Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma

Orientadores: Carmem Silvia Passos Lima, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T04:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ortega_ManoelaMarques_D.pdf: 8882093 bytes, checksum: 7322fec26906786406c5385e9ac32926 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O mieloma múltiplo (MM) é uma doença neoplásica caracterizada pelo acúmulo de plasmócitos na medula óssea (MO) com conseqüente osteólise, comprometimento da hematopoese e da síntese das imunoglobulinas normais e com a produção de imunoglobulina monoclonal ou de seus fragmentos. A sobrevida observada para pacientes com a doença varia de alguns meses a dez anos ou mais, o que impõe a busca de fatores prognósticos para a identificação de grupos que devam receber tratamento mais agressivo para o controle da doença. As anormalidades do cariótipo foram descritas, em geral, como fatores com valor prognóstico desfavorável. Por outro lado, não se encontram suficientemente estabelecidos os valores prognósticos das anormalidades numéricas do cromossomo 17 e das deleções e mutações do gene p53 em pacientes com MM. Frente ao exposto, estes constituíram os objetivos deste estudo. Para cumprir tais objetivos, foram avaliados 60 pacientes com MM no período de março de 1999 a dezembro de 2000. A avaliação das anormalidades numéricas do cromossomo 17 foi realizada por meio da análise citogenética convencional e do método de hibridização in situ com fluorescência (FISH), enquanto que a avaliação das deleções do gene foi realizada por meio do método FISH. As mutações do gene p53 foram investigadas por meio da reação em cadeia da polimerase, do polimorfismo de conformação em hélice simples e de seqüenciamento. Não foram identificadas mutações do gene p53 em qualquer dos pacientes incluídos no estudo. Em contraste, as deleções do gene, predominantemente monoalélicas, foram identificadas em 15,7% deles. Observamos ainda, que os pacientes com a deleção do gene p53 apresentaram menor probabilidade de sobrevida do que aqueles sem a deleção do gene (P= 0,0006). A mediana dos tempos de sobrevida global de pacientes do primeiro grupo foi menor do que a observada em pacientes do segundo grupo (7,5 e 17,0 meses, respectivamente; P= 0,05). Frente a estes resultados, pudemos concluir que a deleção do gene p53 constituiu um fator preditivo de menor sObrevida,em nossos casos / Abstract: Multiple myeloma (MM) is a neoplastic disease characterized by the accumulation of plasma cells in the bone marrow (BM) with consequent osteolysis, comprimising hematopoiesis and the synthesis of normal immunoglobins and the production of monoclonal immunoglobin or its fragments. The survival observed for patients with the disease varies from a few months to ten years or more, which makes the search for prognostic factors for the identification of groups which require more aggressive treatment for the control of the disease. Abnormalities of the karyotype have been described, in general, as factors with desfavorable prognostic value. On the other hand, the prognostic values of the numerical abnormalities of chromosome 17, and of the deletions and mutations of the p53 gene have not been sufficientJy established as prognostic values in patients with MM.Thus, these were the objectives of this study. To view these objectives, 60 patients with MM were evaluated in the period of March, 1999 to December, 2000. The evaluation of the numerical abnormalities of chromossome 17 was performed by cytogenetic analysis and by the fluorescence in situ hybridization method (FISH), whilst the evaluation of p53 deletions was performed by FISH. The evaluation of p53 gene mutations was carried out using polymerase chain reaction, single strand conformation polymorphism and the sequencing. No mutations in the p53 gene were detected in any of the patients enroled in the study. In contrast, deletions of the gene, predominantly monoallelic, were identified in 15.7% of them. Furthermore, we observed that patients with p53 deletions demonstrated a lower probability of survival than those without gene deletion (P=0.0006). The median survival time of the patients of the first group was lower than that observed in the second group of patients (7.5 and 17.0 months, respectively; P= 0.05). From these results, we may condude that deletion of the p53 gene constituted a predictive factor of shorter survival, in our cases / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Oxisteróis são derivados oxigenados do colesterol que podem ser formados por autoxidação ou por atividade de enzimas específicas. Eles apresentam inúmeras atividades biológicas, incluindo inibição da proliferação celular e citotoxicidade. Dentre os oxisteróis, 