inositol Triphosphate is a second messenger that releases calcium stored in the endoplasmatic reticulum, providing several cell responses depending on the cell where the process is done. Adenophostin A and B are two potent glyconucleotides triphosphate that were isolated from a penicillium brevicompactum culture in 1993. They are the powerful agonist described up to now for the IP3 receptor, with affinities 10-100 higher than IP3.The replacement of a phosphate group by an isoster methylencarboxilate group in biological active molecules doesn't altered the recognition of their specific receptors, being more stable to the phosphatases hydrolisis. On the other hand, the introduction of a fluorine atom in a biological active molecule involves a significant change in their activity, enhancing the stability of the nearby positions of the molecule at the same time.This thesis is the beginning of a wide investigation project where the target is synthesize different analogues of Adenophostin A. In these analogues phosphate groups have been replaced systematically by isoster methylencarboxilate groups. On the other hand, another analogue with a fluorine atom in the 2" position would be synthesized in order to determine the function of the replaced essential hydroxil group and, at the same time, enhance the neighbour glycosidic bond. First of all, we have done three different synthesis towards the glucose 3,4-dialquilated derivative. We obtain the adenosine 2'-allyl derivative in six synthetic stages. After doing a study of the glycosidic reaction with three different glycosil donors (glucose fluoride, phosphite and tricloroacethimidate derivatives), we found that the best result was with the glycosil tricloroacethimidate with tert-buthyldimethylsilil as activator. The yield of this reaction weren't brilliant, so we decide to investigate a second synthetic way, where the functionalities of the target molecule were included in the glycosil donor and acceptor before the glycosilation reaction. Firstly, the glucopyranoside with two phosphate groups in the positions 3 and 4 was synthesized, being this a new interesting way to obtain adenophostin derivatives. But it was not possible to obtain the 2'-methylencarboxilate derivative of adenosine because of an unexpected lactonization. The Selectfluor treatment of different protected glycals lead to four glycosil 2-deoxy-2-fluoro-glucopyranoside donors with estereoselectivity and yields good. The glycosilation reaction was performed with a protected adenosine derivative as glycosil acceptor, which had been synthesized before. The best result was obtained with glycosil bromide and silver triflate and silver carbonate activation system. Subsequent deprotection steps led us to a very close synthetic precursor of the target molecule. This work has opened the synthetic route to the different target molecules and, nowadays, there is another doctoral thesis which is developing this project in the laboratory. / El inostilo trifosfato (IP3) es un mensajero secundario, responsable de la liberación del calcio almacenado en el retículo endoplasmático, dando lugar a diferentes respuestas celulares en función de la célula en la cual se dé el proceso. En 1993 se aislaron de un cultivo de penicillium brevicompactum dos potentes gliconucleósidos trifosfatados, la Adenofostina A y B. Éstos son los agonistas más potentes descritos hasta el momento para el receptor específico del IP3, con afinidades 10-100 veces superiores al mismo IP3.Se ha descrito que la substitución de un grupo fosfato por un grupo metilencarboxilato isóstero en moléculas con actividad biológica no modifica el reconocimiento por parte de sus receptores específicos, siendo más estables frente la hidrólisis por parte de las fosfatasas. Por otro lado, la introducción de un átomo de flúor en una molécula con actividad biológica supone un importante cambio en su actividad, reforzando al mismo tiempo la estabilidad de las posiciones vecinas, y con ello toda la molécula.La presente tesis se encuadra dentro de un proyecto de investigación más amplio, constituyendo el punto de partida del mismo. En este proyecto se pretende, en primer lugar, sintetizar diferentes análogos de la Adenofostina A en los que se ha substituido sistemáticamente los grupos fosfatos de la molécula original por grupos metilencarboxilatos isósteros, y por otro lado introducir un átomo de flúor en la posición 2" para estudiar el grupo hidroxilo esencial que substituye y al mismo tiempo reforzar el enlace glicosídico vecinal.En primer lugar se