Cultivars of Agrostis stolonifera showed weak and strong responsiveness to the systemic acquired resistance (SAR) activator, benzothiadiazole (BTH), or the induced systemic resistance (ISR) activator, 2R, 3R-butanediol (BD). Next Generation RNA sequencing was used to identify 2163 putative transcripts with increased expression in BTH versus water-treated A. stolonifera. Among three BTH-induced genes, AsASP-2 and AsHIR-1 were induced faster, while AsLOX-1 had stronger transient induction, in one out of two strongly BTH-responsive cultivars. Three ISR-responsive genes, AsGNS-5, AsOPR-4 and AsAOS-1, showed no greater induction or priming in the strongly versus weakly BD-responsive cultivars. Cultivars of A. stolonifera vary significantly in their response to defense activators, however this is not consistently related to defense gene expression. To quantify disease severity, chlorophyll fluorescence imaging of the maximum quantum efficiency of photosystem II (Fv/Fm) was tested on Nicotiana benthamiana infected with Colletotrichum orbiculare. Leaf areas of healthy, non-necrotic affected and necrotic tissue could be individually quantified, which demonstrated that BD delayed symptom development by approx. 24-hour and reduced non-necrotic affected tissue compared to controls. Chlorophyll fluorescence imaging can quantify and reveal novel features about induced disease resistance.

Exocyst is a protein complex composed of eight subunits, evolutionarily conserved in yeasts, animals, and plants. The main function of exocyst is to mediate the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. However, the involvement of exocyst in some other processes, especially in autophagy, has been recently discovered. Plant exocyst is specific because most of its subunits have multiple paralogs. The most diversified subunit is EXO70, which is encoded by 23 paralogous genes in Arabidopsis thaliana. In this thesis, I dealt with subunit AtEXO70E2 (AT5G61010), which has been localized to double-membrane compartments considerably reminiscent of autophagosomes. These compartments were named EXPOs (for exocyst-positive organelles) and described as a component of unconventional protein secretion pathways. There are also hints that EXO70E2 could play a role in autophagic processes. However, details of this relationship remained unexplored. For my experiments, I used stably transformed lines of A. thaliana and transiently transformed leaves of Nicotiana benthamiana. I performed numerous colocalization experiments, applied various pharmacological treatments to the studied lines, and analyzed a mutant line in the EXO70E2 gene. According to my observations, protein EXO70E2 is expressed especially...

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Wheat is one of the most essential food sources in the world. However, there has been serious yield loss of wheat production due to stripe rust disease caused by the fungal pathogen Puccinia striiformis f. sp. tritici. The cost-effective and long-lasting defense to the disease can be achieved by generating genetically resistant crops against the disease forming pathogens. To accomplish this, first step is to acquire knowledge in the plant pathogen interactions of the crop and the pathogen of interests at the cellular and the molecular level. In this thesis research, PstHa2a5 candidate effector gene from Puccinia striiformis f. sp. tritici is investigated to identify its role and interaction between host factors in yellow rust infected Triticum aestivum L. The gene construct was engineered with FLAG-tag fusion at its N-terminus, and synthesized. This construct was cloned into pJL48-TRBO vector for an expression in Nicotiana benthamiana via agrobacterium-mediated gene transformation. The expressed protein structure with FLAG-tag was purified, and immunoprecipitated with one putative N. benthamiana interactor by immunoprecipitation experiments. This candidate interactor protein will be identified with Mass Spectroscopy. In addition to this, subcellular localization of the effector candidate was examined in N. benthamiana plant. This was achieved by cloning PstHa2a5 gene construct in pK7WGF2 gateway destination vector and localization is determined by GFP expression in N. benthamiana after agrobacterium-mediated gene transformation.

