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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The compound 2,2 -dithienyl diselenide (DTDS), an organoselenium compound with thiophene moieties, has been proven to be a promising antioxidant in vitro and in vivo, as well as an antifungal and antimicrobial agent. However, its toxicity, an important point to be investigated, has not been evaluated. The objective of this study was to evaluate whether DTDS has potential toxicity in vitro or in vivo. For this reason, sulfhydryl enzyme activities, such as δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) and Na+, K+-ATPase were assessed to predict in vitro DTDS toxicity in rat brain homogenate, in addition to its thiol oxidase-like activity. In other section of experiments, DTDS was administered to rats (50 or 100 mg/kg; per orally) in order to determine toxicological parameters in vivo. Plasma samples were collected in order to measure the biochemical parameters: alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase activities and urea and creatinine levels. Besides, in brain homogenates, it was determined the activity of the enzymes δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase, as well as lipid peroxidation levels and antioxidant defenses (catalase and superoxide dismutase activities and ascorbic acid and reduced glutathione levels). The compound DTDS inhibited in vitro both δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities (IC50 2 μM and 17 μM, respectively). The DTDS inhibitory effect on δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities was restored by dithiol dithiothreitol. In addition, DTDS (5-25 μM) showed a thiol oxidase-like activity. In vivo, DTDS (50 and 100 mg/kg) caused a decrease in food and water intakes and the loss of body weight, indicating systemic toxicity, even causing death of the animals. At a dose of 100 mg/kg, DTDS decreased urea levels and increased plasma alanine and aspartate aminotransferase activities. Lipid peroxidation was increased in both administered doses. Moreover, in the highest dose, DTDS inhibited δ-ALA-D activity. By contrast, neither Na+, K+-ATPase activity nor antioxidant defenses were altered in the brain of rats exposed to DTDS. In conclusion, the interaction with thiol groups of sulfhydryl enzymes seems to mediate the inhibitory effect of DTDS against δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities in vitro. Furthermore, in the administered doses, DTDS causes cerebral and systemic toxicity in rats. Although other studies are necessary to give more information about this specific compound, our findings contribute to the knowledge on the toxicology of DTDS, a compound with pharmacological properties. / O composto 2,2 -disseleneto de ditienila (DSDT), um composto orgânico de selênio com grupamento tiofeno, fora comprovado como um promissor antioxidante in vitro e in vivo, assim como um agente antifúngico e antimicrobiano. Entretanto, sua toxicidade ainda não fora avaliada, representando um importante ponto a ser investigado. O objetivo deste estudo foi avaliar se o DSDT apresenta potencial toxicidade in vitro ou in vivo. Para este fim, a atividade de enzimas sulfidrílicas, como δ-aminolevulato desidratase (δ-ALA-D) e Na+, K+-ATPase fora testada para predizer a toxicidade in vitro do DSDT em homogeneizado de cérebro de ratos, bem como a sua atividade tipo-tiol oxidase. Em outra seção de experimentos, o DSDT foi administrado em ratos (50 ou 100 mg/kg; oralmente) com o intuito de determinar parâmetros toxicológicos in vivo. Amostras de plasma foram retiradas para dosagem dos parâmetros bioquímicos: atividade das enzimas alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotrasferase e níveis de ureia e creatinina. Além disso, em homogeneizado de cérebro foram dosadas a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase, assim como os níveis de peroxidação lipídica e as defesas antioxidantes (atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase e níveis de ácido ascórbico e glutationa reduzida). O composto DSDT inibiu in vitro, tanto a atividade da δ-ALA-D quanto da Na+, K+-ATPase (IC50 2μM e 17μM, respectivamente). O efeito inibitório do DSDT sobre a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase foi restaurado pelo ditiol ditiotreitol. Adicionalmente, DSDT (5-25μM) apresentou atividade do tipo-tiol oxidase. In vivo, o DSDT (50 e 100 mg/kg) causou uma diminuição no consumo de comida e água e perda de peso corporal, evidenciando toxicidade sistêmica, causando inclusive morte de ratos. Quando administrado na dose de 100 mg/kg, DSDT diminui os níveis de ureia e aumentou a atividade plasmática da ALT e da AST. Os níveis de peroxidação lipídica encontraram-se aumentados em ambas as doses administradas. Na maior dose, o DSDT inibiu a atividade da δ-ALA-D. Em contrapartida, nem a atividade da Na+, K+-ATPase nem as defesas antioxidantes foram alteradas no cérebro de ratos expostos ao DSDT. Em conclusão, a interação com grupos tióis de enzimas sulfidrílicas parece mediar o efeito inibitório do DSDT em relação a atividade da δ-ALA-D e da Na+, K+-ATPase in vitro. Além disso, nas doses administradas, o DSDT induz toxicidade cerebral e sistêmica em ratos. Embora outros estudos sejam necessários para fornecer mais informações sobre este composto em específico, estes dados contribuem para o conhecimento sobre a toxicologia do DSDT, um composto com propriedades farmacológicas.

