Orientador : Wagner Vilegas / Banca: Ana María Simonet Morales / Banca: Cássia Regina Primila Cardoso / Banca: Luís Vitor Silva do Sacramento / Banca: Marcos Hikari Toyama / Resumo: A família Sapindaceae é bastante estudada do ponto de vista farmacológico. A Serjania marginata Casar., uma espécie dessa família, é indicada, popularmente, para dores de estômago. Os objetivos deste trabalho foram estabelecer o perfil químico, isolar e caracterizar os constituintes químicos do extrato EtOH 70% de S. marginata, quantificar as substâncias marcadoras da espécie, avaliar a toxicidade aguda, neurotoxicidade, atividade anti-ulcerogênica, antiradicalar e mutagênica do extrato, determinar o teor de fenóis e flavonoides totais e avaliar a espécie no cultivo ex situ. Os estudos foram realizados com as folhas de plantas nativas do Cerrado e cultivadas no Horto de Plantas Medicinais, da UFGD, em Dourados-MS. O maior rendimento foi da espécie nativa coletada em fevereiro de 2011 (32,6%). Pela triagem fitoquímica, determinou-se que o extrato é composto por flavonoides, saponinas, taninos, compostos fenólicos e esteróides. Foram isoladas quinze substâncias, das classes dos flavonoides, taninos e saponinas, sendo o ácido oleanólico 3-O-α-L-arabinopiranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)[β-D-glicopiranosil(1→4)]-α-L-arabinopiranosídeo e a 7,5"-anidroapigenina 8-C-α-(2,6-dideoxi-5-hidroxi-ribo-hexopiranosil)-4'-O-β-D-glucopiranosídeo, descritos pela primeira vez na literatura. O extrato não apresentou efeitos tóxicos nem neurotóxicos no uso oral agudo e não foi mutagênico. Evidenciou-se também significativa atividade anti-úlcera para o extrato em diversos modelos farmacológicos, avaliados in vivo. Os extratos das folhas colhidas em diferentes épocas de cultivo, avaliados através do uso do reagente DPPH, apresentaram alta atividade antiradicalar, quando comparados ao ácido gálico e quercetina, especialmente devido à presença de taninos. As plantas coletadas após o florescimento apresentaram maior quantidade de compostos fenólicos e, antes do florescimento, maior concentração de flavonoides... / Abstract: Sapindaceae family is extensively studied on a pharmacological point of view. Serjania marginata Casar., a specie of this family, is indicated popularly for stomach aches. The objectives of this work were to standardize the chemical profile, to characterize the chemical composition of 70% EtOH extract from S. marginata, to quantify the marker substances for the specie, to assess the acute toxicity, neurotoxicity, anti-ulcerogenic, antiradical and mutagenic activities of the extract, to determine the total phenolic and flavonoid contents and to evaluate conditions of ex situ cultivation for the specie. The studies were performed with leaves of native plants from the Cerrado and of plants grown in the Garden of Medicinal Plants from the UFGD, Dourados-MS. The highest contents were achieved by the native accesses collected during February 2011 (32.6%). During the chemical screening, it was determined that the extract was composed by flavonoids, saponins, tannins, phenols and steroids. Fifteen substances were isolated which were classified as flavonoids, tannins and saponins, and the oleanolic acid 3-O-α-L-arabinopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-α-L-arabinopyranoside and 7,5"-anhidroapigenin 8-C-α-(2,6-dideoxy-5-hydroxy-ribo-hexopyranosyl)-4'-O-β-D-glucopyranoside described for the first time in the literature. The extract here studied did not show any toxic or neurotoxic effect by acute oral dose neither presented any mutagenic potential. Significant anti-ulcer activity of the extract was evidenced when applied in different pharmacological modulations, evaluated in vivo. The extracts from leaves harvested in different growing seasons evaluated through the use of the reagent DPPH showed high antiradical activity when compared to the gallic acid and quercetin, mainly due to the presence of tannins. Plants collected after flowering showed higher amounts of phenolic compounds and, before flowering, ... / Doutor

Orientador: Marcos Dias Fontana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-26T03:25:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gregio_AnaMariaTrindade_D.pdf: 2249313 bytes, checksum: 6fac809aa95af8768f99c3cb5d8801a4 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O presente trabalho relata uma comparação entre as duas principais espécies de escorpião de importância médica: T. serrulatus e T. bahiensis. O estudo dos acidentes escorpiônico é muito importante devida sua gravidade e freqüência que ocorrem. O estudo comparativo dos venenos de escorpião T. bahiensis e T. se"ulatus foi dividido em duas partes. Primeiramente o estudo farmacológico em preparações isoladas (preparação nervo frênico-diafragma de rato, aurícula isolada, biventer cervicis de pintainho), além de pressão arterial de rato e dose mediana letal em camundongos. Nestes experimentos utilizou-se o veneno de T. serrulatus e T. bahiensis nas mesmas doses para estabelecer uma comparação de seus efeitos. A segunda parte do trabalho: estudos bioquímicos com estes venenos. Foi realizado estudos sobre atividades enzimáticas destes venenos (atividade proteolítica e hialuronidásica) e o fracionamento destes venenos através de cromatografia por gel filtração. Os principais picos destes fracionamentos foram testados em preparação nervo frênico-diafragma de rato, para verificação da atividade neuromuscular destas frações. Em preparações isoladas nervo frênico-diafragma de rato e preparação de biventer cervicis de pintainho os venenos comportaram-se de maneira semelhante, na preparação de aurícula isolada de cobaia e pressão arterial de rato pode-se constatar uma discreta diferença para o veneno de T.bahiensis, este promovia uma bradicardia e hipotensão mais acentuadas do que o veneno de T. se"ulatus. Além disso, em preparações nervo frênico diafragma de rato onde foi analisado a atividade dos venenos sobre os "twitches " o veneno de T. bahiensis demonstrou ser mais ativo nas preparações que haviam sido previamente Icurarizadas (d-Tc 14,6 11M), pois induziu o aparecimento de contraçoes espontâneas e aumento no tempo de relaxamento. Em termos de letal idade o veneno de T. se"ulatus mostrou-se mais potente que o veneno de T.bahiensis, também revelou ser mais potente no antagonismo do bloqueio neuromuscular em preparações curarizadas pela d-Tc (1 ,46 11M). A atividade hialuronidásica demonstrou níveis parecidos para ambos venenos, o que leva a crer que os venenos em estudo tenham um bom fator de difusão nas membranas. Quanto à atividade proteolítica, não foi encontrada nos dois venenos. O perfil do fracionamento foi diferente para ambos venenos, porém suas frações reproduziram os mesmos efeitos: aumento na amplitude das contrações, contrações espontânes, contraturas e bloqueio neuromuscular. Todos estes efeitos também foram visualizados com o veneno total. Nossos resultados sugerem que, as duas espécies de escorpião possuem uma taxonomia relativa, porém contém toxinas diferentes que exercem efeitos farmacológicos similares sobre preparações neuromusculares / Abstract: T. bahiensis and T.serrulatus are the main scorpion species involved in envenomations in the Brazil, the latter being the more widely distributed. Clinically, envenomations by T. serrulatus is more serious than that by T. bahiensis. In this thesis, the lethal and neurotoxic activities of venoms from these two species were compared. Male Swiss withe mice (18-20 g) were used to determine the Lv. LDso of the venoms and the rat phrenic nerve-diaphragm preparations was used to examine the neuroxic activity. The LDso for T. bahiensis and T. serrulatus venom was 0,72 (95% CI: 0,68 -0,75) mg/Kg and 0,54 (95% CI: 0,45-0,64) mg/Kg, respectively. In phrenic nerve-diaphragm preparations, both venoms (2,5 _g/ml) produced similar responses, namely, na increase in contraction amplitude and in the number of fasciculations, as well as mucle contracture followed by neuromuscular blockade. Similar effects were observed for the two venoms in the chik biventer cervicis neuromuscular preparation. T.serrulatus venom completely reverted the neuromuscular blockade produced by d-tubocurarine (d-Tc 1,46 M) in 35,0.:!: 1,8 min and 18,0.:!: 1,2 min at the concentrations of 2,5 _g/ml and 5 _glml, respectively. At these same concentrations, T. bahiensis venom produced only partial reversal after 60 mino Both venoms (100-600_g/Kg) produced marked alterations in the blood pressure of anesthesized rats, including hypo- and hypertensive responses as well as bradycardia. The latter effect was also observed in guinea-pig isolated atria. In both of these preparations, T. bahiensis venom was moe potent than T.serrulatus venom. The fractionation of T. bahiensis and T.serrulatus venoms by gel filtration on Superdex 75 resulted in 13 na 12 peaks, respectively. Ali peaks were tested neuromuscular activity in the isolated phrenic nerve-diaphragm preparation. Several peaks increased the amplitude of the contractions in indirectly stimulated preparations and produced neuromuscular blockade and fasciculations, as well as spontaneous muscle contractions. In general, the venoms of T. bahiensis and T. serrulatus produced similar pharmacological effects but differed in potency. Since Tityus scorpions venoms contain a variety of alfa and beta neurotoxins with marked neuromuscular activity, the differences seen between these two venoms may reflect variation in their content of these toxind or may indicate the presence of novel toxins with similar pharmacological effects on the mammalian neuromuscular junction / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Objetivo. Avaliar o campo visual em ex-trabalhadores de fábricas de lâmpadas fluorescentes com diagnóstico de mercurialismo metálico crônico ocupacional, através de testes psicofísicos de campimetria computadorizada e registros eletrofisiológicos da retina obtidos através do eletrorretinograma multifocal. Método. A avaliação psicofísica do campo visual foi realizada em 35 ex-trabalhadores (idade média = 44,2 ± 5,9 anos; 30 homens) no equipamento Humphrey Field Analyzer II (modelo 750i) em dois testes: acromático (standard automated perimetry) e azul-amarelo (short wavelength automated perimetry). O programa Visual Evoked Response Imaging System (VERISTM Science 5.0) permitiu o registro e análise dos sinais eletrofisiológicos da retina através do eletrorretinograma multifocal em 32 ex-trabalhadores (idade média = 44,6 ± 5,5 anos; 27 homens) dos 35 que realizaram os testes de campimetria computadorizada. Os resultados foram comparados com um grupo controle para o campo visual (n = 34; idade média = 43,3 ± 8,3 anos; 21 homens) e com outro grupo controle para o eletrorretinograma multifocal (n = 21; idade média = 43,5 ± 8,9 anos; 10 homens). Resultados. Os exames psicofísicos de campimetria computadorizada mostraram que há redução da sensibilidade visual em regiões centrais até 27? do campo visual. No exame acromático a diminuição da sensibilidade ocorreu, inclusive, na região foveal. O exame azul-amarelo confirmou a redução encontrada no exame acromático para regiões paracentrais até 27° de excentricidade. O eletrorretinograma multifocal apresentou redução nas amplitudes das respostas retinianas em regiões centrais até 25°, sem alteração no tempo implícito das respostas. As regiões paracentrais mostraram redução significativa para os valores de amplitude do primeiro componente negativo (N1) e do primeiro componente positivo (P1). Discussão. A redução na sensibilidade visual em diferentes regiões do campo visual, confirma que há prejuízos no sistema visual decorrentes da exposição crônica ao vapor de mercúrio. Nesse caso, não se pode especificar as regiões afetadas, porque a metodologia utilizada não permite isolar estruturas da via visual e, consequentemente, não permite localizar as regiões específicas que o mercúrio estaria prejudicando preferencialmente. Os prejuízos causados pela intoxicação ao vapor de mercúrio na retina parecem ser difusos, considerando que a redução de amplitude das respostas de N1 e P1 pode indicar prejuízos em diferentes grupos celulares da retina. Os resultados mostram que parte dos prejuízos de campo visual causados pelo vapor de mercúrio estão relacionados com alterações retinianas. Os resultados estão de acordo com trabalhos preliminares que monstraram alterações visuais que permanecem mesmo anos após o afastamento da fonte de exposição, sugerindo que a intoxicação por vapor de mercúrio pode não ser totalmente reversível. Conclusão. Os sujeitos expostos cronicamente ao vapor de mercúrio durante um período de 10 anos (em média) apresentam redução da sensibilidade visual em diferentes regiões do campo visual, mesmo após 7 anos (em média) de afastamento da fonte expositora. Pode haver prejuízos em diferentes regiões da via visual envolvidos nas alterações de campo visual, mas parte desses prejuízos causados pela exposição crônica ocupacional ao vapor de mercúrio possui origem retiniana. / Purpose. To analyse visual field sensitivity in a group of workers retired from thefluorescent lamp industry diagnosed with chronic occupational metallic mercurialism using psychophysical tests such as automated perimetry and measuring the retina cells\' electrical responses with the multifocal electroretinogram. Methods. The psychophysical evaluation of the visual field was performed in 35 retired workers (mean age = 44.2 ± 5.9 years; 30 males) using Humphrey Field Analyzer II (model 750i) device in two different tests: SAP (standard automated perimetry) and SWAP (short wavelength automated perimetry). The Visual Evoked Response Imaging System (VERISTM Science 5.0) provided us the electrophysiological recordings and analysis of the retina based on measurement data from the multifocal electroretinogram in 32 retired workers (mean age = 44.6 ± 5.5 years; 27 males) that were included in the 35 automated perimetry test subjects. The results were compared with an age-matched control group using the visual field tests (n = 34; mean age = 43.3 ± 8.3 years; 21 males) and to another age-matched control group at the multifocal electroretinogram (n = 21; mean age = 43.5 ± 8.9 years; 10 males). Results. The automated perimetry tests