7-cetocolesterol (7-KC), que difere do colesterol por apresentar um grupamento cetônico no carbono 7, é conhecido por induzir morte celular por diferentes vias. Neste projeto de pesquisa pretendemos avaliar o uso de uma emulsão lipídica contendo oxisterol (OXLE) como veículo para entrega de 7-KC a células tumorais. Os efeitos tóxicos de OXLE foram avaliados nas linhagem celulares RPMI 8226 (mieloma múltiplo) e B16F10 (melanoma). As células foram tratadas com: a) uma emulsão conhecida por atuar funcionalmente como a LDL (LDE); b) OXLE (75 uM até 225 uM de 7-KC); c) 7-KC (100 uM). As distribuições das células nas diferentes fases do ciclo de duplicação celulares foram analisadas por citometria de fluxo com iodeto de propídio. Todos os tratamentos, nestas concentrações, levaram a acúmulo das células de mieloma na fase proliferativa do ciclo celular. Para analisar a resposta apoptótica, nos utilizamos o fluorocromo JC-1, que mede o potencial transmembranar mitocondrial. Ambas a linhagens celulares, quando tratadas com OXLE, apresentaram hiperpolarização do potencial transmembranar associado com progressivo decrescimento do mesmo. Os resultados mostram que os grupos OXLE e 7-KC induziram a uma morte massiva das células de mieloma. OXLE induziu um efeito citostático nas células de melanoma, caracterizadas por alterações de morfologia, com um aumento na polimerização das fibras de actina, hiperpolarização seguida de perda do potencial transmitocondrial (apoptose associada à despolarização) , presença de vacúolos autofágicos como figuras de mielina (morte celular programada do tipo II - Autofagia); e impossibilitando as células de fazer a citocinese, determinado pelo aparecimento de uma população de células poliplóides. Nossos resultados indicam que esta nova emulsão contendo um oxisterol em sua formulação não é apenas um veículo para moléculas hidrofóbicas, mas pode atuar como agente cistotático/citotóxico. A morte mediada por OXLE possui características de apoptose e autofagia. Estes resultados são promissores e o possível use de OXLE in vivo necessita de futuras investigações. / Oxysterols are oxygenated derivatives of cholesterol that may be formed by autoxidation or by action of specific enzymes. They exhibit a number of biologic activities including inhibition of cellular proliferation and cytotoxicity. Among oxysterols, 7-ketocholesterol (7-KC), that differs form cholesterol by a functional ketone group at C7, is known to induce cell death by different ways. Herein we evaluated the use of an oxysterol-containing lipid emulsion(OXLE) as a vehicle to deliver 7-KC to tumor cells. OXLE was evaluated regarding its toxicity on RPMI 8226 (multiple myeloma) and B16F10 (melanoma) cell lines. Cells were treated with: a) an emulsion known to act functionally as LDL (LDE); b) OXLE (75 uM to 225uM of 7KC); c) 7KC (100uM). The distribution of cells in the different phases of cell cycle was analyzed by flow cytometry with propidium iodide. All treatments, according to the concentrations, led the myeloma cells to an arrest in the proliferative phases of the cell cycle. To analyze the apoptotic response, we then used a fluorochrome (JC-1), which measures the mitochondrial transmembrane potential. Both cell lines when treated with OXLE had a hyperpolarization of the transmembrane potential that decrease progressively. The results showed that exposure to either OXLE or 7-KC induced a massive death of myeloma cells. OXLE had an cytostatic effect on melanoma cells characterized by morphologic alterations as increased polymerization of actin fibers; hyperpolarization followed by a dissipation of the mitochondrial transmembrane potential (apoptosis-associated depolarization); presence of IX autophagic vacuoles as myelin figures (programmed cell death type II - Autophagy); and impaired cytokinesis, as determined by the emergence of a polyploid population. Our results indicated that this new oxysterol-containing emulsion is not only a carrier for hydrophobic molecules, but it can act itself as a cytostatic/cytotoxic agent. Cell death mediated by OXLE have both apoptosis and autophagy characteristics. These results are promising and the possible use of OxLE in vivo warrants further investigation

