Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 36.pdf: 6773155 bytes, checksum: bd69a99ee0ef41b4ee959038b0d58be7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Esta Tese aborda as infecções pulmonares e extrapulmonares, os fatores associados para o adoecimento por micobactérias não tuberculosas (MNT), a diversidade e a frequência das espécies de MNT, além do diagnóstico das micobacterioses no estado de Pernambuco, região nordeste brasileira. Os resultados são apresentados em três artigos científicos que respondem a seus objetivos. O primeiro artigo destaca as lacunas no diagnóstico convencional das micobacterioses e avalia uma PCR Multiplex na diferenciação de espécies de MNT como método auxiliar no diagnóstico diferencial entre as micobacterioses e a tuberculose. O segundo trás o primeiro relato no Brasil de infecção extrapulmonar por Mycobacterium wolinskyi diagnosticada após procedimento cirúrgico invasivo em serviço privado do estado. O terceiro artigo descreve o perfil clínico, epidemiológico, laboratorial e fatores associados aos casos de micobacterioses pulmonar por MNT, como também a frequência, diversidade e perfil de resistência aos antimicrobianos das espécies de MNT no estado de Pernambuco que é sabidamente uma região endêmica para tuberculose. Conclui-se que as técnicas de biologia molecular (PCR multiplex, PRA-hsp65 e sequenciamento de genes específicos) podem ser ferramentas valiosas para identificação das espécies de micobactérias reduzindo o tempo necessário para diagnóstico correto e início do tratamento adequado. Os casos de micobacteriose extrapulmonar, no estado de Pernambuco, foram identificados em mulheres submetidas a procedimentos cirúrgicos invasivos (mamoplastia e abdominoplastia) e as espécies associadas a estes casos foram as micobactérias de crescimento rápido (MCR). Os casos de infecção pulmonar foram a maioria (84 por cento) entre as infecções por MNT no estado de Pernambuco. As principais características encontradas nestes casos foram: Sexo masculino, idade superior a 50 anos e estória de infecção prévia por tuberculose. Neste contexto, faz-se necessário o diagnóstico diferencial entre tuberculose e doença pulmonar por MNT, sobretudo em indivíduos com relato de tuberculose anterior ou que falharam o tratamento para TB

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_silva_ioc_dout_2014.pdf: 1893436 bytes, checksum: a728c60780229234c48d95aea41671ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOS O bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-\F067 medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro. Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectados Além disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção / Mononuclear phagocytes are target ed cells for pathogenic mycobacteria that gener al ly require a favorable intracellular environment in wi c h they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy , is able to subvert macrophage microbicid al mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cell modulation is not fully understood. The present study investigated the potenti al role of insulin - like growth factor - I (IGF - I) i n M. leprae pathogenesis. We showed that M. leprae induces IGF - I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose - dependent manner . Notably, only when cells were treated with a neutr al izing antibody to IGF type 1 receptor (IGF - 1R) , M. leprae infection was able to upregulate inducible nitric oxide sintase ( iNOS ) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter in cells transfected with the iNOS - luciferase reporter construct . . The blockage of IGF - I sign al ing al so decreased the intracellular M. le prae viability as measured by qPCR . Mo reover, RAW cells p re - treated with IGF - I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacteri al intracellular surviv al as accessed by colony - forming unit counts (CFU) . Of note, IGF - I was able to attenuate interferon gamma (IFN -  ) activating effects on macrophages as acessed by iNOS expression and quantification of phosphorylate d Sign al Transducers a nd Activators of Transcription 1 (p - STAT1). Addition al ly, IGF - I was able to induce PGE 2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacteri al persistence in the host. Fin al ly, i mmunohistochemic al an al ysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients reve al ed an abundant expression of IGF - I by highly infected foamy macrophages. Moreover, LL lesions reve al ed higher expression of Suppressor of cytokine sign al ing 3 (SOCS3), as well as decreased levels of p - STAT1 when compared to borderline tuberculoid (BT) lesions. Al together, our data suggest that IGF - I produced by macrophages in response to M. leprae infection constitutes a critic al regulator in subverting the immune response in leprosy