han realizado tres aproximaciones sintéticas diferentes para obtener el derivado 3,4-dialquilado de la glucosa.Se obtenió el 2'-alil derivado de la adenosina en seis etapas sintéticas, realizándose un estudio de la reacción de glicosilación con tres diferentes dadores de glicosilo (fluoruro, fosfito y tricloroacetimidato de glicosilo derivado de glucosa). El mejor resultado fue con el tricloroacetimidato de glicosilo y triflato de terc-butildimetilsililo cómo activador.Sin embargo, el rendimiento de esta reacción no era muy bueno, así que se decidió estudiar una segunda aproximación sintética, donde la funcionalización de la molécula final estuviera incluida en el dador y aceptor de glicosilo antes de la reacción de glicosilación. Por un lado se obtuvo el glucopiranósido con los dos grupos fosfato en las posiciones 3 y 4, abriendo así una nueva vía de obtención de derivados de la adenofostina que puede resultar muy interesante. Pero no fue viable la síntesis del derivado 2'-metilencarboxilato de la adenosina porque se daba una inesperada lactonización.El tratamiento con selectflúor de un glical protegido condujo a quatro diferentes dadores de glicosilo 2-desoxi-2-flúoro-glucopiranósidos con muy buena estereoselectividad y buenos rendimientos. Se ensayo la reacción de glicosilación con un derivado de la adenosina protegido como aceptor de glicosilo, sintetizado previamente, obteniéndose un muy buen resultado con bromuro de glicosilo y triflato de plata-carbonato de plata como sistema activador. La síntesis continuó con el tratamiento de grupos protectores llevando a la obtención del precursor sintético más inmediato de la molécula objetivo.El trabajo ha abierto las rutas sintéticas para obtener las diferentes moléculas objetivo y actualmente se está continuando la síntesis en el laboratorio dentro de otra tesis doctoral.

Las funciones del hígado son importantes debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivo y el resto del cuerpo (la circulación sistémica). La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes rCNT1 (pirimidina preferente) y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos transportadores en hígado. El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la distribución subcelular de rCNT1 y rCNT2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular total del hígado; son células altamente polarizadas y se caracterizan por tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes: la membrana basal la apical y la lateral. Por estas características y por ser muy activos metabolitamente, las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas. Examinamos la localización subcelular de tres maneras distintas. Primero, detectamos por técnicas de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fracciones enriquecidas en membranas plasmáticas canaliculares y basolaterales. Segundo, determinamos la cantidad proteica y la distribución de CNT1 y CNT2 en fracciones purificadas de endosomas de hígado de rata, mediante utilización de anticuerpos contra estos transportadores. Tercio, por técnicas de microscopía electrónica. Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especializados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáticas basolaterales en las cuales el transportador es activo. Estos estudios nos indican que los dos transportadores CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferencialmente regulados. En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos. Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el agonista del receptor A1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine (RPIA) produce el incremento de la actividad de transporte de CNT2. Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y se mimetiza en presencia de activadores de dichos canales. Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de los receptores A1, vía los canales KATP. Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura de los canales KATP es dependiente de la activación de la PKC. Por ultimo, observamos que la glicemia y el metabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio. Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas. Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hepatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS). El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad de transporte de CNT2 de un 60%. Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos que la disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo, del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales KATP. / INGLÉS:The first part of this these study of the subcellular localization and trafficking of CNT1 and CNT2 in rat hepatocytes. These studies indicated that the Na+-dependent nucleoside transporter CNT1 is present in a caveolin-enriched plasma membrane fraction (CEF), in transcytotic endosomes, and in canalicular membranes isolated from quiescent rat liver in which the transporter appears to be biologically active. Plasma membrane preparations enriched in basolateral markers showed Na+-dependent nucleoside transport activity that is mostly, if not exclusively, accounted for by CNT2, a transporter protein that it is not detected in CEF nor in the endosomal fractions. The two CNT transporters are spatially segregated and that this is due to their localization being regulated by distinct trafficking pathways in hepatocytes. CNT1 as being the first transporter that follows the transcytotic pathway for insertion into the apical side of liver parenchymal cells. The second part is focused on interactions between CNT proteins and purinergic receptors. These studies reveal a novel mechanism of regulation of the high affinity concentrative adenosine transporter, CNT2, via activation of adenosine A1 receptor in liver. This regulation is mediated by the activation of ATP-sensitive K(+) (K(ATP)) channels. The transient increase in CNT2-mediated transport activity triggered by (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine is fully inhibited by K(ATP)-channel blockers and mimicked by a K(ATP) channel opener. The extent of the purinergic modulation of CNT2 can be modulated by the glucose concentration, a finding that indicates that glycemia and glucose metabolism may affect this cross-regulation among A(1)R, CNT2, and K(ATP) channels. The third part involves a study of the effects of endogenous nitric oxide (NO) synthesis on the concentrative adenosine transporter, CNT2. Inhibition of endogenous NO synthesis (using either L-NAME and L-NMMA) in hepatoma FAO cells and in primary cultures of rat hepatocytes increases the functional activity of CNT2. This effect can be reversed by the addition of NO donors. Unlike the purinergic-mediated response, the activation triggered by NO inhibitors is poorly dependent on extracellular glucose, although interestingly, it can still be inhibited by the addition of K(ATP) channels blocker, glibenclamide.

Dins el camp de les reaccions de cicloaddició, s'ha estudiat a nivell experimental i teòric, mitjançant càlculs amb funcionals de la densitat, l'addició de diazometà i de diazocompostos fosforilats a diferents substrats olefínics quirals pobres en electrons, derivats de D-gliceraldehid, així com la fotòlisi de la pirazolina formada per a l'obtenció del compost ciclopropànic. Alguns dels compostos ciclopropànics obtinguts s'han utilitzat per la síntesi de derivats d'interès. També s'ha estudiat a nivell teòric, la diastereoselectivitat facial i l'estereoespecificitat de l'addició de N-alquilhidroxilamines a acrilat de metil i a èsters a,b-insaturats derivats de D-gliceraldehid.S'ha observat que la diastereoselectivitat p-facial de la cicloaddició 1,3-dipolar de diazometà a diferents substrats olefínics derivats de D-gliceraldehid és preferentment sin, i independent de la isomeria Z/E, la di- o tri-substitució o la naturalesa dels substituents electroatraients del doble enllaç. Segons els càlculs teòrics, l'origen de la diastereoselectivitat facial d'aquestes cicloaddicions, es troba principalment en la quiralitat del centre estereogènic del substrat. Els efectes estèrics constitueixen un factor rellevant en la determinació de l'estereoquímica dels adductes resultants.La reactivitat de bis[(diisopropilamino)fosfino]diazometà 71 envers els èsters a,b-insaturats (S)-(Z) i (E)-3-(2',2'-dimetil-1',3'-dioxolan-4-il)-2-propenoat de metil (3-Z i 3-E), és inferior a la del diazometà respecte el mateix dipolaròfil. D'altra banda, l'isòmer E és menys reactiu que el Z amb el diazocompost fosforilat 71, mentre que la reactivitat de tots dos isòmers amb diazometà és comparable. La diastereoselectivitat p-facial de la cicloaddició de 71 a l'èster 3 depèn de l'esteoquímica Z/E del doble enllaç. Per l'isòmer Z s'obté l'adducte sin amb un 94% e.d., mentre que per l'isòmer E la diastereoselectivitat p-facial és nul·la. D'altra banda, els càlculs teòrics prediuen que la cicloaddició del fosfinodiazometà 71 a l'olefina 3-E ha de ser menys diastereoselectiva que l'addició a l'isòmer Z.A nivell experimental s'observa una total estereoespecificitat de la fotòlisi de les D1-pirazolines. El