Le Myélome Multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération de plasmocytes tumoraux médullaires. MYC occupe un rôle central dans l'oncogenèse du MM car son activation est responsable de la progression du stade précurseur de MGUS en MM symptomatique. Dans ce travail, nous rapportons que l’expression de LIN28B est corrélée à celle de MYC et est associée à un mauvais pronostic dans le MM. Nous montrons que l'axe LIN28B/let-7 module l'expression de l’ARNm de MYC, lui-même cible de let-7. De plus, la perturbation de l'axe LIN28B/let-7 induit une régulation la prolifération des lignées cellulaires de MM in vitro et in vivo. L'analyse par séquençage d’ARN de modèles de KO par utilisation de la technologie CRISPR a montré que l'axe LIN28B/let-7 régule les voies de signalisation de MYC et du cycle cellulaire dans MM. Nous avons de plus établi une preuve de principe thérapeutique de la possibilité de cibler MYC par l’emploi de LNA-GapmeR contenant une séquence analogue à let-7b. Dans un modèle de xénogreffe murin, nous montrons que des niveaux élevés d'expression de let-7, par administration de LNA-GapmeR let-7b, répriment la croissance tumorale en régulant l’expression de MYC. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme de ciblage thérapeutique de MYC via l'axe LIN28B/let-7 dans MM. Nous nous sommes ensuite intéressés à évaluer de nouvelles formes de biomarqueurs moléculaires dans le MM par étude des miARN contenus dans les exosomes circulants. Nous avons examiné le rôle pronostique des miARN exosomaux dans une cohorte de 156 échantillons de patients uniformément traités pour un MM au diagnostic. Après analyse du profil de miARN exosomaux par séquençage de nouvelle génération, nous avons utilisé technique de qRT-PCR pour étudier la corrélation entre le niveau d’expression de 22 miARN et la survie sans progression (SSP) et la survie globale (SG). Deux miARN, à savoir let-7b et miR-18a, étaient significativement associés à la SSP et SG en analyse univariée, et étaient statistiquement significatifs après ajustement pour le système international de stratification du risque (ISS) et les marqueurs cytogénétique en analyse multivariée. Nos résultats confirment le niveau d’expression des miARN let-7b et miR-18a au sein des exosomes circulants permettent d’améliorer la stratification du risque chez les patients atteints de MM. Enfin, pour mieux comprendre le programme oncogénique piloté par MYC, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique d’une librairie de petites sur des lignées cellulaires avec une forte expression de MYC, dans le MM. Les résultats ont permis d’identifier les rocaglates, une famille de composés inhibant l’initiation de la traduction, comme étant les plus actifs. L’étude du profil transcriptionnel par séquençage de l’ARN de lignées cellulaires de MM traitées par CMLD010509 ou DMSO a révélé l’activation d’un programme de transcription et l’inhibition d’un programme traductionnel, caractéristique de l’inactivation de HSF1 secondaire à l’inhibition de la traduction. Le profile traductionnel était étudié par spectrométrie de masse quantitative, permettant d’identifier un ensemble de protéines, tels que MYC, MDM2, CCND1, MAF et MCL-1, spécifiquement affectées par l’inhibition de la traduction liée au composé CMLD010509 dans le MM. Nous avons confirmé l’efficacité thérapeutique des rocaglates dans plusieurs modèles murins de MM. Ces résultats démontrent la possibilité de cibler le programme de traduction oncogénique lié à MYC dans MM. / MYC is a major oncogenic driver of Multiple Myeloma (MM) and yet almost no therapeutic agents exist that target MYC in MM. Here we report that the let-7 biogenesis inhibitor LIN28B correlates with MYC expression in MM and is associated with adverse outcome. We also demonstrate that the LIN28B/let-7 axis modulates the expression of MYC, itself a let-7 target. Further, perturbation of the axis regulates the proliferation of MM cells in vivo in a xenograft tumor model. RNA-sequencing and gene set enrichment analyses of CRISPR-engineered cells suggested that the LIN28/let-7 axis regulates MYC and cell cycle pathways in MM. We provide proof of principle for therapeutic regulation of MYC through let-7 with an LNA-GapmeR (locked nucleic acid-GapmeR) containing a let-7b mimic in vivo, demonstrating that high levels of let-7 expression repress tumor growth by regulating MYC expression. These findings reveal a novel mechanism of therapeutic targeting of MYC through the LIN28B/let-7 axis in MM. We next sought to establish new biomarkers in MM, enable to capture the molecular alterations of the disease. For this purpose, we examined the prognostic significance of circulating exosomal microRNAs (miRNAs) in a cohort of 156 patients with newly diagnosed MM, uniformly treated and followed. Circulating exosomal miRNAs were isolated and used to perform small RNA sequencing analysis on 10 samples and a qRT-PCR array on 156 samples. We studied the relationship between miRNA levels and patient outcomes including progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). We identified miRNAs as the most predominant small RNAs present in exosomes isolated from the serum of MM patients and healthy controls by small RNA sequencing of circulating exosomes