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Tout épithélium glandulaire sécrétoire est constitué d'une unité structurale et fonctionnelle commune, l'acinus. C'est une architecture sphérique pluricellulaire parfaitement différentiée et polarisée qui, reconstruite en culture 3D, mime l'organisation réelle du tissu. Etudier les déterminants environnementaux et génétiques qui gouvernent la transformation d'un acinus en sphéroïde s'apparentant à une tumeur est l'un des enjeux majeurs des modèles in vitro. Un des défis actuels est d'adapter ces modèles in vitro à des conditions de culture 3D qui soient compatibles avec la réalisation de cribles génétiques en 3D, basés par exemple sur l'ARN interférence (RNAi). Cependant, les formats standards de culture 3D et les méthodes analytiques ne sont pas compatibles aux cribles haut-débit. Ils ne permettent pas de contrôler la taille et la distribution des acini, sont dépendants d'immuno-marquages et les acquisitions sont longues. Par ailleurs, la microscopie confocale et vidéomicroscopie offrent un champ d'observation restreint qui ne permet pas d'observer un grand nombre de structures 3D en même temps, pour permettre une analyse statistique. Ainsi, dans le but i) de développer des modèles cellulaires appropriés en 3D, ii) d'adresser des questions fondamentales relatives au cancer de la prostate et iii) de réaliser des cribles RNAi dans un contexte plus pertinent que la culture 2D, j'ai développé des outils innovants au format microsystèmes adaptés à l'analyse haut-débit d'un grand nombre d'objets 3D. En optimisant les conditions de culture cellulaire 3D sur le modèle de la lignée cellulaire RWPE1, j'ai pu récapituler les étapes de formation des acini prostatiques et montrer que la formation du lumen est indépendante de la polarité et est gouvernée par deux mécanismes, « hollowing » et cavitation. / In all secretory epithelia from glandular tissues, there is a common structural and functional unit, the acinus. It is a well polarized and organized pluricellular structure that is spontaneously reconstructed in 3D culture, therefore closely mimics the real structure we find in vivo. For my purpose, acini are used as models for tumor initiation and cancer development. One of the objectives of Biomics laboratory is to identify the genetic and microenvironmental determinants of prostate acini morphogenesis and polarity. The strategy is based on High-Throughput (HT) RNA interference (RNAi)-based screening. To meet this objective, my project was to develop appropriate 3D cell models which closely mimic the cyst-like and duct-like structure of prostate. By optimizing conventional 3D culture in Matrigel, I could recapitulate prostate acini morphogenesis and showed that lumen formation is independent to the polarity, which appears later. However, the conventional 3D cell culture formats and analytical tools are not suited for HT Screening (HTS). They lack control over acini size, are label-dependant and therefore time-consuming and labor intensive. Also, classical microscopy offers a very limited field of view and hence does not allow observing a large amount of 3D structures for statistical analysis.

