) do que os menos virulentos. Apesar da prevalência dos genes mutAI (P<0,001) e mutAIII (P<0,001) terem sido diferentes entre os genótipos de S. mutans transmitidos e não transmitidos, não houve associação (P=0,357) entre a experiência de cárie dentária das crianças e a virulência dos genótipos adquiridos. Os resultados sugerem que os genótipos dotados de informação genética para sintetizar GbpA e mutacinas apresentam importante vantagem ecológica no processo de colonização por S. mutans, mantendo-se estáveis na microbiota bucal do hospedeiro e favorecendo a transmissão intrafamiliar. / Streptococcus mutans (S. mutans) is the main etiologic agent in the development of dental caries and several studies about its virulence have been conducted to understand the mechanisms of disease pathogenesis. Among other factors, the virulence of this bacterial species is based on their ability to produce glucan-binding protein-A (GbpA) and mutacins, proteins that play an important role in cell adhesion and colonization of the dental surface. Thus, the aim of the present study was to analyze, genetically, these virulence factors of S. mutans and to investigate their relation with the persistence and transmission of genotypes among the members from eight Brazilian families. A total of 392 clinical isolates of S. mutans, collected from 20 caries-active adults, were utilized. These microorganisms were previously identified and genotyped in a study that evaluated their transmissibility and stability over time. The samples stored at -86°C were plated on different culture media (blood agar and Mitis Salivarius Sucrose Bacitracin agar) and grown in Brain Heart Infusion broth. After extraction of bacterial chromosomal DNA, the samples were amplified, by the technique of polymerase chain reaction, for the presence of genes coding for GbpA (gbpA) and for mutacins types I, II, III and IV (mutAI, mutAII, mutAIII and mutAIV). Data obtained were analyzed through descriptive and inferential statistics, using the Chi-Square, Odds Ratio (OR) and Fisher\'s exact tests, with a 95% confidence interval (95%CI) and a significance level of 5%. The gbpa, mutAI, mutAII, mutAIII and mutAIV genes were detected, respectively, in 77.3%, 12.5%, 51%, 16.6% and 89.8% of viable clinical isolates (N=392). The virulence of S. mutans was associated with the transmission (P<0,001) and stability of colonization (P=0.011). The most virulent genotypes showed approximately three times more likely to be transmitted (OR=3.07; 95%CI 2.02 - 4.66) and approximately two times more likely to persist in the oral cavity (OR=2.06; 95%CI 1.17 - 3.63) than the less virulent genotypes. Despite the prevalence of genes mutAI (P<0.001) and mutAIII (P<0.001) have been different between the genotypes of S. mutans transmitted and no transmitted, there was no association (P=0.357) between the experience of dental caries of children and the virulence of the acquired genotypes. The results suggest that the genotypes with genetic information to synthesize GbpA and mutacins can represent an important ecological advantage in the process of colonization by S. mutans, remaining stable in the oral microbiota of the host and favoring an intrafamilial transmission.