and used a qRT-PCR assay to measure the expression of 22 exosomal miRNAs. Two of them, namely let-7b and miR-18a, were significantly associated with both PFS and OS in the univariate analysis, and were still statistically significant after adjusting for the International Staging System (ISS), and adverse cytogenetics in the multivariate analysis. Our findings support the use of circulating exosomal let-7b and miR-18a improves the identification of patients with newly diagnosed MM with poor outcomes. Finally, to better understand the oncogenic program driven by MYC and investigate its potential as a therapeutic target, we screened a chemically diverse small molecule library for anti-MM activity in cell lines with high expression of MYC. The most potent hits identified were rocaglate-scaffold inhibitors of translation initiation. Expression profiling of MM cells revealed reversion of the oncogenic MYC-driven transcriptional program by CMLD010509, the most promising rocaglate. Proteome-wide, reversion correlated with selective depletion of short-lived proteins that are key to MM growth and survival, most notably MYC, MDM2, CCND1, MAF, and MCL-1. The efficacy of CMLD010509 in several mouse models of MM confirmed the therapeutic relevance of these findings in vivo and supports the feasibility of targeting the oncogenic MYC-driven translation program in MM with rocaglates.

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne de la lignée B qui se manifeste par <p>une accumulation de plasmocytes monoclonaux dans la moelle osseuse. Le MM se caractérise par <p>la nature inéluctable de ses rechutes de plus en plus réfractaires au traitement. Au sein de la moelle <p>osseuse, les cellules malignes interagissent avec leur microenvironnement notamment composé de <p>cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Les CSM apportent un soutien aux cellules <p>plasmocytaires (PC) malignes via des interactions cellulaires directes (VLA-4, VCAM-1, CD44,…) <p>ou par la production de cytokines (IL-6, SDF1, VEGF,…). De ces interactions résulte l’apparition <p>d’altérations constitutives au sein des MM-CSM telles qu’une production réduite de dépôts de <p>calcium et une augmentation de la sécrétion de nombreux facteurs (IL-6, GDF-15, etc.). <p>L’objectif de ce travail est de mieux caractériser les anomalies constitutives (génomiques, <p>prolifératives, immunomodulatrices, etc.) des MM-CSM et d'évaluer l’impact des traitements reçus <p>par les patients sur ces anomalies. Ces analyses permettront de mieux définir le rôle des CSM dans <p>la physiopathologie et la progression de la maladie afin de mettre en évidence d’éventuelles cibles <p>thérapeutiques.<p>Compte tenu de l’altération de nombreux acteurs du cycle cellulaire mise en évidence par <p>notre analyse du profil d’expression génique des MM-CSM après comparaison avec celui des CSM <p>de donneurs sains (DS-CSM), nous avons décidé d’étudier leurs capacités prolifératives. Nos <p>observations démontrent que a) les MM-CSM sont caractérisées par une réduction de leur <p>clonogénicité et par un temps de doublement plus important par rapport aux DS-CSM b) l’entrée <p>précoce des MM-CSM en sénescence est confirmée par l'augmentation drastique du nombre de <p>cellules exprimant la « senescence-associated β-galactosidase », par l’augmentation de la taille <p>cellulaire, par l’expression spécifique de membres du « senescence-associated secretory profile » <p>(SASP) et par la surexpression de TP53 et TP21, deux facteurs importants du cycle cellulaire et de <p>la sénescence c) l’ostéoblastogenèse des MM-CSM est altérée en raison de ce processus de <p>sénescence, à savoir, une réduction de la production de calcium et une hausse précoce de l’activité<p>de la phosphatase alcaline des MM-CSM par rapport aux DS-CSM d) l’activité de support à <p>l’hématopoïèse des MM-CSM est augmentée (« increased Blast-Colony Forming Cells and LongTerm Culture Initiating Cells »). <p>Dans la seconde partie de ce travail, on s’est intéressée plus particulièrement aux capacités <p>immunomodulatrices des MM-CSM. Nous avons observé, par réaction mixte lymphocytaire et <p>stimulation mitogénique (PHA/IL-2), a) une réduction de l’inhibition de la prolifération des <p>lymphocytes T activés en présence de MM-CSM par rapport aux DS-CSM b) une inversion du ratio <p>Th17/Treg lorsque des lymphocytes T activés sont cultivés en présence de MM-CSM par rapport <p>aux DS-CSM ;les mécanismes potentiellement impliqués dans ces altérations ont été investigués c)<p>les MM-CSM présentaient une expression anormale du CD40/40L, VCAM1, ICAM-1, LFA-3 <p>HLA-DR et HLA-ABC et des taux d’IL-6 et d’IL-10 altérés ont été mesuré dans le milieu de <p>culture lorsque les lymphocytes T activés étaient cultivés en