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_dout_2015.pdf: 13428594 bytes, checksum: 3b9534ef5ab8b753d140d8d49bb0c9a0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os corpúsculos lipídicos (CL), também chamados de gotas lipídicas, são organelas ricas em lipídios que tem sido frequentemente associadas às condições inflamatórias e infecciosas. O aumento no número e tamanho dessas organelas é um fenômeno bem regulado que tem sido associado com a persistência bacteriana. Nesse trabalho, nós investigamos os mecanismos pelos quais os CL induzidos pela micobactéria podem atuar em favor da infecção. Por microscopia eletrônica de transmissão (MET), nós mostramos que os CLs marcados com ADRP interagem com fagossomas durante a infecção por M. bovis bacillus Calmette-Guérin, (BCG) in vivo. Por microscopia de fluorescência, nós observamos que a interação entre os CL e os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Nós mostramos uma maior frequência de CLs em proximidade com os fagossomas contendo partículas de látex revestidas com Lipoarabinomanana (LAM) ou Fosfatidilinositol manosídeo (PIM) de M. tuberculosis (M.tb), mas não com as partículas de látex não revestidas, sugerindo um mecanismo de recrutamento de CL para próximo dos fagossomas. Partículas de látex revestidas com LAM interagem com os CL, 102,60% mais do que as partículas de látex não revestidas em macrófagos carregados com ácido oleico. Além disso, nós observamos que a Rab7, uma importante GTPase endocítica e, marcador de endossoma tardio, assim como seu efetor RILP, mas não a Rab5 co-localizou com os CL marcados por Bodipy® induzidos pela infecção com BCG em 24 h. Por MET, nós observamos a imunolocalização da Rab7 co-localizada com os CL no local de interação com um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo. De maneira interessante, nós observamos uma diminuição na aproximação das partículas revestidas com LAM e os CL após os macrófagos terem sidos tratados com CID1067700, um inibidor competitivo da Rab7 Nós observamos que o BCG e o LAM, mas não, a micobactéria não patogênica M. smegmatis, ou partículas de látex não revestidas, foram capazes de induzir a formação de CL em macrófagos in vitro. O papel dos CL na modulação da infecção micobacterianas foi avaliado pelo tratamento com C75 (inibidor de ácido graxo sintase) que modulou negativamente a formação dos CL e a síntese de PGE2 induzidos por BCG. Além disso, esse tratamento foi capaz de aumentar o TNF-\03B1 enquanto inibiu a produção de IL-10 e a sobrevivência micobacteriana, determinado por contagens de UFC. Esses resultados sugerem que a interação dos CLfagossomas é um fenômeno bem regulado e modulado pelo componente da parede micobacterina, LAM e dependente de Rab7. O sequestro da Rab7 ativa para os CL pode permitir a interação com o fagossomas e favorecer a troca de lipídios atuando como nutrientes para sobrevivência micobacteriana. Além disso, nossos resultados indicam que os CL modulam mediadores pro- e anti- inflamatórios em favor da replicação e sobrevivência do BCG. Assim, sugerindo que a inibição da formação e/ou função dos corpúsculos lipídicos como um alvo promissor para intervenções terapêuticas na infecção micobacteriana / Lipid bodies (LB) also named lipid droplets, are lipid rich organelles that have been often associated with inflammatory and infectious conditions. The increase in number and size of these organelles is a well-regulated phenomenon that have been involved with bacterial persistence. In this work, we investigated the mechanisms by which mycobacteria induced -lipid bodies may act in favor of infection. By Transmission electron microscopy (TEM), we showed ADRP-marked LB