A tentativa de compreender as consequências do tratamento precoce crônico com metilfenidato é muito importante uma vez que este psicoestimulante tem sido amplamente utilizado em crianças de idade pré-escolar. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas alterações persistentes no comportamento e no funcionamento neuronal associada à sua utilização. Neste estudo, nós inicialmente investigamos o efeito do tratamento precoce crônico com metilfenidato sobre o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano. Além disso, foram também avaliados a homeostase glutamatérgica, a Na+,K+-ATPase e o equilíbrio redox no córtex pré-frontal de ratos jovens. Ratos Wistar receberam injeções intraperitoneais de metilfenidato (2,0 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina 0,9% (controles), uma vez por dia, do 15º ao 45º dia de vida. Vinte e quatro horas após a última administração de metilfenidato, os animais foram decapitados e o líquido cefalorraquidiano e o córtex pré-frontal foram obtidos e processados conforme o protocolo para cada uma das análises. Os resultados mostraram que o metilfenidato alterou o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano, aumentando os níveis de glutamato. A captação de glutamato foi diminuída pelo tratamento crônico com metilfenidato, mas o conteúdo dos transportadores, GLAST e GLT-1, não foram alterados por esse tratamento. A atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas (α1, α2 e α3) da Na+,K+-ATPase foram diminuídos em córtex pré-frontal de ratos submetidos ao metilfenidato. Alterações na expressão gênica das subunidades α1 e α2 da Na+,K+-ATPase também foram observadas. O conteúdo de sulfidrilas, um marcador inversamente correlacionado com dano proteíco, foi diminuído. A atividade da CAT foi aumentada e a razão SOD/CAT foi diminuída em córtex pré-frontal de ratos. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significativas quando comparado aos controles. Os nossos resultados, tomados em conjunto, sugerem que o tratamento precoce crônico com metilfenidato promove excitotoxicidade devido, pelo menos em parte, à inibição da captação de glutamato provavelmente causada por perturbações na função da Na+,K+-ATPase e/ou pelo dano à proteína observados no córtex pré-frontal. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações bioquímicas e comportamentais associadas ao uso crônico de metilfenidato durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. / Understanding the consequences of chronic treatment with methylphenidate is very important since this psychostimulant is extensively in preschool age children. Additionaly to this, little is known about the mechanisms involved in persistent changes in behavior and neuronal function related with use of methylphenidate. In this study, we initially investigate the effect of chronic treatment with methylphenidate in juvenile rats on the amino acids profile in cerebrospinal fluid, as well as on glutamatergic homeostasis, Na+,K+-ATPase function and redox balance in prefrontal cortex. Wistar rats at early age received intraperitoneal injections of methylphenidate (2.0 mg/kg) or an equivalent volume of 0.9% saline solution (controls), once a day, from the 15th to the 45th day of life. Twenty-four hours after the last administration of methylphenidate, the animals were decapitated and the cerebrospinal fluid and the prefrontal cortex were obtained and processed according to the protocol for each analysis. Our results showed that methylphenidate altered amino acid profile in cerebrospinal fluid, increasing the levels of glutamate. In the prefrontal cortex, methylphenidate administration was able to decrease the glutamate uptake, with no changes in GLAST and GLT-1; and the activity and immunocontent of catalytic subunits (α1, α2 and α3) of Na+,K+-ATPase. We also observe changes in α1 and α2 gene expression of catalytic α subunits of Na+,K+-ATPase, decrease in sulfhydryl content, CAT activity and SOD/CAT ratio in juvenile rat prefrontal cortex treated with methylphenidate. Taken together, our results suggest that chronic treatment with methylphenidate at early age induces excitotoxicity, at least in part, due to inhibition of glutamate uptake probably caused by disturbances in the Na+,K+-ATPase function and/or protein damage observed in the prefrontal cortex. These findings may contribute, at least in part, to a better understanding of mechanisms involved in the biochemical and behavioral changes associated with chronic use of methylphenidate during the development of the central nervous system.