Effect of Manipulation of Notch Signaling Pathway on Neural Stem Cell Proliferation in the Hippocampus Following Traumatic Brain Injury By Seung L. Kim A thesis statement submitted for degree requirement in Mater of Science Virginia Commonwealth University, 2019 Advisor: Dong Sun, MD. PhD. Department of Anatomy & Neurobiology The Notch signaling pathway is known as a core signaling system in maintaining neural stem cells (NSCs) in embryonic development and adulthood including cell proliferation, maturation, and cell fate decision. Proliferation of NSCs persists throughout lifespan in neurogenic niches and is often upregulated following neurological insults including traumatic brain injury (TBI). Therefore, NSCs are viewed as the brain’s endogenous source for repair and regeneration. We speculate Notch signaling pathway is also involved in injury-induced cell proliferation in the neurogenic niche following TBI. TBI, which is a leading cause of death and disability, has been a huge burden to our society. Many efforts have been made in attempt to treat and manage TBI. In this study, we examined the involvement of Notch signaling pathway in injury induced NSC proliferation in the neurogenic niche, by administering exogenous Notch ligands including, Notch agonist or antagonist. Adult rats were intraventricularly infused with Notch1 receptor agonists (anti-Notch1 antibody at the dose of 0.5, 2 or 4μg/ml), Notch1 receptor antagonist (recombinant Jagged1 fusion protein at the dose of 25, 50 or 100μg/ml) or vehicle for 7 days following TBI. 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) was administered single daily via intraperitoneal injection to label proliferating cells for 7 days post injury. The animals were sacrificed on the 7th day at 2 hours after the last BrdU injection. Sequential vibratome sliced coronal brain sections were processed for proliferation marker BrdU, Ki67 or immature neuronal marker DCX staining. BrdU, Ki67 or DCX-labeled cells in the dentate gyrus of the hippocampus were quantified using unbiased stereological method. We found TBI in the form of moderate lateral fluid percussion injury (LFPI) induced cell proliferation was further augmented by 7-day infusion of Notch agonist (Notch1-2μg/ml) as shown by BrdU and Ki67 labeling. Further, 7-day infusion of Notch antagonist (Jagged1-50μg/ml) post-injury greatly reduced the number of BrdU+ cells. However, ambiguous dose related responses were also observed where 7-day infusion of higher dose of Notch agonist (Notch1-4μg/ml) resulted in reduced cell proliferation. No major changes in the numbers of newly generated neurons were observed across the animals, except a slight reduction in Notch agonist (Notch1-2μg/ml) and Notch antagonist (Jagged1-50μg/ml) infused animals as shown by DCX labeling. Infusion of Notch agonist or antagonist affects NSC proliferation following TBI suggesting the involvement of Notch signaling pathway in regulating post-TBI NSC proliferation in the neurogenic niche. For the unexpected opposite results of higher dosing of Notch 1 agonist, the presence of other Notch receptors regulating NSC in the neurogenic niche should be considered. Future studies involving selective manipulation of these Notch receptors and their downstream effectors would clear some results.

Ovarian cancer is the most common cause of death from gynecological malignancy. Taxanes and platinum derivatives are most used therapeutics for its treatment. Development of multi drug resistance to chemotherapy represents a serious complication of the treatment. Therefore, new chemotherapeutic and therapeutic targets are investigated, which could help to overcome tumor cell resistance. The main objectives of the thesis were to study: i) the efficiency of new derivatives of conventional taxanes in vitro with the aim to determine the potentially most effective taxane derivatives in resistant tumor ovarian cells and, ii) the gene expression profile of the Notch signaling pathway, as a possible therapeutic target for the treatment of ovarian cancer. Specifically, the thesis focused on the relationship between levels of Notch signaling gene expression in patients with ovarian carcinoma and their prognosis, progression and survival. This thesis revealed that Stony Brook Taxanes - "SB-T"; SB-T-121402, SB-T-121605, and SB-T-121606 derivatives are very effective in NCI/ADR-RES tumor carcinoma cells resistant to conventional taxane - paclitaxel, and should be further studied in more advanced models, e.g. in vivo patient derived xenografts. In a study of the importance of the Notch signaling pathway in...