Este estudo teve por objetivos (1) estudar os efeitos de diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de células planctônicas e biofilme de S. mutans UA159, (2) verificar a viabilidade de uso de um modelo para crescimento de biofilme bacteriano no estudo do processo de desmineralização, (3) avaliar a capacidade da terapia fotodinâmica em controlar o processo de desmineralização mediado por biofilme de S. mutans crescidos sobre discos de dentina bovina e (4) mensurar a capacidade da terapia fotodinâmica em promover estresse celular a S. mutans UA159 com deleção do gene VicK. Os procedimentos de terapia fotodinâmica foram realizados pela associação do fotossensibilizador Photogem® e de um LED vermelho visível (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) como fonte de luz. A viabilidade de células bacterianas foi determinada por dois métodos distintos: teste de atividade metabólica pelo uso da resazurina (etapa 1) e contagem de UFC (etapas 1,2 e 3). Microrradiografia transversal e análise da concentração de cálcio por espectrometria de absorção atômica foram os métodos de escolha para a determinação do perfil do conteúdo mineral (%vol), perda mineral integrada (PMI, %vol x m), profundidade de lesão (PL, m) e concentração de cálcio liberado em meio de cultura (mg/dL). A intensidade de fluorescência emitida pela modulação da proteína GFP após ensaio de estresse celular foi determinada por citometria de fluxo. Os diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica foram capazes de reduzir a viabilidade de células planctônicas de S. mutans, bem como das células organizadas em biofilme (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05), sendo o resultado dose-dependente. Quando Photogem® a 0,25 mg/mL foi associado ao LED a 150 J/cm2, uma redução de aproximadamente 3,9 log10 na contagem de células viáveis provenientes de biofilme foi observada. O modelo para crescimento de biofilme permitu a progressão do processo de desmineralização (24 h PMI: 1905±391 vol% x m, PL: 69,9±12,2 m; 48 h - PMI: 3529±886 vol% x m, PL: 114,2±24,6 m; 72 h - PMI: 4186±1099 vol% x m, PL: 146,1±20,1 m) em função do tempo. As associações de Photogem® 0,25 mg/mL + LED 75 J/cm2 e Photogem® 0,25 mg/mL + LED 150 J/cm2 foram capazes de controlar por 24 h a perda mineral integrada, a profundidade de lesão e a concentração de cálcio liberada em relação ao grupo controle (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Os diferentes tipos de tratamento utilizados no ensaio de estresse celular (H2O2 a 0,0025%, H2O2 a 0,005%, Photogem® a 0,00625%, Photogem® a 0,0125%, LED 4,5 J/cm2, Photogem® a 0,00625% + LED 4,5 J/cm2 e Photogem® a 0,0125% + LED 4,5 J/cm2) produziram aumento significativo da fluorescência captada pela citometria de fluxo em relação ao grupo controle (água deionizada) (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Entretanto, diferenças significativas não foram notadas entre os grupos de tratamento. Portanto, a terapia fotodinâmica foi capaz de reduzir a viabilidade de células planctônicas e células organizadas em biofilme (S. mutans UA159), bem como controlar o processo de desmineralização mediado por bactéria durante 24 h. Além disso, pelo modelo utilizado, a terapia fotodinâmica pode ser capaz de modular estresse celular comparável àquele obtido com a utilização do peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. / The present study aimed (1) to assess the effects of different parameters of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) on the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, (2) to test the effectiveness of a biofilm model in evaluating the demineralization process, (3) to assess the influence of PACT on the control of demineralization process mediated by S. mutans biofilm growth on dentin discs, and (4) to measure the ability of PACT in promoting cellular stress on S. mutans UA159 knockout vicK gene. PACT procedures were performed by association between a photosensitizer (Photogem®) and a visible red LED (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) as light source. Viability of bacterial cells was determined by two distinct methods: resazurin assay (phase 1) and Colony Forming Unit (CFU) counts (phases 1, 2, and 3). Transversal microradiography and calcium release analysis by atomic absorption spectrometry were chosen to analyze mineral content profile (%vol), integrated mineral loss (IML, %vol x m), lesion depth (LD, m), and concentration of calcium release in culture media (mg/dL). Fluorescence intensity levels, which were modulated by expression of Green Fluorescent Protein-reporter (GFP) after cellular stress, were measured by flow cytometer. A dose-dependent effect on the reduction of viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans was observed after application of different parameters of PACT (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED decreased in nearly 3.9 log10 the viability of S. mutans biofilm. Progression of demineralization process was correlated with the time (24 h IML: 1905±391 vol% x m, LD: 69.9±12,2 m; 48 h - IML: 3529±886 vol% x m, LD: 114.2±24.6 m; 72 h - IML: 4186±1099 vol% x m, LD: 146.1±20.1 m). Integrated mineral loss, lesion depth and concentration of calcium release were controlled for 24 h by the following associations: 0.25 mg/mL Photogem® plus 75 J/cm2 LED, and 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED, in comparison to control group (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). Different treatments (0.0025% H2O2, 0.005% H2O2, 0.00625% Photogem®, 0.0125% Photogem®, 4.5 J/cm2 LED, 0.00625% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED, and 0.0125% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED) increased significantly the fluorescence levels emitted by S. mutans, when compared with levels of the control group (demi water) (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). However, significant statistical differences were not observed among treatment groups. Therefore, PACT was able to decrease the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, as well as controlling the demineralization process mediated by bacteria for 24 h. Moreover, according to present methods, PACT may modulate cellular stress similar to hydrogen peroxide.