Contrairement aux mammifères, la rétine des amphibiens et des poissons croît tout au long de la vie de l’animal grâce à l’activité de cellules souches neurales présentes dans une région de neurogenèse continue appelée zone marginale ciliaire (ZMC). Leur caractérisation moléculaire et la compréhension des mécanismes qui sous-tendent leur activité et leur maintenance pourraient trouver des applications majeures dans le traitement par thérapie cellulaire des patients atteints de pathologies neurodégénératives de la rétine. Au cours de ma thèse, je me suis principalement penché sur deux problématiques majeures : quelle est l’origine ontologique de ces cellules souches adultes et comment se maintiennent-elles au cours de la rétinogenèse embryonnaire ? J’ai abordé ces deux questions via l’analyse descriptive et fonctionnelle de deux gènes, Hes1 et Hes4, identifiés dans mon laboratoire comme des marqueurs spécifiques des cellules souches rétiniennes. Ces gènes codent pour des répresseurs transcriptionnels de type bHLHO. L’étude de leur dynamique d’expression au cours du développement montre que ces gènes marquent un territoire restreint, situé initialement à la frontière entre l'épithélium pigmenté rétinien (EPR) présomptif et la rétine neurale, dont l’évolution au cours du temps suggère qu’il est à l’origine de la cohorte des cellules souches adultes. Ces résultats permettent pour la première fois de proposer que ces dernières seraient ségrégées très tôt au cours de l’embryogenèse rétinienne des cellules destinées à se différencier. Je me suis ensuite posé la question du rôle de Hes1/4 dans la maintenance de ces cellules souches présomptives. Mes expériences de gain de fonction suggèrent que ces gènes contribuent de façon autonome cellulaire (i) à les empêcher de se différencier vers un destin EPR ou neuronal, (ii) à les maintenir en prolifération et (iii) à ralentir leurs divisions. Enfin, j’ai également travaillé à positionner les gènes Hes1/4 dans le réseau de signalisation qui contrôle les cellules souches rétiniennes en étudiant leur régulation par les voies Wnt, Hedgehog et Notch. L’ensemble de mes données me permet de proposer un modèle selon lequel les facteurs Hes1/4, sous contrôle positif de la voie Wnt, permettent au cours du développement la maintenance à l’état indifférencié et en prolifération lente d’une population cellulaire destinée à former la cohorte des cellules souches adultes de la ZMC. / The retina of fish and amphibian contains genuine neural stem cells located at the most peripheral edge of the ciliary marginal zone (CMZ). However, their cell-of-origin as well as the mechanisms that sustain their maintenance during development are presently unknown. We identified Hes1 and Hes4 (previously named XHairy1 and XHairy2, respectively), genes encoding bHLHO transcriptional repressors, as stem cell specific markers of the CMZ that are positively regulated by the canonical Wnt pathway and differentially regulated by Hedgehog signalling. We found that during retinogenesis, Hes1/4 labels a small territory, located first at the pigmented epithelium (RPE)/neural retina (NR) border and latter in the retinal margin, that likely gives rise to adult retinal stem cells. Our gain of function experiments show that Hes1/4 cell autonomously prevent retinal precursor cells from commitment towards retinal fates and maintain them in a proliferative state. Besides, our data highlight for the first time that Hes1/4 may also constitute crucial regulators of cell cycle kinetics. Hes1/4 gain of function indeed significantly slow down cell division, mainly through the lengthening of G1 phase. As a whole, we propose that Hes1/4 maintain particular stemness features in a cellular cohort dedicated to constitute the adult retinal stem cell pool, by keeping it in an undifferentiated and slowly proliferative state along embryonic retinogenesis.

Chez les Vertébrés, la moelle épinière se développe à partir de la région postérieure de la plaque neurale. La plaque neurale se ferme progressivement pour donner la gouttière puis le tube neural au cours de l'allongement antéro-postérieur de l'embryon. Les précurseurs neuraux sont soumis à l'action de morphogènes comme Sonic Hedgehog (Shh) au niveau de la gouttière neurale. La protéine Shh qui est sécrétée par les structures ventrales de la gouttière et du tube neural contrôle à la fois la prolifération et la spécification des précurseurs neuraux ventraux. Si les mécanismes moléculaires qui mènent à la spécification neuronale commençaient à être bien connus, les bases moléculaires de l'action proliférative de Shh restaient à élucider. <br />Pour comprendre comment Shh contrôle la prolifération dans l'ébauche de moelle épinière j'ai utilisé l'embryon de poulet comme modèle d'étude. J'ai observé que deux régulateurs du cycle cellulaire : Cycline D1 et CDC25B sont exprimés dans la partie ventrale de la gouttière neurale. Les Cyclines D sont connues pour leur rôle dans le couplage des signaux extracellulaires avec la progression des cellules en phase G1 du cycle. La phosphatase CDC25B est connue pour promouvoir la transition G2/M. J'ai démontré par des expériences de perte et de gain de fonction que l'expression de Cycline D1 et de CDC25B est régulée par la voie de signalisation Shh dans la partie ventrale de la gouttière neurale. L'inhibition de la voie dans le tube neural entraîne un blocage des cellules en phase G1 et à la transition G2/M. La surexpression de Cycline D1 dans le tube neural favorise la prolifération cellulaire au détriment de la différenciation neuronale. Ces données suggèrent donc que Shh pourrait maintenir en prolifération certaines populations de précurseurs neuraux par l'activation de la Cycline D1. Ce travail a donc permis l'identification de Cycline D1 et CDC25B comme des cibles de Shh. Il suggère que Shh agit positivement sur la prolifération à deux phases du cycle cellulaire : la progression en G1 et la transition G2/M. Le contrôle de la progression en G1 pourrait servir à maintenir certains précurseurs en prolifération, la signification du contrôle à la transition G2/M reste à être déterminé. Cette étude nous permet de mieux comprendre par quels mécanismes la voie de signalisation Shh va coordonner la prolifération avec la spécification dans le tube neural.

