Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies. / G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies.

Les parasites de la classe des Kinetoplastidae, comprenant notamment les trypanosomes et les leishmanies, sont responsables pour plusieurs maladies d’importance socio-économique et de santé publique. La maladie du sommeil, la maladie de Chagas et la leishmaniose, classées comme maladies tropicales négligées (NTD) par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et la Surra, reportée par l’Organisation pour l’alimentation et l’agriculture, des Nations Unies (FAO). La Trypanosomiase Animale Africain sub-saharienne entraîne la mort de 3 millions bovins par an accompagné d'une perte annuelle de l'économie de 4,5 milliards de dollars américains. La leishmaniose cutanée, une maladie zoonose, présente 1,5 millions de nouveaux cas chaque année.Trypanosoma brucei (T. brucei) est un ancien eucaryote, utilisé comme organisme modèle dans le laboratoire pour l’étude des cils et des flagelles. Le remodelage du cytosquelette des trypanosomes est essentiel pour la morphologie cellulaire, le positionnement et la division des organites. L’étude des protéines essentielles du cytosquelette permet de mieux comprendre les processus cellulaires. Ces protéines pourraient également constituer des cibles potentielles pour des traitements thérapeutiques. Les trypanosomes échappent au système immunitaire de l’hôte en modifiant périodiquement les antigènes de présent à leur surface. En effet ces antigènes de surface sont endocytés, ainsi que les anticorps de l’hôte qui y sont attachés, au niveau d’une structure appelée la poche flagellaire (FP). TbBILBO1 est une protéine structurelle du collier de la poche flagellaire (FPC), essentielle à la biogenèse du FPC et à la survie du parasite. En raison du rôle majeur de la protéine TbBILBO1 dans le parasite, des partenaires de TbBILBO1 ont été recherchés.Dans ce travail, j’ai pu caractériser une nouvelle protéine essentielle du cytoskelette, la protéine FPC6, partenaire de TbBILBO1, qui se situe au niveau du complexe FPC/Complexe du Hook de T. brucei. L’ARN interférence de FPC6 conduit à une mort rapide des formes sanguines des trypanosomes, accompagnée d’un blocage de l’endocytose. Ensuite, j’ai produit un nanobody (Nb48), dirigé contre TbBILBO1, dans le système d’expression bactérien. Je l’ai également exprimé dans les lignées de trypanosomes. Le Nb48 reconnait TbBILBO1 sur les trypanosomes fixés par immunofluorescence et dans les extraits totaux de protéines dénaturées. L’analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) a confirmé une haute affinité du Nb48 pour TbBILBO1. L’expression de Nb48 dans le parasite T. brucei en tant qu’intrabody demontrant que ce nanobody pouvait être exprimé de manière fonctionnelle, capable de reconnaitre spécifiquement sa cible protéique, TbBILBO1, intra-cellulaire et de bloquer sa fonction conduit à un effet trypanocide rapide. Ces études ouvrant ainsi la voie pour de nouvelles utilisations potentielles thérapeutiques dans le traitement des trypanosomiases. / Kinetoplastid parasites, including trypanosomes and leishmania, are responsible for several diseases of socio-economic and public health importance worldwide. These include the Neglected Tropical Diseases: Sleeping Sickness, Chagas disease and Leishmaniasis, as classified by the World Health Organisation (WHO) and the global wasting disease of animals, Surra, as reported by the Food and Agricultural Organisation of the United Nations (FAO). Animal African Trypanosomiais (AAT) causes the death of 3 million cattle per year in sub-Saharan Africa, with an annual loss of 4.5 billion US dollars to the African economy. Cutaneaous leishmaniasis is a zoonotic disease, with 1.5 million new cases reported globally each year.Trypanosoma brucei is an ancient, early diverging eukaryote, used as a model organism in the laboratory for studying eukaryotic cilia and flagella. Remodelling of the trypanosome cytoskeleton is essential for cell morphology, organelle positioning and division. Study of essential proteins of the cytoskeleton provides insight into intracellular processes and could provide potential targets for therapeutic interventions. Trypanosomes evade the host immune system by periodically changing their external surface coat, which is endocytosed, along with any attached host antibodies, via a structure called the flagellar pocket. TbBILBO1 is a structural protein of the Flagellar Pocket Collar (FPC) that is essential for FPC biogenesis and parasite survival. Due to the importance of TbBILBO1 for the parasite, protein partners were investigated.In my thesis, I describe, firstly, the characterisation of a novel and essential cytoskeletal protein, FPC6, of the FPC/Hook complex of T. brucei; FPC6 is a partner of TbBILBO1. RNAi Knock-down of FPC6 protein leads to rapid cell death in the blood-stream form of the parasite accompanied with a block in endocytosis. Secondly, I describe the purification and intracellular expression of a nanobody (Nb48), raised against TbBILBO1. The purified Nb is able to identify TbBILBO1 in fixed trypanosomes and denatured protein. Surface Plasmon Resonance analysis confirmed a high affinity of Nb48 to TbBILBO1. Expression of Nb48 as an intrabody in T. brucei, reveals that it binds precisely to its target, TbBILBO1 and leads to rapid cell death. Further exploration of the potential uses of this trypanocidal nanobody is warranted.