mecanisme postulat a partir dels càlculs teòrics passa per una espècie intermèdia diradicalària que gaudeix de lliure rotació. L'origen de l'estereoespecificitat observada a nivell experimental, segons els càlculs teòrics, es troba en el fet que la rotació del diradical intermedi és més lenta que el col·lapse d'aquest diradical per donar l'anell de ciclopropà.La reacció d'addició de N-alquilihidroxilamines als èsters a,b-insaturats mitjançant un mecanisme concertat a través d'un estat de transició cíclic, és més favorable que un mecanisme per etapes, segons els càlculs teòrics, cosa que explicaria la gran estereoespecificitat observada a nivell experimental en aquest tipus de reaccions. Pel que fa a la diastereoselectivitat facial, els adductes sin són els majoritaris en els casos considerats, tant des d'un punt de vista teòric com experimental.Com a culminació dels estudis previs realitzats en aquesta tesi doctoral, que han permès exercir el control de la diastereoselectivitat en les reaccions de ciclopropanació, s'ha assolit la síntesi altament estereoselectiva de nous b-aminoàcids i nucleòsids ciclopropànics enantiopurs, compostos de gran interès des d'un punt de vista biològic. / Regarding cycloaddition reactions, we have done experimental studies and DFT theoretical calculations, to study the stereochemical outcome of the cycloaddition reaction of diazomethane and other phosphorilated diazoalcanes to chiral electron-deficient olefins prepared from D-glyceraldehyde acetonide, as well as the photochemical decomposition of the corresponding pyrazolines that leads to the cyclopropane compounds. Some of these cyclopropane derivatives have been used to synthesize interesting structures. We have also studied the p-facial diastereoselection and the stereospecificity of N-alkylhydroxylamines addition reaction to a,b-unsaturated esters derived from D-glyceraldehyde.A total syn diastereoselection has been observed for the 1,3-dipolar cycloaddition of diazomethane to different olefinic substrates derived from D-glyceraldehyde, independently of the Z/E stereochemistry of the substrate, the di- or tri-substitution or the nature of the conjugated functional groups of the double bond. Theoretical calculations show us that the origin of the p-facial diastereoselection in these cycloadditions is found in the chirality of the dixolane stereogenic center, as the most relevant feature determining the stereochemistry of the resulting adducts.Bis[(diisopropilamine)fosfine]diazomethane 71 is less reactive than diazomethane with a,b-unsaturated esters (S)-(Z) and (E)-3-(2',2'-dimethyl-1',3'-dioxolane-4-yl)-2-methyl propenoate (3-Z and 3-E). On the other hand, the E isomer is less reactive than the Z one with the phosphorilated diazocompound 71, while the reactivity of both isomers with diazomethane is comparable. Therefore, p-facial diastereoselectivity of the cycloaddition reaction of 71 to ester 3 is dependent on the Z/E stereochemistry of the double bond. Considering isomer Z, one obtains the sin cycloadduct with 94% d.e., while with the E isomer the diastereoselectivity is almost null. On the other hand, theoretical calculations predict less diastereoselectivity for the cycloaddition reaction of phosphinodiazomethane 71 to 3-E isomer, than for the Z one.In an experimental level, a total stereospecificity is observed for the photochemical decomposition of D1-pirazolines. Regarding theoretical calculations, a mechanism for this reaction has been postulated, which involves a diradical intermediate with free rotation. The origin of the experimentally observed stereospecificity is found in the fact that the rotation of the C2-C3 bond in the transient diradical is slower than the collapse of this biradical to yield the ciclopropane ring.Theoretical calculations indicate that the addition reaction of N-alkylhydroxylamines to a,b-unsaturated esters by means of a concerted mechanism through a cyclic transition state, is more favorable than a two-step process, and these results are in good agreement with the experimentally observed high stereospecificity. Regarding the p-facial diastereoselectivity, sin adducts are the major ones in all considered cases, experimentally and theoretically.As a culmination of the exposed studies in the present doctoral thesis, which allowed us to exert a total p-facial diastereoselection control of the cyclopropanation reactions, we have achieved the highly stereoselective synthesis of biologically interesting compounds such as new enantiopure b-amino acids and nucleosides.