Tesis por compendio / [ES] En el contexto actual de cambio climático, resulta urgente desarrollar nuevas tecnologías de fitomejoramiento que garanticen el suministro de alimentos a una población en rápido crecimiento. La reciente aparición de herramientas basadas en las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (del acrónimo CRISPR en inglés) y sus proteínas asociadas (Cas) ha revolucionado la edición genómica dirigida, resultando muy prometedora tanto para la biología vegetal básica como para la mejora de cultivos. Los sistemas CRISPR-Cas más comunes incluyen una endonucleasa Cas y un ARN guía que determina específicamente la secuencia diana a editar en el genoma. El suministro de los componentes de reacción CRISPR-Cas a una célula vegetal es un paso crucial que influye notablemente en la velocidad y la eficiencia de edición. Los enfoques convencionales se basan en el suministro de dichos componentes mediante tecnologías de transformación o la expresión transitoria en protoplastos, siendo ambos procesos laboriosos que pueden acarrear problemas legales. Alternativamente, estudios recientes han destacado el potencial de virus de ARN para ser utilizados como vectores de expresión transitoria de los componentes de reacción CRISPR-Cas en plantas, también conocido como edición genómica inducida por virus (VIGE en inglés). Puesto que la aplicabilidad de cada vector viral se encuentra limitada por sus propiedades moleculares y un rango específico de plantas huésped, esta Tesis ha tenido como objetivo principal expandir y mejorar las herramientas disponibles para el VIGE. En primer lugar, diseñamos un vector derivado del Virus X de la patata (PVX; género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) para suministrar múltiples ARNs guía a una línea transformada de Nicotiana benthamiana que expresaba constitutivamente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mediante el vector derivado de PVX, conseguimos editar genes endógenos de la planta huésped de manera eficiente, IV produciendo casi un 80% de modificaciones en tejidos de plantas adultas. Curiosamente, PVX permitió la expresión simultánea de matrices de ARNs guía no espaciados, lo cual resultó en la edición de múltiples genes en pocos días. Obtuvimos progenies editadas con una alta tasa de mutaciones bialélicas hereditarias tanto de plantas regeneradas a partir de tejido infectado como de semillas de plantas infectadas; en este último caso, el ARN guía fue previamente fusionado a un módulo de ARN móvil. Dado que PVX no se transmite por semillas, todas las plántulas editadas estaban libres de virus. A fin de expandir las estrategias basadas en virus de plantas para una edición genómica sin transformación, seguidamente desarrollamos un sistema de dos vectores virales compatibles para el suministro simultáneo de todos los componentes de reacción CRISPR-Cas en la planta. Modificamos el Virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus; familia Potyviridae) para que expresase una nucleasa Cas12a y, en combinación con el envío de ARN guía mediante PVX, logramos la edición sin transformación de una línea de N. benthamiana que expresaba constitutivamente la NIb del potyvirus. Además, demostramos que un único vector PVX era capaz de proporcionar la actividad de NIb, así como de suministrar el ARN guía para la edición genómica en plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis contribuye a la expansión de las herramientas actuales para VIGE. La amplia gama de huéspedes que poseen tanto PVX como TEV, particularmente entre solanáceas, postula a ambos virus como candidatos muy prometedores para futuras aplicaciones en genómica funcional y mejora de cultivos. / [CA] En el context actual de canvi climàtic, resulta urgent desenvolupar noves tecnologies de fitomillorament que garantisquen el subministrament d'aliments a una població en ràpid creixement. La recent aparició d'eines basades en les repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment interespaiades (de l'acrònim CRISPR en anglés) i les seues proteïnes associades (Cas) ha revolucionat l'edició genòmica dirigida, resultant molt prometedora tant per a la biologia vegetal bàsica com per a la millora de cultius. Els sistemes CRISPR-Cas més comuns inclouen una endonucleasa Cas i un ARN guia que determina específicament la seqüència diana a editar en el genoma. El subministrament dels components de reacció CRISPR-Cas a una cèl·lula vegetal és un pas crucial que influeix notablement en la velocitat i l'eficiència d'edició. Els enfocaments convencionals es basen en el subministrament d'aquests components mitjançant tecnologies de transformació o l'expressió transitòria en protoplasts, sent tots dos processos laboriosos que poden implicar problemes legals. Alternativament, estudis recents han destacat el potencial de virus d'ARN per a ser utilitzats com a vectors d'expressió transitòria dels components de reacció CRISPR-Cas en plantes, també conegut com a edició genòmica induïda