Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 644915 bytes, checksum: d059fb831fbd9168fde56d0f1948a13a (MD5) Previous issue date: 2005-05-25 / During the past ten years, the protozoan Neospora caninum has been described and associated as an ethyological agent of infected abortions in cattle. This disease in dogs also has an abortive character, but since dogs are definitive hosts, they have relevant importance in the life cycle of this parasite, acting as a source of the disease. Other diseases such as leptospirosis and brucelosis are also disseminated in Brazil and are associated to reproductive disturbances. The objective of this study was to evaluate the presence of infection for N. caninum in cattle and dogs of rural properties in two municipalities, Viçosa and Mercês, located in the macro-region of Zona da Mata in the state of Minas Gerais, as well as to analyze the existing risk factors for the infection. Serum samples of female cattle and dogs were collected for research of anti-N. caninum antibodies, using the indirect immunofluorescence technique; Brucella abortus selective test (Buffered Acidified Antigen - BAA) and corroborative tests (2-ME and SAT) and Leptospira sp., Microscopic Agglutination Technique (MAT) without and with sera dilution. The bovine sera were tested for the three pathogenic bioagents and the canine sera for N. caninum and Leptospira sp. In addition, information was collected by applying a structured questionnaire on type of exploration, production system and reproductive problem history in cattle and habits, type of food, demographic characteristics in dogs. The prevalence of positive properties was of 54.3% and 18.5% for N. caninum in cattle and dogs, respectively; 15.2% for Brucella abortus and 6.5% for Leptospira sp. in cattle and 7.4% for Leptospira sp.in dogs. The prevalence of positive animals presented lower results: 23.3% of N. caninum in cattle and dogs, respectively; 15.2% for Brucella abortus and 6.5% for Leptospira sp. in cattle and 7.4% for Leptospira. However, it should be emphasized that the prevalence for N. caninum in cattle was significantly higher, compared to Brucella abortus (p < 0.01) and Leptospira sp. (p < 0.01). Positive properties for bovine neosporosis were associated to the presence of reproductive disturbances in the animals (p < 0.01), when the analysis considered the type of disturbance, abortion (OR = 5.2; IC 95% = 1.32-20.54) and prenatal mortality (OR = 6.0; IC 95% = 1.22 - 29.95) presented significant association. The occurrence of positive serology for N. caninum in cattle was associated to the presence of positive dogs in the property (p<0.01); however, reproductive problem in cattle was not associated with canine neosporosis (p = 0.1046). Significant association was also verified between bovine osteoporosis and type of exploration, serum positive cattle having, approximately, three times more chance (OR = 2.82 and IC 95% = 1.05 - 9.52) of belonging to a milk production system rather than mixed. The characterization of canine neosporosis did not show significant association with the variables sex (p = 0.55), age (p = 0.34), animal habit (p = 0.03; OR = 0.00; IC 95% = 0.0-1.06) and type of food (p = 0.11). The results suggest that sanitation in neosporosis has become of utmost importance in bovine herds, especially when reproductive problems resulting from the infection are considered. Therefore, it becomes evident the need for animal health authorities and institutions to fight this disease. / Durante os últimos dez anos o protozoário Neospora caninum tem sido descrito e associado como agente etiológico de abortamentos infecciosos em bovinos. Esta doença em cães também tem caráter abortivo, mas como os caninos são hospedeiros definitivos, possuem relevante importância no ciclo de vida deste parasita, funcionando como reservatório da doença. Outras doenças como a leptospirose e a brucelose também são disseminadas em nosso país e também estão associadas a transtornos reprodutivos. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de infecção para N. caninum em bovinos e cães existentes em propriedades rurais de dois municípios, Viçosa e Mercês, pertencentes à Macrorregião Zona da Mata do Estado de Minas Gerais, bem como analisar a existência de fatores de risco para a infecção. Foram coletadas amostras de soro de bovinos fêmeas e cães para pesquisa de anticorpos anti-N. caninum, pela técnica de imunofluorescência indireta; Brucella abortus prova seletiva (Antígeno Acidificado Tamponado - AAT) e provas confirmatórias (2-ME e SAT) e Leptospira sp., Técnica de Aglutinação Microscópica (MAT) sem e com diluição dos soros. Os soros bovinos foram testados para os três bio-agentes patogênicos e os de cães para N. caninum e Leptospira sp. Adicionalmente, foram coletadas informações, utilizando-se questionário estruturado, relativas ao tipo de exploração, sistema de produção e histórico de problemas reprodutivos em bovinos e hábitos, tipo de alimentação, características demográficas dos cães. As prevalências de propriedades positivas foram de 54,3% e 18,5% para N. caninum em bovinos e cães, respectivamente; 15,2% para Brucella abortus e 6,5% para Leptospira sp. em bovinos e 7,4% para Leptospira sp. em cães. As prevalências de animais positivos apresentaram resultados menores: 23,3% de N. caninum em bovinos e cães, respectivamente; 15,2% para Brucella