have shown visual sensitivity reductions in the central areas around 27° of eccentricity. In the SAP test sensitivity decrease was found even in the foveal region. The SWAP test results are in agreement with the reduction found around 27° in the SAP test at mid-peripheral areas. The multifocal electroretinogram has shown decreases in amplitude in the retina recordings in the central areas around 25° of eccentricity, but there were no implicit time reductions. The mid-peripheral areas have shown significant reductions in the amplitude values in the first negative component (N1) and in the first positive component (P1) as well. Discussion. The visual sensitivity reductions in the different visual field areas confirm the visual damages in patients with long-term mercury vapor exposure. In this case the affected visual pathway sections could not be determined since the applied psychophysical method does not allow us to indicate the specific visual structure principally damaged by the mercury vapor. The damages found in the retina due to mercury vapor intoxication can be considered broadly dispersed, since the reductions in N1 and P1 amplitudes might be the indications of damages in multiple retina cell groups. Our results show that some visual field losses are related to various retinal alterations caused by the mercury vapor. The results are in agreement with preliminary works that showed visual dysfunctions after several years away from the mercury vapor source suggesting that mercury vapor intoxication may not be completely reversible. Conclusion. The long-term (10 years in average) mercury vapor exposed workers have shown visual sensitivity reductions in different visual field areas after 7 years (in average) away from the mercury vapor source. In our present study we would like to indicate that visual field reductions cannot only be related to damages in the various sections of the visual pathway, but some of these visual field losses can occur due to retinal alterations caused by cronic mercury vapor exposure.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:19:34Z No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:19:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T18:19:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Recent studies have shown several applications of graphene oxide (GO) in neurology in the imaging area as a contrast agent for diagnostic purposes, for drug delivery of anticarcinogenic drugs, proteins and peptides and in the field of tissue engineering for applications in the regeneration of nervous lesions. Advances in GO applications research in neurology require addressing its potential toxic mechanisms of action. Zebrafish (Danio rerio) has been widely used in neurotoxicological trials due to the homology of biochemical processes and neural structures with vertebrates. To investigate the potential neurotoxic effects of GO exposure in different concentrations at development period, we evaluated in vivo parameters for initial toxicological screening. We found that GO did not induce changes in survival, hatching and spontaneous movement. However, an increase in heart rate at 48 hpf was found and a reduction in body length without altering the ocular area at 5 dpf. Additionally, molecular gene expression analyses of nervous system-related proteins were performed, showing synapsin IIa expression is increased and dopamine transporter (dat) gene expression is reduced, suggesting a potential compensatory mechanism. The evaluation of the locomotion behavior of animals exposed at GO showed an increase in the absolute turn angle. Based on these initial parameters, we performed biochemical analyzes to determination of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) activity and dopamine levels. The exposure at GO did not change AChE activity and decreased dopamine levels. Additionally, the gene expression of B cell lymphoma 2 (bcl2) gene and caspase 3 (casp3) gene were evaluated for the group of larvae exposed to GO, demonstrating an increase of bcl2 and unchanged casp3 expression, suggesting no apoptosis involvement. The tissue and cellular structure of zebrafish larvae brain exposed at GO was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) and cell dead by autophagosome formation with loss of cellular architecture was observed most likely due to exposure to the nanomaterial. Further studies are necessary to the complete understanding of the neurological changes observed in zebrafish by exposure to GO and the mechanisms involved in this process, are necessary. / Estudos recentes t?m mostrado diversas aplica??es do ?xido de grafeno (GO) como agente de contraste para fins de diagn?stico, para o endere?amento de drogas (do ingl?s drug delivery) de f?rmacos anticarcinog?nicos, prote?nas e pept?deos e na ?rea de engenharia tecidual para aplica??es na regenera??o de les?es nervosas. O avan?o em pesquisas relacionadas a aplica??es do GO em neurologia exige a investiga??o dos mecanismos de a??o potencialmente t?xicos desencadeados pela exposi??o ao nanomaterial. O zebrafish (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado em ensaios neurotoxicol?gicos devido ? homologia de processos bioqu?micos e estruturas neurais com outros vertebrados, vis?veis desde o in?cio de seu desenvolvimento externo. Para investigar os efeitos neurot?xicos da exposi??o a diferentes concentra??es do GO no per?odo de desenvolvimento, foram avaliados diversos par?metros in vivo para avalia??o toxicol?gica preliminar. Foi verificado que o GO n?o induziu altera??es na sobreviv?ncia, eclos?o e movimentos espont?neos. Contudo, o aumento dos batimentos card?acos em 48 hpf foi constatado e redu??o do tamanho do eixo axial, sem altera??o na ?rea ocular em 5 dpf. Adicionalmente, an?lises moleculares da express?o de genes espec?ficos para prote?nas do sistema nervoso foram realizadas mostrando que o GO aumenta a express?o de sinapsina IIa e reduz a express?o do transportador de dopamina (dat), sugerindo um prov?vel mecanismo compensat?rio. A avalia??o da locomo??o dos animais expostos ao GO mostra o aumento do ?ngulo absoluto de virada. Com base nestes par?metros iniciais, foram realizadas an?lises bioqu?micas para a determina??o da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e dosagem dos n?veis de dopamina. A exposi??o ao GO n?o alterou a atividade da AChE e reduziu os n?veis de dopamina. Adicionalmente, a express?o do gene de linfoma de c?lulas B2 (do ingl?s B cell lymphoma 2 (bcl2) ) e do gene que codifica para caspase 3 (casp3) foram avaliadas para o grupo de larvas expostas ao GO onde foi mostrado aumento da express?o de bcl2, enquanto que a express?o de casp3 permaneceu inalterada, sugerindo que o GO parece n?o induzir mecanismo de apoptose. A estrutura tecidual e celular do c?rebro de larvas de zebrafish expostas ao GO foi avaliada por microscopia eletr?nica de transmiss?o (TEM) onde morte celular por necrose com perda da arquitetura celular foi constatada. Estudos adicionais para o completo entendimento das altera??es neurol?gicas observadas pela exposi??o ao GO e dos mecanismos envolvidos nesse processo s?o necess?rios.