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L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est devenue un outil incontournable en recherche biomédicale. Le développement d’outils de neuroimagerie pour le petit animal est primordial pour valider des hypothèses biologiques et tester l’efficacité de nouvelles thérapies. Dans le contexte de la maladie d’Alzheimer (MA), l’utilisation d’IRM à haut champ magnétique permet l’imagerie des plaques amyloïdes, signature moléculaire de cette pathologie. Cependant, seule une faible proportion de ces lésions sont détectées et aucune méthode de neuroimagerie ne permet actuellement d’imager les dégénérescences neurofibrillaires, deuxième signature microscopique de la MA. Dans cette thèse, deux méthodes complémentaires, utilisant différents agents de contraste à base de Gadolinium (Gd), ont été étudiées pour améliorer la détection des plaques amyloïdes par IRM. La première partie de cette thèse s’est intéressée à la méthode du « Gd- staining ». Une étude comparative réalisée sur différents modèles murins d’amyloïdose et sur des primates non-humains, a permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la détection des plaques amyloïdes grâce à cette technique. Également, nous avons montré pour la première fois qu’il est possible d’imager les lésions Aβ humaines, en post mortem, par Gadolinium-staining. La deuxième partie de cette thèse s’est intéressée au développement d’agents de contraste vectorisés, ciblant spécifiquement les lésions de la MA. Ces molécules seraient capables de traverser spontanément la barrière hémato-encéphalique, principale limite au développement de molécules à visée cérébrale, et permettraient de cibler spécifiquement les deux lésions caractéristiques de la MA. Ces propriétés font de ces molécules de outils potentiels intéressants pour l’imagerie cérébrale de la MA. / Magnetic resonance imaging (MRI) has become a key tool for both clinical and preclinical research. Developing innovative neuroimaging techniques specifically designed for small animal models is therefore crucial to validate biological hypotheses and screen new drugs. Amyloid plaques and neurofibrillary tangles are the major lesions characterizing Alzheimer’s disease (AD) and intensive research has been carried out in order to enable the accurate detection of amyloid plaques using high-field MRI. However, only a small portion of plaques are spontaneously detected by MRI and no method is so far available for neurofibrillary tangles imaging. Here, we develop two contrast-enhanced MRI techniques to improve amyloid plaques detection using high-field MRI. The first part of this work focuses on Gadolinium-Staining for amyloid plaques detection by MRI. We performed a comparative study between mice model of amyloi-dosis and non-human primate models, which al-lowed us to gain a better understanding of the origin of the contrast induced by amyloid plaques when performing contrast-enhanced MRI. We also showed for the first time that Gd-stained MRI is able to detect amyloid plaques in human-AD brain tis-sues. The second part of this manuscript describes two novel single-domain antibodies (VHHs or nano-bodies) that are able to specifically recognize and bind amyloid plaques or neurofibrillary tangles. The detection of intracerebral targets with imaging probes is challenging due to the non-permissive nature of the blood-brain barrier. Interestingly, VHH exhibiting a basic isoelectric point are able to transmigrate across the blood-brain barrier, thus making them promising tools for in vivo imaging of AD’s lesion at high-field MR.