abortus e 6,5% para Leptospira sp. em bovinos e 7,4% para Leptospira, entretanto, é de se destacar que, para os bovinos, a prevalência para N. caninum, significativamente superior quando comparada a Brucella abortus (p < 0,01) e Leptospira sp. (p < 0,01). Propriedades positivas para neosporose bovina estiveram associadas à presença de distúrbios reprodutivos nos animais (p < 0,01), quando a análise considerou o tipo de distúrbio, abortamento (OR = 5,2; IC 95% = 1,32-20,54) e mortalidade perinatal (OR = 6,0; IC95% = 1,22 - 29,95) apresentaram associação significativa. A ocorrência de sorologia positiva para N. caninum em bovinos esteve associada à presença de cães positivos na propriedade (p < 0,01), entretanto, problema reprodutivo em bovinos não esteve associado à neosporose canina (p = 0,1046). Associação significativa também foi verificada entre a neosporose bovina e o tipo de exploração, sendo que os bovinos soropositivos tiveram, aproximadamente, três vezes mais chance (OR = 2,82 e IC 95% = 1,05 - 9,52) de pertencerem a sistema de produção tipo leite do que tipo misto. A caracterização da neosporose canina não revelou associação significativa com as variáveis sexo (p = 0,55), idade (p = 0,34), hábito do animal (p = 0,03; OR = 0,00; IC 95% = 0,0-1,06) e tipo de alimentação (p = 0,11). Os resultados sugerem o significado sanitário que a neosporose vem assumindo em rebanhos bovinos, notadamente quando se considera a ocorrência de problemas reprodutivos decorrentes da infecção. Nesse sentido, evidencia-se a atenção necessária das autoridades e instituições de saúde animal, no combate a esta enfermidade.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA10MA057.pdf: 284934 bytes, checksum: 412cd7a894dff7250bef856cd5965d43 (MD5) Previous issue date: 2010-07-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The neosporosis is a disease caused by protozoan Neospora caninum. Dogs, coyotes and dingos are definitive hosts and among livestock, the sheep is one of the intermediate host, wich may have mainly reproductive problems, and hence siginificant economic losses. Aiming to determine the prevalence of onfection by N. caninum in sheep in the city of Lages, Santa Catarina State, identify possible risk factors for infection in sheep and to correlate the prevalence of antibodies against N. caninum with risk factors assessed, blood was collected from 360 sheep on 13 farms. The samples, properly identified and packaged, were sent to the Laboratory of Parasitology and Parasitic Diseases of CAV/UDESC. The detection of LgG antibodies was performed by indirect fluorescent antibody test (IFAT). Sera were initially tested at 1:50 dilution and those positive were retested in serial dilutions of two basis until the maximum degree reactive. Information about the variables, age, sex, race, animal category, breeding system, diet, water source, contact with dogs and reproductive disorders were obtained through the application of questionnaires to the owners. The data were statiscally analyzed usinf Fisher s exact test and chi-square test (p&#8804;0.05).in 46.15% (6/13) of the farms had at least one positive animal. Variation of percentage of positive animals between properties was zero to 25.81%. positive reactions with titers &#8805; 1:50 were found in 21 sheep (5.83%). Titers ranged from 1:50 to 1:400, and five animals (23.81%) had a titer of 1:50; five (23.81%) at 1:100, six (28.57%) at 1:200 and five animals (23.81%) had a titer of 1:400. There were no association between positivity to N. caninum in sheep and the others variables. The results indicate that N. caninum is presente in siginificant percentages in sheep in the city of Lages, Santa Catarina State, Brazil / A neosporose é uma doença causada pelo protozoário Neospora caninum. Os cães, coiotes e dingos são hospedeiros definitivos e entre os animais de produção, a espécie ovina constituise em um dos hospedeiros intermediários, podendo apresentar principalmente problemas reprodutivos e, consequentemente, perdas econômicas significativas. Com os objetivos de determinar a prevalência da infecção por N. caninum em ovinos no município de Lages, Santa Catarina, identificar possíveis fatores de risco para a infecção nesses animais e correlacionar a prevalência de anticorpos contra N. caninum com os fatores de risco avaliados, foram realizadas coletas de sangue de 360 ovinos, em 13 propriedades rurais. As amostras, devidamente identificadas e acondicionadas, foram encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia e Doenças Parasitárias do CAV/UDESC. A detecção de anticorpos da classe IgG foi realizada por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Os soros foram testados inicialmente na diluição 1:50 e aqueles positivos foram reexaminados em diluições seriadas de base dois até a titulação máxima reativa. Dados referentes às variáveis, idade, sexo, raça, categoria animal, sistema de criação, dieta, fonte de água, contato com cães e transtornos reprodutivos foram obtidos por meio da aplicação de questionário aos proprietários. Os dados foram tabulados e analisados estatisticamente por meio dos testes exato de Fisher e de qui-quadrado (p&#8804;0,05). Em 46,15% (6/13) das propriedades havia ao menos um animal positivo. A variação de percentuais de animais positivos entre as propriedades foi de zero a 25,81%. Reações positivas com títulos &#8805; 1:50 foram encontradas em 21 ovinos (5,83%). Os títulos encontrados variaram de 1:50 a 1:400, sendo que cinco animais (23,81%) tiveram titulação de 1:50; cinco (23,81%) com 1:100; seis (28,57%) com 1:200 e cinco animais (23,81%) com titulação de 1:400. Não foi verificada associação entre positividade dos ovinos ao N. caninum e as variáveis analisadas. Os resultados indicam que N. caninum está presente em percentuais importantes nos ovinos do município de Lages, Santa Catarina, Brasil

O Neospora caninum é um protozoário filogeneticamente relacionado a vários coccídeos de importância em medicina veterinária e humana, além de ser um parasita intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para um melhor diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados. No presente trabalho, propomos a expressão do clone do gene da proteína interna Nc56 de N. caninum em sistema procarioto (Escherichia coli), para avaliar sua antigenicidade frente a soros de bovinos imunoreativos contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Para tanto, estabelecemos as condições ideais de expressão da proteína (indução por 4 horas e concentração de L-arabinose de 0,2%) e posteriormente avaliamos duas formas de purificação do produto recombinante (cromatografia de afinidade por metal imobilizado e eluição direta do gel de SDS-PAGE), constatando que a eluição de proteínas recombinantes diretamente do gel de SDS-PAGE mostrou-se o procedimento mais adequado para evitar a presença de proteínas contaminantes advindas do sistema procarioto de expressão. Foi selecionado um painel de soros bovinos (animais de campo), previamente testados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para avaliar sua reatividade para Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Utilizamos o soro de um bezerro macho da raça Holandesa recém-nascido, colhido antes da administração de colostro materno (mãe soronegativa pela RIFI-Nc e RIFI-Tg) como controle negativo. O controle positivo foi obtido do mesmo bezerro após inoculação experimental de taquizoítos viáveis de N. caninum, quando este animal já apresentava seis meses de idade. O ELISA indireto foi realizado com microplacas de poliestireno com 96 cavidades de fundo chato sensibilizadas com 10 &mu;g/mL de proteína recombinante purificada Nc56 e apresentou altas densidades ópticas tanto para soros bovinos positivos na RIFI para N. caninum quanto para T. gondii, quando comparadas com a densidade óptica do soro controle negativo. A proteína recombinante purificada e o extrato bruto de proteínas solúveis em tampão desnaturante foram submetidos ao teste de Western-blotting, para avaliação de antigenicidade frente a soros de animais positivos e negativos para N. caninum e T. gondii, previamente testados por RIFI. Os resultados apresentados nas duas técnicas (ELISA e Western-blotting) demonstram que a proteína recombinante purificada Nc56 de N. caninum possui reatividade cruzada entre os dois coccídeos, não se prestando, portanto, para uso em sorodiagnóstico da neosporose. / Neospora caninum, a protozoa phylogenetically related to other coccidea, is an obligatory intracellular parasite, able to cause abortions in bovine and neuromuscular paralysis in dogs. Researches with Neospora caninum antigens and recombinant proteins leads to numerous information to a better diagnosis and differentiation of several coccidea. The purposes of this study were expressing the Neospora caninum inner protein Nc56 in a prokaryotic system (Escherichia coli) and evaluate its antigenicity with i>Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive bovine sera. It was established the ideal conditions to express the protein (4 hour induction and 0,2% L-arabinose concentration) and, after that, two protein purification systems were assayed (immobilized metal affinity chromatography and elution from polyacrylamide gel) resulting in a better protein recuperation the elution method. A panel of previous RIFI-tested bovine sera was selected to evaluate the immune reactivity of Nc56 protein with Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera. The negative control was obtained from a Neospora caninum and Toxoplasma gondii negative newborn male bovine and the positive control was obtained from the same animal (6 month old), after the inoculation of live Neospora caninum tachyzoits. The indirect ELISA assay was performed in 96-wells microtiters plates, coated with purified Nc56 recombinant protein (10 µg/mL), resulting in higher optical densities for Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera, when compared with negative control. The purified recombinant protein and the crude extract of soluble proteins in denaturing binding buffer were submitted to Western-blotting to evaluate its antigenicity with Neospora caninum and Toxoplasma gondii/i> positive sera. The results obtained in both techniques shown that Nc56 purified recombinant protein has cross reactivity between both coccidea, therefore, it is not indicated to be used as antigen in neosporosis serodiagnosis.

Neospora caninum e Hammondia heydorni são coccídeos formadores de cistos proximamente relacionados com outros organismos heteroxenos pertencentes ao filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Hammondia hammondi. Para saber se o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), um canídeo silvestre comumente encontrado do nordeste da Argentina ao nordeste da América do Sul, pode ser hospedeiro definitivo de N. caninum, exemplares de cachorro-do-mato foram alimentados com tecidos de bovinos e bubalinos naturalmente infectados por N. caninum. As fezes dos cachorros-do-mato foram colhidas e examinadas diariamente para pesquisa de oocistos. No primeiro experimento, masseter e cérebro (peça inteira dos dois órgãos) colhidos de dois bovinos de aproximadamente dois anos de idade, foram picados, misturados e fornecidos às quatro raposas em dois dias consecutivos. Duas raposas eliminaram oocistos sub-esféricos não esporulados medindo 10-13µm no oitavo e nono dias pós-infecção, respectivamente. Uma das raposas eliminou oocistos por cinco e a outra nove dias. Amostras de DNA extraída dos de oocistos de cada dia de eliminação foram analisadas por PCR com primers grupo-específicos PCR-ITS-1 e espécie-especificos Nc5-NPCR. Todas as amostras foram positivas por PCR-HSP-70 e PCR-ITS-1, mas negativas por Nc5-NPCR. A sequência de nucleotídeos PCR-ITS-1 revelou 100% de identidade com seqüências homólogas de H. Heydorni. Concluímos que H. heydorni também utiliza o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) como hospedeiro definitivo. O cachorro-do-mato é usualmente reportado em contato com rebanhos em diversas regiões do Brasil. Então, é razoável inferir que estes carnívoros possam exercer um importante papel nos ciclos silvestre e doméstico da infecção por H. heydorni. Em um segundo experimento, sete exemplares de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) foram alimentados com tecidos de 3 búfalos (Bubalus bubalis) naturalmente infectados por N. caninum. As fezes das raposas foram analisadas 30 dias antes e trinta depois da infecção experimental e nenhuma das raposas eliminou oocistos N. caninum-like nas fezes. Estes resultados sugerem que o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) não é hospedeiro definitivo de N. caninum, entretanto estudos adicionais são necessários. / Neospora caninum and Hammondia heydorni are two cyst forming coccidians closely related to other apicomplexans, such as Toxoplasma gondii and Hammondia hammondi with a two host life-cycle. To clarify whether crab-eating fox (Cerdocyon thous), a wild carnivore commonly found from northern Argentina to northern South America, can be final hosts of N. caninum, foxes were fed on tissues of cows and water buffaloes naturally infected with N. caninum. Faeces were examined from 30 days before to 30 days after infection. In experiment 1, the whole masseter muscle and brain from two-year old bovines are collected, minced and pooled together for the fox infection. The bovine pooled tissues were equally administered for four fox, in two consecutive days. Two foxes shed unsporulated oocysts subspherical in shape measuring 10-13µm, after eight and nine days post-infection, respectively. One of the foxes eliminated oocysts for five days, while the other fox shed oocysts for nine days. A DNA sample of oocysts detected at each day of oocyst elimination was tested by a PCR carried out employing primers directed to the common toxoplasmatiid 18S and 5.8S coding genes (PCR-ITS-1). These samples were also submitted to a N. caninum specific gene (Nc-5nPCR). All of them were positive by PCR-ITS-1 and negative by Nc-5nPCR. The PCR-ITS-1 nucleotide sequence revealed 100% identity with homologous sequences of H. heydorni. In conclusion, it is clear that H. heydorni also uses the crab-eating fox as a definitive host. The crab-eating fox is usually reported to live in close contact with livestock in several regions of Brazil. Therefore it is reasonable to infer that such carnivores may play an important role in the sylvatic and domestic cycles of H. heydorni infection. In experiment 2, seven fox consumed tissues from three N. caninum naturally infected water buffaloes. Feaces were examined from 30 days before to 30 days after infection and none fox shed N. caninum-like oocysts. These results suggest that the crab-eating fox cannot be definitive host of N. caninum; however additional studies will be necessary.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_francine_sinnott.pdf: 966836 bytes, checksum: 31b75fbc3400564832438403aff0c6e0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Neosporosis is a disease caused by the obligate intracellular parasite Neospora caninum, causing reproductive disorders, such abortions and sltillbirths in several animals, being considered a major cause of abortion in cattle worldwide. The serological standard diagnosis is indirect fluorescent-antibody test (IFAT), but due to morphological and antigenic similarities of N. caninum with other protozoa of the phylum Apicomplexa, such as Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp., false positive results may occur. To improve the diagnosis of this disease and reduce cross-reactions with other coccidian, the use of specific recombinant proteins of N. caninum has been described. The Nc-p43 surface protein encoded by the gene NcSRS2 is specific of the parasite and is present in tachyzoites and bradyzoites of N. caninum. Indirect ELISA format assays have been developed for the diagnosis of neosporosis, however the blocking ELISA may present additional level of specificity. In this context, the objective of this study was develop and standardize a blocking ELISA (b-ELISA) for the diagnosis of bovine neosporosis. To this end, NcSRS2 gene, previously cloned into plasmid vector, was used to produce the recombinant protein (rNc-p43) in prokaryotic expression system Escherichia coli. The purified protein was used to produce a polyclonal antibody (pAb/rNc-p43) in rabbit and this was further purified and characterized by indirect ELISA. For the development of the b-ELISA were used a total of 152 cattle sera (71 negative and 81 positive) and 10 positive cattle sera for toxoplasmosis, all previously confirmed by IFI. As controls, a pool of all positive sera and a pool of all negative sera were used, in addition to a normal calf serum, confirmed by IFAT, used with negative reference sera. The percent inhibition for each sample was determined by comparing the optical density (OD) mean of test sera to the OD mean of negative reference sera. The cut-off value was determined as the percent inhibition of negative pool. The results suggest that the b-ELISA is a tool that can be used for diagnosis of bovine neosporosis, with a sensitivity of 98.7% and specificity of 88.7% when compared with the IFAT. Antibodies against T. gondii present in positive samples for toxoplasmosis were not able to recognize the rNc-p43. The b-ELISA showed that serum samples positive for N. caninum is able to prevent the binding of pAb/rNc-p43, enabling detect different class of antibodies in a single assay. This technique is / Neosporose é a doença causada pelo parasito intracelular obrigatório Neospora caninum, causando problemas reprodutivos, como abortos e mortalidade neonatal em diversos animais, sendo considerada uma das principais causas de abortos em bovinos em todo o mundo. O diagnóstico sorológico padrão é a imunofluorescência indireta (IFI), porém devido a semelhanças morfológicas e antigênicas de N. caninum com outros protozoários do filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp., pode ocorrer resultados falsos positivos. Para melhorar o diagnóstico desta parasitose e diminuir as reações cruzadas com outros coccídeos, à utilização de proteínas recombinantes específicas de N. caninum vem sendo descrita. A proteína de superfície Nc-p43 codificada pelo gene NcSRS2 é específica do parasito e está presente em taquizoítos e bradizoítos de N. caninum. Ensaios no formato ELISA indireto vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico da neosporose, no entanto os ELISAs de bloqueio podem apresentar nível adicional de especificidade. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um ELISA no formato bloqueio (b-ELISA) para o diagnóstico da neosporose bovina. Para tal, o gene NcSRS2, previamente clonado em vetor plasmidial, foi utilizado para produzir a proteína recombinante (rNc-p43) em sistema de expressão procarioto Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada para produzir um anticorpo policlonal (pAb/rNc-p43) em coelho e este foi posteriormente purificado e caracterizado através de ELISA indireto. Para o desenvolvimento do b-ELISA foram utilizados um total de 152 soros bovinos (71 negativos e 81 positivos) e 10 soros bovinos positivos para toxoplasmose, todos previamente confirmados por IFI. Como controles, um pool de todos os soros positivos e um pool de todos os soros negativos foi utilizado, além de um soro normal de terneiro, confirmado através de IFI, utilizado como controle negativo referencial. O percentual de inibição de cada amostra foi determinado pela comparação da média da densidade óptica (DO) de cada soro teste com a média da DO do controle negativo referencial. O ponto de corte foi determinado pelo percentual de inibição do pool negativo. Os resultados obtidos sugerem que o b-ELISA é uma ferramenta que pode ser utilizada no diagnóstico da neosporose bovina, com sensibilidade de 98.7% e especificidade de 88.7%, quando comparado com a IFI. Os anticorpos contra T. gondii presentes nas amostras positivas para toxoplasmose não foram capazes de reconhecer a rNc-p43. O b-ELISA demonstrou que as amostras de soros positivas para N. caninum são capazes de impedir a ligação do pAb/rNc-p43, possibilitando a detecção de diferentes classes de anticorpos em um único ensaio. Esta técnica pode ser uma alternativa de triagem para a detecção de anticorpos contra N. caninum em populações de bovinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_diene_de_borba_pacheco.pdf: 1130271 bytes, checksum: e77a03d669b55e89749bb0d6922531eb (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Neosporosis is a disease caused by the apicomplexan parasite Neospora caninum, which is closely related to Toxoplasma gondii. N. caninum infection represents an important cause of reproductive failure in sheep, goats, horses, and cattle worldwide. The diagnosis of neosporosis is based on the detection of pathogen-specific antibodies in animal sera or the presence of tissue cysts. However, morphological similarities and serological cross-reactivity between N. caninum and T. gondii can result in the misdiagnosis. In this study, the N. caninum tachyzoite surface protein Ncp-43 was expressed in a recombinant form to elicit polyclonal antibodies (pAb) response. The pAb was purified and conjugated to horseradish peroxidase (HRP) or fluorescein isothiocyanate (FITC) to detect the recombinant and native Ncp-43 proteins, respectively. The pAb and pAb/HRP were able to recognize rNcp-43 by Dot blot and ELISA, and pAb/FITC immunolabeled the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate pAb/HRP as a diagnostic tool. The mean percent inhibition for the positive and negative serum samples from cattle with neosporosis was significantly different (P < 0.0001). These results suggest that the pAb may bind to the same epitopes of Ncp-43 as anti-N. caninum antibodies in the positive samples tested. The b-ELISA using the pAb/HRP can facilitate diagnostic testing for neosporosis, since fewer steps are involved and cross-reactivity with secondary antibodies is avoided. In summary, this report describes the production of antibodies against N. caninum, and evaluates the potential of these tools for the development of new diagnostic tests for neosporosis. / Neosporose é a doença causada pelo parasito apicomplexa Neospora caninum, o qual é intimamente relacionado a Toxoplasma gondii. A infecção por N. caninum representa uma importante causa de falha reprodutiva em ovinos, caprinos, equinos e bovinos ao redor do mundo. O diagnóstico da neosporose é baseado na detecção de anticorpos específicos contra o patógeno em soros, ou a presença de cistos teciduais em animais. No entanto, as semelhanças morfológicas e a possível reatividade sorológica cruzada entre N. caninum e T. gondii pode resultar no diagnóstico errôneo. Neste estudo, a proteína de superfície Ncp-43 de taquizoítos de N. caninum, foi expressa de forma recombinante em Escherichia coli e utilizada para produção de anticorpos policlonais (pAb). O pAb foi purificado e conjugado a peroxidase (HRP) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) para detectar as proteínas recombinantes e nativas Ncp-43, respectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, o que foi avaliado pelas técnicas de Dot blot e ELISA enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de pool de soros positivos e o pool de negativos de bovinos com neosporose foi significativamente diferente (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a produção de anticorpos contra N. caninum, e avalia o potencial dessas ferramentas para o desenvolvimento de novos testes diagnósticos para neosporose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alceu_santos_junior.pdf: 1787319 bytes, checksum: 33ba7f2289b9ac4a868e567f7462444a (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The intracellular protozoan Neospora caninum, is considered the main causative agent of abortion in cattle. Infection occurs by ingestion of sporulated oocysts in the environment, first occurs systemic parasitemy characterizing acute phase of infection and subsequent chronic phase with formation of tissue cysts, thus persisting the infected and the asymptomatic host. Diagnosis is made by serologic tests. Currently, there are no data to ensure the effectiveness of commercial vaccine available for cattle. Apical complex antigens of the parasite are being studied, since they have an important role in infection. The rhoptries, secretory glands present in this region of the parasite N. caninum, play an important role in invasion and formation of parasitophago vacuoles, these properties have generated interest in its use in experimental vaccine formulations. Experimentally it showed partial results of protection in challenge, when fused to other proteins of this protozoan, the protection was increased, suggesting that antigens fusion is effective for protection against N. caninum. This work produced a new chimeric antigen, originated from the fusion of ROP² N. caninum with the B subunit of heat labile enterotoxin of Escherichia coli. The construction of the chimera was accomplished by cloning in sequence where ROP² gene was inserted directly into the N-terminus of LTB. The construction ROP²/LTB was expressed in E. coli strain BL 21 (DE3) StarTM where it presented a size of approximately 24kDa. The fusion antigen did not impair the antigenicity when tested against positive bovine serum by immunofluorescence, the Western blot technique, therefore, show great potential for use as a recombinant vaccine. / O protozoário intracelular Neospora caninum, é considerado principal agentes causadores de aborto em bovinos. A infecção ocorre pela ingestão de oocistos esporulados no ambiente, inicialmente ocorre parasitemia sistêmica caracterizando fase aguda da infecção e posteriormente fase crônica com formação de cistos teciduais, permanecendo assim o hospedeiro infectado e assintomático. O diagnóstico é feito através de provas sorológicas. Atualmente, não há dados que assegurem a eficácia da vacina comercial disponível para bovinos. Antígenos do complexo apical do parasito estão sendo estudados, pois apresentam papel importante na infecção. As roptrias, glândulas secretoras presente nesta região do parasito N. caninum, desempenham papel importante na invasão e formação do vacúolo parasitófago, essas propriedades produziram interesse na sua utilização em formulações de vacina experimentais. Experimentalmente apresentou resultados parciais de proteção ao desafio, quando fusionada a outras proteínas deste protozoário, aumentou a proteção, sugerindo que fusão de antígenos é eficiente para proteção contra N. caninum. O presente trabalho produziu um novo antígeno quimérico, originado da fusão entre ROP² de N. caninum com a subunidade B, da enterotoxina termolábil de Escherichia coli. A construção da quimera foi realizada por clonagem em sequência, onde gene ROP² foi inserido diretamente na porção N-terminal da LTB. A construção, ROP²/LTB, foi expressa em cepa E. coli BL 21 (DE3) StarTM onde apresentou tamanho de aproximadamente 24kDa. A fusão de antígeno não prejudicou a antigenicidade quando testado frente a soro bovino positivo por Imunofluorescência, na técnica de Western blot, portanto, apresentando grande potencial para ser utilizado como vacina recombinante.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_cintia_lidiane_guidoti_aguiar_cunha.pdf: 517290 bytes, checksum: 54cdb2ba4dc72f12759c702f6b1b7cda (MD5) Previous issue date: 2013-07-31 / Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan, causes neosporosis and resembles formation by Toxoplasma gondii tissue cysts in their hosts. Humans are not considered intermediate hosts for N. caninum, but its zoonotic potential is questionable, because of the close phylogenetic relationship with T. gondii and the report of a study, which fetuses of nonhuman primates, Rhesus, (Macaca mulatta) infected artificially with lesions similar to those caused by congenital toxoplasmosis. The present study aimed to verify the occurrence of antibodies to N. caninum in humans and its possible association with HIV infection and other risk factors. The presence of antibodies to N. caninum was determined from a sample of 156 HIV-positive patients and 100 HIV-negative individuals of Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil, through the reaction of Indirect Immunofluorescence Assay (IFA), with initial dilution of 1:25. Antibody titers found by IFA ranged between 25 and 800. Samples of 256 human sera analyzed, 47 (18.3%) were positive for N. caninum. Since antibodies to this protozoan were found in 36 HIV-positive patients (23.1%) and in 11 HIV-negative individuals (11%). Multivariate analysis showed that HIV-positive patients who have CD4+ T-lymphocyte count ≤ 350 cells/mm3 have 2.4 times more likely to be seropositive for N. caninum. HIV-negative individuals who have seropositivity for T. gondii have 4.71 times more likely to have antibodies to the agent studied. The results indicate the exposure of humans to N. caninum, with higher prevalence in immunocompromised individuals. / Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, causador da neosporose e assemelha-se a Toxoplasma gondii pela formação de cistos teciduais em seus hospedeiros. Os humanos não são considerados hospedeiros intermediários para N. caninum, mas seu potencial zoonótico é discutível, em virtude da proximidade filogenética com T. gondii e do relato de um estudo, onde fetos de primatas não humanos, Rhesus, (Macaca mulatta) infectados artificialmente, apresentaram lesões semelhantes às causadas por toxoplasmose congênita. O presente estudo teve por objetivo verificar a ocorrência de anticorpos para N. caninum em humanos e sua possível associação com a infecção por HIV e outros fatores de risco. A ocorrência de anticorpos para N. caninum foi determinada a partir de uma amostra de 156 pacientes HIV-positivos e 100 de indivíduos HIV-negativos do município de Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), com a diluição inicial de 1:25. Os títulos de anticorpos encontrados através da RIFI variaram entre 25 e 800. Das 256 amostras de soros humanos analisadas, 47 (18,3%) foram positivas para N. caninum. Sendo que anticorpos para esse coccídio foram encontrados em 36 pacientes HIV-positivos (23,1%) e em 11 indivíduos HIV-negativos (11%). A análise multivariada demonstrou que pacientes HIV-positivos que possuem contagem de linfócitos T-CD4+ ≤ 350 células/mm3 possuem 2,4 vezes mais chances de serem soropositivos para N. caninum. Indivíduos HIV-negativos que apresentam soropositividade para T. gondii possuem 4,71 vezes mais chances de apresentarem anticorpos para o agente estudado. Os resultados obtidos indicam a exposição de seres humanos a N. caninum, com prevalência mais elevada em indivíduos imunocomprometidos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_nilton_azevedo_da_cunha_filho.pdf: 1341797 bytes, checksum: 3a24f48f5e86bbb452bd241d5e458c34 (MD5) Previous issue date: 2013-07-08 / Neospora caninum is causing great economic losses in cattle, due to abortion. It has been shown that the transmission of N. caninum is the primary route of infection in cattle, followed by horizontal transmission. Few studies demonstrate the outcome of this type of transmission in herd raised in pasture cattle. The first experiment aimed to evaluate the occurrence of vertical transmission of N. caninum in beef cattle and verify the relationship between seropositivity and abortion. Blood was collected from mothers in the pre-pregnancy and after, three more times in the gestation period, plus a sampling of calves at birth. The seroprevalence in the arrays found in the screening was 32.2% (29/90). The vertical transmission rate was 75.8% and all dams evaluated completed pregnancy, demonstrating that N. caninum is present on the property studied, with high transmission rates, but no apparent influence on the reproductive performance of dams. The second experiment aimed to demonstrate the importance of horizontal transmission in maintaining N. caninum in the same herd. Were accompanied by serological tests, 61 seronegative mothers during pregnancy thirds and their calves at birth (n = 61) and during the first year of life (n = 24). No seroconversion occurred in any of the dams. In calves, however, that seroconversion occurred, indicative of horizontal infection by N. caninum, 12.5% at the end of 12 months. This indicates that horizontal transmission interference occurred in this herd. The third experiment aimed to detect the presence of DNA of N. caninum in umbilical cord of calves positive of positive dams. Was collected the umbilical cord of 20 calves at birth for laboratory testing by PCR. The DNA of the parasite was confirmed by 1/20 (5.0%) umbilical cords. This is the first report of the detection of DNA from N. caninum in umbilical cord of calves by PCR. / Neospora caninum é causador de grandes perdas econômicas na bovinocultura, devidas ao aborto. Já foi demonstrado que a transmissão vertical de N. caninum é a principal rota de infecção entre bovinos, seguida pela transmissão horizontal. Poucos estudos demonstram qual o resultado desse tipo de transmissão em rebanho criado a campo. O experimento 1 teve o objetivo de avaliar a ocorrência de transmissão vertical de N. caninum em matrizes de criação extensiva de gado de corte e verificar a relação entre soropositividade e aborto. Foi coletado sangue das matrizes no período pré-gestacional e, após, em mais três momentos do período gestacional, além de uma coleta de seus bezerros ao nascer. A soroprevalência nas matrizes, constatada na triagem foi de 32,2% (29/90). O índice de transmissão vertical foi de 75,8% e todas as matrizes avaliadas levaram a gestação a termo, demonstrando que N. caninum está presente na propriedade estudada, com índices elevados de transmissão vertical, porém sem influência aparente no desempenho reprodutivo das matrizes. O experimento 2 objetivou demonstrar a importância da transmissão horizontal na manutenção de N. caninum nesse mesmo rebanho. Foram acompanhadas, através de exames sorológicos, 61 matrizes soronegativas durante os terços gestacionais e seus bezerros ao nascer (n=61) e durante o primeiro ano de vida (n=24). Não ocorreu soroconversão em nenhuma das matrizes. Nos bezerros, no entanto, ocorreu essa soroconversão, indicativa de infecção horizontal por N. caninum, em 12,5%, ao final dos 12 meses. Isso indica a interferência da transmissão horizontal nesse rebanho. O experimento 3 teve o objetivo de detectar a presença do DNA de N. caninum em cordão umbilical de bezerros soropositivos filhos de matrizes soropositivas. Coletou-se o cordão umbilical de 20 bezerros no momento do nascimento para os testes laboratoriais pela técnica de PCR. O DNA do parasito foi confirmado em 1/20 (5,0%) dos cordões umbilicais. Este é o primeiro relato da detecção de DNA de N. caninum em cordão umbilical de bezerros pela técnica de PCR.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andreia_lucas.pdf: 441722 bytes, checksum: dac4b1a81e107c0d74f5c96cdf4078ac (MD5) Previous issue date: 2007-06-25 / The seroprevalence of Neospora caninum and the associated risk factors in dairy properties were verified in Pelotas region. Blood serum of 1046 six months older females from 92 properties were analysed by indirect immunofluorescence Assay (IFA &#8805;100). Canine seroprevalence from 67 properties was also verified (IFA &#8805; 50). An epidemiological questionnaire with neosporosis related issues was also applied to evaluate risk factors and statistical associations between the serological status of the livestock and the possible variables related to environment and handling, were evaluated by logistic regression (Statistx 8.0). The prevalence in bovines was 12,04%, in 47,6% of the analysed properties. Although at least one seropositive dog was found in 26,8% of the properties, none association was found between canine and bovine seroprevalences . The variables that presented statistic relation with the seropositivity to N. caninum in the studied were: access of others domestic animals to the bovine food (OR: 13,34; IC 95%: 1,60-111,57, P=0,0168), and monthly milk production until 5000l (OR: 2,77; IC 95%: 1,07-7,18, P= 0,0362). / Para verificar a prevalência de anticorpos para Neospora caninum e os fatores de risco associados em bovinos leiteiros provenientes de 92 propriedades localizadas na bacia leiteira da região de Pelotas, Rio Grande do Sul, foram coletadas 1046 amostras de soro sanguíneo de fêmeas com mais de seis meses de idade e aplicado um questionário epidemiológico, contendo questões ligadas a neosporose aos responsáveis pelas propriedades. As amostras foram avaliadas pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI &#8805; 100). As associações estatísticas entre o status sorológico do rebanho e as possíveis variáveis ligadas ao ambiente e manejo, foram avaliadas por regressão logística (Statistx 8.0). Também foi verificada a soroprevalência dos cães (RIFI &#8805; 50) em 67 propriedades. Em 26,8% (18/67) destas propriedades existia pelo menos um cão soropositivo para N. caninum. A prevalência entre os bovinos foi de 12,04%, distribuídos em 47,6% (43/92) das propriedades analisadas. A porcentagem de fêmeas soropositivas, por propriedade, variou de 2,6 a 100%. As variáveis: acesso de outros animais doméstico à comida dos bovinos (OR: 13,34; IC 95%: 1,60-111,57, P=0,0168) e produção leiteira até 5000 l/mês (OR: 2,77; IC 95%: 1,07-7,18, P= 0,0362) apresentaram associação estatística com a soropositividade para N. canium. Não foi observada associação entre a soropositividade dos cães e dos bovinos nos rebanhos estudados.