Saliva e Streptococcus mutans foram utilizados neste estudo para avaliar a atividade antimicrobiana da quitosana associada à clorexidina. Os testes de atividade antimicrobiana foram realizados utilizando-se soluções de quitosana e quitosana:clorexidina preparadas em ácido acético 1%, em diversos valores de pH (3,5-5,0) e valores de concentração variando entre 0,1 e 1,5% (m/v). Antes de cada experimento o pH da solução estoque de quitosana (grau de desacetilação 76% e massa molar 400.000 g/mol) foi ajustado até o pH desejado pela adição de NaOH. A atividade antimicrobiana aumentou com o pH, com a concentração, com o tempo de exposição e com a associação quitosana/ clorexidina. Aumentando-se a concentração de clorexidina não se observam efeitos significativos, indicando que em presença de quitosana é possível liberar este composto em concentrações menores, o que irá minimizar os efeitos colaterais indesejados de pigmentação e sensação de alteração de sabor / Saliva and Streptococcus mutans were used to evaluate antimicrobial activity of chitosan/chlorexidine solutions. Antimicrobial tests were conducted using chitosan and chitosan/ chlorexidine solutions in 1.0 % acetic acid solution, at various pH values (3.5-5.0) and concentrations ranging from 0.1 to 1.5% (w/v). Prior to each experiment, chitosan (DA 76%, 400.000 g/mol) stock solution pH was adjusted to the desired pH using NaOH. The antimicrobial activity increased with pH, concentration, exposition time and with the association of chitosan and chlorexidine. Increasing the concentration of chlorexidine did not have a significant effect indicating that in presence of chitosan it is possible to deliver this compound at a lower concentration which will avoid unwanted side effects including staining and altered taste sensations

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Este trabalho, portanto, objetiva verificar a inibição da formação de biofilme dentário formado por Streptococcus mutans (S. mutans) através da ação de quatro substâncias (epigalocatequina, clorexidina, xilitol e resveratrol), e verificar o provável mecanismo de ação a partir da expressão gênica das enzimas glicosiltransferase (GTF) e frutosiltransferase (FTF). O ensaio de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizado para quantificar a expressão dos genes. Foram realizados ainda, ensaios de viabilidade celular e para verificação de formação de biofilme após tratamento com as substâncias testes para determinar concentrações em que houvesse inibição da formação de biofilme em condições de viabilidade celular. As concentrações de xilitol, resveratrol e clorexidina que se mostraram eficazes foram 100 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,001 mg/mL, respectivamente, ou seja, concentrações nas quais houve inibição da formação de biofilme sem modificação da viabilidade bacteriana. A epigalocatequina não apresentou uma concentração que proporcionasse inibição de biofilme sem a consequente morte bacteriana. Os tratamentos foram realizados com o xilitol, o resveratrol e a clorexidina, e após realização de RT-qPCR (reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real de transcrição reversa) foram obtidos os resultados referentes à expressão dos genes ftf e gtfb. Houve uma diminuição significativa (72,8%) na expressão gênica do ftf após o tratamento com xilitol. O resveratrol não interferiu na expressão deste gene e a clorexidina provocou redução da expressão do gene de controle (housekeeping gene), inviabilizando a avaliação da expressão do ftf na concentração avaliada. Não houve modificação significativa na expressão de gtfb após o tratamento com o resveratrol e a clorexidina nas concentrações definidas. O xilitol reduziu a expressão do housekeeping gene 16S rRNA, indicando morte celular na concentração testada. Os resultados nos levaram a concluir que as três substâncias - resveratrol, xilitol e clorexidina - atuam como potenciais agentes inibidores de biofilme dentário formado por S. mutans. Verificou-se, entretanto, que o xilitol inibe a expressão do gene ftf, indicando que o provável mecanismo de ação de tal inibição da formação do biofilme foi