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Les maladies parodontales sont causées par une infection bactérienne touchant les tissus entourant les dents, appelés parodonte. L’inflammation aggravée du parodonte peut conduire au déchaussement ou à la chute des dents. Porphyromonas gingivalis est une bactérie anaérobique qui sécrète des toxines appelées gingipaïnes, considérées comme le facteur de virulence majeur. Le système de sécrétion de type IX (T9SS) a été récemment mis en évidence exclusivement chez les membres de la famille des bacteroidetes. Chez P. gingivalis, ce système et directement relié à la sécrétion des gingipaïnes est donc sa pathogénicité. Des études ont montré que plus d’une quinzaine de protéines sont impliquées dans l’assemblage, la fonction et la régulation de ce système de sécrétion. Parmi ces protéines, PorK, PorL, PorM, PorN forment un complexe membranaire au cœur de la machinerie de sécrétion, enchâssé dans les deux membranes bactériennes. L’objectif de ce travail de thèse a été de mettre en place une méthodologie d’extraction et de solubilisation du complexe membranaire PorK-L-M-N afin d’étudier sa structure moléculaire par des méthodes de biochimie intégrative. Trois sous-complexes ont été étudiés successivement. Le complexe de membrane externe PorK-N, le complexe de membrane externe étendu PorK-N-M et le complexe de membrane interne PorL-M. Les résultats obtenus montrent que le complexe de membrane externe PorK-N présente une structure en forme d’anneau de 50nm de diamètre et le complexe de membrane interne PorL-M possède une structure étendue avec une base sphérique de 25nm. Ces résultats valident une méthodologie qui pourra par la suite être utilisée pour d'autres études du T9SS. / Periodontal diseases are caused by a bacterial infection affecting the tissues surrounding the teeth, called periodontal. The aggravated inflammation of the periodontium may lead to loosening or falling of the teeth. Porphyromonas gingivalis is an anaerobic bacterium able to secrete toxins called gingipains, considered as the major virulence factor. First called PorSS, the type IX secretion system (T9SS) was recently found exclusively in members of bacteroidetes. In P. gingivalis this system is directly related to the secretion of gingipains and is therefore its pathogenicity. Studies have shown that more than fifteen proteins are involved in the assembly, function and regulation of this secretory system. Among these proteins PorK, PorL, PorM, PorN form a membrane core complex, the central part of the secretory machinery embedded in the two bacterial membranes. The objective of this thesis was to set up a methodology of extraction and solubilization of the PorK-L-M-N membrane complex in order to study its molecular structure by integrative biochemistry methods. Three sub-complexes have been studied successively. PorK-N the outer membrane complex, PorK-N-M extended outer membrane complex and PorL-M the inner membrane complex. The results show that the PorK-N outer membrane complex has a ring-shaped structure of 50nm in diameter, confirming published results, and the PorL-M inner membrane complex has an extended structure of 25nm with a spherical base. These results validate the established methodology that can subsequently be used to continue the structural study of T9SS.

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The use of super-resolution (SR) microscopy is an important tool for understanding the inside mechanisms of bacterial cells. However, for SR imaging, the labelling of the proteins of interest is a great challenge as flourescent proteins (FPs) are often too big to be directly fused to the target protein and traditional immunolabelling with antibodies creates too long separation between the fluorophore and the target protein. In an attempt to overcome this hurdle, the Escherichia coli (E. coli) cell division protein FtsZ is in this project fused to a nanotag (NT) that is subsequently labelled with a nanobody (NB). The ALFA-tag, a short amino acid peptide, is chromosomally fused to the target protein, creating a MG1655/FtsZ-ALFA strain where all FtsZ proteins have an ALFA-tag attached. Recognising the ALFA-tag is the NB αALFA (anti-ALFA) which is fused to a FP and expressed from a plasmid. The MG1655/FtsZ-ALFA strain is labelled using standard plasmid transformation which allows for live cell imaging of the division ring in E. coli. Both FPs sfGFP and mEos3.2 are used for labelling which means that the cells can be imaged in epifluorescence microscopy and single-molecule Photo-Activated Localisation Microscopy (PALM), and even single-molecule time lapses of the constricting FtsZ-ring is possible. This system is also applicable to other bacterial proteins. / Superupplösningsmikroskopi (SUM) är ett viktigt redskap för att förstå de inre processerna i en bakteriecell. Att på ett framgångsrikt sätt tagga målproteinerna har dock visat sig vara en utmaning för SUM. Att direkttagga målproteinerna med fluorescerande protein är oftast inte möjligt på grund av de fluorescerande proteinernas storlek och traditionell märkning med antikroppar skapar ett för stort avstånd mellan fluorofor och målprotein. För att överkomma detta problem taggas här celldelningsproteinet FtsZ iEscherichia coli (E. coli) med hjälp av nanotaggar (NT) och nanokroppar (NK). ALFA-taggen, en kort aminosyrapeptid, är kromosomt bunden till FtsZ i cellinjen MG1655/FtsZ-ALFA, så att varje FtsZ protein som produceras har en ALFA-tag bunden till sig. NK αALFA (anti-ALFA) känner igen och binder till ALFA-taggen när de kommer i kontakt. NK är bunden till ett fluorescerande protein och uttryckt från en plasmid vilket gör att MG1655/FtsZ-ALFA kan bli taggad med hjälp av vanlig plasmidtransformation. Denna metod möjliggör mikroskopi av divisionsringen i levande E. coli-celler. Två olika fluorescerande protein används, sfGFP och mEos3.2, vilket innebär att både epifluorensmikroskopi och fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) kan användas. Dessutom är även intervallfotografering i enmolekylmikroskopi av divisionsringens konstriktion möjligt. Denna märkningsteknik är vidare applicerbar på andra bakteriella protein.

Antikörper und Antigen-bindende Proteine, die an Fluorophore, Tracer und Wirkstoffe konjugiert sind, sind einzigartige Moleküle, welche die Entwicklung wertvoller diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge ermöglichen. Allerdings ist der Konjugationsschritt sehr anspruchsvoll und trotz intensiver Forschung noch immer ein bedeutender Engpass. Zusätzlich sind Antigen-bindende Proteine oftmals nicht dazu in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen und im Zellinneren nicht funktionsfähig. Daher ist ihre Verwendung auf extrazelluläre Targets beschränkt, was eine bedeutende Anzahl wichtiger Antigene vernachlässigt. Beide Limitierungen bilden Kernaspekte dieser Arbeit. Mit Tub-tag labeling wurde ein neuartiges und vielseitiges Verfahren für die ortsspezifische Funktionalisierung von Biomolekülen und Antigen-bindenden Proteinen entwickelt, und so die Palette der Proteinfunktionalisierungen bedeutend erweitert. Tub-tag wurde erfolgreich für die ortsspezifische Funktionalisierung verschiedener Proteine und Antigen-bindender Nanobodies angewendet, die für konfokale Mikroskopie, Proteinanreicherung und hochauflösende Mikroskopie eingesetzt wurden. In einem weiteren Projekt wurden zellpermeable Antigen-bindende Nanobodies hergestellt und somit das schon lange Zeit bestehende Ziel, intrazelluläre Targets durch in vitro funktionalisierte Antigen-bindende Proteine zu visualisieren und manipulieren, erreicht. Hierzu wurden zwei verschiedene Nanobodies an ihrem C-Terminus cyclischen zellpenetrierenden Peptiden unter Verwendung von Expressed Protein Ligation funktionalisiert. Diese Peptide ermöglichten die Endozytose-unabhängige Aufnahme der Nanobodies mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Mit Tub-tag labeling und der Synthese von zellpermeablen Nanobodies konnten wichtige Bottlenecks im Bereich der Proteinfunktionalisierung und Antikörperforschung adressiert werden und neue Tools für die biochemische und zellbiologische Forschung entwickelt werden. / Antibodies and antigen binding proteins conjugated to fluorophores, tracers and drugs are powerful molecules that enabled the development of valuable diagnostic and therapeutic tools. However, the conjugation itself is highly challenging and despite intense research efforts remains a severe bottleneck. In addition to that, antibodies and antigen binding proteins are often not functional within cellular environments and unable to penetrate the cellular membrane. Therefore, their use is limited to extracellular targets leaving out a vast number of important antigens. Both limitations are core aspects of the presented thesis. With Tub-tag labeling, a novel and versatile method for the site-specific functionalization of biomolecules and antigen binding proteins was developed expanding the toolbox of protein functionalization. The method is based on the microtubule enzyme tubulin tyrosine ligase. Tub-tag labeling was successfully applied for the site-specific functionalization of different proteins including antigen binding nanobodies which enabled confocal microscopy, protein enrichment and super-resolution microscopy. In addition to that, cell permeable antigen binding nanobodies have been generated constituting a long thought goal of tracking and manipulating intracellular targets by in vitro functionalized antigen binding proteins. To achieve this goal, two different nanobodies were functionalized at their C-terminus with linear and cyclic cell-penetrating peptides using expressed protein ligation. These peptides triggered the endocytosis independent uptake of the nanobodies with immediate bioavailability. Taken together, Tub-tag labeling and the generation of cell-permeable antigen binding nanobodies strongly add to the functionalization of antibodies and their use in biochemistry, cell biology and beyond.