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Na+,K+-ATPase is ubiquitously expressed in the plasma membrane of all animal cells where serves as the principal regulator of intracellular ion homeostasis. Na+,K+-ATPase activity is activated by Na+ and K+ and current evidence indicates that total Na+,K+-ATPase activity is, in general, inhibited by anions. However, the effect of pharmacologically-induced Cl- flux on α1- and α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity is not established. In this study we investigated the effect of diazepam, a GABAA receptor positive allosteric modulator, on α1- and α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity. Hippocampal and cortical slices were incubated with diazepam (0, 0.05, 0.15 or 0.5 μM) and/or flumazenil (0, 0.005, 0.015, 0.05, 0.15, 0.5 or 1.5 μM) for 10 minutes. After incubation the slices were homogenized and α1 and α2/3 Na+,K+-ATPase activity were assayed using ouabain 3 μM (that inhibits α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase) and 4 mM (that inhibits both isoforms). Diazepam caused a 50% decrease of α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus, but did not alter enzyme activity in the entorhinal cortex. The effect of diazepam was prevented by flumazenil, indicating that the decrease of Na+,K+-ATPase was involved GABAA receptors. Furthermore, a low chloride medium abolished the diazepam-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity. Our data suggests that Na+,K+-ATPase in the hippocampus is sensitive to the pharmacological effects of a benzodiazepine by GABAA receptor-mediated mechanisms. Keywords: sodium pump. GABAA receptor. diazepam. flumazenil. chloride ion. hippocampus. entorhinal córtex. / A enzima Na+,K+-ATPase, ou bomba de sódio, é expressa na membrana plasmática de células eucarióticas, onde atua como principal regulador da homeostase iônica intracelular. A enzima Na+,K+-ATPase é ativada pelos íons Na+ and K+ e evidências indicam que a atividade total da enzima Na+,K+-ATPase é inibida por ânions. Entretanto, o efeito do fluxo de cloreto induzido farmacologicamente sobre a atividade das subunidades α1 e α2/3 da enzima Na+,K+-ATPase ainda não foi investigado. Neste estudo, nós investigamos o efeito do diazepam, um modulador alostérico positivo do receptor GABAA na atividade específica das subunidades α1 e α2/3 da Na+,K+-ATPase. Fatias de hipocampo e de córtex entorrinal foram incubadas com diazepam (0; 0,05; 0,15 ou 0,5 μM) e/ou flumazenil (0; 0,005, 0,015; 0,05; 0,15; 0,5 ou 1,5 μM) por 10 minutos. Após a incubação, as fatias foram homogeneizadas e a atividade das subunidades α1 e α2/3 da enzima Na+,K+-ATPase foi determinada. Diazepam diminuiu 50% a atividade da subunidade α2/3 da Na+,K+-ATPase no hipocampo, mas não alterou a atividade da enzima em córtex entorrinal. O efeito do diazepam foi prevenido por flumazenil, indicando que a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase envolveu a ativação dos receptores GABAA. Além disso, a baixa concentração de cloreto no meio de incubação aboliu a diminuição da atividade enzimática induzida por diazepam. Nossos dados sugerem que a enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo é sensível a efeitos farmacológicos dos benzodiazepínicos por meio de mecanismos ativados por receptores GABAérgicos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mycotoxins are secondary metabolites, produced by fungi species of the genus Aspergillus, Fusarium, Penicillium and Claviceps. The high incidence of toxicity is by ingestion of contaminated plant products and by consuming products derived from food. Among the 400 different mycotoxins; there are the fumonisins, especially fumonisin B1 (FB1), which corresponds to about 70% of total fumonisins. It has been demonstrated that toxicity of this mycotoxin may be related to toxic effects on the central