através da redução da expressão deste gene do S. mutans. A clorexidina já possui reconhecida ação bactericida, entretanto neste trabalho verificamos uma concentração desta substância em que houve inibição de biofilme sem a consequente morte celular. Diante dos achados podemos propor outras formas de aplicação do xilitol e da clorexidina, em odontologia, e também a utilização do resveratrol como um agente inibidor do processo carioso, já que o mesmo é capaz de inibir a formação de biofilme dentário. A inibição do biofilme por estas substâncias seria interessante de modo que não geraríamos um desequilíbrio na flora bacteriana, mantendo, portanto, bactérias que atuam de forma positiva na cavidade bucal. Desta forma, outros estudos laboratoriais e clínicos são necessários 16 para demonstrar a eficácia de tais substâncias para prevenção ou até mesmo tratamento de cáries dentárias. / Dental caries results from a metabolic imbalance in the biofilm, formed by bacteria, especially streptococci and lactobacilli. One way of preventing caries process would be inhibit cariogenic biofilm formation. This work therefore aims to verify the possible inhibition of biofilm formation by Streptococcus mutans (S. mutans) after the treatment with four substances (epigallocatechin, chlorhexidine, xylitol and resveratrol), and to investigate the action mechanism through the expression of the genes glycosyltrasferase (GTF) and fructosyltransferase (FTF). The test of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was carried out to quantify the expression of these enzymes. Cell viability assays as well as tests for verification of biofilm formation were also carried out after the treatment with the test substances to determine the concentration when the inhibition of biofilm formation occurred under conditions of cell viability.The xylitol, resveratrol and chlorhexidine concentrations that proved effective were 100 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.001 mg/mL, respectively, concentrations in which there was inhibition of biofilm formation without modification of the bacterial viability. The epigallocatechin didn’t demonstrate a concentration that would provide biofilm inhibition without the consequent inhibition of bacterial viability. The treatments were performed with xylitol, resveratrol and chlorhexidine, and after completion of RT-qPCR (reverse transcription real time polymerase chain reaction), they’re obtained the results for enzyme expression of FTF and GTFB. There was a significant decrease (72.8%) in the enzyme FTF expression after treatment with xylitol. The resveratrol didn’t affect the expression of this enzyme and chlorhexidine caused reduced gene expression control (housekeeping gene), precluding to evaluate the FTF gene expression in the assessed concentration. There was no significant change in GTFB expression after treatment with resveratrol and chlorhexidine in defined concentrations. Xylitol reduced housekeeping gene 16S rRNA expression, indicating cell death in the concentration tested. The results led us to conclude that the three substances (resveratrol, xylitol and chlorhexidine) act as potential dental biofilm inhibitors formed by S. mutans. It was found, however, that xylitol inhibits FTF gene expression, indicating that the probable mechanism of action of such inhibition of biofilm formation was by reducing the expression of this S. mutans gene. Chlorhexidine has already recognized bactericidal action, however this work we see a concentration of this substance that was inhibiting biofilm without subsequent cell death. Considering those findings may suggest other ways of applying the xylitol and chlorhexidine in dentistry and also the use of resveratrol as an inhibitory agent of the carious process, since it is capable of inhibiting dental plaque formation. Biofilm inhibition these substances would be interesting to such an extent that there would generate an imbalance in the bacterial flora, thus keeping bacteria that act in a positive manner in the oral cavity. Thus, clinical studies are necessary to demonstrate the efficacy of these substances to prevent or even caries treatment.