per virus (VIGE en anglés). Com que l'aplicabilitat de cada vector viral es troba limitada per les seues propietats mol·leculars i un rang específic de plantes hoste, aquesta Tesi ha tingut com a objectiu principal expandir i millorar les eines disponibles per al VIGE. En primer lloc, dissenyem un vector derivat del Virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus; família Alphaflexiviridae) per a subministrar múltiples ARNs guia a una línia transformada de Nicotiana benthamiana que expressava constitutivament la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mitjançant el vector derivat de PVX, aconseguim editar gens endògens de la planta hoste de manera eficient, produint quasi un 80% de modificacions en teixits de plantes adultes. Curiosament, PVX va permetre l'expressió VI simultània de matrius d'ARNs guia no espaiats, la qual cosa va resultar en l'edició de múltiples gens en pocs dies. Vam obtindre progènies editades amb una alta taxa de mutacions bial·lèliques hereditàries tant de plantes regenerades a partir de teixit infectat com de llavors de plantes infectades; en aquest últim cas, l'ARN guia va ser prèviament fusionat a un mòdul d'ARN mòbil. Atés que PVX no es transmet per llavors, totes les plàntules editades estaven lliures de virus. A fi d'expandir les estratègies basades en virus de plantes per a una edició genòmica sense transformació, seguidament desenvolupem un sistema de dos vectors virals compatibles per al subministrament simultani de tots els components de reacció CRISPR-Cas en la planta. Modifiquem el Virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus; família Potyviridae) perquè expressara una nucleasa Cas12a i, en combinació amb l'enviament d'ARN guia mitjançant PVX, aconseguim l'edició sense transformació d'una línia de N. benthamiana que expressava constitutivament la NIb del potyvirus. A més, vam demostrar que un únic vector PVX era capaç de proporcionar l'activitat de NIb, així com de subministrar l'ARN guia per a l'edició genòmica en plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi contribueix a l'expansió de les eines actuals per a VIGE. L'àmplia gamma d'hostes que posseeixen tant PVX com TEV, particularment entre solanàcies, postula a tots dos virus com a candidats molt prometedors per a futures aplicacions en genòmica funcional i millora de cultius. / [EN] Innovative breeding technologies are urgently needed to ensure food supply to a rapidly growing population in the face of climate change. The recent emergence of tools based on the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins has revolutionized targeted genome editing, thus holding great promise to both basic plant science and precision crop breeding. Most common CRISPR-Cas arrangements include a Cas endonuclease and a single guide RNA (sgRNA) that determines the specific target sequence to edit in the genome. The delivery of CRISPR-Cas reaction components within a plant cell is a crucial step that greatly influences editing speed and efficiency. Conventional approaches rely on supplying editing reaction components by transformation technologies or transient delivery to protoplasts, both of which are laborious processes that can raise legal concerns. Alternatively, recent studies have highlighted the potential of plant RNA viruses as transient delivery vectors of CRISPR-Cas reaction components, following the so-called virus-induced genome editing (VIGE). Since the applicability of each viral vector is limited to its molecular biology properties and a specific host range, the main objective of this Thesis has been to expand and improve the available toolbox for VIGE. First, we engineered a vector derived from Potato virus X (PVX; genus Potexvirus; family Alphaflexiviridae) to deliver multiple sgRNAs in a Nicotiana benthamiana transformed line constitutively expressing Streptococcus pyogenes Cas9. Using the PVX derived vector, host endogenous genes were efficiently targeted, producing nearly 80% indels in the tissues of adult plants. Interestingly, PVX allowed the simultaneous expression of unspaced sgRNA arrays, achieving highly efficient multiplex editing in a few days. We obtained edited progeny with a high rate of heritable bi-allelic mutations either from plants regenerated from infected tissue or infected plant seeds; in the latter II case, the sgRNA was previously fused to a mobile RNA module. Hence, since PVX is not seed-transmitted, all edited seedlings were virus-free. Aiming to expand the virus-based toolbox for transformation-free editing, we next developed a two-compatible virus vector system for the simultaneous delivery of all CRISPR-Cas reaction components in the plant. Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus; family Potyviridae) was engineered to express a Cas12a nuclease, and in combination with PVX-assisted sgRNA delivery, we achieved successful transformation-free genome editing in a N. benthamiana line constitutively expressing potyviral NIb. Moreover, we demonstrated that a single PVX vector can supply the potyviral NIb activity as well as perform sgRNA delivery for genome editing in wild-type plants. Altogether, the work performed in this Thesis contributes to the enrichment of the current VIGE toolbox. The wide host range that both PVX and TEV possess, particularly among solanaceous species, postulates them as promising candidates for future applications in VIGE-mediated functional genomics and precision breeding. / Uranga Ruiz De Eguino, M. (2022). Engineering Viral Vectors for CRISPR-Cas Mediated Genome Editing in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183374 / TESIS / Compendio