Le chloroacétaldéhyde (CAA), un des principaux produits du métabolisme hépatique de l'ifosfamide (IFO), est considéré comme responsable de la néphrotoxicité de ce médicament. Les mécanismes exacts de cette néphrotoxicité ne sont pas complètement élucidés. Dans la première partie de cette étude, nous avons essayé de préciser les mécanismes physiopathologiques de la toxicité du CAA sur un modèle de tranches de cortex rénal de rat, puis, dans la deuxième partie, nous avons recherché un effet anticancéreux éventuel du CAA sur des cellules de cancer du sein humain (MCF-7). La néphrotoxicité du CAA, utilisé à des concentrations proches de celles mesurées chez les patients traités par l'IFO, soit 0 - 75 µM, s'est manifestée par une chute d'ATP et du glutathion ainsi que par une inhibition du métabolisme du lactate. Certaines enzymes de la néoglucogenèse, notamment la glyceraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, ont été inhibées par le CAA. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale ainsi que l'oxydation du lactate ont été également inhibées par le toxique. D'autre part, le CAA (10 et 25 µM) a inhibé la prolifération des cellules MCF-7 sans que cette inhibition soit accompagnée d'une chute d'ATP cellulaire. Le transport cellulaire et le métabolisme du glucose ainsi que certaines enzymes de la glycolyse ont été également inhibés par le CAA. Parmi celles-ci, l'hexokinase semble être l'enzyme qui catalyse l'étape limitante de la voie de la glycolyse. En conclusion, le CAA est bien impliqué dans les mécanismes de la néphrotoxicité de l'IFO, mais de plus, il pourrait, via l'inhibition de la glycolyse, contribuer à l'effet thérapeutique de l'IFO.

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.

Aujourd'hui, l'énergie nucléaire représente une partie non-négligeable du marché énergétique mondial, très probablement vouée à croître dans les prochaines décennies. Les réacteurs du futur devront notamment répondre à des critères supplémentaires économiques mais surtout de sûreté, de non-prolifération, de gestion optimisée du combustible et d'une gestion responsable des déchets nucléaires. Dans le cadre de cette thèse, des études concernant la non-prolifération des armes nucléaires sont abordées, dans le cadre de la recherche et développement d'un nouvel outil potentiel de surveillance des réacteurs nucléaires ; la détection des antineutrinos des réacteurs. En effet, les propriétés de ces particules pourraient intéresser l'Agence Internationale de l'Energie Atomique (AIEA) en charge de l'application du Traité de non-prolifération des armes nucléaires. L'AIEA encourage ainsi ses états membres à mener une étude de faisabilité. Une première étude de non-prolifération est réalisée avec la simulation d'un scénario proliférant utilisant un réacteur de type CANDU et de l'émission en antineutrinos associée. Nous en déduisons une prédiction de la sensibilité d'un détecteur d'antineutrinos de taille modeste à la diversion d'une quantité significative de plutonium. Une seconde étude est réalisée dans le cadre du projet Nucifer, détecteur d'antineutrinos placé auprès du réacteur de recherche OSIRIS. Nucifer est un détecteur d'antineutrinos dédié à la non-prolifération à l'efficacité optimisée conçu pour être un démonstrateur pour l'AIEA. La simulation du réacteur OSIRIS est développée ici pour le calcul de l'émission d'antineutrinos qui sera comparée aux données mesurées par le détecteur ainsi que pour caractériser le bruit de fond important émis par le réacteur détecté dans Nucifer. De façon générale, les antineutrinos des réacteurs sont émis lors des décroissances radioactives des produits de fission. Ces décroissances radioactives sont également à l'origine de la puissance résiduelle émise après l'arrêt d'un réacteur nucléaire, dont l'estimation est un enjeu de sûreté. Nous présenterons dans cette thèse un travail expérimental dont le but est de mesurer les propriétés de décroissance bêta de produits de fission importants pour la non-prolifération et la puissance résiduelle des réacteurs. Des premières mesures utilisant la technique de Spectroscopie par Absorption Totale (TAGS) ont été réalisées auprès du dispositif de l'Université de Jyväskylä. Nous présenterons la technique employée, le dispositif expérimental ainsi qu'une partie de l'analyse de cette expérience.