Orientador: Renata de Oliveira Mattos Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_LiviaAraujo_M.pdf: 2021430 bytes, checksum: 07a84279508cd84bfef41550d34e6ca7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Streptococcus mutans (SM) é um patógeno oral da cárie dentária e endocardite infecciosa. Para se estabelecer no hospedeiro, SM precisa se adaptar às condições biofísicas e aos fatores de defesa do hospedeiro. Para isto, SM utiliza sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC). Dois SDCs, VicRK e CovR, são associados à virulência de SM. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação dos reguladores de transcrição gênica VicRK e CovR na evasão de SM ao sistema complemento e fagocitose. Dessa forma, a marcação pelo complemento foi comparada entre os mutantes vicK- e covR- obtidos da cepa SM UA159 (UAvic e UAcov, respectivamente) e UA159, através da incubação com soro humano a 20% ou soro humano livre de C1q (30 min, 37 ?C, 10% CO2). A deposição de C3b sobre a superfície de SM foi analisada também nas cepas cultivadas em meio com 0,1% de sacarose. A quantidade de C3b nas superfícies bacterianas foi determinada através de reações com anticorpos IgG de cabra anti-C3 humano conjugado com FITC e análise de citometria. Bactérias incubadas com PBS foram usadas como controle negativo. O reconhecimento das cepas de SM por anticorpos séricos opsonizantes foi realizado com anticorpos anti-IgG humano conjugado com FITC e anti-IgM humano conjugado com APC. Para análise da fagocitose, as mesmas cepas coradas com FITC foram incubadas com neutrófilos (PMN) por 5 e 30 min. na presença ou ausência de soro humano a 20%; o número de PMN com bactérias fagocitadas foi determinado por citometria de fluxo. A deposição de C3b foi menor em UAcov (10,86%) e em UAvic (7,6%), comparado à UA159 (23,5%). Na presença de sacarose, a marcação por C3b caiu para 10,86% em UA159, e para os mutantes UAcov e UAvic foi reduzida a 6,6 e 3,96%, respectivamente (ANOVA p<0,001). Os mutantes UAcov e UAvic foram menos reativos contra anticorpos IgG e IgM. A fagocitose por PMN foi reduzida em UAcov e UAvic em cerca de 50 a 60% em relação à UA159 nos tempos de 5 e 30 min. (ANOVA p< 0,005). Assim, a inativação dos sistemas VicRK e CovR reduz significativamente a deposição de C3b do complemento e a frequência de fagocitose de SM, indicando que estes SDC regulam genes envolvidos no escape à opsonização pelo complemento / Abstract: Streptococcus mutans (SM) is an oral pathogen of dental caries and infective endocarditis. To get established in host sites, SM needs to adapt to biophysical conditions and host defense factors. To this purpose, SM applies transcriptional regulatory systems of two components (SDC). Two SDCs, VicRK and CovR, have been implicated in SM virulence. The aim of this study was to investigate the role of VicRK and CovR on SM evasion from complement system and phagocytosis by neutrophils (PMN). Thus, complement deposition was compared between vicK- and covR- mutants obtained strain UA159 (UAvic and UAcov, respectively) and the parent UA159 exposed to 20% human serum or human serum depleted of C1q (30 min, 37ºC, 10% CO2). Deposition of C3b on SM surfaces was also analyzed in strains cultivates in the presence of 0.1% sucrose. The amount of C3b on the bacterial surface was determined by reactivity with goat IgG antibody anti-C3 conjugated FITC and flow cytometry analysis. Bacteria incubated with PBS were used as negative control. The reactiveness of SM strains with human serum antibodies was quantified by flow citometry with anti- human IgG- FITC and anti- human IgM-APC antibodies. For analysis of phagocytosis, the strains stained with FITC were incubated with PMN during 5 and 30 min. in the presence or absence of 20% human serum; the number of internalized bacteria by PMN was determined by flow cytometry. The deposition of C3b on UAcov (10.86 %) and UAvic (7.6%) was lower, compared to UA159 (23.5%) (ANOVA p<0,001). In the presence of sucrose, C3b deposition decreased to 10.86 % in UA159, and to 6.6 and 3.96% in UAcov and UAvic , respectively (ANOVA p < 0.001). The UAcov and UAvic mutants were less reactive with IgG and IgM antibodies. The phagocytosis by PMN was 50 to 60% reduced in UAcov and UAvic compared to UA159, respectively at times 5 and 30 min. (ANOVA p < 0.005). Thus, inactivation of CovR and VicRK TCS systems significantly reduces deposition of complement C3b and phagocytosis by PMN in a serum-dependent way, indicating that these SDC regulate genes involved in the evasion of complement to opsonization / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestra em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Pedro Luiz Rosalen, Francisco Carlos Groppo / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Berto_LucianaAranha_D.pdf: 2510809 bytes, checksum: 95557f04245ce04cb76a352459b80504 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Apesar do constante desenvolvimento do conhecimento, prevenção e tratamento da cárie dental, esta doença continua tendo alta prevalência no Brasil e no mundo. Por este motivo, tem crescido o interesse por novos agentes farmacológicos que possam auxiliar no controle do biofilme dental, atuando contra o principal microrganismo associado ao desenvolvimento da cárie, o Streptococcus mutans. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do extrato de quatro plantas do cerrado brasileiro (e suas frações) contra S. mutans UA159. Extratos hidroalcoólicos de Lantana camara (Lc), Copaifera langsdorffii (Cl), Psidium guajava (Pg) e Cochlospermum regium (Cr), foram submetidos a testes de avaliação da atividade antimicrobiana para determinação das concentrações inibitória (CIM) e bactericida (CBM) mínima, inibição da aderência e queda de pH em solução. O extrato bruto das quatro plantas apresentaram potencial antimicrobiano e foram fracionados por gradiente de polaridade, sendo obtidas, para cada extrato, as frações hexânica (FHx), clorofórmica (FCh), acetato de etila (FAc) e aquosa (FAq). Estas foram submetidas aos experimentos já citados para determinação da(s) fração(ões) ativa(s) de cada extrato, selecionadas com base nos resultados dos testes de atividade antimicrobiana e no rendimento. Foram selecionadas, para a etapa subsequente de avaliação em biofilme, 6 frações ativas: Lc-FHx e Lc-FCl, ambas com CIM = 15,6 µg/ml, e rendimento 9,5 e 17,5%, respectivamente; Cl-FHx, que apresentou CIM = 15,6 µg/ml, atividade inibitória sobre a queda de pH em solução e rendimento igual a 21%; Pg-FHx, com CIM = 125 µg/ml, 93,4% de inibição da aderência na concentração de 62,5 µg/ml e rendimento igual a 2,0%; Cr-FHx, com CIM = 125 µg/ml, apresentou atividade inibitória sobre queda de pH do meio e rendimento igual a 1,0% e Cr-FAq, que obteve CIM elevado, entretanto, inibiu 86,7% de aderência bacteriana, na concentração de 62,5 µg/ml, sendo o rendimento desta fração 32%. As frações selecionadas foram submetidas a avaliações complementares, como: viabilidade bacteriana (time kill), inibição de formação e queda de pH em biofilme de S. mutans, utilizando discos de hidroxiapatita. Nos testes em biofilme, destacaram-se três frações: Lc-FHx, que em concentração 20xCIM, proporcionou redução na viabilidade do microrganismo e diminuição da formação do biofilme tratado diariamente por 5 dias; Lc-FCh, que em concentração equivalente a 20xCIM, reduziu a formação de biofilme e Cl-FHx, que além de reduzir a formação de biofilme na concentração de 20xCIM, interferiu na viabilidade do microrganismo, nas duas concentrações testadas (10xCIM e 20xCIM). A composição química das frações ativas em biofilme foi analisada por CG-EM. As demais frações testadas nesta etapa não diferiram do controle negativo (veículo) nos testes aplicados. Nenhuma das frações avaliadas afetou a redução de pH do meio pelo biofilme. Em conclusão, as frações com polaridades baixa ou intermediária das espécies Lantana camara e Copaifera langsdorffii mostraram ter potencial para gerar novos compostos anti-cárie de origem natural, tendo apresentado atividade antimicrobiana sobre o biofilme formado por S. mutans / Abstract: Despite the continuous development of knowledge, prevention and treatment of dental caries, the disease continues to have a high prevalence in Brazil and worldwide. For this reason, there is been a strong interest for new pharmacological agents that can assist biofilm control, acting against the main microorganism associated with the development of caries, Streptococcus mutans. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of the extract of four plants from Brazilian cerrado (and its fractions) against S. mutans UA159. Hydroalcoholic extracts of Lantana camara (Lc), Copaifera langsdorffii (Cl), Psidium guajava (Pg) and Cochlospermum regium (Cr) were evaluated by means of antimicrobial tests for the determination of minimum inhibitory (MIC) and bactericidal (MBC) concentrations, inhibition of adhesion and pH-drop of S. mutans. The crude extract of four plants showed antimicrobial potential and were fractionated by polarity gradient, and 4 fractions were obtained for each extract: hexane (FHx), chloroform (FCh), ethyl acetate (FAc) and aqueous (FAq) fractions. These fractions were subjected to previously mentioned tests to determine the active fraction(s) of each extract. For the subsequent evaluation step in biofilm, 6 active fractions were selected: Lc-FHx and Lc- FCl, both with MIC = 15.6 µg/ml, and yield of 9.5% and 17.5%, respectively; Cl-FHx, which showed MIC = 15.6 µg/ml, an inhibitory activity on the pH drop in solution and yield of 21%; Pg-FHx with MIC = 125 µg/ml, 93.4% of inhibition of adhesion in the concentration of 62.5 µg/ml and yield of 2.0%; Cr-FHx, with MIC = 125 µg/ml, an inhibitory activity against pH drop and a yield of 1.0% and Cr- Aq, which showed a high MIC value, however, it inhibited 86.7% of bacterial adhesion at a concentration of 62.5 µg/ml, and had a yield of 32%. The selected fractions were subjected to additional tests as bacterial viability (time-kill), inhibition of formation and pH drop in biofilms of S. mutans, using hydroxyapatite disks. Three active fractions stood out in tests on biofilm: Lc-FHx which decreased the viability of the microorganism and biofilm formation in the concentration of 20xMIC, Lc- FCx, which reduced biofilm formation in the 20xMIC concentration, and Cl ¿ FHx, which reduced biofilm formation in the 20xMIC concentration and interfered with the viability of the microorganism at the two tested concentrations (10xMIC and 20xMIC). The chemical composition of active fractions was analyzed by GC-MS. The other fractions tested in biofilm did not differ from the negative control (vehicle). None of the evaluated fractions affected the pH drop by biofilm. In conclusion, Lantana camara and Copaifera langsdorffii fractions with low or intermediate polarities showed potential to generate new naturally occurring anticarie compounds and presented antimicrobial activity against biofilms formed by S. mutans / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutora em Odontologia

Orientador: Regina Maria Puppin Rontani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:37:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_Micaela_M.pdf: 3863451 bytes, checksum: 498ee01fbebe667f482927f69b67f6d4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este estudo teve por objetivos: produzir lesões artificiais de cárie em esmalte bovino, com características clínicas similares àquelas identificadas pelo protocolo ICDAS II 2009 (International Caries Detection and Assessment System), códigos 1, 2, e 3, através da inspeção visual; identificar o tempo de desmineralização necessário para a produção de lesões artificiais de cárie em esmalte bovino; caracterizar segundo a área de secção transversal, profundidade (LD) e volume da lesão, topografia da superfície, a razão entre a porcentagem de perda mineral e a profundidade da lesão (ratio) e perda mineral das lesões, por meio de diferentes metodologias de análise: Análise visual, Microtomografia (?-CT) Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microrradiografia Transversal (TMR) e Microscopia óptica em Luz Polarizada (MLP). Foram utilizados 45 blocos de esmalte bovino distribuídos em 3 grupos (n=15), de acordo com o Código ICDAS 1, 2 e 3, e submetidos ao desafio ácido pelo método biológico, com S. mutans. Os blocos foram imersos em meio BHI suplementado por sacarose a 1% com inóculo de S. mutans, sendo o meio trocado a cada 24h, e para identificação do tempo de produção das lesões (estudo piloto). Em seguida, os espécimes foram removidos do meio de cultura de acordo com o período de tempo identificado para cada grupo (24h, 4 dias e 14 dias), fotografados (análise visual), submetidos à análise por ?