nervous system, engaging in inflammatory processes and seizures. The mechanism of toxicity of fumonisins is related to the metabolism of sphingolipids in which the breakdown of these sphingolipids complexes and accumulation of sphingoid bases alter important cellular functions, favoring oxidative stress, inhibition of protein secondary and excitotoxicity. Thus, this work tried to investigate whether FB1 is able to enhance the inductive effect of the model of pentylenetetrazole (PTZ) seizures. We also evaluated the mechanism of action responsible for this effect, in order to study strategies that make it possible to prevent or minimize their toxic effects. So, C57BL/6 mice were exposed to FB1 (8 mg/kg i.p.) or vehicle (1.6% DMSO + 0.9% NaCl i.p.) and elapsed 30 minutes were injected with PTZ (30 mg/kg i.p.) or vehicle (0,9% NaCl i.p.). Behind 15 minutes observation, mice were euthanized and cerebral cortex and hippocampus were collected for analysis of Na+, K+-ATPase activity, membrane potential and mitochondrial complex I and II activities. FB1 reduced latency for myoclonic jerks and increased myoclonus number. Even, Na+, K+-ATPase total activity as well as subunit �1of this enzyme were increased in cerebral cortex of animals treated with FB1, but in hippocampus it was reduced. FB1 elevated mitochondrial membrane potential in cerebral cortex however mitochondrial complex I and II activity weren t changed in both structures with this treatment. PTZ was able to enhance Na+, K+-ATPase �2/�3 subunit activity in hippocampus. Thus, we showed that FB1 induces neurotoxicity, since this mycotoxin FB1 facilitates seizures induced by PTZ, altered mitochondrial membrane potential and the enzyme Na+, K+ - ATPase activity, which are possibly mediating the mechanism of toxicity. / As micotoxinas são metabólitos secundários, produzidas por espécies de fungos dos gêneros Aspergillus, Fusarium, Claviceps e Penicillium. Geralmente as intoxicações se dão pela ingestão de produtos vegetais contaminados, bem como pelo consumo de alimentos derivados. Dentre os 400 diferentes tipos de micotoxinas, destacam-se as fumonisinas, em especial a fumonisina B1 (FB1) que corresponde a cerca de 70% das fumonisinas totais. Tem sido demonstrado que a toxicidade desta micotoxina pode estar relacionada com efeitos tóxicos no sistema nervoso central, envolvendo-se em processos inflamatórios e crises convulsivas. O mecanismo de toxicidade das fumonisinas está relacionado ao metabolismo dos esfingolipídios no qual o esgotamento desses esfingolipídios complexos e o acúmulo das bases esfingóides alteram funções celulares importantes, favorecendo estresse oxidativo, a inibição secundária de proteínas e excitotoxicidade. Deste modo, este estudo investigou se a FB1 é capaz de facilitar o efeito indutor de convulsões do modelo do pentilenotetrazol (PTZ). Avaliamos também o mecanismo de ação responsável por tal efeito, a fim de estudar estratégias que tornem possível a prevenção ou minimização dos seus efeitos tóxicos. Assim, camundongos machos C57BL/6 foram expostos a FB1 (8 mg/kg i.p.) ou veículo (1,6% DMSO + 0,9% NaCl i.p.) e após 30 minutos injetados com PTZ (30 mg/kg i.p.) ou veículo (0,9% NaCl i.p.). Após 15 minutos de observação, os camundongos foram eutanasiados e o córtex cerebral e o hipocampo foram coletados para a análise das enzimas Na+, K+-ATPase e o potencial de membrana mitocondrial e as atividades dos complexos I e II mitocondriais. A FB1 reduziu a latência para mioclonias e aumentou o número de mioclonias. Da mesma forma, a atividade total e da subunidade �1 da Na+, K+-ATPase foi aumentada no córtex cerebral de animais tratados com FB1, mas no hipocampo foi reduzida. A FB1 elevou o potencial de membrana mitocondrial no córtex cerebral, porém a atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória não foram alteradas em ambas estruturas com este tratamento. O PTZ foi capaz de aumentar a subunidade �2/�3 da Na+, K+-ATPase no hipocampo. Assim, mostramos que a FB1 induz a neurotoxidade, pois esta micotoxina facilitou as convulsões induzidas por PTZ, alterou o potencial de membrana mitocondrial e a atividade da enzima Na+, K+-ATPase, que possivelmente estão mediando o mecanismo da toxicidade.

A tentativa de compreender as consequências do tratamento precoce crônico com metilfenidato é muito importante uma vez que este psicoestimulante tem sido amplamente utilizado em crianças de idade pré-escolar. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas alterações persistentes no comportamento e no funcionamento neuronal associada à sua utilização. Neste estudo, nós inicialmente investigamos o efeito do tratamento precoce crônico com metilfenidato sobre o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano. Além disso, foram também avaliados a homeostase glutamatérgica, a Na+,K+-ATPase e o equilíbrio redox no córtex pré-frontal de ratos jovens. Ratos Wistar receberam injeções intraperitoneais de metilfenidato (2,0 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina 0,9% (controles), uma vez por dia, do 15º ao 45º dia de vida. Vinte e quatro horas após a última administração de metilfenidato, os animais foram decapitados e o líquido cefalorraquidiano e o córtex pré-frontal foram obtidos e processados conforme o protocolo para cada uma das análises. Os resultados mostraram que o metilfenidato alterou o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano, aumentando os níveis de glutamato. A captação de glutamato foi diminuída pelo tratamento crônico com metilfenidato, mas o conteúdo dos transportadores, GLAST e GLT-1, não foram alterados por esse tratamento. A atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas (α1, α2 e α3) da Na+,K+-ATPase foram diminuídos em córtex pré-frontal de ratos submetidos ao metilfenidato. Alterações na expressão gênica das subunidades α1 e α2 da Na+,K+-ATPase também foram observadas. O conteúdo de sulfidrilas, um marcador inversamente correlacionado com dano proteíco, foi diminuído. A atividade da CAT foi aumentada e a razão SOD/CAT foi diminuída em córtex pré-frontal de ratos. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significativas quando comparado aos controles. Os nossos resultados, tomados em conjunto, sugerem que o tratamento precoce crônico com metilfenidato promove excitotoxicidade devido, pelo menos em parte, à inibição da captação de glutamato provavelmente causada por perturbações na função da Na+,K+-ATPase e/ou pelo dano à proteína observados no córtex pré-frontal. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações bioquímicas e comportamentais associadas ao uso crônico de metilfenidato durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. / Understanding the consequences of chronic treatment with methylphenidate is very important since this psychostimulant is extensively in preschool age children. Additionaly to this, little is known about the mechanisms involved in persistent changes in behavior and neuronal function related with use of methylphenidate. In this study, we initially investigate the effect of chronic treatment with methylphenidate in juvenile rats on the amino acids profile in cerebrospinal fluid, as well as on glutamatergic homeostasis, Na+,K+-ATPase function and redox balance in prefrontal cortex. Wistar rats at early age received intraperitoneal injections of methylphenidate (2.0 mg/kg) or an equivalent volume of 0.9% saline solution (controls), once a day, from the 15th to the 45th day of life. Twenty-four hours after the last administration of methylphenidate, the animals were decapitated and the cerebrospinal fluid and the prefrontal cortex were obtained and processed according to the protocol for each analysis. Our results showed that methylphenidate altered amino acid profile in cerebrospinal fluid, increasing the levels of glutamate. In the prefrontal cortex, methylphenidate administration was able to decrease the glutamate uptake, with no changes in GLAST and GLT-1; and the activity and immunocontent of catalytic subunits (α1, α2 and α3) of Na+,K+-ATPase. We also observe changes in α1 and α2 gene expression of catalytic α subunits of Na+,K+-ATPase, decrease in sulfhydryl content, CAT activity and SOD/CAT ratio in juvenile rat prefrontal cortex treated with methylphenidate. Taken together, our results suggest that chronic treatment with methylphenidate at early age induces excitotoxicity, at least in part, due to inhibition of glutamate uptake probably caused by disturbances in the Na+,K+-ATPase function and/or protein damage observed in the prefrontal cortex. These findings may contribute, at least in part, to a better understanding of mechanisms involved in the biochemical and behavioral changes associated with chronic use of methylphenidate during the development of the central nervous system.

A tentativa de compreender as consequências do tratamento precoce crônico com metilfenidato é muito importante uma vez que este psicoestimulante tem sido amplamente utilizado em crianças de idade pré-escolar. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas alterações persistentes no comportamento e no funcionamento neuronal associada à sua utilização. Neste estudo, nós inicialmente investigamos o efeito do tratamento precoce crônico com metilfenidato sobre o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano. Além disso, foram também avaliados a homeostase glutamatérgica, a Na+,K+-ATPase e o equilíbrio redox no córtex pré-frontal de ratos jovens. Ratos Wistar receberam injeções intraperitoneais de metilfenidato (2,0 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina 0,9% (controles), uma vez por dia, do 15º ao 45º dia de vida. Vinte e quatro horas após a última administração de metilfenidato, os animais foram decapitados e o líquido cefalorraquidiano e o córtex pré-frontal foram obtidos e processados conforme o protocolo para cada uma das análises. Os resultados mostraram que o metilfenidato alterou o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano, aumentando os níveis de glutamato. A captação de glutamato foi diminuída pelo tratamento crônico com metilfenidato, mas o conteúdo dos transportadores, GLAST e GLT-1, não foram alterados por esse tratamento. A atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas (α1, α2 e α3) da Na+,K+-ATPase foram diminuídos em córtex pré-frontal de ratos submetidos ao metilfenidato. Alterações na expressão gênica das subunidades α1 e α2 da Na+,K+-ATPase também foram observadas. O conteúdo de sulfidrilas, um marcador inversamente correlacionado com dano proteíco, foi diminuído. A atividade da CAT foi aumentada e a razão SOD/CAT foi diminuída em córtex pré-frontal de ratos. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significativas quando comparado aos controles. Os nossos resultados, tomados em conjunto, sugerem que o tratamento precoce crônico com metilfenidato promove excitotoxicidade devido, pelo menos em parte, à inibição da captação de glutamato provavelmente causada por perturbações na função da Na+,K+-ATPase e/ou pelo dano à proteína observados no córtex pré-frontal. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações bioquímicas e comportamentais associadas ao uso crônico de metilfenidato durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. / Understanding the consequences of chronic treatment with methylphenidate is very important since this psychostimulant is extensively in preschool age children. Additionaly to this, little is known about the mechanisms involved in persistent changes in behavior and neuronal function related with use of methylphenidate. In this study, we initially investigate the effect of chronic treatment with methylphenidate in juvenile rats on the amino acids profile in cerebrospinal fluid, as well as on glutamatergic homeostasis, Na+,K+-ATPase function and redox balance in prefrontal cortex. Wistar rats at early age received intraperitoneal injections of methylphenidate (2.0 mg/kg) or an equivalent volume of 0.9% saline solution (controls), once a day, from the 15th to the 45th day of life. Twenty-four hours after the last administration of methylphenidate, the animals were decapitated and the cerebrospinal fluid and the prefrontal cortex were obtained and processed according to the protocol for each analysis. Our results showed that methylphenidate altered amino acid profile in cerebrospinal fluid, increasing the levels of glutamate. In the prefrontal cortex, methylphenidate administration was able to decrease the glutamate uptake, with no changes in GLAST and GLT-1; and the activity and immunocontent of catalytic subunits (α1, α2 and α3) of Na+,K+-ATPase. We also observe changes in α1 and α2 gene expression of catalytic α subunits of Na+,K+-ATPase, decrease in sulfhydryl content, CAT activity and SOD/CAT ratio in juvenile rat prefrontal cortex treated with methylphenidate. Taken together, our results suggest that chronic treatment with methylphenidate at early age induces excitotoxicity, at least in part, due to inhibition of glutamate uptake probably caused by disturbances in the Na+,K+-ATPase function and/or protein damage observed in the prefrontal cortex. These findings may contribute, at least in part, to a better understanding of mechanisms involved in the biochemical and behavioral changes associated with chronic use of methylphenidate during the development of the central nervous system.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The pathogenesis of Trypanosoma evansi (T. evansi) infection on central and peripheral nervous system (CNS) and immunologic system it is not completely understood. This study was conducted to investigate the effects of infection by T. evansi on the behavioral performance of rats, relating them to neurochemical alterations of the glutamatergic system and activity of important enzymes such as Ca2 + ATPase, Na + / K + ATPase and acetylcholinesterase (AChE) in the brain. Furthermore, we evaluated the activity of AChE in the T. evansi, using a biochemical protocol and discussed some possibilities for the interaction between the presence of this enzyme in the parasite and its possible relation with the host. Also, we investigated the in vivo effect of curcumin as an antitrypanosomal agent to contribute in the search for new therapies. To this end, we conducted a series of studies, as follow that are presented as scientific articles: in the Article I are presented data from rats experimentally infected with T. evansi and in which the activity of AChE in total brain, cerebellum and blood and plasma butyrylcholinesterase activity on days 3 (T3) and 5 (T5) post infection (pi) were evaluated. In the Article II trypanosomes were isolated by Dietil Amino Etil-celulose column to perform enzymatic assays of AChE activity in the parasite. Article III presents the results of daily oral administration of Curcumin (20 or 60 mg / kg) as a preventive treatment (for 30 or 15 days pre-infection) or as curative treatment (for 15 days pi) for T. evansi infection in rats. The animals were evaluated for parasitemia, proinflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) in plasma. Also blood AChE activity was studied. In the manuscript I were evaluated behavioral changes (memory and anxiety), glutamate uptake, activity of AChE and ATPases (Ca +2 and Na +, K +) in brain structures of T. evansi infected rats (5 and 30 dpi). Together these studies suggest that rats infected with T. evansi have cognitive impairment, probably caused by changes on energy metabolism (ATPases) and in the cholinergic and glutamatergic systems. That way, alterations observed during behavioral tests probably indicate the progression of clinical disease as a result of neurochemical dysfunction. It was also demonstrated that it is possible to biochemically detect the AChE activity in the T. evansi and this could cause the hydrolysis of acetylcholine in the parasite. It was also demonstrated that pretreatment with curcumin induces immunomodulatory effects, altering inflammatory cytokines and activity of AChE in rats infected with T. evansi. The treatments reduced parasitic load and mortality. Therefore, curcumin should be considered as a feeding supplement in trypanosomiasis endemic areas. / Com este trabalho, buscou-se compreender os mecanismos da patogenia do Trypanosoma evansi no sistema nervoso central (SNC), periférico e imunológico. Para isso, foram avaliados os efeitos da infecção por T. evansi sobre o desempenho comportamental de ratos, relacionando-os com alterações neuroquímicas do sistema glutamatérgico e com as atividades de importantes enzimas cerebrais como a Ca+2ATPase, a Na+/K+ATPase e a acetilcolinesterase (AChE). Avaliou-se também, a atividade da AChE no T. evansi usando um protocolo de bioquímica, buscando discutir algumas possibilidades de interação entre a presença desta enzima no parasita e suas possíveis relações com o hospedeiro. Também, foi investigado o efeito in vivo da curcumina como agente tripanocida, a fim de contribuir na busca de novas terapias. Com estes propósitos, foram realizadas varios estudos, sendo: no artigo I buscou-se avaliar se a infecção pelo protozoário altera o sistema colinérgico. Para isso, foram utilizados ratos experimentalmente infectados com T. evansi e avaliada a atividade da AChE no cérebro total, no cerebelo e no sangue e a atividade da butirilcolinesterase plasmática nos dias 3 e 5 pós infecção (pi); no artigo II tripanossomas foram isolados por coluna de dietilaminoetilcelulose para realizar ensaios enzimáticos da atividade da AChE no parasito; no artigo III doses diárias de Curcumina (20 ou 60 mg / kg) diluída em óleo de milho foram administradas diariamente por via oral (gavagem) como tratamento preventivo (30 ou 15 dias pré-infecção) e como tratamento durante quinze dias pi. Os animais foram avaliados quanto a parasitemia, as citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) plasmáticas e a atividade sanguínea da AChE; no manuscrito I foram avaliadas as alterações comportamentais (memória e ansiedade), a captação de glutamato, atividade da AChE e das ATPases (Ca +2 e Na +, K +) nas estruturas encefálicas nos dias 5 e 30 de ratos infectados com T. evansi. Com estes estudos, pode-se concluir que ratos infectados com T. evansi apresentam déficit cognitivo, provavelmente causados por alterações nos parâmetros do metabolismo energético (ATPases) e nos sistemas colinérgico e glutamatérgico, sugerindo que as alterações observadas durante testes comportamentais provavelmente indicam uma disfunção neuroquímica. Também foi demonstrado que é possível detectar bioquimicamente a atividade da AChE no T. evansi e esta deve ser responsável pela hidrólise da acetilcolina no parasita. Quando os animais infectados foram tratados com curcumina demonstrou-se que o pré-tratamento com este composto induz efeitos imunomodulatórios, alterando os parâmetros inflamatórios tais como as citocinas e a atividade da AChE sanguínea. Desta forma, sugere-se que a curcumina pode ser utilizada como um suplemento alimentar em áreas endêmicas de tripanossomíase, uma vez que reduziu a carga parasitária e a mortalidade em ratos infectados com T. evansi, contribuindo assim com novas alternativas de tratamento.