interacting with phagosomes during M. bovis bacillus Calmette- Guérin, (BCG) infection in vivo. By fluorescence microscopy we observed that the interaction between LB and phagosomes is not dependent of bacterial viability. We showed an increase in the frequency of LB proximity with phagosomes containing beads coated with Lipoarabinomannan (LAM) or Phosphatidylinositol mannoside (PIM) from M. tb, but not with non-coated beads suggesting a recruitment mechanism for LB-phagosome proximity. LAM coated beads interacts with LB 102,60% more than non- coated beads in macrophages loaded with oleic acid. Moreover, we observed that Rab7, an important endocytic GTPase and late endosome marker, as well as its effector RILP but not Rab5 was co-localized with LB stained with Bodipy® induced by BCG infection at 24 h. By MET, we observed an immunolocalization of Rab7 co-localized with LB in the site of interaction with an infected phagosome during the experimental BCG infection in vivo. Interestingly, we observed a decrease of LAM coated bead and LB apposition after macrophages were treated with CID1067700, a competitive inhibitor of Rab7. We observed that BCG and LAM, but not nonpathogenic mycobacteria M. smegmatis or non-coated latex beads, was able to induce LB formation in macrophages in vitro. Next, we evaluated the role of LB modulation on mycobacterial infection Treatment with C75 (fatty acid synthase inhibitor) down-regulated LB formation and PGE2 synthesis induced by BCG. Also, these treatment were able to enhance TNF-\03B1 while inhibit the IL-10 production and down-modulation of mycobacterial survival and growth assessed by CFU count. These results suggest that LBphagosome interaction are well-regulated phenomena modulated by mycobacteria cell wall component, LAM and dependent on Rab7. The hijack of active Rab7 to LB may enable the interaction with phagosome, and may favour the exchange of lipids acting as nutrients to mycobacterial survival. In addition, our results indicate that LB modulate proand anti- inflammatory mediators in favor of BCG survival and replication. Thus suggesting that inhibition of LB formation and/or function as a promising target for therapeutic interventions in mycobacterial infection

Made available in DSpace on 2016-05-16T13:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_lopes_ioc_dout_2015.pdf: 2822157 bytes, checksum: 7ef4250346238fec2cbc79a65607b81c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, com alto poder incapacitante. O tratamento se baseia na combinação de três drogas: dapsona, rifampicina e clofazimina, porém, a ocorrência de reações adversas (ADRs) induzidas principalmente pela dapsona (~70%) é frequentemente observada. Dentre as ADRs destacam-se: a metemoglobinemia, anemia hemolítica, a hepatite e a síndrome da dapsona. A metabolização da dapsona é baseada em reações enzimáticas de acetilação e hidroxilação, catalisadas, pelas enzimas N-acetiltransferase2 (NAT2) e hidroxilases do citocromo P450 (CYPs). Dentre os vários fatores associados à ocorrência de ADRs, o fator genético é primordial. Polimorfismos presentes em genes que codificam para enzimas metabolizadoras de drogas podem representar alto risco para este desfecho. Paralelamente, outro aspecto importante é a alta variabilidade genética ligada à etnia. O Brasil é um país composto por uma população altamente miscigenada com alta diversidade genética. Sendo a hanseníase uma doença endêmica tratada com um esquema padronizado para toda a população, a avaliação destes perfis genéticos é de fundamental relevância para a prevenção de ADRs. Este estudo teve como principal objetivo descrever a variabilidade dos genes NAT2, CYP2E1, CYP3A4 e CYP3A5 em coortes de pacientes de hanseníase provenientes das cinco diferentes macrorregiões do Brasil e realizar um estudo de associação, do tipo caso-controle, entre as variáveis genéticas presentes nesses genes com a ocorrência de reações adversas em pacientes com hanseníase em tratamento com esquemas contendo dapsona Um total de 964 indivíduos foram incluidos no estudo descritivo de NAT2 enquanto para o estudo de associação variou dependendo da região. Vinte e três SNPs de NAT2, foram identificados nas populações estudadas, dos quais sete: 191 G>A; 282 C>T; 341T>C; 481 C>T; 590 G>A; 803 A>G e 857 G>A, são os mais frequentes na população mundial. Os resultados mostraram uma predominância de alelos NAT2 associados com acetilação lenta porém variando de acordo com a região estudada. De forma semelhante, após genotipagem dos genes da família CYP450, foi observado que as frequências alélicas e genotípicas também variaram ao longo de todo território brasileiro. Os resultados mostraram que pacientes hansenianos com perfil de acetilação lenta e de hidroxilação rápida (CYP2E1), avaliados separadamente demonstraram uma associação com a ocorrência de ADRs, porém com Razões de Chance menores (2,4 e 1,9) que na análise combinada (4,08 para CYP2E1). Os perfis de hidroxilação rápida caracterizada pela presença dos alelos CYP3A5*3,CYP3A5*6 e CYP3A4*1B analisados separadamente não apresentaram associação com a ocorrência de ADRs, porém na análise combinada com o perfil de acetilação lenta, observou-se uma forte associação com este desfecho representada pelas ORs (6,4 para CYP3A5*3; 4,83 para CYP3A5*6 e 2,84 para CYP3A4*1B) sugerindo que a combinação entre os perfís fenotípicos de acetilação lenta com hidroxilação rápida representam o algorítimo ideal para uma proposta de teste preditivo a ser utilizado como suporte no tratamento da hanseníase com esquema contendo DDS / Leprosy is a chronic infectious disease with high disabling potential. The treatment is based on the combination of three drugs: dapsone, rifampicin and clofazimine, however, the occurrence of adverse drug reactions (ADRs) mainly induced by dapsone (~70%) is frequently observed with a predominance of methemoglobinemia, hemolytic anemia, hepatitis and dapsone syndrome. The dapsone metabolization is mediated by acetylation and hydroxylation enzymatic reactions catalyzed by the N-acetyltransferase 2 (NAT2) and cytochrome P450 (CYPs). Among the various factors associated with the occurrence of ADRs, the genetic factor is essential. Polymorphisms in genes encoding drug metabolizing enzymes may represent a high risk for this outcome. In paralell, another important aspect is the high genetic variability related to ethnicity. Brazil is composed of a high mixed population with high levels of genetic diversity. Being leprosy is an endemic disease which treatment is a standard regimen for the entire population, the evaluation of these genetic profiles became relevant for prevention of ADRs. The main goals of this study was to describe the genetic variability of NAT2, CYP2E1, CYP3A4 and CYP3A5 in cohorts of leprosy patients from five Brazilian geographical regions and to perform an association study (case-control) between the genetic variants present in these genes and occurrence of ADRs in leprosy patients treated with dapsone-containing schemes. A total of 964 individuals were enrolled to the descriptive study for NAT2 while for the association study the sample size varied according to the region.Twenty-three SNPs in NAT2, were identified in the study populatuion, seven of which 191 G> A; 282 C> T; 341T> C; 481 C> T; 590 G> A; 803 A> G and 857 G>A are the most frequent in the world population. The results showed a predominance of the NAT2 alleles associated with slow acetylation however, varying according to the studied region . Similarly, after genotyping of CYP450 gene family, an allele and genotype frequency variation was also observed over Brazil. The results showed that leprosy patients with slow acetylation and rapid hydroxylation profile (CYP2E1), evaluated separately showed an association with the occurrence of ADRs, but with lower Odds ratios (2.4 and 1.9) then that observed in combined analysis (4.08 CYP2E1). The fast hydroxylation profile characterized by the presence of CYP3A5*3, CYP3A5*6 and CYP3A4*1B, analyzed separately did not showed association with the occurrence of ADRs, however, the combined analysis with NAT2 slow acetylation profile showed a strong acetylation with this outcome represented by the ORs ( 6.4 for CYP3A5*3; 4.83 for CYP3A5*6 and 2.84 for CYP3A4*1B) suggesting that the combination of slow acetylation with fast hydroxylation phenotypes represent the ideal algorithm for a predictive test to be used as a support for leprosy treatment with DDS-containing regimen.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:19:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015 / Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.<br> / Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-31T03:11:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343682.pdf: 2819403 bytes, checksum: 248286588753491207623482e77331f5 (MD5) Previous issue date: 2016 / Neste trabalho estudou-se o metabolismo do Mycobacterium tuberculosis com ferramentas computacionais. Compreender a fisiologia e o metabolismo dos organismos patogênicos é de primordial importância na pesquisa e desenvolvimento de antibióticos, pois a compreensão do mecanismo de ação de uma nova droga passa pela compreensão de como a exposição do organismo ao antibiótico afeta e altera o seu metabolismo. Esse conhecimento se torna ainda mais importante em situações em que o organismo desenvolve resistência aos compostos. É sabido que o Mycobacterium tuberculosis possui um grande poder de adaptação e capacidade de desenvolver resistência a muitos dos compostos atualmente utilizados para o tratamento da tuberculose. As linhagens resistentes adaptam-se e desenvolvem a capacidade de sobreviver mesmo em presença de um composto a que antes eram susceptíveis. A sobrevivência do organismo está associada diretamente com a capacidade de manter o seu metabolismo em um estado funcional após exposto ao composto bactericida. A sobrevivência das cepas resistentes, portanto, depende de um uso diferenciado dos caminhos metabólicos. Estudar o metabolismo permite compreender a gama de variações metabólicas executadas pelo organismo para manter a sua sobrevivência. O estudo computacional do metabolismo em escala genômica apresenta entretanto diversos desafios. Três principais problemas são (1) o reduzido número de amostras em grande parte dos experimentos de bancada, devido ao alto custo da implementação e complexidade dos métodos de obtenção de dados (2) a inerente alta dimensionalidade dos dados e (3) como incorporar conhecimento biológico existente em modelos computacionais. Este trabalho busca soluções para contornar esses três problemas, com um estudo sobre geração de dados sintéticos, técnicas de estimação, e propostas de modelos com dimensionalidade reduzida e uso de informação biológica a priori em modelos computacionais. Os resultados mostram que a aplicação de técnicas computacionais para estudo de metabolismo de organismos expostos à ação de antibióticos é de fundamental importância na identificação de caminhos metabólicos de sobrevivência, além de produzir uma maior compreensão do mecanismo de ação de compostos antibióticos sobre um organismo patogênico.<br> / Abstract : In this work the metabolism of the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) was studied with computational biology tools. To understand the physiology and metabolism of pathogenic organisms is of paramount importance in antibiotics R & D, because in order to understand the mechanism of action of a new drug it is necessary to understand how exposing an organism to the antibiotics affects and alters its metabolism. Even more important is this knowledge in situations when the organism may develop resistance to the compound. It is known that the Mycobacterium tuberculosis is highly adaptable and is able to develop resistance to a great number of the anti-tubercular compounds used for tuberculosis (TB) treatment today. The resistant strains adapt and develop the ability to survive even in the presence of a bactericidal compound for which they were once susceptible. The survival of the organism is directly linked to its ability to keep metabolism in a functional state after drug exposure. Therefore, the survival of Mtb resistant strains hinges on being able to use its metabolic mechanisms in a different way. By studying metabolism one may be able to understand the large spectrum of metabolic variations performed by the organism in order to remain alive. A computational study of metabolism in a genomic-scale however presents a number of challenges. Three main difficulties that arise are: (1) the small number of samples available in the majority of wetlab experiments, due to high cost and complexity of methods used for experimental data gathering, (2) the high dimensionality of the data and (3) how to incorporate available biological knowledge in computational models. This work has searched for solutions to overcome these three problems with a study on synthetic data generation, estimation tools, models with reduced dimensionality, and with inclusion of a priori biological knowledge. The results show that the use of computational techniques to study the metabolism of organisms exposed to antibiotics is of fundamental importance for identification of metabolic pathways used for survival and also for producing a better understanding of the mechanism of action of antibiotic compounds on a pathogenic organism.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:11Z : No. of bitstreams: 1 000850658.pdf: 2276941 bytes, checksum: 13c29afa33557110baf35e9a370a42d4 (MD5) / O município de Rondonópolis, no Mato Grosso é altamente endêmico para a hanseníase, apesar da existência de serviços qualificados para o diagnóstico e acompanhamento dos casos e a implementação da poliquimioterapia. Para resolver este paradoxo, um estudo completo de epidemiologia molecular foi iniciado. Questionários estruturados, incluindo detalhes clínicos, residencial, demográficas e ocupacionais, amostras biópsias de pele e outros exames laboratoriais para diagnóstico foram coletadas para 260 pacientes diagnosticados no período de 2007-2010. Genótipos de Mycobacterium leprae foram determinados pela a análise por STRs e tipagem de SNP utilizando DNA extraído de biópsias de pele antes de iniciar o tratamento. GoogleMaps foi utilizado para localizar os pacientes. A média de idade dos pacientes variou na faixa dos 11 aos 90 anos e incluiu a 137 homens e 123 mulheres. De acordo com a classificação Ridley & Jopling observamos um predomínio das formas TT (39%) e BT (33%), seguido por BB (19%), BL (5%), LL (3%) e I (1%). A cidade é essencialmente urbana, com 200.000 habitantes e os pacientes estavam distribuídos em 106 bairros. Bairros de alta endemicidade englobando bairros vizinhos puderam ser detectados. Das 260 amostras de DNA de biópsias foram analisadas por meio de 17 loci STRs, 15 loci foram polimórficos (2-23 alelos), enquanto que os loci de 6-3A e 21- 3 foram invariáveis. Quando foram analisados os genótipos do SNP observou-se que 77% (n = 200) foram genótipo 3, 16% (n = 41), o genótipo 4, 1,5% (n = 4), o genótipo 1 e 3, 8% (n = 10 ) genótipo 2. Duas amostras (0,76%) para diferenciar o genótipo 1 do 2 na análise de seqüenciamento foi inconclusivo e em outras três amostras (1,15%) não obtivemos amplificação. Por meio da análise filogenética, observou-se uma estrutura populacional composta por alguns subgrupos. Vários isolados tipados por STRs foram encontrados em cada um dos bairros. Diversidade... / The municipality of Rondonópolis, in Mato Grosso is highly endemic for leprosy despite the existence of qualified services for diagnosis and monitoring of cases and the implementation of multidrug therapy. To address this paradox, a comprehensive molecular epidemiology study was initiated. Structured questionnaires including clinical, residential, demographic, and occupational details and skin samples for diagnosis and laboratory tests were collected for 260 patients diagnosed during the period of 2007-2010. Genotypes of Mycobacterium leprae were determined using STR analysis and SNP typing using DNA extracts from skin biopsies taken before starting treatment. GoogleMaps was used to localize patients. The patients ranging in age from 11 to 90 years included 137 males and 123 females. According to the classification of Ridley & Jopling observed a predominance of forms TT (39%) and BT (33%), followed by BB (19%), BL (5%), LL (3%) and I (1%). The city is primarily urban with 200,000 inhabitants and the patients could be assigned to 106 smaller units (villages). Neighborhoods of high endemicity encompassing adjoining villages could be detected. Of the 260 biopsy DNA samples analyzed across 17 STR loci, 15 loci were polymorphic (2-23 alleles), while the loci 6-3a and 21-3 were not. When we analyzed the genotypes of the SNP we observed that 77% (n = 200) were genotype 3: 16% (n = 41) genotype 4, 1.5% (n = 4) genotype 1 and 3, 8% (n = 10) 2 genotype. Two samples (0.76%) to differentiate genotype 1 and 2 the sequencing analysis was inconclusive and the other three samples (1.15%) did not amplification. Through phylogenetic analysis, we observed a particular population structure composed of some subgroups. Multiple STR strain types are found in each of the neighborhoods. Genetic diversity within and among the neighborhoods does not reveal a distinct population structure. Spatial clustering of patients is likely a consequence of socio-economic ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-28Bitstream added on 2014-06-13T20:55:07Z : No. of bitstreams: 1 tiveron_tg_me_botfmvz.pdf: 943287 bytes, checksum: 0700299366e235cf95f5bad0fd1b22ff (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A tuberculose bovina é causada principalmente pelo Mycobacterium bovis, uma enfermidade mundialmente reconhecida que além de ser um problema de saúde pública proporciona grandes perdas econômicas e impactos negativos ao mercado internacional da carne. O objetivo deste trabalho foi observar a prevalência de lesões sugestivas de tuberculose em um frigorífico localizado na região sudeste do estado de São Paulo, Brasil. Os dados foram coletados a partir das papeletas do serviço de Inspeção Federal, nas quais observou-se a proporção de positividade de tuberculose bovina quanto ao sexo do animal, ao tipo de lesão e a classificação dos linfonodos. Os resultados avaliados demonstraram que não houve uma diferença relevante nos índices de positividade quanto ao sexo masculino e feminino nos animais abatidos nem quanto às lesões calcificadas e caseosas. Porém, os linfonodos mais acometidos foram os retrofaringeanos e mediastínicos; que entre os anos de 2.007 e 2.011, respectivamente, os retrofaríngeos apresentaram prevalência de 55,42%, 53,62%, 53,20%, 47,01%, 44,16% e os mediastínicos, revelou uma prevalência de 36,06%; 39,05%, 38,43%, 36,53% e 35,93%. No entanto, os demais linfonodos como traqueo-brônquico, parotidiano, esofagiano, hepático, apical e mesentéricos não obtiveram grandes índices. O presente estudo demonstra a importância do exame post-mortem e dos mapas nosográficos nos estabelecimentos matadouro-frigorífico para identificar os animais infectados, controlar a doença e promover a Saúde Pública / Bovine tuberculosis is caused mainly by Mycobacterium bovis, a globally recognized disease that besides being a public health problem is of great economic loss and negative impact on the international meat market. This study aimed to observe the prevalence of lesions that suggest tuberculosis in a refrigerator located in the southeastern state of Sao Paulo, Brazil. Data were collected from the ballots of Federal Inspection and a proportion of positive bovine tuberculosis on the sex of the animal, the type of injury and classification of lymph nodes were observed. The evaluated results showed that there was no significant difference in rates of positivity about the male and female animals slaughtered and the calcified and caseous lesions. But the lymph nodes were the most affected retropharyngeal and mediastinal that between the years 2007 and 2011, respectively, the retropharyngeal presented the prevalence of 55.42%, 53.62%, 53.20%, 47.01%, 44, 16% and mediastinal revealed a prevalence of 36.06%, 39.05%, 38.43%, 36.53% and 35.93%. Further as tracheo-bronchial lymph nodes, parotid, esophageal, liver, and mesenteric apical was also evaluated but did not get great rates. The present study demonstrates the importance of post-mortem examination and maps nosographic slaughter and fridgeestablishments to identify infected animals to control disease and to promote public health

Orientadora: Profª. Drª. Sonia Mara Raboni / Co-orientadora: Profª. Drª. Libera Maria Dalla Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 31/10/2014 / Inclui referências / Resumo: Indivíduos infectados com M. tuberculosis (MTB) sem doença ativa têm infecção latente por tuberculose (ILTB). Pacientes portadores de HIV, por serem imunodeprimidos, são mais propensos a desenvolver TB ativa. A identificação da ILTB permite a intervenção precoce com o uso de quimioprofilaxia e, consequentemente, contribui para uma menor morbidade e mortalidade neste grupo de pacientes. A prova tuberculínica (PT) mantém-se como o método padrão-ouro para diagnóstico de ILTB, apesar de apresentar limitações técnicas. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do teste imunológico QuantiFERON TB Gold In Tube®, que se baseia na avaliação da resposta do gama interferon para antígenos específicos de MTB, para diagnóstico de ILTB em pacientes com HIV residentes em um país com alta incidência de tuberculose, comparando estes achados com os resultados da PT. Realizou-se um estudo de Coorte, que incluiu 140 pacientes, que foram acompanhados por um período médio de 12 meses (6 a 21 meses). Um total de 115 (82%) e nove (6,4%) pacientes apresentou ambos os testes negativos e positivos, respectivamente. Entre os resultados discordantes observou-se em 12 (8,6%) pacientes IGRA positivo com PT negativa e em quatro (3%) pacientes resultados de IGRA negativo com PT positiva. O coeficiente de Cohen Kappa foi de 0,214, mostrando uma concordância pobre entre as duas técnicas. Comparando os resultados obtidos em ambos os testes, pode-se verificar que não houve evidência estatística de que um ou outro método seja superior (p = 0,08). Não foi observada nenhuma correlação entre os resultados de IGRA e PT e os valores de LT CD4+, embora em pacientes com maior imunossupressão (LT CD4+ <300 células/mm3) observamos testes IGRA positivos e PT não reatoras. No período de acompanhamento, um paciente que apresentava PT e IGRA negativos evoluiu para morte por septicemia, e outro com resultados discordantes (IGRA+/PT-) apresentou conversão da PT. Avaliando as características de desempenho do IGRA, considerando PT como o teste padrão-ouro, a sensibilidade observada foi em torno de 70%, com especificidade de 90%. Considerando os resultados de ambos os testes como verdadeiro positivo, um aumento de 8% na positividade pode ser observado. O tratamento da ILTB neste grupo de pacientes poderá ter impacto sobre a taxa de tuberculose ativa e sobrevivência de portadores do HIV, porém isso ainda precisa ser avaliado ao longo dos anos. Palavras-chave: HIV, Mycobacterium tuberculosis, teste tuberculínico / Abstract: Individual infected with M. tuberculosis (MTB) without active disease can present latent tuberculosis infection (LTBI). These patients in the context of impaired immune systems, such as HIV+, are more likely to progress to active TB. Identification of LTBI allows early intervention with the use of chemoprophylaxis, consequently contributing to a lower morbidity and mortality in this group of patients. Tuberculin skin test (TST) has remained as gold standard method to diagnosis LTBI, despite it presents technical limitations. The aim of this study was to assess the performance of the new immunological test Quantiferon TB Gold in tube, which is based on evaluating the IFN-gamma response to specific MTB antigens, to LTBI diagnosis on HIV patients from a country with high-tuberculosis burden, comparing the findings with TST results. It was a cohort study that included 140 patients, who are followed up for 21 months. A total of 115 (82%) and 9 (6.4%) patients had both tests negative and positive, respectively. Disagreement results occurred in 12 (8.6%) patients, whom had IGRA positive with negative TST and 4 (3%) patients that showed positive TST with negative IGRA. The Cohen Kappa coefficient found was 0.214, showing a poor concordance between both techniques. Comparing the results obtained by both tests, there was no statistical evidence that either method is different, because of the discrepancies occurred in a statistically identical manner (p = 0,08). None correlation between the results and CD4+ LT values was observed, though in patients with lowers CD4+ LT values (<300 cell/mm3) only IGRA tests were positive. In the period of follow up one patient, that presented both negative tests, evolved to death from sepsis, and another with discordant results (IGRA+/TST-) presented TST conversion. Evaluating the operational characteristics of IGRA, considering TST as the gold standard test, the sensitivity observed was around 70% and the specificity 90%. Considering the results of both tests as true positive an incremental of 8% in the positivity could be observed. If the LTBI treatment in this group of patients will have some impact on the rate of active tuberculosis and survival of HIV carriers still need to be evaluated over the years. Keywords: HIV, Mycobacterium tuberculosis, tuberculin skin test.