No description available.

No description available.

La destruction des cellules ciliées de la cochlée entraine des surdités sensorielles. Chez les mammifères ces cellules ne se régénèrent pas et les déficits auditifs occasionnés sont définitifs. Aucune thérapie visant à remplacer les cellules ciliées détruites n'est actuellement proposée.L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement d'une thérapie cellulaire basée sur la greffe de cellules souches / progénitrices cochléaires et destinée à promouvoir la régénération des cellules ciliées.Au cours de nos travaux, nous avons isolé une population de cellules souches cochléaires chez des souris néonatales appartenant à la « side population » (Savary et al. 2007). Nous avons également montré, par des expériences de perte et de gain de fonction in vitro, que la voie de signalisation Notch est nécessaire pour l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules (Savary et al., 2008). Des lignées de souris transgéniques exprimant la GFP sous le promoteur de la GFAP et de la Nestine nous ont permis de suivre l'expression de ces marqueurs de cellules souches dans des cochlées de souris P3 et adultes. En étudiant l'expression combinée d'autres marqueurs comme Sox2 et Abcg2, nous avons montré que les cellules progénitrices cochléaires sont réparties différemment chez les souris néonatales et les souris adultes (Smeti, Savary et al 2010).Nos expériences préliminaires de transplantation in vitro dans un modèle murin de surdité génétique humaine de type DFNA15 démontrent que les cellules souches / progénitrices greffées sont capables d'intégrer l'épithélium sensoriel lésé et de se différencier en cellules exprimant un marqueur de cellules ciliées. / The destruction of cochlear hair cells causes sensory deafness. In Mammals these cells do not regenerate and damages are irreversible. Currently, there is no proposed therapy to replace the destroyed hair cells.The focus of this thesis is to develop a novel cell therapy based on transplantation of cochlear progenitor cells in order to promote regeneration of hair cells.We first isolated a population of cochlear stem cells from neonatal mice by using the side population analysis technique (Savary et al. 2007). Then, we showed, by in vitro loss and gain of function experiments, that the Notch signaling pathway is necessary for cellular self-renewal and differentiation (Savary et al., 2008).Transgenic mice strains expressing GFP under the control of GFAP and Nestin promotors allowed us to monitor the expression of these markers of stem cells in the P3 and adult mice cochleae. By studying the combined expression of other stem cells markers such as Sox2 and ABCG2, we showed that the niches of cochlear progenitor cells are differently distributed in neonatal and adult mice (Smati, Savary et al 2010).Our preliminary in vitro transplantation experiments in a mouse model that mimics human genetic deafness DFNA15 show that the transplanted stem / progenitor cells are able to migrate to the lesion site, to integrate the damaged sensory epithelium and to differentiate into cells expressing a marker of hair cells.

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.

No description available.

Au cours de la myogenèse post-natale, la voie de signalisation de Notch participe au développement et à la régénération du muscle squelettique chez les mammifères. Elle permet le maintien de l'état prolifératif des myoblastes, contrôle la quiescence des cellules satellites in vivo et préserve une sous-population de cellules de réserve indifférenciées in vitro. L' activation de la voie et l'interaction du récepteur Notch avec ses ligands est dépendante de leur entité glucidique, notamment de leurs O-fucosylglycannes. La synthèse de ces derniers est initiée par la protéine O-fucosyltransférase 1 (Pofut1) qui greffe un O-fucose sur des domaines peptidiques particuliers appelés EGF-like. Bien que les acteurs moléculaires de la différenciation myogénique aient été largement étudiés par la communauté scientifique, la contribution de la glycosylation des protéines dans ce processus reste peu documentée. Une approche expérimentale in vitro basée sur l'utilisation de la lignée myoblastique murine C2C12 nous a permis d'identifier une expression importante de Pofut1 dans les cellules de réserve tandis qu' elle est restreinte dans les myotubes durant la différenciation myogénique. Plusieurs lignées de cellules C2C12 ont été générées pour qu' elles expriment de manière stable et différentielle Pofut1. Elles permettent ainsi d' évaluer l' importance du niveau d' expression de Pofut1 sur la différenciation myogénique.La sous-expression de Pofut1 réduit l' activation de la voie de signalisation de Notch conduisant à une entrée précoce des myoblastes dans le programme myogénique. Ceci a pour conséquence la dépletion des cellules de réserve Pax7+/MyoD- au profit d' une augmentation du nombre de myotubes. Des études morphométriques ont révélé un défaut d' accrétion nucléaire dans les myotubes sous-exprimant Pofut1, caractéristique d' une altération de la fusion secondaire. Ces observations sont accompagnées d' une diminution significative de l' expression du récepteur à l' interleukine 4 dans les cellules de reserve sous-exprimant Pofut1. Les lignées cellulaires ré-exprimant Pofut1 présentent une activation de la voie de signalisation de Notch et un processus de fusion myoblastique correctement restaurés.Ces travaux de thèse ont mis en exergue pour la première fois le rôle essentiel de Pofut1 dans le devenir cellulaire et la fusion des myoblastes au cours de la différenciation myogénique. / During post-natal myogenesis, Notch signaling pathway is involved in the development and regeneration of skeletal muscle in mammals. It maintains progenitor cell properties during the development of the myogenic lineage and controls the transition of satellite cells from a quiescent to an active state and preserves a subpopulation of reserve cells, in cell culture, in an undifferentiated state. The interaction between Notch and its ligands and the activation of this signaling is mainly controlled by the activity of protein O-fucosyltranferase 1 (Pofut1) and thus by the O-fucosylation state of the EGF-like repeats.Although the molecular players in myogenic differentiation have been extensively studied by the scientific community, the contribution of glycosylated proteins in this process remains poorly documented. An experimental in vitro study based on the C2C12 mouse myoblast cell line allowed us to identify a high expression of Pofut1 in reserve cells while a low expression was found in myotubes during myogenic differentiation. Several C2C12 cell lines were generated to express Pofut1 at different levels. They were used to evaluate the contribution of Pofut1 expression to the myogenic differentiation.The knockdown of Pofut1 repressed Notch signaling pathway activation leading to an earlier entrance of myoblasts in myogenic program. This resulted in the depletion of reserve cells Pax7+/MyoD- and an increase in the number of myotubes. Morphometric analysis revealed a nuclear accretion defect in Pofut1 knockdown myotubes. A significant decrease in the expression of the interleukin-4 receptor in Pofut1 knockdown reserve cells was also observed. Cell lines re-expressing correctly Pofut1 restored Notch signaling pathway and subsequently myoblast fusion process.This thesis work highlights, for the first time, the crucial role of Pofut1 in the cell fate decision and the fusion of myoblasts during myogenic differentiation.

La protéine O-fucosyltransférase 1 (POFUT1) réticulaire, dont le gène est localisé dans la région chromosomique 20q11.21 chez l’Homme, catalyse le transfert d’un fucose qui sera O-lié sur la sérine ou la thréonine présente dans la séquence consensus (C2X4S/TC3), portée par un domaine EGF-like d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Le knockdown de Pofut1 (Po -) dans la lignée myoblastique murines C2C12 conduit à la formation de myotubes allongés et minces, à faible nombre de noyaux ainsi qu’à une sous-expression du marqueur myogénique tardif Myf6, suggérant des défauts significatifs dans la fusion secondaire. La signalisation NFATc2/IL-4 est décrite comme la voie principale associée à cette étape. Nous montrons que la moindre expression de Nfatc2 dans les myotubes Po - est corrélée à une baisse de l'IL-4 sécrétée et à une faible quantité de son récepteur (IL-4Rα) présent chez les cellules de réserve qui doivent participer à la fusion avec les myotubes naissants. La neutralisation de l’IL-4Rα sur les C2C12 sauvages provoque des défauts d'accrétion myonucléaire, semblables à ceux observés pour les Po -. Ainsi, POFUT1 pourrait être un nouveau médiateur de la croissance des myotubes au cours du processus myogénique, notamment par la signalisation NFATc2/IL-4. La glycoprotéine WIF1, cible potentielle de POFUT1, est un antagoniste de la signalisation WNT via sa fixation aux protéines WNT. Cette voie est connue pour être impliquée dans la prolifération et la différenciation des myoblastes. Néanmoins, aucune donnée ne concerne le rôle de WIF1 dans le processus myogénique. Par un apport exogène de WIF1, nous avons montré l’augmentation de la prolifération et l’altération de la différenciation myoblastique des C2C12. Lors de la prolifération, une augmentation de l’expression de Myf5 et une diminution de MyoG sont observées. A 7 jours de différenciation, les myotubes Po - ont un diamètre plus petit que les myotubes sauvages et ils sont plus nombreux à avoir un faible nombre de noyaux, traduisant des défauts de fusion. Nous démontrons pour la première fois, l’implication de la protéine WIF1 dans le processus myogénique. Récemment, POFUT1 a aussi été proposé comme nouveau biomarqueur pour certains cancers, mais pas évalué dans le cancer colorectal (CCR). Nous avons donc collecté des données issues de 626 tumeurs et 51 tissus adjacents non tumoraux disponibles dans FireBrowse, celles de lignées cellulaires cancéreuses colorectales et de prélèvements tumoraux provenant du Centre de Ressources Biologiques du CHU de Limoges. Une surexpression de POFUT1 est observée dès le stade I, majoritairement due à une amplification de la région 20q11.21. Elle est significativement associée aux adénocarcinomes non mucineux et à une localisation rectale. De plus, l’expression de POFUT1 est corrélée à celles des récepteurs NOTCH ainsi qu’au processus métastatique, probablement par activation de la voie NOTCH. A ce titre, POFUT1 pourrait être considéré comme un nouveau biomarqueur pour le diagnostic du CCR. / The ER protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1), whose gene is located at the 20q11.21 chromosomic region in humans, catalyzes O-linked fucose addition to serine or threonine present in the consensus sequence (C2X4S/TC3) carried by EGF-like domain of membrane or secreted glycoprotein. Pofut1 knockdown (Po -) in murine myoblast C2C12 cell line leads to formation of elongated and thin myotubes, with a low number of nuclei and to downexpression of the late myogenic marker Myf6, suggesting significant defects in secondary fusion. NFATc2/IL-4 signaling is described as the main pathway associated to this step. We showed that the slightest expression of Nfatc2 in Po - myotubes is correlated with a decrease in IL-4 secretion and a lower quantity of IL 4Rα in reserve cells, which had to fuse with nascent myotubes. IL-4Rα neutralization on wild-type C2C12 causes myonuclear accretion defects, similar to those observed in Po -. Then, POFUT1 could be a new mediator of myotube growth during myogenic process, particularly through NFATc2/IL-4 signaling. The glycoprotein WIF1, potential POFUT1 target, is an antagonist of WNT signaling via its binding to WNT proteins. This pathway is involved in proliferation and differentiation of myoblasts. However, no data are available on WIF1 role in the myogenic process. Through exogenous WIF1 treatment, we showed a proliferation increase and a myoblast differentiation impairment in C2C12. During proliferation, increase in Myf5 and decrease in MyoG expressions are observed. At 7 days of differentiation, Po - myotubes have a smaller diameter than wild-type ones and are more numerous to have a small number of nuclei, reflecting fusion defects. For the first time, we demonstrate the involvement of WIF1 in the myogenic process. Recently, POFUT1 was proposed to be a new biomarker for several cancers, but not evaluated in colorectal cancer (CRC). We used data from 626 tumors and 51 adjacent non-tumor tissues available at FireBrowse, colorectal cancer cell lines and tumor samples from the Biological Resource Centre of Limoges hospital. A POFUT1 overexpression is observed from stage I, mainly due to amplification of 20q11.21 region. It is significantly associated to non-mucinous adenocarcinoma and to rectum location. Moreover, POFUT1 expression is correlated with those of NOTCH receptors as well as the metastatic process, probably by activation of the NOTCH pathway. POFUT1 could therefore be considered as a new biomarker for CRC diagnosis.

Au pic de la réponse effectrice des LT CD8, on retrouve deux sous-populations, soit les effecteurs à demi-vie courte (SLEC) ou les effecteurs précurseurs de cellules mémoires (MPEC). La phase de contraction de la réponse effectrice implique l’apoptose des SLEC et la survie des MPEC, qui se différencient en cellules mémoires pour protéger contre une réinfection. La voie Notch est impliquée dans les choix de différenciation binaire et l’interaction ligand-récepteur mène au clivage du domaine intracellulaire de Notch (NICD), qui migrera au noyau afin d'induire l’expression de gènes cibles. Dans un modèle où l’expression des récepteurs Notch1 et Notch2 est absente uniquement dans les LT CD8 (N1N2∆/∆), le laboratoire a démontré que l’absence du signal Notch favorisait la différenciation en MPEC et affectait l’expression de 217 gènes. Cette étude visait à 1) identifier les gènes cibles de Notch contrôlant la différenciation SLEC-MPEC, et 2) évaluer si l’absence du signal Notch permet un meilleur contrôle tumoral par les LT CD8. Nous avons priorisé les 217 gènes en fonction de différents critères et identifié Il2ra comme une cible importante en aval de la voie Notch. Toutefois, nous avons établis que lors d’une infection aiguë, la surexpression rétrovirale de Il2ra dans les LT CD8 N1N2∆/∆ n’influençait pas la différenciation SLEC-MPEC. Nous avons également déterminé qu’une thérapie adoptive de LT CD8 N1N2∆/∆ limitait le contrôle de la croissance tumorale et impliquait une diminution des fonctions effectrices des LT CD8 N1N2∆/∆, qui étaient moins terminalement différenciés. Une meilleure compréhension du rôle de Notch dans la réponse des LT CD8 permettra de développer de nouvelles stratégies de vaccination et de traitement du cancer. / In response to acute infections, effector CD8 T cells differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor effector cells (MPECs) capable of generating long-lived memory CD8 T cells. The Notch signaling pathway is a key regulator of cell fate decision. Following ligand- receptor interaction, the Notch intracellular domain (NICD) is cleaved and migrates to the nucleus in order to induce the expression of target genes. In a model in which Notch1 and Notch2 expression is inhibited only in mature CD8 T cells, our team has established that Notch deficiency favors MPEC differentiation in CD8 T cells and influences the expression of 217 gens. This study aims to: 1) identify target genes of the Notch pathway regulating SLEC-MPEC differentiation, 2) evaluate if Notch deficiency can augment tumor control by CD8 T cells. We have prioritized the list of genes differentially expressed in the absence of Notch signaling according to various criteria. We hence identified Il2ra as a target gene, but during an acute infection, overexpression of Il2ra in Notch deficient CD8 T cell was insufficient to modulate SLEC-MPEC differentiation. In addition, we have established that adoptive therapy with Notch deficient CD8 T cell impaired tumor control and implicated a diminution of effector function in Notch deficient CD8 T cell, which were less terminally differentiated. A better understanding of Notch signaling pathway’s role in the CD8 T cell response will allow for improvement of vaccinal strategies and cancer treatment.