Les recherches exposées dans ce document portent sur l'étude du rôle de HSF2 au cours du développement du système nerveux central. Les Heat Shock Factors (HSF) sont impliqués dans la réponse au choc thermique et également au cours du développement embryonnaire. Mes travaux ont démontré que HSF2 est requis au cours de la formation du cortex cérébral pour la migration de certains neurones en régulant directement l'expression de p35, sous unité activatrice de CDK5. D'autres cibles ont été identifiées NudE, Dclk, Dab1 nécessaires à la migration des neurones en participant à la dynamique du cytosquelette. De plus, ces travaux montrent que HSF2 module la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales (NSC) et des progéniteurs (NP) car i) par électroporation in ovo chez le poulet, la surexpression de HSF2 provoque une augmentation de la prolifération des NP; ii) les NSC Hsf2−/− en culture présentent un retard de prolifération, de survie et de différenciation. Ainsi, HSF2 pourrait assister la décision cellulaire des NSC/NP vers la prolifération ou la différenciation et la migration, tel un aiguilleur de destin cellulaire

Les micro-ARNs (miRNAs) sont des ARNs de 20-22 nucléotides, transcrits à partir du génome, dont la fonction est de réguler l'expression génique en s'appariant à des ARNm cibles, inhibant ainsi leur traduction et/ou entrainant leur dégradation. Dans les cancers, l'expression des miRNAs est fortement dérégulée. Une majorité de miRNAs est diminuée dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux, et un lien causal a été décrit entre inhibition globale des miRNAs et tumorigenèse. Par ailleurs, des miRNAs agissant comme des suppresseurs de tumeurs et d'autres comme des oncogènes ont été décrits. Dans ce contexte impliquant de plus en plus les miRNAs dans les pathologies néoplasiques, l'objectif de ce travail était d'étudier le rôle de la voie miRNA dans la biologie des cellules tumorales. Afin d'identifier des cellules tumorales dépendant de miRNAs oncogènes endogènes pour survivre ou proliférer, nous avons développé une stratégie d'inhibition globale de la biogenèse des miRNAs en ciblant Drosha ou DGCR8, les deux composants du microprocesseur, complexe nucléaire de maturation des miRNAs. Cette stratégie nous a permis d'identifier des lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l'inhibition du microprocesseur conduit à un phénotype d'arrêt de prolifération durable. Nous avons mis à profit cette dépendance à la voie miRNA pour réaliser un crible positif de complémentation du défaut de prolifération observé grâce à l'expression de miRNAs individuels. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des miRNAs capables de soutenir individuellement la prolifération de ces cellules tumorales. Cette stratégie nous a également permis de montrer des différences fonctionnelles entre miRNAs homologues ou de la même famille. La recherche des cibles régulées par ces miRNAs nous a permis d'élaborer des hypothèses concernant les cibles potentiellement impliquées dans le phénotype observé. Nous avons ainsi démontré la participation du suppresseur de tumeur PTEN à l'arrêt de prolifération induit par l'inhibition du microprocesseur. La stratégie d'inhibition globale de la voie miRNA suivie d'une complémentation phénotypique par des miRNAs individuels permet de s'affranchir de la grande redondance de séquence et de fonction des miRNAs et devrait pouvoir s'appliquer d'une manière plus générale à l'étude d'autres processus régulés par les miRNAs.

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s'est orienté sur l'étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J'ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s'est penchée sur l'étude de l'expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l'arrêt de la prolifération. A l'issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka.