Resumo: O estudo da epidemiologia molecular através de diferentes técnicas vigentes revolucionou a compreensão da epidemiologia da tuberculose permitindo comparação entre linhagens de Mycobacterium tuberculosis e rastreamento da movimentação de linhagens individuais. O presente projeto teve como objetivo utilizar as técnicas de epidemiologia molecular (MIRU) para tentar compreender um pouco mais sobre o fenômeno da transmissão da tuberculose entre os pacientes portadores de tuberculose pulmonar numa pequena cidade de interior paulista , atendidos no Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - ambulatório de referencia no diagnostico e tratamento de tuberculose) na cidade de Araraquara. Do total de 163 culturas positivas recebidas, a técnica de MIRU foi realizada em 74, 2% (121/163) dos isolados provenientes de pacientes atendidos pelo SESA no período de 2002 à 2006. Foram ainda identificados 5 isolados de micobactérias ambientais (M. avium, M. gordonae, M. genevense, M.abcessus e M. xenopi) e 4 micobactérias não identificadas. Dos 121 isolados submetidos a genotipagem, seis não apresentaram todos os alelos dentre os 12 locci de MIRU. Dos 115 isolados submetidos ao dendrograma, 29 (25,2%) agruparam-se em 13 grupos clonais com similaridade de 100%, sendo 10 grupos de dois isolados cada (125 e 168; 153 e 253; 95 e 97; 91 e 99; 92 e 266; 217 e 228; 27 e 117; 260 e 257; 105 e 107; 106 e 220) e 3 contendo 3 isolados cada (150, 157 e 283; 137, 147 e 155; 224, 271 e 286). Os demais 86 isolados (74,8%) apresentaram perfil genético único. Dos 29 pacientes agrupados, apenas 10 (34,4%) eram do sexo feminino e 19 (65,6%) do sexo masculino. Com exceção de um paciente, os demais 28 (96,5%) foram tratados com o esquema I obtendo-se alta por cura em 82,8% dos casos. Apenas um caso de co-infecção HIV/TB foi verificado entre os pacientes em grupos genéticos formados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The molecular epidemiology study using different techniques revolutionized the understanding of the epidemiology of tuberculosis allowing comparison between strains of Mycobacterium tuberculosis and tracking the movements of individual lines. This project aimed to use the techniques of molecular epidemiology (MIRU) trying to understand more about the phenomenon of transmission of tuberculosis among patients with pulmonary tuberculosis in a small city of São Paulo, attended the Special Health Service of Araraquara (SESA - clinic of reference in the diagnosis and treatment of tuberculosis) in the city of Araraquara. From total 163 positive cultures received, the MIRU technique was performed in 74,2% (121/163) of the isolates from patients attended by SESA in the period from 2002 to 2006. 5 isolates were also identified as environmental mycobacteria (M. avium, M. gordonae, M. genevense, M.abcessus and M. xenopi) and 4 unidentified mycobacteria. From the 121 isolates submitted to genotyping, six did not present all alleles among the 12 loci of MIRU. From the 115 isolates submitted to the dendrogram, 29 (25,2%) are grouped into 13 clonal groups with similarity of 100%. 10 groups with two isolates each (125 and 168, 153 and 253, 95 and 97, 91 and 99 ; 92 and 266, 217 and 228, 27 and 117, 260 and 257, 105 and 107, 106 and 220) and 3 groups containing 3 isolates each (150, 157 and 283, 137, 147 and 155, 224, 271 and 286) . The others 86 isolates (74,8%) had a single genetic profile. About the group of 29 patients, only 10 (34,4%) were female and 19 (65,6%) males. Except for one patient, the other 28 (96,5%) were treated with the schedule I having cure in 82,8% of the cases. Only one case of co-infected HIV / TB was found among patients in genetic groups formed, while 31% (9 / 29) were drinkers, except the patients with this data ignored. The 19 male patients grouped genetically, 21% (4 / 19)... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: José Rodrigo Cláudio Pandolfi / Banca: Rosilene Fressati Cardoso / Banca: Daisy Nakamura Sato / Mestre

Resumo: O Mycobacterium tuberculosis, principal agente da tuberculose (TB), é responsável pela morte anual de dois a três milhões de pessoas no mundo e por prejuízos econômicos globais de aproximadamente 12 bilhões de dólares ao ano. Estima-se que 1/3 da população mundial esteja infectada com o bacilo na forma latente. Apesar disso, nenhuma nova droga específica contra o M. tuberculosis foi desenvolvida desde 1960. O presente trabalho objetivou a investigação do potencial anti-M. tuberculosis intra e extracelular juntamente com a citotoxicidade de 66 compostos envolvendo diferentes classes de ligantes como tiossemicarbazonas, semicarbazonas, hidrazonas, diiminas, fosfinas e bases de Schiff, juntamente com dois diferentes metais (vanádio e rutênio) formando diferentes e inéditos complexos. Para as diferentes análises biológicas in vitro, 3 técnicas já padronizadas foram utilizadas para a detecção da Concentração Inibitória Mínima (CIM), da Citotoxicidade (IC50) e da Atividade Intracelular. Dos 66 compostos analisados neste trabalho, 7 complexos contendo o rutênio, cis-[RuCl2(NO)(BPA)] (G1), cis- [Ru(pic)(dppe)2]PF6 (G6), [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (G7), [Ru(pic)(dppb)(Mebipy)] PF6 (G8), [Ru(pic)(dppb)(Cl-bipy)]PF6 (G9), [Ru(pic)(dppb)(fen)] (G12), cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] (G14), foram qualificados como potenciais agentes anti- TB, porque apresentaram atividade inibitória melhor do que algumas drogas comumente utilizadas no tratamento da tuberculose, baixa citotoxicidade e alta atividade inibitória intracelular. / Abstract: The Mycobacterium tuberculosis, the major agent of tuberculosis (TB), is responsible for approximately 2-3 million deaths annually, with a global economic injury of approximately $12 billion per year. It is estimated that 1/3 of the worldwide population are infected with the latent form bacilli. Although, no new specific drug against M. tuberculosis was developed since 1960. The objective of this study was the investigation of intra and extracellular anti-M. tuberculosis activity and cytotoxicity of 66 compounds involving different class of ligants as thiosemicarbazones, semicarbazones, hydrazones, diimines, phosphines and Schiff bases with two different metals (vanadium and ruthenium) resulting different and unknown complexes. For the different biologicals in vitro analyses, three standardized techniques had been used for the detection of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC), Cytotoxicity (IC50) and Intracellular Activity. Of 66 compounds analyzed in this study, 7 complexes containing the ruthenium, cis-[RuCl2(NO)(BPA)] (G1), cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (G6), [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (G7), [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (G8), [Ru(pic)(dppb)(Cl-bipy)]PF6 (G9), [Ru(pic)(dppb)(fen)] (G12), cis- [RuCl2(dppb)(bipy)] (G14), were qualified as potential anti-TB agents, because they presented inhibitory activity better than some drugs commonly used in the TB treatment, low cytotoxicity and high intracellular inhibitory activity. / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Daisy Nakamura Sato / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Mario Hiroyuki Hirata / Mestre

Thesis (MTech (Biomedical Technology))--Cape Peninsula University of Technology, 2007. . / Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are often isolated from Human Immunodeficiency Virus (HIV) infected individuals, but there is very little information documented about the prevalence of NTM in community settings. An increase in NTM infection is also noted in HIV-negative people. Although it is as yet unknown whether the organisms cause desease in HIV-negative individuals or whether they are merely commensal organisms, their affect on HIV-positive individuals is unquestionable.

Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: Paulo Sérgio Lopes de Oliveira / Banca: Paula Regina Kuser Falcão / Banca: Jorge Chahine / Banca: José Roberto Ruggiero / Resumo: O seqüenciamento de genomas em larga escala estão nos munindo com várias informações biológicas sobre centenas de organismos. O entendimento das diferentes funções de proteínas expressas por genes obtidos nos projetos de seqüenciamento, nos leva à era pós-genômica, com a caracterização das estruturas 3D de proteínas. A determinação de estruturas de proteínas nem sempre é possível devido a limitações nas técnicas de cristalografia de raios X e RMN, tornando a utilização da modelagem molecular comparativa muito útil. O principal interesse no estudo de vias metabólicas identificadas em genomas de patógenos, é o fato de que algumas destas vias não estão presentes em humanos, o que as tornam alvos seletivos para desenho de drogas, diminuindo o impacto das drogas em humanos. O DBMODELING é um banco de dados relacional, criado para evidenciar a importância dos métodos de modelagem molecular aplicadas ao genoma do Mycobacterium tuberculosis. A motivação deste trabalho é o fato de que o M. tuberculosis é a causa de morte de milhões de pessoas no mundo, assim a caracterização estrutural de proteínas alvo para propor novas drogas tornou-se essencial. Há atualmente no banco de dados mais de 260 modelos de proteínas do genoma do M. tuberculosis e outros genomas de interesse também serão acrescentados. Este banco de dados contém uma descrição detalhada da reação catalisada, do gene e da qualidade estrutural de cada proteína, e suas coordenadas atômicas estão disponíveis para download, podendo ser acessadas em http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools. Este trabalho aumenta a certeza de que a modelagem comparativa é uma ferramenta útil em bioinformática estrutural, uma vez que não se tem acesso às estruturas determinadas experimentalmente, podendo ser valiosa na anotação de seqüências genômicas, contribuindo para a genômica estrutural e funcional, e simulações de docking proteína-ligante. / Abstract: The large-scale genome sequencing are providing us with several information about hundreds of organisms. Understanding of different protein functions expressed by genes obtained in the sequencing projects, lead us to the post-genomic era, with characterization of protein 3D structure. The determination of protein structure, is not always possible, due to limitations in X-ray crystallography and NMR techniques. This fact makes the utilization of comparative modeling very useful. The main interest in the study of metabolic pathways is the fact that some of these pathways are not present in human, which make them selective targets for drug design, decreasing the impact of drugs in humans. DBMODELING is a relational database, created to highlight the importance of molecular modeling methods applied in the Mycobacterium tuberculosis genome. The motivation of this work is the fact that M. tuberculosis is the cause of the deaths of milions of people in the world, thus the protein target structural characterization to propose new drugs became essential. There are currently in the database more than 260 protein models of the M. tuberculosis genome, and other genomes of interest will be added. This database contains a detailed description of reaction catalized, of gene and structural quality of each protein, and their atomic coordinates are available to download, can be accessed at http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools.This work increase the conviction that comparative modeling is an useful tool in structural bioinfomatics, once that we have not access to the experimentally structures determinated, can be valuable in annotating genome sequence, contributing to the structural and functional genomics, and protein-ligand docking simulations. / Doutor

Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Luiz Pedro Sorio de Carvalho / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Pedro Eduardo Almeida da Silva / Banca: Cristiano Gallina Moreira / Banca: Patrícia Bento da Silva / Banca: Leonardo Neves de Andrade / Resumo: Tuberculose (TB), com principal agente etiológico o bacilo Mycobacterium tuberculosis, é uma doença infecciosa passível de cura. Entretanto, é detentora de uma estatística mundial preocupante, e em 2014 apresentou 9,5 milhões de novos casos e 1,5 milhão de mortes. Além dos altos índices estatísticos, a TB aparece ainda associada a dois fatores agravantes: a co-infecção com HIV ("Human Immunodeficiency Virus") e a crescente emergência de linhagens resistentes aos quimioterápicos como "multi-drug resistant" (MDR) e "extensively drug resistant" (XDR), que dificultam sobremaneira o tratamento, indicando premência na pesquisa de novos fármacos. A resistência do bacilo manifesta-se a partir de eventos adquiridos (como aquisição de mutações cromossomais em genes específicos relacionados ao metabolismo de fármacos) ou intrínsecos, como uma parede celular altamente hidrofóbica (devido à grande quantidade de ácidos micólicos). Estes mecanismos de resistência são discutidos amplamente na literatura. Por outro lado, pouco se sabe a respeito da resistência devido as alterações na expressão dos genes das bombas de efluxo, responsáveis pela exclusão de fármacos, bem como dos mecanismos de resistência relacionados a halotolerância bacteriana. Neste sentido, três assuntos de relevância no combate à tuberculose foram abordados nesta tese. Como primeira frente, avaliou-se inicialmente a expressão de 5 genes codificadores de bombas de efluxo pela técnica de RT-qPCR em 12 isolados clínicos frente ao tratamento com rifampicina, principal fármaco do regime terapêutico da TB. Resultados indicaram que essas proteínas auxiliam na emergência da resistência, sendo indicados pela superexpressão dos genes frente ao tratamento. Como segunda frente avaliou-se a atividade de 15 compostos inéditos de furoxânicos e benzofuroxânicos... / Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis bacillus, presenting 9.5 million of new cases and 1.5 million of deaths in 2014. Two aggravating factors are associated with these high statistical indexes: a co-infection with HIV ("Human Immunodeficiency Virus") and the increasing emergence of resistant strains represented by MDR ("multi-drug resistant") and XDR ("extreme drug resistant") strains. The bacillus resistance manifests from acquired events (such as acquisition of chromosomal mutations in specific genes related to drug metabolism) or intrinsic, as a highly hydrophobic cell wall (due to the large amount of mycolic acids) and the action of efflux pumps (responsible for drug extrusion). Thus, the thesis project evaluated the expression of five genes encoding efflux pumps by RT-qPCR technique in 12 clinical isolates against rifampicin, the main anti-TB drug used in the standard treatment. Results indicated that these proteins contribute to the emergence of resistance, indicated by overexpression of these genes after treatment. The second part of the study evaluated the activity of 15 furoxan and benzofuroxan derivative compounds for inhibitory capacity against the M. tuberculosis, cytotoxicity in VERO cells, as well as ethidium bromide accumulation and efflux assays. Aiming evaluate their mechanism of action, microarray and assays of nitric oxide release were also done, as they are supposed nitric oxide donors and may present an action by oxidative stress and/or the activity efflux pumps inhibition. Results indicated that the class of compounds is promising for the treatment, with good inhibitory activity against bacillus and substantial degree of selectivity. Mechanism of action assays indicated activity independent of efflux inhibition, of isoniazid subunit' or nitric oxide release. Microarray pointed to changes ... / Doutor

Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Lucilaine Ferrazoli / Banca: Carmo Elias Andrade Melles / Banca: Wagner Vilegas / Banca: Antonio Carlos Massabini / Resumo: O aumento de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas utilizadas no esquema de tratamento convencional, principalmente por falha terapêutica, têm levado os pesquisadores à busca de novas drogas. Entretanto, faz-se necessário desenvolver novas metodologias para a determinação da atividade bactericida destes compostos. Este estudo descreve a padronização de uma metodologia rápida para triagem de atividade intra e extracelular de novos compostos, empregando Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 e Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801, ambas contendo o plasmídio pSMT1 com o gene luxA e luxB proveniente do Vibrio harveyi. A rifampicina e a isoniazida foram empregadas como droga de referência na padronização da técnica da luciferase extracelular, obtendo-se resultados de Concentração Inibitória Mínima de 0,03 μg/mL, para ambas as drogas, valores estes compatíveis com os da técnica de Alamar Blue. Para a padronização da técnica da luciferase intracelular foi utilizado o M. tuberculosis Erdman ATCC 35801 contendo o plasmídio pSMT internalizado em células de macrófagos J774. A droga de referência empregada foi a rifampicina obtendo-se um...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There has been an increase of Mycobacterium tuberculosis strains that are resistant to the current anti-TB agents, mainly through acquired resistance by therapeutic failure. This fact has underscored the need of a quick development of antimycobacterial drugs that are more effective than those currently in use. Moreover, new methodologies to determine the bactericidal activity of these compounds have been proposed. This study describes the use of bioluminescent strains of Mycobacterium tuberculosis H37Rv - ATCC 27974 and Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801 both containing the plasmid pSMT1 constructed with luxA and luxB genes from Vibrio harveyi in a screening to evaluate the antimycobacterial activities of anti-TB agents. Standardization of the technique was performed using isoniazid and rifampicin, as drugs standard. The results of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) were 0.03 μg/mL and 0.03 μg/mL, respectively. These values were totally compatible with those obtained by Microplate Alamar Blue Assay (MABA). Standardization of bioluminescence measurements of intracellular antimycobacterial activity was performed using the J774 murine...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:18:36Z : No. of bitstreams: 1 cavalheiro_js_me_botfmvz.pdf: 256330 bytes, checksum: f23556a464c6107559d352bd6a674722 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A tuberculose bovina é uma doença transmissível de natureza granulomatosa crônica e caráter progressivo, apresentando tubérculos característicos, tendo como agente etiológico o Mycobacterium bovis - um patógeno intracelular. A imunidade celular é o mecanismo mais efetivo para o controle da infecção por Mycobacterium spp. Esta resposta resulta no acúmulo de fagócitos e na formação de lesão macroscópica (tubérculo ou granuloma tuberculoso), na tentativa de impedir a proliferação e disseminação bacteriana. Neste trabalho foram utilizados modelos experimentais murinos, obtidos por seleção genética bidirecional de camundongos bons (High=H) e maus (Low=L) produtores de anticorpos (Seleção IVA) contra antígenos naturais complexos. Trabalhos anteriores demonstraram alterações funcionais de células imunocompetentes, particularmente de macrófagos, sugerindo que os animais HIV-A seriam mais susceptíveis à infecção causada por patógenos intracelulares, enquanto que ocorreria maior susceptibilidade dos LIV-A à infecção por patógenos extracelulares, quando a imunidade humoral seria o mecanismo mais importante... . / The bovine tuberculosis is a transmissible disease, showing a chronic and progressive character, with typic tubercles. Its etiological agent, Mycobacterium bovis, is an intracellular pathogen. Cell-mediated immunity is the most effective mechanism for this infection control, with phagocytes accumulum and formation of a macroscopic lesion, aiming to avoid the bacteria proliferation and dissemination. In this work, a murine experimental model was used, with mice genetically selected for high (H) and low (L) antibody production (Selection IV-A). Previous works related functional alterations in immunecompetent cells, manily macrophages, suggesting that HIV-A mice were more susceptible to intracellular pathogens, whereas LIV-A were more susceptible to extracellular ones, when humoral-mediated immunity would be the most important mechanism. The goal of this work was to evaluate the macrophagic activity and to characterize the immune response of Mycobacterium bovis-AN5-infected mice. The response prolife previously observed in these strains was not similar in the Mycobacterium bovis infection; however, it was in agreement with works carried out with selection I, which is very similar the selection IV-A with regards to infection with Mycobacterium tuberculosis and Bacillus Calmette-Guérin. As to the bacterial recovery, LIV-A selection showed a higher containnment of the infectious process in the lung, but not in the spleen, where HIV-A selection was more resistant. With respect the macrophagic activity, H2O2 seemed to be not involved in the containment of the infection in both strains, since there was an inibition of this metabolite generation. NO and TNF- production was also analysed, and seemed to be important in the control of bacterial replication, varying according to the strain, time period and compartiment. Antibody production was also evaluated... (Complete abstract, click electronic address below).

Os contatos de pacientes com hansenÃase à um grupo de alto risco de desenvolver a doenÃa, logo a precocidade no diagnÃstico à uma importante ferramenta para o controle da enfermidade. NÃs investigamos a presenÃa de DNA de Mycobacterium leprae, atravÃs da ReaÃÃo em Cadeia Polimerase (PCR), na mucosa nasal e anticorpos anti-PGL1 sÃricos, IgG/IgM, e salivares, IgA/IgM, por meio do ensaio imunoenzimÃtico ligado à fase sÃlida (ELISA), em contatos intradomiciliares de pacientes com hansenÃase (n=135) e seus casos Ãndices. O estudo foi realizado em duas cidades endÃmicas para a doenÃa no CearÃ, Crato e MaracanaÃ. Uma boa correlaÃÃo entre os isotipos IgA e IgM salivares e IgG sÃrico foi observada quando comparou-se os contatos intradomiciliares e seus casos Ãndices (p<0,01, p<0,005 e p<0.0001, respectivamente). Entretanto, essa relaÃÃo nÃo foi observada para IgM sÃrico anti-PGL1 (p>0,05). Observou-se alta frequÃncia de IgM sÃrico anti-PGL1 no grupo de contatos negativos para IgG sÃrico anti-PGL1 (71/121, 58,6%). Dentre os contatos positivos para IgG sÃrico anti-PGL1, o nÃvel de anticorpos sÃricos IgM anti-PGL1 positivos tambÃm foi alto (10/14, 71,4%). Em relaÃÃo aos anticorpos salivares, contatos de pacientes com a forma clÃnica PB mostraram boa correlaÃÃo entre IgA e IgM (r = 0.54, p <0.0001); o mesmo foi verificado em contatos de pacientes com a forma clÃnica MB (r = 0.61, p <0.0001). Foi observado que dos contatos positivos para os anticorpos salivares anti-PGL1, 53,3% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos negativos. Por outro lado, dos contatos que foram negativos para os anticorpos salivares, 71,1% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos positivos. O DNA de Mycobacterium leprae foi encontrado em swabs nasais de 9 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica MB da hansenÃase (10,6%) e em 3 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica PB (6.0%). NÃs concluÃmos que anÃlises quantitativas de anticorpos sÃricos e salivares anti-PGL1 em contatos de pacientes com hansenÃase sÃo necessÃrias para montar estratÃgias de levantamento de infecÃÃes subclÃnicas da hansenÃase, a fim de prevenir o desenvolvimento da doenÃa. / Leprosy household contacts are group at high risk of developing the disease. We investigated the presence M. leprae DNA in nasal mucosa and anti-PGL1 serum IgG/IgM and salivary IgA/IgM antibodies from leprosy household contacts (n=135) in two endemic regions, Ceara, Brazil. Good correlation between serum IgM and IgG isotypes was observed both in MB and in PB leprosy household contacts (r = 0.39, p <0.0001). However, their levels were much different (p <0.0001). Among the contacts positive for serum IgM, 74 (87%) were found to be negative for serum IgG. In respect to the salivary antibodies, PB leprosy household contacts showed correlation between IgA and IgM (r = 0.60, p <0.0001); the same was observed in MB leprosy contacts (r = 0.77, p <0.0001). It was observed that in 75.3% of the leprosy household contacts who were positive to serum anti-PGL1, their salivary antibodies were negative. On the other hand, 50% of the leprosy household contact who were negative to serum anti-PGL1 antibodies, their salivary antibodies were positive. M. leprae DNA was found in nasal swab in 9 MB household leprosy contacts (10.6%) and in 3 PB leprosy contacts (6.0%). We concluded that quantitative analysis of serum and salivary anti-PGL1 in leprosy contacts is necessary for mounting strategies to survey subclinical leprosy infections in order to prevent development of the disease.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-07-12T13:37:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayanny Gomes de Andrade - 2018.pdf: 3411156 bytes, checksum: cfec02b05834f880d1758da75f7a6436 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-13T10:34:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayanny Gomes de Andrade - 2018.pdf: 3411156 bytes, checksum: cfec02b05834f880d1758da75f7a6436 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T10:34:52Z (GMT). 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Thus, proteases are good targets for the development of new anti-TB drugs or as possible vaccine antigens. This work aimed to clone and express the gene Rv2467, a putative protease with aminopeptidase activity from M. tuberculosis. To achieve this goal, oligonucleotides design were made to amplify the gene Rv2467 by Polimerase Chain Reaction (PCR), which was cloned in the pGEM-T easy vector. The clone Rv2467 gene was then transfere to the expression vector pET-28a. The recombinant protein was expressed from the recombinant plasmid pET-28a/Rv2467 in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS through induction with IPTG. The recombinant protein, with the expected size of 94KDa, was expressed and subjected to the purification process by nickel affinity chromatography. The recombinant protein was partially purified only in its denatured form. The low yield of purified recombinant protein raised the possibility of histidine tail loss. To verify that, Western Blotting with anti-histidine antibody was made and it was verified that the antibody did not recognize the target Rv2467 protein, which made it impossible to acquire the pure protein, not allowing further characterization tests. Additionally, a literature review was performed about Mycobacterium tuberculosis proteases that are involved in virulence mechanisms to make a manuscript to be submitted to a scientific journal / Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose (TB), que provocou em 2015, 10,4 milhões de novos casos e 1,8 milhões de mortes registrados mundialmente. Para conseguir evadir as barreiras de defesa do hospedeiro, a bactéria evoluiu criando mecanismos que modulam ou modificam o ambiente no qual ela está inserida, sendo a secreção de moléculas bioativas uma estratégia eficiente para isso. Dentre as moléculas bioativas produzidas por M. tuberculosis, as proteases desempenham papel crucial para o sucesso da infecção, pois estão envolvidas em diversos processos biológicos importantes para a bactéria, tais como replicação do DNA, proliferação celular, processamento de antígeno, entre outros. Deste modo, as proteases se apresentam como alvo para novas drogas anti-TB ou como possíveis antígenos vacinais. Com isso, o foco deste trabalho foi clonar e expressar o produto do gene Rv2467, uma suposta protease com atividade aminopeptidase de M. tuberculosis. Para tanto foi realizado o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores para amplificar o gene Rv2467 por Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) que foi clonado no vetor pGEM-T easy. O inserto correspondendo ao gene Rv2467 foi retirado do vetor de clonagem e inserido no vetor de expressão pET-28a. A proteína recombinante foi expressa a partir do plasmídeo recombinante pET-28a/Rv2467 em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS através de indução com IPTG. A proteína recombinante, apresentando o tamanho esperado de 94 KDa, foi expressa e submetida ao processo de purificação por cromatografia de afinidade ao níquel. A purificação parcial da proteína recombinante somente foi possível de forma desnaturada, sendo que as tentativas de obtê-la de forma nativa para testar atividade resultaram improdutivas. O baixo rendimento de purificação da proteína recombinante levou a suspeitar da possível perda da cauda de histidina e, para tanto, realizou-se um Western Blotting com anticorpo anti-histidina. Ao ver a revelação na membrana verificou-se que o anticorpo não reconheceu a proteína Rv2467 o que impossibilitou obter a proteína pura não podendo seguir para futuros testes de caracterização. Além de testes para obter a proteína em sua forma nativa foi escrito um manuscrito científico de revisão da literatura sobre proteases de Mycobacterium tuberculosis envolvidas no mecanismo de virulência.

nÃo hà / A tuberculose à uma doenÃa infectocontagiosa, que persiste ao longo da histÃria mundial como um sÃrio problema de saÃde pÃblica. à causada pelo Complexo Mycobacterium tuberculosis. O MinistÃrio da SaÃde considera a tuberculose como uma doenÃa prioritÃria no Brasil, pois o mesmo ocupa o 17 lugar entre os 22 paÃses em desenvolvimento, responsÃveis por 80% dos casos mundiais dessa enfermidade. TÃm-se verificado um aumento no nÃmero de casos de resistÃncia bacteriana Ãs drogas antituberculose. Este estudo teve carÃter descritivo e foi retrospectivo dos anos de 2005 a 2007 e prospectivo de 2008 a 2009, tendo por objetivo avaliar o diagnÃstico da tuberculose e o perfil de resistÃncia Ãs drogas antituberculose em 563 exames de pacientes atendidos nos ServiÃos de SaÃde do Estado no LACEN-PI, atravÃs da cultura e teste de sensibilidade de variadas espÃcimes biolÃgicas. De 563 casos encontrados avaliados, 123 apresentaram cultura positiva, dos quais cerca de 91,8 % apresentaram a forma pulmonar da doenÃa, sendo 65 % da populaÃÃo avaliada do sexo masculino. A mÃdia da idade em anos foi de 43,97Â16,81 (1-89). Em todos os anos, os casos tratados superaram em 92,6% os casos novos. Identificou-se qualquer resistÃncia em 68 casos (55,3%). A taxa de resistÃncia primÃria e adquirida foi, 3% e 97%, respectivamente. Foi encontrado 39 casos (31,7%) de multirresistÃncia, 15 casos (12,1%) de monorresistÃncia, 14 casos (11,3%) de polirresistÃncia. Conclui-se que os nÃveis de resistÃncia encontrados sÃo elevados. Dessa forma, faz-se necessÃrios o monitoramento dos nÃveis de resistÃncia, o controle adequado dos casos de tuberculose no PiauÃ, com a ampliaÃÃo dos exames de cultura e teste de sensibilidade para o diagnÃstico precoce. TambÃm deve ser encorajado o desenvolvimento de mais pesquisas para padronizaÃÃo de novos testes de diagnÃsticos que sejam prÃtico, rÃpido, de fÃcil execuÃÃo, baixo custo que reÃna alta especificidade e sensibilidade para a doenÃa / Tuberculosis is an infectious and contagious disease which persists throughout world history as a serious public health problem. It is caused by the complex Mycobacterium tuberculosis. The Ministry of Health considers tuberculosis a priority disease in Brazil, because the country occupies the 17th place among 22 developing countries, all together responsible for 80% of the worldwide cases of this disease. There has been an increase in the number of bacterial resistance cases to antituberculosis drugs. This study was descriptive and retrospective study of the years 2005 to 2007 and prospective from 2008 to 2009, aiming to assess the diagnosis of tuberculosis and the profile of antituberculosis drug resistance tests in 563 patients treated in the Health Services of the State in LACEN -PI, through culture and sensitivity testing of various biological specimens. From 563 cases, 123 were positive to culture, of which about 91.8% had the pulmonary form of the disease, being 65% of the population in focus consisting of male sex individuals. The mean age in years was 43.97  16.81 (1 - 89). In all years, the cases treated exceeded in 92.6% the new cases. No resistance was identified in 68 cases (55.3%). The rate of primary and acquired resistance was 3% and 97% respectively. It was found 39 cases (31.7%) of multi-drug resistance, 15 cases (12.1%) of single drug resistance, and 14 cases (11.3%) of full range drug resistance. The conclusion is that levels of resistance found are high. Thus, it is necessary to monitor the resistance levels, in addition to adequate control of tuberculosis cases in PiauÃ, by expanding the culture testing and sensitivity testing for early diagnosis. It should also be encouraged to develop more research to standardize new diagnostic tests that are practical, fast, easily run, low cost and possessing high specificity and sensitivity for the disease