présence de MM-CSM par rapport aux <p>DS-CSM. <p>Nos résultats suggèrent que les MM-CSM entrent précocement en sénescence avec de <p>profondes altérations de leurs propriétés biologiques et notamment leur capacités <p>d'immunomodulation et de différenciation ostéogénique. Nous concluons que l’entrée en <p>sénescence des MM-CSM pourrait être à l’origine d’une altération du microenvironnement tumoral <p>qui favoriserait rechutes et résistances aux traitements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Multiple myeloma and its aggressive variant, plasma cell leukemia, are still considered to be incurable diseases despite the progressive treatment approaches comprising novel drugs. This can be attributed to the presence of the bone marrow microenvironment which plays an important role in drug resistance of myeloma cells. Hematopoietic cell lines derived from hematologic malignancies are suitable models for the study of etiopathogenesis of these malignant diseases and for testing new potential drugs. Establishment of these cell lines is still considered to be coincidental and rare event. The first part of the thesis is focused on establishment and characterization of the cell line UHKT-944 derived from a patient with primary plasma cell leukemia, and on completion of characterization of the cell line UHKT-893 derived from a patient with multiple myeloma. Additional analysis of UHKT-893 cell line were performed including sequence analysis of IgVH gene rearrangements and cytogenetic analysis which contributed to more detailed characterization of this cell line. During cultivation of UHKT-944 cells, we monitored the cell growth and confirmed dependence on interleukin-6 (IL-6). Immunophenotype analysis revealed the presence of surface markers characteristic of malignant plasma cells. UHKT-944 cells...

The hepatitis C virus (HCV) was characterised in 1989. HCV was transmitted through transfusion of blood/blood products, but injection drug use is now the most common route of transmission. The infection is usually asymptomatic but becomes chronic in about 75%, and in 20 years 15-25% develops liver cirrhosis, with a risk for liver failure and liver cancer. HCV has also been associated with lymphoproliferative disorders. The aim of this thesis was to study morbidity and mortality in a national, population-based cohort of HCV-infected individuals. The study population consisted of all persons with a diagnosed HCV-infection recorded in the national surveillance database. This file was linked to other national registers to obtain information of emigration, deaths, cancers, and inpatient care. All personal identifiers were removed before analysis. In Paper I the standardized incidence ratios (SIR) for Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma (NHL), multiple myeloma, acute and chronic lymphatic leukaemia, and thyroid cancer were studied. In the HCV-cohort (n: 27,150) there was a doubled risk for NHL and multiple myeloma in patients infected for more than 15 years, compared with the general population (age-, sex- and calendar-year specific incidence rates). The results strengthened these earlier controversial associations. The SIR and also the absolute risk for primary liver cancer were estimated in Paper II. In the HCV-cohort (n: 36,126) the individuals infected for more than 25 years had a more than 40 times increased risk for liver cancer compared with the general population. The absolute risk of primary liver cancer was 7% within 40 years of HCV-infection. Mortality and cause of death were studied in Paper III. The standardized mortality ratio (SMR) demonstrated a 5.8 times excess mortality in the HCV-cohort (n: 34,235) compared with the general population, and a 35.5 times excess mortality from liver disease. Deaths from illicit drugs and external reasons were common in young adults. Paper IV presents a study of inpatient care. The HCV-cohort (n: 43,000) was compared with a matched reference population (n: 215,000). Cox regression was used to estimate the likelihood, a hazard ratio, for admission to hospital, and frequencies and rates to estimate the total burden. In the HCV-cohort inpatient care was high and about 50% was psychiatric, often drug-related care. The likelihood for liver-related admissions was very high, and serious liver complications increased in the 2000s, indicating that HCV-associated liver disease will increase the next decade. In the 2000s, about 1000 individuals per year were treated with HCV-combination therapy. To conclude, the risk for NHL and multiple myeloma was doubled, and liver- and drug-related morbidity and mortality was very high in the HCV-cohort. Serious liver complications increased in the 2000s and will probably increase the coming decade.