-CT, MEV e posteriormente, seccionados longitudinalmente em relação à lesão de cárie e avaliados em TMR e MLP. Os dados obtidos da MEV foram avaliados descritivamente; aqueles provenientes da ?-CT, TMR e MLP foram submetidos aos testes ANOVA e Tukey (p<0,05). O tempo necessário para produção de lesões clinicamente semelhantes àquelas para cada código ICDAS II foi identificado visualmente. Para a produção de lesões in vitro similares ao código 1, o tempo necessário foi de 24 horas; para o código 2, 4 dias; e para o código 3, 14 dias. Para as lesões similares àquelas Código 1, a MLP e TMR identificaram a presença de lesões subsuperficiais de cárie, porém o ?-CT não permitiu visualizá-las. O MEV mostrou superfície mais regular, na maioria das amostras, sem sinais de erosão e com pequenos orifícios provocados pelo S. mutans. Para as lesões Código 2 a análise por ?-CT identificou áreas e volume de lesão menores do que para o Código 3. A profundidade da lesão não pode ser identificada pelo ?-CT para ambos os Códigos. MLP e TMR identificaram maiores profundidades de lesão para o Código 3, comparado ao 2, porém, evidenciaram a presença de desmineralização e cavitação, também maiores no grupo ICDAS 3. A profundidade média das lesões dos três grupos foi mensurada pelos métodos TMR e MLP, e ambas as análises evidenciaram que, quanto maior o código ICDAS, maior a profundidade das lesões; porém, não foi observada correlação significativa entre estes dois métodos. Baseando-se nos resultados obtidos pode-se concluir que o método biológico de produção de cárie por S. mutans possibilita a produção de lesões similares às observadas clinicamente pelo protocolo ICDAS II. Diferentes metodologias empregadas podem ser recomendadas de acordo com o tipo de lesão produzida artificialmente / Abstract: This study was developed in order to identify the effect of demineralization process to provide bovine enamel caries-like lesions, using Streptococcus mutans biofilms with clinical features similar to those found in ICDAS II (2009) criteria, codes 1, 2 and 3 by visual inspection; to identify the time required for providing the demineralization; to characterize the lesions obtained from different analysis methodologies: X-ray microtomography (?-CT), Scanning Electron Microscopy (SEM), Transversal Microradiography (TMR) and light polarized optical microscopy (MLP). It was used 45 enamel block divided into 3 groups (n =15) submitted to caries-like lesions by biological method, with Streptococcus mutans biofilm. The specimens were immersed in BHI broth supplemented with 1% sucrose inoculum of S. mutans and the medium was changed every 24 hours. Then, the specimens were removed from the culture media in each period of time (24h, 4 and 14 days) and pictures were taken from their demineralized surface (visual analysis). Next, the specimens were submitted to ?-CT and SEM evaluations and longitudinally sectioned by the caries lesions and they were evaluated in TMR e MLP. Data obtained from SEM were descriptively evaluated. Data from ?-CT, TMR and MLP were submitted to ANOVA and Tukey's tests (p<0,05). The time required to produce clinical lesions similar to those ICDAS II for each protocol code was visually identified. For the production of lesions in vitro similar to code 1, the time required was 24 hours, code 2 for 4 days and code 3 for 14. For the similar lesion to those from code 1, the MLP and TMR identified the presence of subsurface carious lesions, but ??CT did not allow viewing it. The SEM analysis showed smoother surface, mostly without signs of erosion and pinholes caused by S mutans. For code 2 lesions the ??CT analysis identified lesions areas and volume smaller than Code 3. The lesion depth cannot be identified by ??CT for both codes. MLP and TMR identified higher depths to code 3 as compared to 2, however, showed the presence of demineralization and cavitation also higher than code 3 ICDAS. The lesion depth average from the three groups was measured by TMR and MLP methods, and both analyses showed that the higher the ICDAS II code, the deeper the lesions were. Different methods may be employed in accordance with the recommended type of lesion produced artificially / Mestrado / Odontopediatria / Mestra em Odontologia