Submitted by Chrissie Carvalho (chrissieca@gmail.com) on 2018-03-01T16:00:54Z No. of bitstreams: 1 Chrissie Carvalho 2017 - Tese de Doutorado - Heróis da Mente.pdf: 6819867 bytes, checksum: 3c9eeccac78e36ed9dab54fe8da932f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Biblioteca Isaías Alves (reposiufbat@hotmail.com) on 2018-04-02T18:15:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Chrissie Carvalho 2017 - Tese de Doutorado - Heróis da Mente.pdf: 6819867 bytes, checksum: 3c9eeccac78e36ed9dab54fe8da932f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-02T18:15:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chrissie Carvalho 2017 - Tese de Doutorado - Heróis da Mente.pdf: 6819867 bytes, checksum: 3c9eeccac78e36ed9dab54fe8da932f5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia e Coordenação de Aperfeiçoamento (FAPESB) de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estudos tem evidenciado que a participação em programas de estimulação das Funções Executivas (FE) beneficiam principalmente crianças em situação de vulnerabilidade e baixas FE. As pesquisas básicas no campo das neurociências e da neuropsicologia tem contribuído para o melhor entendimento em relação ao desenvolvimento cognitivo e socioemocional e a influência de fatores de risco. As FE possuem um papel crucial no processo de aprendizado, autorregulação e sucesso escolar. Comprometimento neuropsicológico tem sido retratado em crianças cronicamente expostas ao manganês (Mn), configurando assim esse grupo com alto grau de vulnerabilidade. O Mn é um nutriente essencial ao organismo, no entanto em altos níveis tem potencial neurotóxico, prejudicando o desenvolvimento das funções cognitivas principalmente de crianças e adolescentes que são mais susceptíveis aos efeitos deletérios da exposição crônica. Diante desse contexto, a presente tese teve como objetivo caracterizar déficits cognitivos associados à exposição ao Mn em crianças de 7-12 anos de idade, e a partir disso desenvolver e avaliar a eficácia de um programa de estimulação com foco na promoção de FE para escolares do 2o ao 5o ano nesse contexto de exposição. Para tanto, desenvolveu-se quatro estudos empíricos. No primeiro estudo participaram 70 crianças expostas ambientalmente ao Mn e 127 crianças sem histórico de exposição ao Mn. Os residentes estão vulneráveis à exposição ao Mn por emissões atmosféricas provenientes da atividade industrial de uma fábrica ligas de ferro-manganês na região de Simões-Filho, Bahia. Os achados indicaram que mesmo controlando para possíveis confundidores, as crianças expostas ao Mn comparadas aos controles apresentaram menor desempenho em fluência verbal, memória e aprendizagem verbal, controle inibitório e flexibilidade cognitiva. Além disso, foram encontradas associações entre os níveis de Mn no cabelo das crianças com o desempenho em memória verbal e maior incidência de comportamentos hiperativos, sendo essas associações modificados pelo sexo da criança. Por sua vez, o estudo empírico II buscou descrever as etapas do desenvolvimento e as evidências de validade de conteúdo do Programa de Estimulação das Funções Executivas Heróis da Mente (PHM). O PHM é composto de seis histórias em quadrinhos e de quatro módulos para a estimulação das FE. Utilizou-se o Índice de Validade de Conteúdo (ICV) para determinar o nível de concordância entre os quatro juízes especialistas para cada atividade, módulo e do programa como um todo. Os resultados indicaram alto grau de concordância entre os juízes tanto na análise global do programa (ICV Global de 0,94), quanto de suas atividades e módulos. De acordo com os critérios analisados foi possível verificar a adequação ao contexto, idade, compreensão, coerência entre o objetivo proposto e o engajamento das FE, permitindo assim os aprimoramentos necessários das atividades para a promoção das FE. O estudo empírico III objetivou avaliar a eficácia da implementação do PHM em crianças expostas ambientalmente ao Mn. Foi realizado um estudo com desenho pré/pós-teste com três grupos de crianças com idades entre 7 e 12 anos que estudam 3 escolas públicas da Bahia. Participaram crianças expostas cronicamente ao Mn, residentes no município de Simões Filho – Bahia, mesma região do estudo empírico I, divididas em dois grupos: Grupo Controle que continuou com suas atividades regulares (GC-Mn) e grupo experimental que participou do PHM (GE-Mn). Além disso, o PHM foi implementado em um grupo de crianças com desenvolvimento típico e sem histórico de exposição ao Mn (GE-T). O PHM foi implementado por professores em sala de aula pelo período de 4 meses. Os resultados mostraram que o GE-Mn apresentou ganhos mais expressivos e com maior tamanho de efeito em memória de trabalho, flexibilidade cognitiva, fluência verbal fonêmica e houve efeito de transferência para outras habilidades cognitivas e acadêmicas como atenção visual e habilidades de escrita. O GC-Mn apesar de ter apresentado ganhos significativos em memória de trabalho verbal e fluência verbal, esses ganhos obtiveram um tamanho de efeito menor que o GE-Mn, além disso o grupo controle foi o único que reduziu de forma significativa os escores em inteligência fluida. Já o GE-T foi o grupo que apresentou melhores FE na linha base e demostrou melhora significativa em tomada de decisão e em velocidade de processamento em tarefas que demandam controle inibitório e flexibilidade cognitiva. Por fim, o estudo empírico IV buscou analisar uma série de 8 casos de crianças que participaram dos estudos empírico I e III, sendo 4 pertencentes ao GC-Mn e 4 ao GE-Mn. Cada caso foi analisado individualmente nos três momentos de avaliação (T1, T2 e T3), totalizando um intervalo de quatro anos. O PHM ocorreu entre T2 e T3. Os dados evidenciaram que o perfil neuropsicológico analisado ao longo dos anos demonstrou, em parte dos casos, um decaimento dos escores Z nos testes de inteligência, memória de trabalho verbal e fluência verbal semântica. A análise dos casos revelou que a maioria das crianças do grupo controle mostrou maior tendência a terem perdas cognitivas ao longo dos anos. Já as crianças que participaram do PHM apresentaram mais ganhos cognitivos que perdas principalmente entre T2 e T3, mesmo esse grupo tendo apresentado níveis de Mn superior ao grupo controle e perfil cognitivo mais comprometido em T1. Em conjunto, os achados demonstraram que o programa de estimulação foi capaz de trazer benefícios em alguns aspectos das FE, representando uma diminuição entre as diferenças no desenvolvimento neuropsicológico entre o grupo exposto ao Mn e as crianças sem histórico de exposição que participaram do PHM. Este estudo apresenta dados relevantes em termos de políticas públicas, oferendo um programa de baixo custo para ser implementado por professores podendo ser facilmente ser inserido no currículo escolar. / Studies have shown that be enrolled in programs to stimulate Executive Functions (EF) mainly benefit children in situations of vulnerability and low EF. Basic research in the field of neuroscience and neuropsychology has contributed to a better understanding of cognitive and social-emotional development and the influence of risk factors. EFs play a crucial role in the process of learning, self-regulation and school achievement. Neuropsychological deficits has been described in children chronically exposed to manganese (Mn), consequently configuring this group with a high degree of vulnerability. Mn is an essential nutrient to the body, however at high levels is potentially neurotoxic, impairing the development of cognitive functions mainly regarding children and adolescents who are more susceptible to the deleterious effects of chronic exposure. Given this context, the present thesis aimed to characterize cognitive deficits associated with exposure to Mn in children aged between 7 and 12 years, and beyond that, to develop and evaluate the effectiveness of a stimulation program focused on promoting EF for students from 2nd to 5th grade in this context of exposure. Taking into account four empirical studies were developed. In the first study, participants were 70 children exposed to Mn and 127 children with no history of Mn exposure. Residents are vulnerable to Mn exposure by air emissions arising from an iron-manganese alloy plant in the region of Simões Filho - Bahia. Findings indicated that even controlling for possible confounders, children exposed to Mn compared to controls showed lower performance in verbal fluency, verbal memory, inhibitory control and cognitive flexibility. In addition, we