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180

[ES] Plant Molecular Farming (PMF) es la producción de proteínas de interés industrial y valor comercial en plantas. Su objetivo es proporcionar un enfoque seguro y rentable para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Las plantas del género Nicotiana, especialmente Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana, han adquirido una importancia creciente como plataformas de producción de PMF debido a sus ventajas, como el alto rendimiento de biomasa, la facilidad de transformación y la expresión robusta de proteínas. Sin embargo, en la actualidad N. tabacum y N. benthamiana no son hospedadores ideales para el cultivo molecular. Los objetivos de mejora genética, como retrasar o suprimir la floración para aumentar la biomasa de la planta, podrían convertir a N. benthamiana en un chasis de primera para fines de cultivo molecular. En este trabajo de investigación nos centramos en este objetivo. En el primer capítulo, realizamos un análisis de todo el genoma de los genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicados en la transición de fase vegetativa y el tiempo de floración, en esta especie y en su pariente cercana N. tabacum, identificando 49 genes SPL en N. tabacum y 43 genes SPL en N. benthamiana. Los genes SPL de las dos especies se clasificaron en ocho grupos filogenéticos de acuerdo con la clasificación de SPL en Arabidopsis thaliana. La estructura génica exón-intrón y los dominios de unión al ADN se conservaron en gran medida entre homeólogos y ortólogos, y también se identificaron las dianas potenciales del microARN156, implicado en la transición de fase vegetativa. La expresión de genes SPL en hojas se analizó mediante RNA-seq en tres fases de crecimiento diferentes, revelando que los genes que no estaban bajo el control de miR156 se expresaban en general de forma constitutiva a niveles altos, mientras que los genes regulados por miR156 mostraban niveles de expresión más bajos, a menudo regulados por el desarrollo. Seleccionamos el gen SPL13_1a de N. benthamiana como diana para un experimento de knockout CRISPR/Cas9. El knock out completo de este único gen condujo a un retraso significativo en el tiempo de floración de 2-5 días y a un aumento de la ramificación. En el segundo capítulo, mostramos más ediciones de genes CRISPR/Cas9 realizadas en N. benthamiana con el objetivo de la abolición de la floración. Se eliminaron los inductores florales FLOWERING LOCUS T 4 y 5 (NbFT4 y NbFT5_1a/1b) solos y en combinación con NbSPL13_1a. En la línea más editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el tiempo de floración se duplicó en comparación con las plantas de tipo silvestre. Sin embargo, no se logró la abolición total de la floración. El retraso de la floración tuvo consecuencias en varios aspectos del crecimiento de la planta, que cuantificamos a través de diversos parámetros: las líneas altamente editadas presentaron un aumento de la biomasa, la altura, el número de hojas y el área foliar total en comparación con las menos editadas y el tipo silvestre. Además, se evaluó el potencial de las líneas generadas para expresar proteínas heterólogas. Inesperadamente, no fueron capaces de mantener altos niveles de expresión después de la quinta semana. En el futuro, se apilarán en nuestras líneas knockouts en otros actores importantes en el inicio de la floración, como NbSPL9/15 y NbSPL3/4/5. / [CA] Plant Molecular Farming (PMF) és la producció de proteïnes d'interès industrial i valor comercial a plantes. El seu objectiu és proporcionar un enfocament segur i rendible per a la producció de proteïnes recombinants a gran escala. Les plantes del gènere Nicotiana, especialment Nicotiana tabacum i Nicotiana benthamiana, han adquirit una importància creixent com a plataformes de producció de PMF a causa dels seus avantatges, com ara l'alt rendiment de biomassa, la facilitat de transformació i l'expressió robusta de proteïnes. No obstant això, actualment la N. tabacum i la N. benthamiana no són hostes ideals per al cultiu molecular. Els objectius de millora genètica, com ara endarrerir o suprimir la floració per augmentar la biomassa de la planta, podrien convertir N. benthamiana en un xassís de primera per a fins de cultiu molecular. En aquest treball de recerca ens centrem en aquest objectiu. Al primer capítol, realitzem una anàlisi de tot el genoma dels gens SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicats en la transició de fase vegetativa i el temps de floració, en aquesta espècie i en el seu parent proper N. tabacum, identificant 49 gens SPL a N. tabacum i 43 gens SPL a N. benthamiana. Els gens SPL de les dues espècies es van classificar en vuit grups filogenètics d'acord amb la classificació de SPL a Arabidopsis thaliana. L'estructura gènica exón-intron i els dominis d'unió a l'ADN es van conservar en gran mesura entre homeòlegs i ortòlegs, i també es van identificar les potencials dianes del microARN156, implicat en la transició de fase vegetativa. L'expressió de gens SPL en fulles es va analitzar mitjançant RNA-seq en tres fases de creixement diferents, revelant que els gens que no estaven sota el control de miR156 s'expressaven en general de forma constitutiva a nivells alts, mentre que els gens regulats per miR156 mostraven nivells més baixos d'expressió, sovint regulats pel desenvolupament. Seleccionem el gen SPL13_1a de N. benthamiana com a diana per a un experiment de knockout CRISPR/Cas9. El knock out complet d'aquest gen va conduir a un retard significatiu en el temps de floració de 2-5 dies ia un augment de la ramificació. Al segon capítol, mostrem més edicions de gens CRISPR/Cas9 realitzades a N. benthamiana amb l'objectiu de l'abolició de la floració. Es van eliminar els inductors florals FLOWERING LOCUS T 4 i 5 (NbFT4 i NbFT5_1a/1b) sols i en combinació amb NbSPL13_1a. A la línia més editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el temps de floració es va duplicar en comparació amb les plantes de tipus silvestre. Tot i això, no es va aconseguir l'abolició total de la floració. El retard de la floració va tenir conseqüències en diversos aspectes del creixement de la planta, que vam quantificar a través de diversos paràmetres: les línies altament editades van presentar un augment de la biomassa, l'alçada, el nombre de fulles i l'àrea foliar total en comparació amb les menys editades i el tipus silvestre. A més, es va avaluar el potencial de les línies generades per expressar proteïnes heteròlogues. Inesperadament, no van ser capaços de mantenir alts nivells dexpressió després de la cinquena setmana. En el futur, s'apilaran a les nostres línies knockouts en altres actors importants a l'inici de la floració, com NbSPL9/15 i NbSPL3/4/5. / [EN] The term Plant Molecular farming (PMF) refers to the production of industrially relevant and commercially valuable recombinant products in plants. Its purpose is to provide a safe and cost-effective approach for the manufacturing of recombinant bioproducts at a large scale. Plants of the Nicotiana genus, especially Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, have become increasingly important as production platforms for PMF due to their advantages such as high biomass yield, ease of transformation, and robust protein expression. However, at present, there is room for improvement for N. tabacum and N. benthamiana as ideal hosts for molecular farming. Breeding goals such as delaying or abolishing flowering to enhance plant biomass could convert N. benthamiana into a prime chassis for molecular farming purposes. This objective was the focus of this research. In the first chapter, a genome-wide analysis of SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL) genes was performed. These genes are involved in vegetative phase transition and flowering time, on this species and its close relative N. tabacum, identifying 49 SPL genes in N. tabacum and 43 SPL genes in N. benthamiana. The SPL genes of the two species were classified into eight phylogenetic groups according to the SPL classification in Arabidopsis thaliana. The exon-intron gene structure and the DNA-binding domains were highly conserved between homeologues and orthologues, and the potential targets of microRNA156, involved in vegetative phase transition, were also identified. The expression of SPL genes in leaves was analysed by RNA-seq at three different growth stages, revealing that genes not under miR156 control were in general constitutively expressed at high levels, whereas miR156-regulated genes showed lower expression levels, often developmentally regulated. The N. benthamiana SPL13_1a gene was selected as target for a CRISPR/Cas9 knockout experiment. The full knock out of this single gene lead to a significant delay in flowering time of 2-5 days and increased branching. In the second chapter, more CRISPR/Cas9 gene editions are performed in N. benthamiana with the objective of flowering abolition. Floral inducers FLOWERING LOCUS T 4 and 5 (NbFT4 and NbFT5_1a/1b) were knocked out alone and in combination with NbSPL13_1a. In the most edited line FT4-FT5-SPL13 40-1 flowering time was doubled compared to wild type plants. However, total abolition of flowering was not achieved. The delayed flowering had consequences on various aspects of plant growth, that were quantified through various parameters: highly edited lines had increased biomass, height, number of leaves and total leaves area compared to the less edited ones and wild type. Moreover, the generated lines were evaluated for their potential to express heterologous proteins. Unexpectedly, they were not able to maintain high expression levels after week five. In the future, knockouts in other important players in flowering initiation, such as NbSPL9/15 and NbSPL3/4/5, will be stacked in our lines. / Paola, CD. (2024). Enhancing Nicotiana benthamiana as chassis for Molecular Farming: targeting flowering time for increased biomass and recombinant protein production [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204803

Le métabolisme des phénylpropanoïdes est un métabolisme secondaire spécifique au règne végétal. Il conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des esters d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. Ces métabolites secondaires interviennent dans la pigmentation florale ou encore la protection des tissus végétaux contre divers stress biotiques et abiotiques. Quant à la lignine, elle assure rigidité aux parois cellulaires végétales et imperméabilité aux tissus conducteurs. La lignine est un polymère tridimensionnel constitué de trois unités monomériques qui possèdent le même squelette carboné phénylpropane mais diffèrent par leur degré de méthoxylation et d'hydroxylation. Une partie de mon travail de thèse a consisté à étudier la relation structure/fonction de la caféoyl-coenzyme A O-méthyltransférase (CCoAOMT) de N. tabacum, responsable de l'introduction de la première des deux fonctions méthyles. Des études bioinformatiques couplées à des approches de biochimie et de mutagenèse dirigée, nous ont permis de modéliser l'interaction de la CCoAOMT avec son substrat, le caféoyl-CoA. Trois acides aminés du site actif ont notamment été identifiés comme intervenant dans la reconnaissance spécifique de la chaîne latérale de CoA. J'ai également caractérisé, chez N. tabacum, une nouvelle acyltransférase à activité HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT) impliquée dans le métabolisme des phénylpropanoïdes. Nous avons montré que l'enzyme HCT recombinante synthétisait, in vitro, les substrats de l'hydroxylation en position 3 du noyau aromatique. De plus, la répression de l'expression du gène HCT par le «VIGS» conduit à un ralentissement de la croissance des plantes, à une perturbation importante du pool d'acide chlorogénique, ainsi qu'à une diminution de la quantité et à une modification de la composition de la lignine synthétisée.

[ES] Los virus de plantas son los agentes causales de un gran número de enfermedades en plantas que ocasionan grandes pérdidas económicas. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV), es un pequeño virus de RNA monocatenario de polaridad positiva, perteneciente al género Gammacarmovirus, cuyo genoma codifica cinco proteínas. La proteína de cubierta (CP), está formada por tres dominios distintos. El descubrimiento de un péptido de transito dual en la región amino-terminal de la CP fue el punto de partida de esta tesis. Al inicio de una infección por MNSV, la CP nuevamente sintetizada es transportada al interior de cloroplastos y mitocondrias mientras que, una parte mucho menor se mantiene en el citoplasma aumentando a medida que avanza la infección. La inhibición de este transporte dual conlleva un aumento de la actividad supresora del silenciamiento del RNA de la CP. Sin embargo, la infección sistémica se ve particularmente afectada. Por tanto, la acumulación de la CP en el citoplasma puede provocar un aumento de la replicación viral pero a su vez una sobreexpresión de la p29, puede provocar una explosión oxidativa y una necrosis que restringe el movimiento viral. De este modo, el transporte de la CP a los orgánulos podría evitar una replicación viral excesiva mediante la modulación de la actividad supresora para gestionar el equilibrio entre la defensa de la planta y la contradefensa viral favoreciendo una interacción compatible entre ambos. Desafortunadamente, Arabidopsis thaliana no es huésped para el MNSV. Por tanto, para entender mejor el transporte de la CP a estos orgánulos, se identificaron los receptores y los poros de los translocones de las membranas externas de las mitocondrias y los cloroplastos en Nicotiana benthamiana. Esta caracterización funcional se realizó principalmente mediante VIGS y RT-qPCR, que mostró una redundancia funcional mayor que la observada entre los homólogos de Arabidopsis. Además, esta herramienta también se utilizó para evaluar la relevancia de cada componente bajo la infección por MNSV, y junto con los estudios de interacción CP-receptor realizados mediante BiFC y Y2H, nos permitió identificar NbToc159A para cloroplastos y NbOm64 para mitocondrias, como principales receptores. A su vez, el silenciamiento de NbToc34, NbToc75 o NbTom40 resultó en una resistencia generalizada no solo a MNSV sino también al virus del arrugamiento del nabo (TCV) y al virus del moteado del clavel (CarMV), lo que respalda la idea actualmente aceptada y que involucra el estado fisiológico del cloroplasto y la mitocondria en la señalización temprana de la respuesta defensiva. Finalmente, se realizó una búsqueda de factores del huésped que interaccionasen con la CP mediante con TurboID, una ligasa de biotina, que permite la detección de interacciones tanto directas e indirectas como transitorias y estables. Así, se obtuvo un gran número de proteínas candidatas utilizando la CP de MNSV y su mutante de localización citoplásmica, ∆NtCP. Tres de ellas, NbSIK1, NbSMU2 y NbMAP3K mostraron un efecto perjudicial constante y repetitivo sobre la acumulación del RNA viral. Después de la validación de las interacciones mediante otro método, y el análisis de la localización subcelular de la CP bajo el silenciamiento del interactor correspondiente, se establecieron dos hipótesis principales. En primer lugar, dado que la función principal de NbSMU2 está relacionada con el procesamiento y regulación del RNA mensajero, esta proteína podría ser secuestrada por la CP provocando la expresión de genes provirales. Por otro lado, NbSIK1 y NbMAP3K, actúan como reguladores positivo y negativo de la respuesta PTI a la infección, respectivamente. Además, ambas proteínas interaccionan entre sí y forman parte de la cascada de MAP quinasas, por lo que en nuestra segunda hipótesis, la CP interaccionaría con este complejo, promoviendo una regulación negativa de la PTI que facilitaría el desarrollo de la infección. / [CA] Els virus de plantes són els principals causants de la major part de malalties en plantes i les consegüents pèrdues econòmiques. El virus de les taques necròtiques del meló (MNSV) és un virus menut d'RNA monocatenari de polaritat positiva, pertanyent al gènere Gammacarmovirus, el genoma del qual codifica cinc proteïnes. La proteïna de coberta (CP) està formada per tres dominis diferents. El descobriment d'un pèptid de trànsit dual a la part aminoterminal de la CP va ser el punt de partida d'aquesta tesi. A l'inici d'una infecció per MNSV, la CP novament sintetitzada és transportada a l'interior dels cloroplasts i mitocondris mentre que, una part molt menor es manté al citoplasma augmentant a mesura que avança la infecció. La inhibició d'aquest transport dual comporta un augment de l'activitat supressora del silenciament de l'RNA de la CP. No obstant això, la infecció sistèmica es va frenar. Per tant, l'acumulació de la CP al citoplasma pot provocar un augment de la replicació viral però alhora una sobreexpressió de la p29, una replicasa auxiliar que ocasiona alteracions morfològiques als mitocondris, una explosió oxidativa i necrosi que restringeix el moviment viral. D'aquesta manera, el transport de la CP als orgànuls podria evitar una replicació viral excessiva mitjançant la modulació de l'activitat supressora per gestionar l'equilibri entre defensa de la planta i contradefensa viral que condueixen a una interacció compatible entre tots dos. Per entendre millor el mecanisme molecular que regeix el transport de la CP a aquests orgànuls, es van identificar els receptors i els porus dels translocon de les membranes externes dels mitocondris i els cloroplasts a Nicotiana benthamiana. Aquesta caracterització funcional es va realitzar principalment mitjançant VIGS i RT-qPCR, que va mostrar una redundància funcional més gran que l'observada entre els homòlegs d'Arabidopsis. A més, aquesta eina també es va utilitzar per avaluar la rellevància de cada component sota la infecció per MNSV, i juntament amb els estudis d'interacció CP-receptor realitzats mitjançant BiFC i Y2H, ens va permetre identificar a NbToc159A per a cloroplasts i NbOm64 per a mitocondris, com els principals receptors implicats en el transport de la CP a aquests orgànuls. Alhora, el silenciament de NbToc34, NbToc75 o NbTom40 va resultar en una resistència generalitzada a MNSV, TCV i CarMV, la qual cosa recolza la idea que circula actualment i que involucra l'estat fisiològic del cloroplast i el mitocondri en la senyalització primerenca de la resposta defensiva. Finalment, es va fer una cerca de factors de l'hoste que interaccionessin amb la CP mitjançant la innovadora tècnica de marcatge de proximitat amb TurboID, una lligasa de biotina, que permet la detecció d'interaccions tant directes i indirectes com transitòries i estables. Així, es va obtenir un gran nombre de proteïnes candidates utilitzant la CP de MNSV i el seu mutant de localització citoplàsmica, ∆NtCP. Tres de elles, NbSIK1, NbSMU2 i NbMAP3K van mostrar un efecte perjudicial constant i repetitiu sobre l'acumulació de l'RNA viral. Després de la validació de les interaccions mitjançant un altre mètode, i l'examen de la localització subcel·lular de la CP sota el silenciament de cada interactor, es van establir dues hipòtesis principals. En primer lloc, atès que la funció principal de NbSMU2 està relacionada amb el processament i la regulació de l'RNA missatger, aquesta proteïna podria ser segrestada per la CP provocant l'expressió de gens provirals. D'altra banda, NbSIK1 i NbMAP3K actuen com a reguladors positiu i negatiu de la resposta PTI a la infecció, respectivament. A més, les dos proteïnes interaccionen entre si i formen part de la cascada de MAP quinases, per la qual cosa en la nostra segona hipòtesi, la CP interaccionaria amb aquest complex, promovent una regulació negativa de la PTI que facilitaria el desenvolupament de la infecció. / [EN] Plant viruses are the causal agents of many plant diseases and the subsequent economic losses, estimated to be US$60 billion worldwide each year. The melon necrotic spot virus (MNSV) is a small, single-stranded, positive-sense RNA virus that belongs to the genus Gammacarmovirus and encodes five proteins. The coat protein (CP) is composed of three distinct domains. The discovery of a dual transit peptide in the amino-terminal part of the CP was the starting point of this thesis. Early in MNSV infection, the new synthesized CP is imported into chloroplasts and mitochondria, while the cytoplasmic pool increases as the infection progresses. Inhibiting this dual transport leads to an increase in the RNA silencing suppressor activity of the CP. However, far from resulting in an enhanced infection development, systemic spread was impaired. Therefore, the accumulation of cytoplasmic CP may cause an increase in viral replication and overexpression of p29, an auxiliary replicase that causes morphological alterations, ROS, and necrosis that may restrict viral movement. Thus, a new role for CP targeting would be to avoid excessive viral replication by modulating the suppressor activity to manage the balance between plant defense and viral counter-defense, leading to a compatible interaction. Unfortunately, Arabidopsis thaliana is not a host for MNSV. Thus, to better understand the molecular mechanism behind the CP dual targeting, the receptors and pores of the Nicotiana benthamiana mitochondrial and chloroplast outer membrane translocons were genome identified, and some functional characterization was carried out. We assigned the following names NbToc75-III, NbToc34, NbToc90, NbToc120, NbToc159A, NbToc159B, NbTic22-III for chloroplast translocon components, and NbTom40, NbTom20-1, NbTom20-2, NbOm64 for mitochondrion translocon components. The functional characterization was mainly carried out by virus-induced gene silencing (VIGS) and RT-qPCR, revealing a functional redundancy higher than that reported for Arabidopsis homologs. Additionally, VIGS was also used to evaluate the relevance of each translocon component in MNSV infection, and together with CP-receptor interaction studies performed by BiFC and Y2H, allowed us to identify NbToc159A for chloroplasts and NbOm64 for mitochondria as the main receptors involved in the CP organelle import. Moreover, silencing of NbToc34, NbToc75, or NbTom40 resulted in a generalized resistance not only to MNSV but also to turnip crinkle virus (TCV), and carnation mottle virus (CarMV), supporting the current idea that involves the chloroplast and mitochondrion physiological state in early defense response signaling. Finally, a search for host factors interacting with the CP was performed by the innovative TurboID proximity labeling tool, which allows the detection of both direct/indirect and transient/stable interactions. Thus, a large number of candidate proteins were obtained that interacted either with the MNSV CP or with ∆NtCP, a cytoplasm-localized mutant. Three of them, NbSIK1, NbSMU2, and NbMAP3K, showed a consistent and repetitive detrimental effect on MNSV RNA accumulation. After the validation of the interactions using another method and the analysis of the subcellular localization of the MNSV CP under each interactor silencing, two main hypotheses were proposed. Firstly, since the main function of NbSMU2 is related to messenger RNA regulation by splicing, this protein could be sequestered by the CP, causing the expression of proviral genes. On the other hand, NbSIK1 and NbMAP3K act as positive and negative regulators of the PTI response to infection, respectively. Moreover, both proteins interact with each other and are part of the MAP kinase cascade, so in our second hypothesis, CP would interact with this complex, promoting a negative regulation of PTI that would facilitate viral infection. / La autora ha disfrutado de un contrato predoctoral de formación de personal investigador (FPI) (PRE-2018-84130) otorgado por el Ministerio de Ciencia e Innovación asociado al proyecto BIO2017-88321-R. Este trabajo de tesis doctoral ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia e Innovación, BIO2017-88321-R y PID2020-115571RB- I00. / Sáiz Bonilla, M. (2023). Deciphering the intracellular dual targeting of the melon necrotic spot virus coat protein, its interaction with host factors and their roles in plant defense [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195836