Els nucleòsids poden ser modificats estructuralment amb l'objectiu de generar compostos farmacològicament actius en el tractament de tumors sòlids i malalties limfoproliferatives. Aquests fàrmacs són internalitzats a través dels transportadors de nucleòsids, pel que la dotació de transportadors en les cèl.lules tumorals pot determinar la seva acció citotòxica. En base a aquestes dades l'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat analitzar el paper dels transportadors de nucleòsids en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids, especialment en el tractament de malalties limfoproliferatives. La primera part de l'estudi va suposar la caracterització cinètica dels transportadors presents en la línia cel.lular derivada de leucèmia pro-limfocítica JVM-2, així com dels transportadors responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid fludarabina. Posteriorment, l'estudi es va estendre a la determinació dels nivells d'ARNm, proteïna i activitat dels transportadors de nucleòsids presents en cèl.lules de pacients de leucèmia limfàtica crònica. Paral.lelament, es va mesurar la seva sensibilitat a la fludarabina amb l'objectiu de determinar si existia algun tipus de correlació entre el transport i la citotoxicitat. Les dades obtingudes van demostrar que els nivells de proteïna d'hENT2 podien ser predictius de la sensibilitat a la fludarabina en la leucèmia limfàtica crònica. Per complementar els resultats obtinguts, es va realitzar un estudi equivalent amb línies cel.lulars derivades de limfoma de mantell, amb l'objectiu de comprovar el paper diferencial dels transportadors de nucleòsids equilibratius en la sensibilitat a anàlegs de nucleòsids en funció del tipus de malaltia i del fàrmac administrat. En aquest cas, va ser el transportador hENT1 el que es correlacionava amb la sensibilitat a la gemcitabina. Així doncs, atenent al paper que juguen els transportadors equilibratius en la sensibilitat a fàrmacs derivats de nucleòsids es va avaluar el paper del transportador hENT1 en la resposta transcripcional associada a la teràpia amb fluoropirimidines mitjançant la utilització de microarrays d'ADN. Com a model es va utilitzar la línia cel.lular derivada de tumor de mama MCF7, pel que inicialment es va realitzar una caracterització dels transportadors de nucleòsids presents en la línia, així com de les isoformes responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid 5'-desoxi-5-fluorouridina. L'avaluació del paper d'hENT1 es va realitzar mitjançant la inhibició farmacològica de la seva activitat amb NBTI. Els canvis d'expressió gènica obtinguts mitjançant els experiments de microarrays d'ADN van demostrar que la inhibició d'hENT1 bloqueja total o parcialment els canvis transcripcionals associats a l'acció del 5'-DFUR. Per tant, els resultats obtinguts demostren que els transportadors de nucleòsids equilibratius juguen un paper important en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids. / ROLE OF EQUILIBRATIVE NUCLEOSIDE TRANSPORTERS IN SENSITIVITY TO ANTINEOPLASIC DRUGSNucleoside-derivatives are currently used in the treatment of tumours and hematological malignancies. Although intracellular events involved in the pharmacological action of these compounds have been extensively studied, the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in cancer cells has not been comprehensively addressed. We examined the expression patterns and activity of nucleoside transporters in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) patients and correlated them with in vitro fludarabine cytotoxicity. Among the known plasma membrane transporters, we observed a significant correlation between fludarabine uptake via ENT carriers and ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. Moreover, western blot results suggested a role of hENT2 in fludarabine responsiveness in CLL patients. A similar study was performed using mantle cell lymphoma (MCL) cells. In this case we found a significant correlation between protein and mRNA levels of hENT1, drug uptake and sensitivity to gemcitabine. Finally, we addressed the question of whether equilibrative nucleoside transporters contribute to the transcriptomic response associated with nucleoside-derived drug therapy. For this reason, we used a pharmacogenomic approach to determine which are the intracellular targets of 5'-DFUR action in breast cancer cell line MCF7 and how inhibition of hENT1 function contributes to the transcriptomic response. The study identified selected gene targets of 5'-DFUR action in a breast cancer cell model, and highlighted the relevant role hENT1-mediated drug uptake plays in drug action. Therefore, the results obtained further support that equilibrative nucleoside transporters are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues.

Els transportadors de nucleòsids són fonamentals en la regulació de molts processos fisiològics, modulant els nivells extra- i intracel·lulars dels substrats que internalitzen però a la vegada representen el camí d'entrada de molts anàlegs citotòxics utilitzats en la quimioteràpia i teràpies antivirals. En aquesta tesi s'han dut a terme diversos estudis amb l'objectiu d'intentar determinar mecanismes implicats tant en la localització subcel·lular així com en la regulació dels transportadors de nucleòsids. Així, s'ha demostrat que les diferents isoformes de transportadors de nucleòsids es regulen de manera diferencial en funció dels requeriments de la cèl·lula. Concretament, els resultats obtinguts en un model cel·lular d'epiteli intestinal han demostrat que el transportador equilibratiu ENT1 és sensible a factors proliferatius i en canvi l'expressió i activitat dels transportadors concentratius CNT1 i CNT2 responen a factors que afavoreixen la diferenciació de les cèl·lules. Addicionalment, s'ha posat de manifest que l'activitat del transportador CNT2 està regulada a curt termini per la disponibilitat dels seus substrats mitjançant un mecanisme que no depèn de canvis en la localització subcel·lular del transportador sinó que implica una disminució de la seva afinitat. D'altre banda s'ha demostrat que per l'expressió polaritzada d'aquest transportador a la membrana apical de les cèl·lules epitelials absortives és necessària una seqüència de direccionament present en el extrem N-terminal de la proteïna. Finalment, els resultats obtinguts en aquesta tesi han posat de manifest que aquests transportadors, a més de ser necessaris per mantenir les vies de recuperació o salvage podrien jugar un paper en la senyalització cel·lular. Així el transportador d'alta afinitat d'adenosina CNT2, mitjançant una relació entre el transport d'adenosina i la regulació de l'AMPK, podria participar en la complexa regulació del metabolisme energètic. / Plasma membrane transporters play a crucial role in the function of absorptive epithelia, since they mediate intestinal absorption and renal reabsorption and the secretion of numerous physiological and pharmacological compounds. Among these transport systems, nucleoside transporters are responsible for the uptake of natural nucleosides and most nucleoside-derived drugs. There are two main families of nucleoside transporters, concentrative (CNT) and equilibrative (ENT) transporters and most mammalian cells, as epithelial intestinal cells, coexpress several nucleoside transporters isoforms. In the present study, we have fully characterized the expression pattern of nucleoside transporters in two intestinal epithelial cell lines, IEC-6 and Caco-2 cells. We have analysed the regulation of these membrane transporters in IEC-6 cells upon exposure either differentiating or proliferative agents. We conclude that differentiation of intestinal epithelial cells is accompanied by an increase mature enterocytes features, such concentrative nucleoside transport (located at the brush border membrane), thus preparing the cell for its ultimate absortive function. On the contrary, proliferative stimulus up-regulate the equilibrative nucleoside transporter ENT1, known to be located at the basolateral membrane, allowing the uptake of nucleoside from the bloodstream for the increase demands of the proliferating cell. However, nucleoside transporter may not only respond to the requirement for nucleoside salvage but may also but may also play a role in cell signaling. In fact, the study shows that physiological concentrations of adenosine activate AMPK through a mechanism that requires its transport into the cell and subsequent phosphorylation, resulting in phosphorylation of the downstream AMPK target ACC. This effect is mostly dependent on the high-affinity concentrative adenosine transporter CNT2. Thus, CNT2 may therefore be considered a novel player in the complex regulation of AMPK and energy metabolism.

La información disponible acerca de los transportadores de nucleósidos concentrativos en cerebro es muy limitada, mientras que existen varios estudios acerca de los transportadores equilibrativos. La primera parte de esta tesis se centra en la localización del transportador de nucleósidos concentrativo preferente por adenosina CNT2 en cerebro y su posible regulación transcripcional, ya que su afinidad por este neuromodulador es mayor que el resto de transportadores. Se ha visto que el transcrito de CNT2 se localiza en un gran número de regiones del sistema nervioso central, principalmente en poblaciones neuronales. En concreto, se han detectado niveles moderados del transcrito en hipocampo, amígdala, capas profundas de la corteza cerebral, corteza retrosplenial y piriforme, así como en la capa molecular del cerebelo. Estudios de regulación indican que el transcrito de esta proteína varía en situaciones donde la adenosina interviene vía el receptor de adenosina A1, por ejemplo, se han realizado estudos de privación de sueño prolongado donde los niveles de adenosina son muy elevados. Así mediante muestras de cortezas cerebrales de rata a las que se les tuvo en vigilia durante 24 horas, se valoraron los niveles de transcrito de CNT2, observando una disminución de hasta un 25% respecto al control. Tras ocho horas de recuperación los niveles iniciales sólo se recuperaban de forma parcial. También mediante modelos animales a los que se les había tratado con ácido kaínico para la inducción de convulsiones, los niveles del transportador aumentan a medida que pasa el tiempo tras el tratamiento. Esto sería consistente con el hecho de que la adenosina incrementa sus niveles en situaciones patológicas vía el receptor A1 en su función de neuroprotección.La segunda parte de esta tesis consiste en el estudio de la expresión de los transportadores de nucleósidos en tejidos tumorales. Para esto se han generado y desarrollado anticuerpos específicos contra las isoformas humanas de estas proteínas que se han utilizado en el análisis de un gran número de pacientes de tumores ginecológicos y de mama. Los resultados obtenidos nos indican que la pérdida de expresión de hCNT1 es más común que la de los transportadores equilibrativos en tumores ginecológicos y esta disminución se asocia a subtipos histológicos de peor pronóstico como pueden ser tumores de célula clara o adenocarcionomas. En tumores de mama, la expresión citoplasmática y sobre todo nuclear de hCNT1 se encuentra asociada a un por pronóstico, además de encontrar correlaciones positivas entre el número de células positivas para el transportador de nucleósidos hCNT1 y algunos marcadores del metabolismo de nucleótidos como DPD y TS, y correlaciones negativas con marcadores de baja proliferación celular como bcl2 y MIB. Si tenemos en cuenta el estado del nódulo linfático y lo asociamos al número de células positivas para hCNT1 observamos que estos dos factores combinados son indicativos de un mayor riesgo de recaída. / In this study, we analysed the concentrative transporter CNT2 in the rat brain and compared it with that of ENT1. Furthermore, we evaluated their changes in a situation of increased extracellular levels of adenosine, such as sleep deprivation. CNT2 mRNA was most prevalent in the amygdala, the hippocampus, specific neocortical regions and the cerebellum. Total sleep deprivation dramatically diminished the amounts of CNT2 mRNA, whereas ENT1 mRNA remained unchanged. This decrease in CNT2 transcript suggests a new physiological role for the transporter in the modulation of extracellular adenosine levels.In this part of the study we report the characterization of 2 new antibodies raised against hENT1 and hENT2. These 2 antisera, along with a previously characterized antibody against hCNT1 have been used to analyze NT expression in gynecologic cancers: hCNT1 was by far the isoform whose expression was most frequently reduced or lost in the types of gynecologic tumors analyzed. NT expression is related to the type of gynecologic tumor and its specific subtype, hCNT1 protein loss being highly correlated with poor prognosis histotypes. We also studied ninety breast cancer patients who were treated with CMF after surgery. hCNT1 and enzymes associated with nucleotide metabolism were assessed immunohistochemically. CNT1 expression was mostly cytoplasmic, with some nuclear staining.. Nuclear staining correlated negatively with decreased disease-free survival, whereas the percentage of hCNT1-positive cells correlated positively with reduced long term survival, the hCNT1-positive index being indicative of poor prognosis. A relative risk of relapse was associated with high hCNT1-positive indexes, whereas when this parameter was combined with the nodal status (positive) a high risk of relapse was found, suggesting that both parameters may reflect a poor prognosis.

La present Tesi tracta sobre el desenvolupament d’inhibidors d’integrasa (INIs) del VIH alternatius. Es va partir de la base existent a la literatura química sobre diverses substàncies quelatants d’ions divalents com a potencials inhibidors del procés de strand transfer catalitzat per la integrasa. Amb aquest concepte en mà, varem pensar que la unió de grups quelatants semblants, però no idèntics, als àcids 2,4-dioxocarbonílics a nucleobases o nucleòsids purínics i pirimidínics podrien millorar les propietats farmacocinètiques dels substrats, tot reduint-ne la toxicitat intrínseca d’alguns dicetoàcids. Al Capítol 1 de la Tesi es duen a terme rutes accessibles i segures cap a la síntesis de tetrazols substituïts mitjançant una reacció de cicloaddició-[3+2] entre azides orgàniques i cianurs d’acil en presència de Cu2(OTf)2. Al Capítol 2 es concentren els nostres esforços cap a la preparació de “dicetotetrazols” juntament amb la síntesi de derivats de timidines i AZT amb subestructures de “dicetotetrazols”. Al Capítol 3 es preparen estructures que contenen nucleòsids o nucleobases units a hidroxiquinolines (com a farmacòfors del tipus “dicetoàcids” o “dicetotetrazols”). Finalment, al Capítol 4, es descriuen les diferents rutes que s’han assajat per arribar a la obtenció de N-hidroxiderivats d’hipoxantina i inosines, així com N-hidroxiderivats de benzopirimidines. En aquest cas, el farmacòfor està relacionat amb el Raltegravir, que és l’únic INI aprovat fins la data per la FDA. / As the initial diketo acids, uncovered by Shionogi and Merck pharmaceutical companies around 2000 as integrase inhibitors, turned out to be toxic, other small molecules were early designed. An obvious replacement of the carboxyl group by its bioisoster tetrazole ring was envisaged by many groups. This posed the question of how to prepare these substrates safely and efficiently. A new method to synthesize 5-acetyl or 5-methoxycarbonyl derivatives of tetrazoles was envisaged in our lab taking advantage of the [3+2]-cycloaddition reaction of organic azides with acyl cyanides and alcoxycarbonyl cyanides (ROCO-CO-CN) in the presence of Cu2(OTf)2 as the catalyst of choice. We achieved to carry out these processes under very mild conditions as described in chapter 1. The most outstanding facts of the second topic may be summarized as follows: 5-acetyl-tetrazole (prepared as reported in topic 1) was linked to N3 of thymidine and of 3’-azido-3’-deoxythymidine (AZT), as model compounds of natural nucleosides and of nucleoside RT inhibitors (NRTIs), respectively, by condensation of the lithium salt of 5-acetyl-1-(4-methoxybenzyl)tetrazole, with nucleoside-derived oxo nitriles. Most of the original activity of AZT was retained. A route for the conjugation of potential NRTIs with pharmacophores of integrase inhibitors (INIs) was disclosed. In the third topic, which we examined in parallel with the preceding one, 8-hydroxy-quinolinecarboxylic acids were linked to position 5 of 5-iodo-2’-deoxy- uridines or 5-iodouracils through spacers that were generated by [3+2]-cycloaddition of TMS–C=C–Ura (where Ura means any uracil derivative), with azides, catalysed by Cu2(OTf)2. This is an example of a click reaction with a non-terminal triple bond, but it was shown that the cleavage of C–Si bond preceded the CuAAC reaction. In topic 4, N-hydroxybenzopyrimidine-2-carboxamides and N-hydroxyhypoxanthine-2-carboxamide with the amide nitrogen substituted by a 4-fluorobenzyl group, containing the essential pharmacophoric elements of HIV-1 integrase inhibitor Raltegravir, were synthesized by means of a sequence that involved a cyclization of amino-hydroxamates with methyl trimetoxiacetate. Other approaches were unsuccessful. Unfortunately, prototypes prepared to date are devoid of integrase inhibition and antiviral activity (IC50 and EC50 > 10 μM).