found associations between Mn levels in children's hair with verbal memory performance and higher incidence of hyperactive behavior, and these associations were modified by child's sex. The empirical study II aimed to describe the stages of development and content validity evidences of the Executive Function Stimulation Program Heroes of the Mind (PHM). The PHM is composed of six comic’s histories and four modules to promoting EF. The Content Validity Index (CVI) were used to determine agreement between the four expert judges for the program (each activity, module, and global). The results indicated high degree of agreement between the judges in the program (Global ICV was 0.94) and its activities and modules. According to the criteria analyzed, it was possible to verify adequacy to the context, age, comprehension, coherence between the proposed objective and engagement of EF, allowing the improvement of the activities to promote EF. The objective of empirical study III was to evaluate the effectiveness of the implementation of PHM in children environmentally exposed to Mn. A pre/post-test design study was conducted including three groups of children aged between 7 and 12 years studying at 3 public schools in Bahia. Children chronically exposed to Mn, living in the municipality of Simões Filho - Bahia, region of empirical study I, were divided into two groups: Control Group remained with school regular activities (CG-Mn) and experimental group participating in PHM (EG-Mn). In addition, PHM was implemented in a group of children with typical development and no history of exposure to Mn (EG-T). Teachers in the classroom implemented the PHM for the period of 4 months. Results showed that EG-Mn presented more expressive gains with greater effect size in working memory, cognitive flexibility, phonemic verbal fluency, and there were transferring effects to other cognitive and academic functions such as visual attention and written skills. Although CG-Mn had significant gains in verbal work memory and verbal fluency, these gains obtained lower effect size compared to EG-Mn, in addition the control group was the only one that significantly reduced the scores in Fluid intelligence. EG-T presented better EF performance at baseline and showed significant improvement in decision making and in processing speed in tasks that require inhibitory control and cognitive flexibility. Finally, the empirical study IV aimed to analyze a series of 8 cases of children enrolled in the empirical studies I and III, 4 belonging to CG-Mn and 4 to EG-Mn. Each case was analyzed individually at three evaluation moments (T1, T2 and T3), completing an interval of four years. The PHM occurred between T2 and T3. The results showed that the neuropsychological profile analyzed over the years demonstrated, in part of the cases, a decrease of the Z scores in tests of intelligence, verbal work memory and semantic verbal fluency. An analysis of the cases revealed that most of the children in the control group showed a greater tendency to have cognitive losses over the years. In the other hand, children who participated in the PHM presented more cognitive gains than losses between T2 and T3, even this group had higher levels of Mn and had a more compromised cognitive profile in T1 than the control group. Taken together, the findings demonstrated that the stimulation program was able to demonstrate gains in some aspects of EF, representing a decrease between the differences in neuropsychological development between the exposed Mn group and children with no history of exposure who participated in the PHM. This study presents relevant data in terms of public policies, offering a low cost program that can be implemented by teachers and easily inserted into the school curriculum.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337736.pdf: 2749407 bytes, checksum: 83fc4df7953d4ab58a50f4b11d22723d (MD5) Previous issue date: 2015 / Os efeitos neurotóxicos do metilmercúrio (MeHg) são bem conhecidos, mas informações mais detalhadas sobre a sua ação durante o desenvolvimento embrionário ainda são escassas. Este estudo teve como objetivo caracterizar os efeitos do MeHg sobre a organização ultraestrutural e sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento das camadas da medula espinhal, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo. No terceiro dia embrionário (E3), os embriões foram tratados in ovo com uma única dose de cloreto de metilmercúrio (ClMeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e avaliados no décimo dia embrionário (E10). As análises morfológicas e morfométricas da medula espinhal foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A localização e quantificação dos marcadores relacionados ao ciclo celular e dano ao DNA foram obtidos a partir de técnicas de imunohistoquímica e citometria de fluxo. Adicionalmente, foram realizados o ensaio de TUNEL, para a identificação de células em apoptose e análise por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar possíveis danos ultraestruturais. Nossos resultados mostraram significativa deposição de mercúrio nas três camadas da medula espinhal, as quais apresentaram alteração na expressão de marcadores relacionados ao controle do ciclo celular, proliferação e morte celular. O aumentado número de células ?H2A.X-positivas observado na camada de manto indica dano ao DNA, o qual pode ser a causa do aumento na expressão de p21 e consequente retenção do ciclo celular na fase G1. A exposição ao MeHg também causou alterações nos componentes subcelulares das células da medula espinhal, principalmente nas mitocôndrias que apresentaram edemas e rupturas de membranas, além do aparecimento de formas mitocondriais incomuns cup-like (em cálice) e donut-like (em anel). Esses danos podem estar associados com o aumento da morte celular na camada do manto, a qual parece ser mais afetada após a exposição ao MeHg. A redução da proliferação associada a aumento da morte celular, mostraram que uma única dose de MeHg foi capaz de perturbar mecanismos celulares essenciais causando redução na espessura das camadas da medula espinhal. Do ponto de vista toxicológico, estes resultados são importantes porque mostram que a exposição ao MeHg, in ovo, altera a medula espinhal em desenvolvimento e pode levar a possíveis comprometimentos neuromotores na vida pós-natal.<br> / Abstract : The neurotoxic effects of methylmercury (MeHg) are well known, but more detailed information on its action during embryonic development are still scarce. This study aimed to characterize the effects of MeHg on the ultrastructural organization and on the molecular and cellular mechanisms involved in the development of spinal cord layers, using Gallus domesticus embryos as a model. At third embryonic day (E3), the embryos were treated in ovo with a single dose of methylmercury chloride (ClMeHg) (0.1 µg diluted in 50 µL saline) and evaluated at the tenth embryonic day (E10). The morphological and morphometric analyses of the spinal cord were taken from histological sections stained with HE. The localization and quantification of the cell cycle related and DNA damage markers were performed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Additionally, TUNEL assay was used to apoptosis identification and transmission electron microscopy was conducted to investigate ultrastructural damage. Our results showed significant mercury deposition in the three spinal cord layers, which had alterations in expression of markers related to cell cycle control, proliferation and cell death. The increased number of ?H2A.X-positive cells observed in the mantle layer indicates DNA damage, which may be the cause of the p21 expression increased and consequent cell cycle arrest in G1 phase. The MeHg exposure also caused changes on subcellular components of spinal cord cells, mainly in mitochondria that showed swelling and membrane disruptions, beyond the appearance of unusual cup-like and donut-like shapes. These damage may be associated with increased cell death in the mantle layer, which appears to be the most affected layer after the MeHg exposure. The decreased cell proliferation associated to the increased cell death showed that a single dose of MeHg was able to disrupt essential cellular mechanisms, causing reduction in thickness of the spinal cord layers. From a toxicological point of view, these results are important because showed that in ovo MeHg exposure changes the developing spinal cord and can leads to potential neuromotor impairments in the postnatal life.

Orientador: Flavio Ailton Duque Zambrone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T12:16:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_MarciaMariaReisVieira_M.pdf: 2283119 bytes, checksum: b53803c737ba4b24f8ee8fab9274456a (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A ocorrência de neurotoxicidade crônica secundária à exposição em longo prazo a níveis baixos de agrotóxicos é ainda controversa. O presente estudo teve por objetivo analisar a relação da exposição ao longo prazo aos agrotóxicos e a ocorrência de efeitos neurotóxicos crônicos. Consiste em uma revisão crítica e sistemática da literatura, de estudos epidemiológicos publicados entre 1996 e 2006, que abordaram a ocorrência de neurotoxicidade crônica em humanos, secundária à exposição a baixas doses de agrotóxicos. A revisão da literatura identificou estudos descritivos de prevalência, estudos de coorte, estudos de caso-controle e ecológicos que investigaram a relação entre neuropatologias crônicas adquiridas e a exposição aos pesticidas. Foram incluídos sessenta e três estudos nesta revisão (quarenta e seis estudos caso-controle, sete estudos seccionais e nove estudos de coorte). Somente um estudo ecológico foi identificado. Vinte e dois dos estudos caso-controle se relacionaram à doença de Parkinson ou parkinsonismo e vinte e quatro abordaram outras alterações neurológicas. Uma grande parte dos estudos documentou exposição humana a uma mistura de agrotóxicos Os organofosforados formam os mais estudados, seguidos dos carbamatos. A grande maioria dos estudos utilizou métodos indiretos para a avaliação da exposição (85%). Poucos estudos levaram em consideração a história de intoxicação aguda prévia. A maioria dos estudos mostrou uma associação positiva entre a exposição aos agrotóxicos e a ocorrência de doenças neurológicas, no entanto muitas destas associações são limitadas, fracas ou não estatisticamente significantes. Diversos efeitos neurológicos eram de detecção subjetiva e de difícil confirmação diagnóstica. Esta revisão constatou que alguns efeitos neurotóxicos crônicos podem estar associados à exposição de longo prazo, aos agrotóxicos, embora nenhuma associação com substâncias específicas pode ser detectada. Muitos dos resultados dos estudos apresentaram uma relação fraca; inconsistente; ou estatisticamente insignificante. Os estudos epidemiológicos que estão por vir devem tentar sanar os vieses encontrados nos estudos desta revisão, em especial devem proceder a uma avaliação da exposição mais cuidadosa. Um programa de pesquisa é necessário para um maior esclarecimento do risco representado por exposição em longo prazo e às baixas doses destas substâncias / Abstract: The occurrence of secondary chronic neurotoxicity to the exposition in long stated period to low levels of pesticideds is still controversial. The present study it had for objective to analyze the relation of the exposition in long stated period to the pesticides and the occurrence of chronic neurotoxic effect. It consists of a critical and systematic review of literature, in epidemiologists studies published between 1996 and 2006, that they had approached the occurrence of chronic neurotoxicity in human beings, secondary to the exposition the low doses of pesticides. The review of literature identified descriptive studies of prevalence, ecological studies, coorte studies and case-control studies that had investigated the relation between acquired chronic neuropathologies and the exposition to pesticides. They had been enclosed sixty and three studies in this revision (forty and six case-control studies, seven sectional studies and nine coorte studies). Only one ecological study it was identified. Twenty and two of the case-control studies had related to the Parkinson illness or parkinsonism and twenty and four had approached other neurologic alterations. A great part of the studies registered exposition human being to a mixture of pesticides. The organophosphates ones forms the most studied, followed of the carbamates. The great majority of the studies used indirect methods for the evaluation of the exposition (85%). Few studies had taken in consideration the history of previous acute poisoning. The majority of the studies showed a positive association between the exposition to the pesticides and the occurrence of neurological illnesses, however many of these associations are limited, weak or not statistically significant. Diverse neurological effect were of subjective detection and with difficult diagnostic confirmation. This review evidenced that some chronic neurotoxic effects can be associate to the long stated period exposition to the pesticides, even so no association with specific substances can be detected. Many of the results of the studies had presented a weak relation, inconsistent, or statistically insignificant. The epidemiologists studies who are for coming must try to cure the bias found in the studies of this revision, in special must proceed to a most careful evaluation of the exposition. A research program is necessary for a bigger clarification of the risk represented for exposition in long stated period and to the low doses of these substances / Mestrado / Epidemiologia / Mestre em Saude Coletiva

Objetivo. Avaliar o campo visual em ex-trabalhadores de fábricas de lâmpadas fluorescentes com diagnóstico de mercurialismo metálico crônico ocupacional, através de testes psicofísicos de campimetria computadorizada e registros eletrofisiológicos da retina obtidos através do eletrorretinograma multifocal. Método. A avaliação psicofísica do campo visual foi realizada em 35 ex-trabalhadores (idade média = 44,2 ± 5,9 anos; 30 homens) no equipamento Humphrey Field Analyzer II (modelo 750i) em dois testes: acromático (standard automated perimetry) e azul-amarelo (short wavelength automated perimetry). O programa Visual Evoked Response Imaging System (VERISTM Science 5.0) permitiu o registro e análise dos sinais eletrofisiológicos da retina através do eletrorretinograma multifocal em 32 ex-trabalhadores (idade média = 44,6 ± 5,5 anos; 27 homens) dos 35 que realizaram os testes de campimetria computadorizada. Os resultados foram comparados com um grupo controle para o campo visual (n = 34; idade média = 43,3 ± 8,3 anos; 21 homens) e com outro grupo controle para o eletrorretinograma multifocal (n = 21; idade média = 43,5 ± 8,9 anos; 10 homens). Resultados. Os exames psicofísicos de campimetria computadorizada mostraram que há redução da sensibilidade visual em regiões centrais até 27? do campo visual. No exame acromático a diminuição da sensibilidade ocorreu, inclusive, na região foveal. O exame azul-amarelo confirmou a redução encontrada no exame acromático para regiões paracentrais até 27° de excentricidade. O eletrorretinograma multifocal apresentou redução nas amplitudes das respostas retinianas em regiões centrais até 25°, sem alteração no tempo implícito das respostas. As regiões paracentrais mostraram redução significativa para os valores de amplitude do primeiro componente negativo (N1) e do primeiro componente positivo (P1). Discussão. A redução na sensibilidade visual em diferentes regiões do campo visual, confirma que há prejuízos no sistema visual decorrentes da exposição crônica ao vapor de mercúrio. Nesse caso, não se pode especificar as regiões afetadas, porque a metodologia utilizada não permite isolar estruturas da via visual e, consequentemente, não permite localizar as regiões específicas que o mercúrio estaria prejudicando preferencialmente. Os prejuízos causados pela intoxicação ao vapor de mercúrio na retina parecem ser difusos, considerando que a redução de amplitude das respostas de N1 e P1 pode indicar prejuízos em diferentes grupos celulares da retina. Os resultados mostram que parte dos prejuízos de campo visual causados pelo vapor de mercúrio estão relacionados com alterações retinianas. Os resultados estão de acordo com trabalhos preliminares que monstraram alterações visuais