Das multiple Myelom ist eine seltene maligne Knochenerkrankung bei insbesondere älteren Menschen. Dabei vermehren sich im Knochenmark in hohem Maße unkontrolliert entartete Plasmazellen. Diese Myelomzellen unterdrücken einerseits die Bildung von normalen Plasmazellen, andererseits wird das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und –abbau empfindlich gestört, woraus eine erhöhte Knochenresorption resultiert. Neben den bisher angewandten Chemo- und Strahlentherapien gewinnen innovative Medikamente, wie Proteasominhibitoren und Bisphosphonate, in der Therapie an Bedeutung. Diese Medikamente reduzieren das Myelomzellwachstum und wirken hemmend auf den Knochenabbau. Durch das Auffüllen von durch Resorptionsprozesse geschädigten Knochendefekten mit wirkstoffbeladenen Calciumphosphatzementen (CPC) wird nicht nur der Knochen stabilisiert, sondern im Vergleich zur herkömmlichen oralen oder intravenösen Medikamentenverabreichung eine gezielte Freisetzung des Wirkstoffes direkt am Wirkort in wesentlich reduzierten Dosen ermöglicht. Durch die Kombination des Knochenzementes mit anderen effizienten Drug-Delivery-Systemen (DDS), wie z. B. Polymeren, kann eine optimale Anpassung der Wirkstofffreisetzung ermöglicht werden. Insbesondere haben sich bereits dendritische Polymere aufgrund ihrer globularen Struktur und Vielzahl an peripheren Funktionalitäten als besonders geeignete Wirkstoffträgersysteme herausgestellt. Bei der Anwendung im physiologischen System spielt insbesondere die Biokompatibilität dieser polymeren DDS eine entscheidende Rolle. Durch Modifizierung der peripheren Gruppen mit biokompatiblen Einheiten, wie Oligosacchariden oder Aminosäuren, kann die physiologische Verträglichkeit signifikant erhöht werden. Für die Behandlung des multiplen Myeloms am Knochen sollte in dieser Arbeit ein geeignetes dendritisches DDS auf Basis von hochverzweigtem Polyethylenimin (PEI) synthetisiert und charakterisiert werden. Das DDS sollte dabei verschiedene Anforderungen, wie eine hohe Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität, erfüllen. Weiterhin sollten die mechanischen Eigenschaften des CPC nicht negativ beeinflusst werden und der Wirkstoff sollte effektiv vom DDS aufgenommen und kontrolliert aus dem generierten Komposit (Wirkstoff/DDS/CPC) freigesetzt werden. In der sogenannten N-Carboxyanhydrid (NCA)-Polymerisation wurden am PEI(5) (5 ≙ Mw 5 kDa) benzylgeschützte Polyglutaminsäure bzw. Polyasparaginsäureketten aufgepfropft. Durch hydrolytische Abspaltung der Schutzgruppen an den PBLG-Ketten von PEI(5)-PBLG-346 und PEI(5)-PBLA-346 erfolgte die Generierung der wasserlöslichen DDS PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346. Die Charakterisierung der synthetisierten Kern-Schale-Architekturen PEI(5)-PBLG-346, PEI(5)-PBLA-346, PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346 zeigte, dass nur wenige lange Polyaminosäureketten an wenigen primären und sekundären Aminogruppen des PEI(5) aufgebaut wurden. Aufgrund der noch freien primären und sekundären Aminogruppen am PEI(5) und den peripheren Aminogruppen an den Polyaminosäureketten wurden durch die Anbindung von Maltose- bzw. Laktoseeinheiten Kern-Schale-Architekturen mit einer binären Doppelschalenstrukturen erzeugt. Im Gegensatz zu reiner Polyglutaminsäure zeigten die mit Glutaminsäure modifizierten Polymerstrukturen PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PGlu-346-Mal interessante strukturelle Eigenschaften in wässriger Umgebung. Aufgrund des pH-abhängigen Ladungszustandes resultiert bei reinen Polyglutaminsäureketten normalerweise der typische Helix-Coil-Übergang. Dabei findet eine Konformationsumwandlung der α-helikalen Struktur zur ungeordneten Sekundärstruktur statt. Im Falle der PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5) PGlu-346-Mal-Copolymere wurde jedoch keine α-helikale Konformation bei niedrigem pH-Wert nachgewiesen. Die PGlu-Ketten der wasserlöslichen Kern-Schale-Architekturen bildeten sowohl im sauren, als auch im basischen pH-Wertbereich eine ungeordnete Sekundärstruktur aus. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Kern-Schale-Architekturen in Abhängigkeit vom pH-Wert als isolierte Makromoleküle bzw. Aggregate mit unterschiedlich lang gestreckten Peptidketten vorliegen. Die Ursache dafür sind nicht-kovalente, intra- und intermolekular wirkende Kräfte. Zur Beurteilung der Kern-Schale-Architekturen als geeignete DDS wurde die Komplexierung des Proteasominhibitors Bortezomib (BZM) in die reinen Copolymere PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und PEI(25)-Mal B (25 ≙ Mw 25 kDa, ohne Polyglutaminsäureketten) sowie deren Polyelektrolytkomplexe untersucht. Dabei wurden Copolymer/BZM- bzw. PEK/BZM-Komplexe in verschiedenen Verhältnissen hergestellt und die Komplexierungskapazität durch zeitabhängige Ultrafiltration UV/Vis-spektroskopisch ermittelt. Im Vergleich zu den glutaminsäuremodifizierten Copolymeren wurde durch PEI(25)-Mal B etwa doppelt so viel Wirkstoff in verschiedenen wässrigen Systemen aufgenommen. Der Grund dafür ist der größere PEI-Kern und die dementsprechend höhere Anzahl an peripheren Aminogruppen mit gebundenen Maltoseeinheiten. Die PEK zeigten im Vergleich zu den Copolymeren keine Verbesserung der Komplexierungskapazität. Um eine effektive Wirkstofffreisetzung für eine dosierte Langzeittherapie aus dem Kompositmaterial zu erhalten, ist eine stark verzögerte Freisetzung des Copolymers bzw. PEK selbst aus dem CPC notwendig. In Abhängigkeit von der Konzentration wurde für PEI(25)-Mal B eine geringere Freisetzung aus dem Copolymer/CPC- und PEK/CPC ermittelt. Aufgrund der nanoskaligen Dimension der polymeren Strukturen wird die Diffusion durch das offene CPC-Porensystem erschwert. Für die PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und die zugehörigen PEK wurde hingegen keine messbare Freisetzung aus dem CPC nachgewiesen. Die Glutaminsäureeinheiten können Calciumionen komplexieren und beeinflussen dadurch die Keimbildung und das Wachstum der CaP-Phase. Die Copolymerstrukturen werden somit in den CPC integriert und können nur durch Abbau des schwerlöslichen Zementes freigesetzt werden. Bei den Untersuchungen der BZM-Freisetzung aus den BZM/Copolymer/CPC- und BZM/PEK/CPC-Kompositen kristallisierte sich BZM/PEI(5)-PGlu-346-Mal/CPC als effektivstes DDS heraus. Im Vergleich zum reinen BZM in CPC wurde nach 24 h nur etwa die Hälfte des Wirkstoffes aus dem Komposit freigesetzt. Weiterhin steigerte sich die Freisetzungsrate über den gesamten Zeitraum von 14 Tagen auf nur etwa 60 %. Aus dem BZM/CPC-Komposit wurden nach 14 Tagen mehr als 75 % BZM freigesetzt. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Michael Gelinsky vom Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung (TU Dresden) wurde keine signifikante Änderung der Druckfestigkeit des CPC durch die Integration der glutaminsäuremodifizierten Copolymere festgestellt. Weiterhin wurde in in vitro-Untersuchungen mit osteogen stimulierten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) kein entscheidender Einfluss der in dieser Arbeit hergestellten PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5)-PGlu-346-Mal-Copolymere auf die Proliferation der Zellen beobachtet. Zudem war bei beiden Copolymeren eine osteogene Differenzierung der hMSC zu knochenbildenden Osteoblasten nachweisbar, wobei PEI(5)-PGlu-346-Mal die Entwicklung der Stammzellen zu knochenbildenden Zellen sogar zu fördern scheint. Durch die Kombination von hochverzweigtem PEI mit Polyglutaminsäure und Maltose wurde in dieser Arbeit ein innovatives DDS für die kontrollierte und effektiv verzögerte Freisetzung von BZM aus CPC erzeugt, welches die einleitend erwähnten Anforderungen erfüllt. Das Copolymersystem weist eine hohe Biokompatibilität auf, ohne die mechanischen Eigenschaften des CPC zu verändern. Diese Arbeit hat daher einen entscheidenden Beitrag im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus festen Materialien geliefert und bildet die Grundlage für zukünftige polymere DDS in CPC.

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Introduction L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques est un traitement avec un potentiel curatif chez une minorité de patients ayant un diagnostic myélome multiple. Malheureusement, ce traitement est associé à un taux élevé de complications, incluant une probabilité élevée de rechute et/ou de GVH chronique limitant. L’objectif principal de cette étude est de déterminer si un entretien au bortezomib (BTZ) post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) chronique. Les objectifs secondaires étaient d’évaluer la prise d’immunosuppresseur, de déterminer l’atteinte d’organe et la survie (OS et PFS) chez les patients ayant reçu ou pas du BTZ en entretien. Méthodes Dans cette étude rétrospective, nous avons comparé 46 patients ayant reçu du BTZ en entretien post-allogreffe à 61 patients n’ayant pas reçu d’entretien. Nous avons étudié l’impact du BTZ sur l’incidence et la sévérité de la GVH chronique en utilisant les critères du NIH de 2014. Résultats À 2 ans, l’incidence globale (61.2% vs 83.6%, p=0.001) et modérée/sévère (44.5% vs 77.0%, p=0.001) de GVH chronique était significativement inférieure chez les patients ayant reçu du BTZ en entretien. Les atteintes buccale (43% vs 67%, p=0.018) et ophtalmique (9% vs 41%, p=0.001) étaient diminuées de manière significative lors du diagnostic initial de la GVH chronique chez ces patients ayant reçu un entretien post-allogreffe. Une diminution de l’usage des immunosuppresseurs, dont les corticostéroïdes systémiques (45.1% vs 76.4%, p<0.001), du mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) et du tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) a été observée chez les patients ayant reçu le BTZ. La probabilité d’être vivant et sans immunosuppresseur à 3 ans post-allogreffe était de 77% chez les patients de la cohorte BTZ et 56% dans la cohorte contrôle (p=0.046). Conclusion En conclusion, un entretien avec du BTZ post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la GVH chronique. Ceci devrait donc être considéré comme une option valide chez les patients avec un myélome multiple traités avec une allogreffe. / Background Allogeneic hematopoietic cell transplant (HCT) has curative potential in myeloma but remains hampered by high rates of relapse and chronic GVHD. The primary endpoint of this study was to determine if BTZ maintenance decreases the incidence and severity of chronic GVHD using NIH criteria. The secondary endpoints were to determine the immunosuppression burden, organ involvement and survival (OS, PFS) in patients receiving or not BTZ. Study Design In this retrospective study, we compared the outcome of 46 myeloma patients who received BTZ after upfront tandem auto-allo HCT to 61 patients without maintenance. We explored the impact of bortezomib (BTZ) maintenance on incidence and severity of chronic GVHD using the 2014 NIH criteria. Results At 2 years, incidences of overall (61.2% vs 83.6%, p=0.001) and moderate/severe chronic GVHD (44.5% vs 77.0%, p=0.001) were significantly lower in BTZ recipients who had less mouth (43% vs 67%, p=0.018) and eyes (9% vs 41%, p=0.001) involvement at initial diagnosis. We report a lower use of systemic steroids (45.1% vs 76.4%, p<0.001), mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) and tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) in BTZ recipients. Probability of being alive and off systemic immunosuppressants at 3 years was 77% in BTZ recipients and 56% in controls (p=0.046). Conclusion In summary, BTZ maintenance improved incidence and severity of chronic GVHD and should be considered as a valid option in myeloma patients receiving upfront tandem auto-allo HCT.