que permanecem mesmo anos após o afastamento da fonte de exposição, sugerindo que a intoxicação por vapor de mercúrio pode não ser totalmente reversível. Conclusão. Os sujeitos expostos cronicamente ao vapor de mercúrio durante um período de 10 anos (em média) apresentam redução da sensibilidade visual em diferentes regiões do campo visual, mesmo após 7 anos (em média) de afastamento da fonte expositora. Pode haver prejuízos em diferentes regiões da via visual envolvidos nas alterações de campo visual, mas parte desses prejuízos causados pela exposição crônica ocupacional ao vapor de mercúrio possui origem retiniana. / Purpose. To analyse visual field sensitivity in a group of workers retired from thefluorescent lamp industry diagnosed with chronic occupational metallic mercurialism using psychophysical tests such as automated perimetry and measuring the retina cells\' electrical responses with the multifocal electroretinogram. Methods. The psychophysical evaluation of the visual field was performed in 35 retired workers (mean age = 44.2 ± 5.9 years; 30 males) using Humphrey Field Analyzer II (model 750i) device in two different tests: SAP (standard automated perimetry) and SWAP (short wavelength automated perimetry). The Visual Evoked Response Imaging System (VERISTM Science 5.0) provided us the electrophysiological recordings and analysis of the retina based on measurement data from the multifocal electroretinogram in 32 retired workers (mean age = 44.6 ± 5.5 years; 27 males) that were included in the 35 automated perimetry test subjects. The results were compared with an age-matched control group using the visual field tests (n = 34; mean age = 43.3 ± 8.3 years; 21 males) and to another age-matched control group at the multifocal electroretinogram (n = 21; mean age = 43.5 ± 8.9 years; 10 males). Results. The automated perimetry tests have shown visual sensitivity reductions in the central areas around 27° of eccentricity. In the SAP test sensitivity decrease was found even in the foveal region. The SWAP test results are in agreement with the reduction found around 27° in the SAP test at mid-peripheral areas. The multifocal electroretinogram has shown decreases in amplitude in the retina recordings in the central areas around 25° of eccentricity, but there were no implicit time reductions. The mid-peripheral areas have shown significant reductions in the amplitude values in the first negative component (N1) and in the first positive component (P1) as well. Discussion. The visual sensitivity reductions in the different visual field areas confirm the visual damages in patients with long-term mercury vapor exposure. In this case the affected visual pathway sections could not be determined since the applied psychophysical method does not allow us to indicate the specific visual structure principally damaged by the mercury vapor. The damages found in the retina due to mercury vapor intoxication can be considered broadly dispersed, since the reductions in N1 and P1 amplitudes might be the indications of damages in multiple retina cell groups. Our results show that some visual field losses are related to various retinal alterations caused by the mercury vapor. The results are in agreement with preliminary works that showed visual dysfunctions after several years away from the mercury vapor source suggesting that mercury vapor intoxication may not be completely reversible. Conclusion. The long-term (10 years in average) mercury vapor exposed workers have shown visual sensitivity reductions in different visual field areas after 7 years (in average) away from the mercury vapor source. In our present study we would like to indicate that visual field reductions cannot only be related to damages in the various sections of the visual pathway, but some of these visual field losses can occur due to retinal alterations caused by cronic mercury vapor exposure.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heleno_MauricioAurelioGomes_D.pdf: 8695465 bytes, checksum: 8ac64464abefb901cab1d4e5b6b96336 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma grande variedade de toxinas provenientes de venenos animais tem sido largamente utilizada no estudo de mecanismos de ação e processos fisiológicos, sendo consideradas valiosas ferramentas moleculares. As serpentes peçonhentas expressam no veneno diversas proteínas muito estudadas e utilizadas clinicamente, apresentando diferentes graus de variabilidade inter e intraespecífica em suas composições e nos seus efeitos biológicos. O conhecimento obtido com os estudos destas moléculas tem grande importância clínica na compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos nos envenenamentos ofidicos e também acadêmico-tecnológica, devido à possibilidade do desenvolvimento de novos instrumentos moleculares utilizados na pesquisa e também de novos modelos moleculares para princípios ativos de drogas. Neste trabalho pesquisamos as atividades neurotóxica, miotóxica e inflamatória de uma PLA2 básica, D49, purificada do veneno da serpente Bothrops roedingeri após duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em Sephadex G-75 e hidrofobicidade em HPLC de fase reversa em coluna 'mi'-Bondapak C-18. A BrTX-I apresentou massa molecular relativa em tomo de ~14 kDa (SDS-PAGE) e confirmada por espectrometria de massas (ESI-MS), em 14.358,69 Da. A análise da composição de aminoácidos da BrTX-I, revelou que esta é constituída aproximadamente por 120 resíduos aminoacídicos, com alto conteúdo de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, resultando em um valor calculado de pI de 8,63. A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de sete pontes dissulfeto. A análise estrutural da BrTX-I foi realizada por ESI-MS e as regiões analisadas mostraram semelhança com outras PLA2 miotóxicas isoladas de venenos botrópicos. A BrTX-I apresentou alta atividade PLA2 e um comportamento tipo sigmoidal em baixas concentrações do substrato. Atividade PLA2 ótima da BrTX-I foi em pH 8,0 e temperatura de 37°C. A BrTX-I mostrou-se dependente de Ca2+ (mM) e na sua substituição por zn+2, Mn+2, Mg+2 e Cd+2 a atividade foi reduzida. O estudo da homologia sequencial da BrTX-I mostrou posições extremamente conservadas na molécula. Nas posições 1 e 2 há predominância da sequência de aminoácidos (DL), na posição 4 (Q). Uma das regiões altamente conservadas na sequência de aminoácidos das PLA2 é a alça de ligação ao cálcio, segmento ...YGCYCGXGG. Resíduos formando a alça de ligação ao cálcio e a rede catalítica da BrTX-I mostraram um alto grau de conservação, refletindo na manutenção da atividade. A região relacionada à atividade neurotóxica pré-sináptica (80-11 O) apresentou principalmente resíduos hidrofóbicos. Em preparações ex vivo, o veneno e a BrTX-I causaram rápido bloqueio da neurotransmissão na preparação biventer cervicis de pintainho de modo similar a outras Bothrops, sem alterar significativamente as respostas contraturantes à adição de AChe de KCl (5 e 20 'mi'g/mL), indicando atividade neurotóxica pré-sináptica. Em camundongos, a BrTX-I induziu miotoxicidade local, determinada pelo aumento nos níveis plasmáticos de CK e mostrou efeito pró-inflamatório analisado através da formação do edema de pata e liberação das citocinas IL-1 , IL-6 e TNF-'alfa'. Como BrTX-I produz um efeito inflamatório, a hidrólise de fosfolipídios pode ser relevante na fisiopatología do envenenamento / Abstract: A great variety of animal venom toxins has been widely used in the study of action mechanisms and metabolic processes, thus considered valuable molecular tools. Poisonous snakes contains in their venom several well studied and clinically used proteins, showing these venoms different intra or interspecific variability degrees in their composition and biological effects. The knowledge obtained with these molecules study, has a great clinical relevancy understanding pathophysiological process regarding snake envenomations, and also academic technological, due to the possibility to develop new molecular tools and new molecular models to study active principies of some drugs. ln this work, we study neurotoxic, myotoxic and inflammatory activities of BrTX-I, a basic PLA2, purified from Bothrops roendigeri snake venom after two chromatographic steps, using molecular exclusion chromatography (Sephadex G-75) and reverse phase HPLC on 'mi'-Bondapak C-18 column. BrTX-I showed relative molecular mass around 14 kDa (PAGE) and specific molecular mass of 14,358.69 Da was determined by ESl-MS mass spectrometry. The amino acid composition analysis showed that BrTX-I contains 120 aminoacidic residues with high content of basic and hydrophobic amino acids, resulting in a calculated pi value of 8. 63. The presence of 14 Cysteine residues, suggests the formation of seven dissulfide bonds. Structural analysis of BrTX-I PLA2, performed by ESI-MS showed high identity values when compared to other myotoxic PLA2, isolated from Bothrops snakes venoms. BrTX-I presented high PLA2 activity and showed a sigmoidal behavior at low substrate concentrations. The BrTX-I reached its maximal PLA2 activity at pH 8.0 and 37 °C. Maximum PLA2 activity required Ca2+ (mM) and substitution of Ca2+ by zn+2, Mn+2, Mg+2 or Cd+2 showed reduced enzymatic activity. Sequence homology studies of BrTX-I showed extremely conserved positions in the molecule. ln positions 1 and 2, there is a predominance of the amino acids sequence (DL), and in position 4 (Q). One of the highly conserved regions in the amino acid sequences of PLA2 is the Ca2+ -binding loop, segment ... YGCYCGXGG. Residues forming the Ca2+-binding loop and the catalytic network of BrTX-I PLA2 showed a high conservation grade, reflecting the non-decreased catalytic activity. The region related to the presynaptic neurotoxic activity (80-110), showed mainly the presence of hydrophobic residues. ln ex vivo studies, the whole venom and BrTX-I caused a fast blockade of the neuromuscular transmission in young chick biventer cervicis preparations m a similar way to other Bothrops species, without alters significantly the contractures induced by ACh and KCL at doses of 5 and 20 'mi'g/mL, respectively, indicating presynaptic neurotoxic activity. ln mice, BrTX-I induced local myotoxicity, determined by increase in CK serum leveis, and showed proinflammatory effects analyzed through edema-forming activity and citokines IL-1 , IL-6, and TNF'alpha' release. Once BrTX-I induces a strong pro-inflammatory effect, the enzymatic phospholipid hydrolysis may be relevant for envenomation pathophysiology / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sérgio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_M.pdf: 2297387 bytes, checksum: fc95267d0ed3c753978294fe999d0cf7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho apresenta a purificação e caracterização bioquímica de uma nova PLA2 neurotóxica nomeada BbilTX-I isolada do veneno da serpente Bothriopsis bilineta. Esta proteína foi purificada através de dois passos cromatográficos, em Sephadex G75 e HPLC de fase reversa C18 (?Bondapak Watters). A BbilTX-I é uma PLA2D49, com elevada atividade catalítica, massa molecular de 14185,48 Da, e alta similaridade na sua sequência N-terminal com outras PAL2 de veneno de serpentes. A temperatura ótima para a atividade enzimática da BbilTX-I está entre 25Cº e 37 ºC. A fração BbilTX-I é cálcio dependente e tem a atividade enzimática bastante diminuída quando testadas com os íons divalentes. Da mesma forma como outras PLA2 descritas na literatura, a BbilTX-I mostra o pH ótimo em torno de 8. A fração F3 isoladas de crotapotinas crotálicas e a DA2-II extraída do soro de Didelphis albiventris apresentaram um efeito inibitório de mais de 50% sobre a atividade enzimática da toxina BbilTX-I. O efeito da concentração do substrato 4-nitro-3-(octanoiloxi) ácido benzóico sobre a atividade enzimática da BbilTX-I demonstrou que a toxina é uma enzima monomérica com tendência alostérica sugerindo provavelmente um mecanismo de cooperatividade positiva mnemônical. A PLA2 BbilTX-I inserida em preparação isolada de biventer cervicis de pintainho apresentou um efeito bloqueador da transmissão nervosa na junção neuromuscular, em doses de 10, 20, 30 e 50?g/ml e causou 50% de bloqueio em 20 minutos com 10 ?g/ml, 30 minutos com 20 ?g/ml, 22 minutos com 30 ?g/ml e 20 minutos com 50 ?g/ml. Como não houve alteração significativa na resposta ao KCl (usado para detectar danos na membrana celular) e à Acetilcolina (usada para identificar atividade sobre os receptores colinérgicos nicotinicos) podemos dizer que a PAL2 BbilTX-I é uma neurotoxina pré-sináptica não miotoxica, que atua no terminal nervoso da sinapse neuromuscular interferindo sabre a liberação da ACh. A crotapotina F3 isolada do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella e o fator anti-homorrágico DA2-II isolado do soro de Dildelphis albiventris inibiram em 64% e 57% respectivamente a atividade edematizante da fração BbilTX-I demonstrando que a ação inflamatória desta proteína é dependente de sua ação catalítica / Abstract: In this present work we described the purification and functional characterization of a new neurotoxic PLA2, named BbilTX-I from Bothriopsis bilineata snake venom. This protein was by the combination of two chromatographic steps, Molecular Exclusion on a Sephadex lunm and Reverse Phase HPLC (RP-HPLC) on a C18 ?-Bondapack (Waters) column. BbilTX-I is a monomeric PLA2-D49 showing high purity degree in SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions. The purity of the toxin was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry and shows a molecular mass of 14185.48 Da. BbilTX-I posses a high catalytic activity upon 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzóic acid as a substrate compare with other bothropic PLA2. The optimal temperature and pH for BbilTX-I activity was determinate between 25-37 °C and around 8, respectively. This PLA2 is Ca+2 dependent but others divalent ions significatively reduce its catalytic activity, when pre­incubated with the protein. Also were tested the effects of fraction F3, crotapotin from Crotalus durrisous cascavela, and anti-hemorrhagic factor DA2-Il from Didelphis albiventris opossum sera under optimal conditions; both fraction showed an inhibitory effect over the BbilTX-I catalytic activity. At different concentrations of the substrate this monomeric PLA2 show an allosteric behavior suggesting a positive cooperative mnemonical enzyme mechanism in the catalysis. BbilTX-I showed an inhibitor effect on neuromuscular nerve transmissions on the isolated muscle biventer cervicis. At doses at 10, 20, 30 and 50 g/ml it elicited a blockade of 50% of 20, 30, 22 and 20 minutes, respectively. The effect displayed by BbilTX-I did not with the responses evoked by the addition of KCl (cell membrane damage) and (Ach functionality of cholinergic receptors), thus, we can argue that BbliTX-I is a pre-synaptic neurotoxin impairing the Ach liberation. BbilTX-I shows itself as an edematogenic PLA2 when injected in the mouse right footpad, it elicited a 70% higher than of edema when compare with the control. The edemetogenic activity of this PAL2 is related to its catalytic activity since both are inhibited by F3 crotapotin and DA2-II, 64 and 57% respectively. The reproducibility of biological activity, through the pharmacologic effects, only is possible by the use of chemically homogeneous fractions that hold biological function integrity. This fraction was obtain with high efficiency methodologies like HPLC, mass spectrometry, this result can be associated with the biological activity, disregarding the subjectivity caused by the venom or by impure fractions. This kind of methodologies can be applied to biochemical, structure and function, logical and pharmacological studies, which can reveal unknown mechanism in the function-structure relationship of snake venom PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular