Pesquisas prévias evidenciaram que a desmineralização óssea com ácido cítrico melhora a consolidação de enxertos autógenos em bloco e favorece o espalhamento e a morfologia de pré-osteoblastos em cultura. Os resultados promissores encontrados com o ácido cítrico levantaram a suspeita de que a tetraciclina ácida pudesse suscitar efeitos semelhantes. Assim, este estudo se propôs a avaliar comparativamente o comportamento de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 cultivadas sobre superfícies ósseas de calvária de ratos desmineralizadas com tetraciclina ácida (50mg/mL) e com ácido cítrico (10%, pH1) em diferentes tempos de aplicação. Foram removidas 126 amostras ósseas bicorticais da calvária de 63 ratos Wistar adultos machos empregando broca trefina de 5 milímetros de diâmetro. As amostras foram distribuídas aleatoriamente em um dos seguintes grupos de estudo (n=18): AC 15 no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 15 segundos; AC 30, no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 30 segundos; AC 60, no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 60 segundos; TCN 15 no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 15 segundos; TCN 30, no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 30 segundos; TCN 60, no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 60 segundos e C, grupo controle formado por amostras não desmineralizadas. Os pré-osteoblastos foram cultivados sobre as amostras por 24, 48 e 72 horas (n= 6) para serem examinadas à microscopia eletrônica de varredura. Vinte e uma amostras coletadas de outros 11 animais foram distribuídas entre os mesmos grupos e analisadas com espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para análise da composição química superficial (n=3). A área de recobrimento superficial por células foi significantemente maior após 24 e 48 horas de cultura nos grupos AC15 (60,38% e 100% respectivamente), AC30 (99,32% e 100% respectivamente), AC60 (99,22% e 100% respectivamente), TCN15 (96,73% e 70,24% respectivamente) e TCN30 (64,72% e 57,40% respectivamente) do que nos grupos TCN60 (9,67% e 51,45% respectivamente) e C (5,99% e 31,83% respectivamente). Às 72 horas os grupos apresentaram recobrimento praticamente completo das superfícies ósseas por células, com exceção do grupo TCN60 (56,15%). As células apresentaram-se com morfologia compatível com em estágios mais avançados de diferenciação nos grupos que sofreram desmineralização do que no controle. As variações nas porcentagens anatômicas (A%) dos elementos C, O, Na, Mg, P e Ca foram insuficientes para justificar mudanças no comportamento celular. Concluiu-se que a desmineralização quer por ácido cítrico ou tetraciclina de superfícies ósseas são favoráveis para o crescimento e diferenciação de células pré-osteblásticas especialmente quando empregada conforme os grupos AC30 e TCN15. Os mecanismos por trás desses resultados ainda carecem de elucidação. / Previous researches have demonstrated that bone demineralisation by citric acid improves the consolidation of bone autografts and promotes spreading and morphology of pre-osteoblasts in culture. The promising results with citric acid raised the suspicion that tetracycline could elicit similar effects. Thus, the aim of this study was to comparatively evaluate the behavior of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cultured on bone surfaces of rat calvaria demineralized with tetracycline (50mg / ml) and citric acid (10%, pH1) at different times of application. 126 bicortical samples were removed from the calvarial bone of 63 adult male Wistar rats using trephine drill of 5 mm in diameter. Samples were randomly assigned to one of the following study groups (n = 18) AC 15 in which the samples were demineralized by citric acid for 15 seconds; AC 30, in which the samples were demineralized by citric acid for 30 seconds; AC 60 wherein the samples were demineralized by citric acid for 60 seconds; TCN 15 in which the samples were demineralized tetracycline for 15 seconds; TCN 30, in which the samples were demineralized tetracycline for 30 seconds; TCN 60 wherein the samples were demineralized tetracycline for 60 seconds, and C, control group of samples not demineralized. The pre-osteoblasts were cultured on the samples for 24, 48 and 72 hours (n = 6) to be examined in the scanning electron microscope. Twenty-one samples were collected from other 11 animals and were distributed among the same groups for analysis of the surface chemical composition by energy dispersive spectroscopy (EDS) (n = 3). The average percentage of the bone surfaces covered by cells was significantly higher after 24 and 48 hours of culture in groups AC15 (60.38% and 100% respectively), AC30 (99.32% and 100% respectively), AC60 (99.22% and 100% respectively) TCN15 (96.73% and 70.24% respectively) and TCN30 (64.72% and 57.40% respectively) than in groups TCN60 (9.67% and 51.45% respectively), and C (5.99% and 31.83% respectively). At 72 hours, all the groups presented almost complete covering of the surfaces by cells, with the exception of TCN60 group (56.15%). Cells presented with morphology compatible with more advanced stages of differentiation in groups undergone to demineralization than control. Variations in the anatomical percentages (A%) of the elements C, O, Na, Mg, Ca and P were insufficient to justify changes in cell behavior. The conclusion was that both demineralization of citric acid or tetracycline are favorable for the growth and differentiation of pre-osteoblasts especially when used according to AC30 and TCN15 groups. The mechanisms behind these results still need elucidation.

Orientador: Rita Cássia Menegati Dornelles / Banca: Márcio Mateus Beloti / Banca: Sandra Lia do Amaral / Resumo: Células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do estroma da medula óssea possuem potencial para se diferenciar in vivo e in vitro, em vários tipos celulares, incluindo osteoblastos e adipócitos. Durante o envelhecimento, há o maior número de células que se diferenciam espontaneamente em adipócitos, comprometendo a qualidade óssea, bem como perda da massa óssea decorrente do estilo de vida sedentário. Dentre fatores capazes de modular a diferenciação de CTMs em prol a formação óssea, sinais mecânicos estão sendo estudados como alternativa para o tratamento da osteoporose. Neste estudo, analisamos como o treinamento de força (TF) influencia a remodelação óssea durante o envelhecimento. Para isso, analisamos o potencial osteogênico de diferenciação de CTMs isoladas da medula óssea de ratas adultas (09 meses) e idosas (21 meses) que realizaram ou não o exercício físico com sobrecarga. Os resultados mostraram que o TF aumentou a expressão da proteína óssea morfogênica 2 (BMP2), regulando a diferenciação dos osteoblastos e formação óssea por promover up-regulation do fator de transcrição relacionado com o Runt 2 (Runx2) e down-regulation do fator de transcrição de adipócitos, receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (Pparγ) em CTMs diferenciadas de doadoras idosas. Além disso, os valores de densidade mineral óssea areal e os parâmetros biomecânicos na tíbia das ratas idosas foram otimizados após a realização do TF. Estes resultados sugerem que o aumento dos fatores de transcrição e proteínas de matriz, bem como o decréscimo de Pparγ, desencadeado pelo TF, contribui para a melhoria da qualidade do osso de ratas idosas treinadas / Abstract: In vivo and in vitro studies indicate that a subpopulation of bone marrow stromal cells derived mesenchymal stem cells (MSCs) has potential to differentiate into multiple cell types, including osteoblasts and adipocytes. During the aging, greater number of cells is able to differentiate spontaneously into adipocytes, committing bone quality, well as loss of bone mass due to the sedentary lifestyle. Among the factors capable of modulating differentiation of MSCs to promote bone formation mechanical signals are being studied as an alternative for the treatment of osteoporosis. In this study, we analyzed how the strength training (ST) participates in the bone remodeling during the aging. For this purpose, we analyzed the osteogenic potential of differentiation of MSCs isolated from the bone marrow of adult (09 months) and elderly (21 months) female rats that performed or not physical activity with overcharge. The results showed that the ST increased the bone morphogenic protein 2 (BMP2), regulated the osteoblast differentiation and bone formation for up-regulation of the osteogenic master transcription factor, Runt-related transcription factor 2 (Runx2) and the down-regulation of the adipocytes master transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor γ (Pparγ) in differentiated MSCs of the elderly donors. In addition, the values of areal bone mineral density and biomechanical parameters in the tibia of elderly rats were optimized after the realization of ST. These results suggest that increase of transcription factors and matrix proteins as well as the decrease of Pparγ, triggered by ST, contributes to better bone quality of trained elderly / Mestre

Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Gustavo Pompermaier Garlet / Banca: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: Células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas a partir da medula óssea são capazes de se diferenciarem, sobretudo, em condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Durante a osteogênese in vitro, alguns parâmetros são utilizados para caracterizar este processo, tais como atividade da fosfatase alcalina (FAL), mineralização e expressão de proteínas associadas à osteoblastos. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) são um modelo animal de hipertensão essencial humana e desenvolvem hipertensão após 4 semanas de idade. Esta linhagem apresenta alterações significativas no metabolismo ósseo. O objetivo do presente estudo foi investigar se, o genótipo hipertensivo poderia interferir na diferenciação osteoblástica das CTMs de ratos SHR e qual mecanismo está alterado quando comparadas com a linhagem progenitora, ratos Wistar. Para isso, nós obtivemos CTMs da medula óssea de ratos Wistar e SHR com 4 semanas de idade, sem a hipertensão estabelecida, afim de avaliar somente o possível efeito do genótipo hipertensivo na diferenciação osteogênica in vitro. Nós induzimos, ou não, a diferenciação osteogênica in vitro por meio da utilização dos indutores osteogênicos: ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametasona. Os resultados demonstraram que, CTMs indiferenciadas de SHR (SHRC) demonstraram taxa de proliferação aumentada em comparação a CTMs, na mesma condição, de Wistar (WC), e após a indução da osteogênica, a taxa de proliferação apresentou uma diminuição acentuada no grupo SHR (SHRMO) do que no grupo Wistar na mesma condição (WMO). Embora não fora observada diferença significativa na atividade da FAL entre SHRMO e WOM no 7° dia, a mineralização e a diferenciação osteoblástica foram menores no grupo SHRMO no mesmo período experimental. Os fatores de transcrição Osterix e β-catenina parecem estar envolvidos na diferenciação reduzida no grupo SHRMO... / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow are able to differentiate mainly into chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. During in vitro osteogenesis, some parameters are used to characterize this process, such as the activity of alkaline phosphatase (ALP), mineralization and osteoblast-associated proteins expression. Spontaneously hypertensive rats (SHR) is an animal model of human essential hypertension. This animals developing hypertension after 4 weeks of age. This strain shows significant changes in bone metabolism. The aim of this study was to investigate whether the hypertensive genotype could influence the osteoblastic differentiation of MSCs from SHR and which mechanism are altered when compared to the parental strain, Wistar rats. For that, we have obtained bone marrow MSCs from Wistar and SHR rats at 4 weeks of age, without hypertension established in order to evaluate only the possible effect of hypertensive genotype on osteogenic differentiation in vitro. We induced or non-osteogenic differentiation in vitro using osteogenic inducers: ascorbic acid, dexamethasone and β-glycerophosphate. The results demonstrate that undifferentiated MSCs SHR (SHRC) showed increased proliferation rate compared to MSCs, in the same condition Wistar (WC) and after osteogenic induction, proliferation rate showed a marked decrease in SHR (SHRMO) than in Wistar group in the same condition (WMO). Although it was not observed significant difference in ALP activity between WMO and SHRMO on day 7, mineralization and osteoblast differentiation were lower on group SHRMO in the same experimental period. The transcription factors Osterix and β-catenin appear to be involved in reduced differentiation in SHRMO group because they showed lower expression in this experimental group. Furthermore, the decreased... / Mestre

SILVA, J. S. P. Estudo das caracter?sticas f?sico-qu?micas e biol?gicas pela ades?o de osteoblastos em superf?cies de tit?nio modificadas pela nitreta??o em plasma. 2008. 119 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina, Universidade de S?o Paulo. S?o Paulo, 2008. / Submitted by CECILIA SANTOS (cecilia@bczm.ufrn.br) on 2010-09-29T13:32:45Z No. of bitstreams: 2 2008Tese_JSandroPS_Estudo.pdf: 2786183 bytes, checksum: a2ca1d8386a1a0d5d0c3befb46b1ed92 (MD5) license_rdf: 20464 bytes, checksum: d540d98f4c56c073d1d99228e27d53ca (MD5) / Approved for entry into archive by clediane guedes(clediane@bczm.ufrn.br) on 2010-09-29T18:15:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2008Tese_JSandroPS_Estudo.pdf: 2786183 bytes, checksum: a2ca1d8386a1a0d5d0c3befb46b1ed92 (MD5) license_rdf: 20464 bytes, checksum: d540d98f4c56c073d1d99228e27d53ca (MD5) / Made available in DSpace on 2010-09-29T18:15:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2008Tese_JSandroPS_Estudo.pdf: 2786183 bytes, checksum: a2ca1d8386a1a0d5d0c3befb46b1ed92 (MD5) license_rdf: 20464 bytes, checksum: d540d98f4c56c073d1d99228e27d53ca (MD5) / PURPOSE: The aim of this study was to evaluated the physico-chemical properties of different titanium surfaces modified by means of low temperature plasma nitridind on rat osteoblast cell adhesion and proliferation. METHODS: Pure Titanium discs grade II was submitted to three different surface preparations (polishing, glowglow discharge plasma nitriding in planar and cathodic cage configurations). Surface parameters as roughness, wettability and chemichal composition was determined to compare influency of gas mixture on the modified surface material properties. Cellular morphology was observed by scanning electron microscopy.To evaluate the effect of the surface on cellular response, osteoblast cells (MC3T3) adhesion and proliferation was quantified and data analised by Kruskal-Wallis and Friedman statistical tests. RESULTS: plasma nitriding discs shows rougher surfaces( p<0,02) in cathodic cage configuration andlower contact angle values. MC3T3 cells attached on rough surfaces produced by cathodic cage configuration was statistically significant p<0,05 compared to polished discs. CONCLUSIONS: Glow discharge plasma nitriding improve titanium surface roughness and wettability. MC3T3 cell adhesion behavior is related to substrate chemical composition and topography. Resumo: INTRODU??O: Superf?cies de tit?nio modificadas por diferentes m?todos foram estudadas com base nos par?metros f?sicos e qu?micos de caracteriza??o superficial e sua influ?ncia no comportamento de c?lulas pr?osteobl?sticas (MC3T3) in vitro. M?TODOS: Discos de tit?nio comercialmente puro grau II foram submetidos a tr?s m?todos de modifica??o de superf?cie (polimento, nitretados em plasma em configura??o planar e gaiola cat?dica). As diferentes superf?cies foram caracterizadas para observar o efeito do processamento na estrutura da camada superficial, na rugosidade e molhabilidade. Ensaios de ades?o e prolifera??o celular usando linhagens de c?lulas pr?-osteobl?sticas MC3T3 foram realizados para avaliar o efeito das novas superf?cies no comportamento celular in vitro. RESULTADOS: Os resultados demonstraram que a nitreta??o em plasma na configura??o de gaiola cat?dica produz superf?cies mais rugosas (p<0,02) e com menores ?ngulos de contato com a ?gua. CONCLUS?ES: A ades?o celular ? maior nas superf?cies mais rugosas do que nas superf?cies polidas (p<0,05) e reagem de modo diferente a composi??o qu?mica do substrato e ? topografia da superf?cie

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478687-Texto+Completo-0.pdf: 1432001 bytes, checksum: 2d6dc8303449f3f554bf97804d426795 (MD5) Previous issue date: 2016 / The liraglutide is a glucagon-like peptide 1 (GLP-1) based therapy and an alternative treatment to type 2 diabetes mellitus (T2DM). Apart from its hypogliycemic effect, the drug has been also associated with the prevention of cardiovascular diseases, regulation of blood lipid and anti-inflammatory action. Reports indicate, however, that liraglutide can increase the risk of thyroid cancer and cause pancreatitis. Besides, studies demonstrated that some analogues of GLP-1 have a deleterious bone effect, while others demonstrated to be benefic to the bone. The aim of this study was to evaluate the effect in vitro of liraglutide in mouse pre-osteoblastic cells, MC3T3-E1. The results demonstrated that liraglutide significantly decreased the number of viable cells without inducing apoptosis. The mechanism of this effect is associated to the reactive oxygen species production (ROS), which resulted in an increase of cell autophagy. The decreased number of viable cells indicates therefore that liraglutide may affect the bone formation. / A liraglutida é uma terapia baseada no hormônio GLP-1 utilizada como tratamento alternativo para a diabetes mellitus tipo 2 (DM2). O medicamento, além do efeito hipoglicemiante, tem sido associado à prevenção de doenças cardiovasculares, diminuição dos lipídeos no sangue e à ação anti-inflamatória. Relatos indicam, porém, que a liraglutida pode aumentar o risco de câncer de tireoide e provocar pancreatite. Além disso, estudos demonstram que alguns análogos do GLP-1 têm efeito ósseo deletério, enquanto outros têm efeito benéfico. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da liraglutida sobre o crescimento de células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1). Os resultados têm demonstrado que a liraglutida diminuiu significativamente o número de células sem induzir a apoptose. O mecanismo deste efeito está associado à produção de espécies reativas de oxigênio, que resulta em um aumento da autofagia das células, indicando, desta forma, que pode afetar a formação óssea.

Orientador: Osvaldo Magro Filho / Coorientador: Gustavo Mendonça / Banca: Roberta Okamoto / Banca: Mariza Akemi Matsumoto / Banca: Daniela Baccelli Silveira Mendonça / Banca: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Resumo: Proposição: Este estudo teve como objetivo avaliar a modulação dos miRNAs que afetam o potencial osteogênico de CTMs em diferentes topografias de superfície de discos de vidro. Material e Métodos: Células tronco mesenquimais humanas foram plaqueadas nas diferentes superfícies e comparadas após 3, 7 e 14 dias para atividade de fosfatase alcalina, expressão de genes (Osteocalcina, Osteopontina, Sialo Proteína Óssea, Osterix, Runx2, BMP2 e ALP) e expressão de miRNAs. Microscopia eletrônica de varredura das superfícies com células foram obtidas para avaliação de adesão celular. Resultados: Atividade de fosfatase alcalina nas diferentes superfícies foi significantemente maior na superfície com nanotopografia. Do mesmo modo, a expressão de genes relacionados com osteoblastos foi mais elevada na superfície nano. Com 14 dias foi observado um aumento de 3.5 e 9 vezes para os genes Runx2 e Osterix, respectivamente. O gene da BMP2 e ALP também apresentou um aumento de 4 e 7 vezes comparado ao controle. Utilizando a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) onde todos os RNAs existentes foram sequenciados, um total de 123 miRNAs com diferença de expressão foram encontrados comparando a superfície controle (dia 7) com a superfície nano (dia 14). 48 miRNAs apresentaram uma redução na expressão e 75 apresentaram um aumento de expressão. Alguns destes apresentaram marcadores para genes osteogênicos já identificados, tais como hsa-miR-135b-5p marcador para OCN, BSP, Runx2, CO15A1 e OSX, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Purpose: This study aimed to evaluate the modulation of miRNAs that affect the osteogenic potential of MSCs in different surface topographies of glass disks. Material and Methods: Human mesenchymal stem cells (hMSCs) were plated on different surfaces of glass disks and compared at 3,7 and 14 days for alkaline phosphatase (ALP) activity, expression of genes (Osteocalcin, Osteopontin, Bone Sialo Protein, Osterix, Runx2, BMP2 and ALP) and expression of miRNAs. Scanning electron microscopy of surfaces with cells were obtained to analyse the attachment of cells. Results: ALP activity on different surfaces was significantly greater in the nanotopography surface. At day 14 there was a 3.5-fold and a 9-fold increase for Runx2 and Osterix gene, respectively. BMP2 and ALP also increased by 4- and 7-fold compared to control. Using RNA sequencing technology (RNA-Seq) a total of 123 miRNAs were found differently expressed comparing control (day 7) to nano surface (day 14). 48 miRNAs were downregulated and 75 were upregulated. Some of them regulated osteogenic genes such as hsa-miR-135b-5p that targets OCN, BSP, RUNX2, CO15A1 and OSX, hsa-miR-122-5p wich targets OPN, hsa-miR-196a-5p targets BMP4, hsa-miR-26b-5p that targets BMP2 and hsa-miR-148b-3p that targets OPN. Conclusion: Surfaces with nanotopography have the potential to improve osseointegration response in order to reduce the time of osseointegration and also increase the production of bone tissue around the implants improving low ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000422228-0.pdf: 2027786 bytes, checksum: fc45ed715786efb01f83f7fff755ceef (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Nowadays, the focus of many researches in Implant Dentistry is on the modification of the titanium surface in search of alternatives that can provide more quickness and quality to the osseointegration process. Osseointegration is a phenomenon that happens mainly through the interfacial response of bone cells in contact with the titanium surface. There are different treatment methods that can be used to modify the topographic and chemical properties of the titanium surface in order to optimize the tissue-implant reactions. In this study, we evaluated the influence of different titanium surface treatments in the adhesion and proliferation of human osteoblasts by quantitatively analyzing the number of adherent cells in different cell culture periods. Forty level II titanium disks with 15mm diameter and 1mm thickness were divided into four groups according to their surface characterization: G1. machined; G2. acid-etched; G3. with hydroxyapatite coating; and G4. with bisphosphonate immobilized on hydroxyapatite coating. Osteoblast cells derived from human osteosarcoma (SaOS-2) were cultured on the disks and the cell counting was made in 3, 7 and 14 days. To determine the number of cells, a coloring process of the nucleus using propide iodide was carried out and disks were then analyzed in an optical microscope under ultraviolet light. The cell counting in the different experimental groups and culture periods was compared using ANOVA complemented by Tukey’s test. Results of the statistical analysis made it possible to conclude that: (1) the titanium surface and the cell culture period, as well as the interaction of both, significantly affect the cell growth; (2) modifying the titanium surface by acid-etching favors the adhesion and proliferation of human osteoblasts, in vitro. Further researches are necessary to elucidate the immobilized bisphosphonate influence on the titanium surface at the initial osteogenesis events. / Atualmente, o foco de muitas pesquisas científicas em Implantodontia está voltado para a modificação da superfície do titânio na busca de alternativas que proporcionem maior rapidez e qualidade no processo de osseointegração. A osseointegração é um fenômeno que acontece fundamentalmente através da resposta interfacial das células ósseas em contato com a superfície do titânio. Diferentes métodos de tratamento podem ser utilizados para modificar as propriedades topográficas e químicas da superfície do titânio a fim de otimizar as reações tecido-implante. Neste estudo foi avaliada a influência de diferentes tratamentos de superfície do titânio na adesão e proliferação de osteoblastos humanos, através da análise quantitativa do número de células aderidas em diferentes períodos de cultura celular. Para isso, 40 discos de titânio grau II, comercialmente puro, de 15mm de diâmetro e 1mm de espessura, foram divididos em quatro grupos conforme a caracterização de sua superfície: G1. maquinada; G2. ácido-condicionada; G3. com cobertura de hidroxiapatita; e G4. com bisfosfonato imobilizado na cobertura de hidroxiapatita. Células osteoblásticas derivadas de osteossarcoma humano (SaOS-2) foram cultivadas sobre os discos e a contagem celular foi realizada em 3, 7 e 14 dias. Para determinação do número de células, um processo de coloração dos núcleos com Iodeto de Propídio foi realizado, e os discos foram analisados em microscópio óptico sob luz ultravioleta. As contagens celulares nos diferentes grupos experimentais e períodos de cultura foram comparadas por meio de ANOVA, complementado pelo teste de Tukey. Os resultados da análise estatística permitem concluir que: (1) a superfície do titânio e o período de cultura celular, bem como a interação de ambos, significativamente afetam o crescimento celular; (2) a modificação na superfície do titânio através de condicionamento ácido favorece, in vitro, a adesão e proliferação de osteoblastos humanos. Mais pesquisas são necessárias para elucidar a influência do bisfosfonato imobilizado na superfície do titânio nos eventos iniciais da osteogênese.

Dentre os vários compostos utilizados na pesquisa e na terapia de doenças osteo-degenerativas, a fototerapia com laseres de baixa potência (LLLT) e os diodos emissores de luz (LEDs) vem sendo investigada com o intuito de avaliar seus efeitos no metabolismo ósseo. Estes, que possuem comprimentos de ondas específicos, atuam na biomodulação das células, funcionando como um agente terapêutico, reequilibrando e normalizando a sua atividade. No entanto, pouco se sabe sobre o efeito dos diferentes espectros na proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos, bem como seus efeitos no metabolismo celular como a síntese e a ativação de proteínas sinalizadoras envolvidas nesses processos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar, comparativamente, a influência da fototerapia com LLLT e LED na proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos. Além disso, investigamos o envolvimento da ativação da via de sinalização ERK1,2 nestas respostas, utilizando o seu inibidor específico e/ou avaliando a sua ativação durante a proliferação e após fototerapia. Para esse estudo, osteoblastos humanos (HOAL) foram cultivados em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e incubados em estufa de CO2. As células foram irradiadas pontualmente com os laseres vermelho (660nm), infravermelho (780nm) e LED (637nm), nas doses de 10, 20 e 50 J/cm2 na potência de 40mW, após adesão celular. Após 24, 48, e 72 horas foram realizados os ensaios de redução do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- difeniltetrazólio) e cristal violeta (CV) para avaliar a viabilidade das células e após 72 horas foi realizada a análise da proliferação por citometria de fluxo nos quais os resultados sugerem aumento de células viáveis ou proliferação quando estimuladas pelos diferentes espectros. Após a verificação do efeito positivo dos laseres e LED na viabilidade e/ou proliferação, foi realizada a análise da ativação da proteína intracelular ERK por western blotting usando anticorpo específico após 10 minutos da irradiação pontual. Mostramos que a irradiação das células HOAL com LLLT, na dose de 10 J/cm2, aumentou significativamente a fosforilação da ERK1/2 em relação ao controle. Para os ensaios de diferenciação, as células receberam pontualmente o estimulo a cada 6 dias e após os períodos de 07, 14, 21 e 28 dias foram realizados os ensaios da atividade de fosfatase alcalina (ALP), expressão gênica do colágeno I (COL1A1) e SPARC (osteonectina) por RT-PCR em tempo real e ensaio de mineralização com vermelho de alizarina. De um modo geral, não foram observados diferenças na atividade da ALP entre os grupos tratados em relação ao controle. A expressão gênica do COL1A1 e SPARC foi aumentada, no qual o LED em ambas doses apresentou maior eficácia em aumentar a expressão desses genes. No que se refere à mineralização, foram observadas pequenas diferenças quanto a deposição de cálcio. Dessa forma, a LLLT e LED, nesse regime de aplicação modulou positivamente o metabolismo dos osteoblastos humanos em relação à viabilidade, porém, no processo de mineralização foram observadas poucas diferenças. / Among the various compounds used in research and bone degenerative diseases therapy, phototherapy with low level laser (LLLT) and light emitting diodes (LEDs) has been investigated in order to evaluate its effects on bone metabolism. Those, who have specific wavelengths, act in biomodulation cells functioning as a therapeutic agent, rebalancing and normalizing their activity. However, little is known about the effect of the different spectra in the proliferation and differentiation of human osteoblasts and their effects on cellular metabolism as well as the synthesis and activation of signaling proteins involved in these processes. Therefore, the aim of this study was to compare the influence of LLLT and LED phototherapy in the proliferation and differentiation of human osteoblasts. In addition, we investigated the involvement of activation of ERK1,2 signaling pathway these responses using its specific inhibitor and/or evaluating their activation during the proliferation and after phototherapy. For this study, human osteoblasts (HOAL) were cultured in DMEM culture medium supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) and incubated in CO2 incubator . Cells were irradiated with punctual red lasers (660nm), infrared (780nm) and LED (637nm) at doses of 10, 20 and 50 J/cm2 in power 40mW, after cell adhesion. After 24, 48, and 72 hours, MTT assay (- (4,5- dimethylthiazol-2- yl) -2,5 - diphenyltetrazolium bromide 3 ) and violet crystal (CV) were performed to assess the viability of cells and after 72 hours, was performed of proliferation analysis by flow cytometry. The results suggest an increase in viable and proliferation of cells when stimulated by different spectra. After checking the positive effect of lasers and LED viability and/or proliferation, analysis of ERK activation of intracellular protein by western blotting using a specific antibody was performed 10 minutes after the spot irradiation. We show that irradiation of HOAL cells with LLLT at a dose of 10 J/cm2, significantly increased the phosphorylation of ERK1/2 compared to control. For differentiation assays, cells promptly received stimulation every 6 days and after periods of 07, 14, 21 and 28 days testing the activity of alkaline phosphatase (ALP), gene expression of type I collagen (COL1A1) and SPARC (osteonectin) were performed by Real Time RT-PCR and mineralization experiment with alizarine red. In general, no differences in the activity of ALP between the treated groups compared to the control were observed. The gene expression was increased, and SPARC COL1A1, where in the LED in both doses showed greater effectiveness in increasing the expression of these genes. With respect to mineralization, small differences in the deposition of calcium were observed. Thus, LLLT and LED, this enforcement regime, positively modulated the metabolism of human osteoblasts during the cell viability, but in the process of mineralization few differences were observed.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Orientadores: Pedro Duarte Novaes, Marcelo Rocha Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:15:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcelos_DanielFernandoPereira_D.pdf: 3147772 bytes, checksum: f14ddeae900959b567ea4b605c927b8b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A administração intermitente de hormônio paratireóideo (PTH) é capaz de promover anabolismo ósseo, favorecendo a neoformação óssea em condições como osteoporose e reparo de fraturas. Sabendo-se que tanto os tecidos ósseos mandibulares e alveolares como os tecidos periodontais podem responder à administração de PTH de forma intermitente, o objetivo deste estudo foi avaliar histomorfometricamente o efeito da administração de PTH (1-34) em um modelo de defeito periodontal, do tipo fenestrado, na mandíbula de ratos. Foram utilizados neste estudo 32 ratos Wistar machos, com o objetivo de expor a região vestibular da raiz distal do primeiro molar inferior direito. A criação do defeito possibilitou a remoção parcial de ligamento periodontal e do cemento dentário. Após a cirurgia os animais foram separados aleatoriamente em 4 grupos (n=8): Grupo C14: administração intermitente (3 vezes por semana) do veículo de diluição do PTH por 14 dias; Grupo P14: administração intermitente de PTH (1-34) por 14 dias; Grupo C21: injeções intermitentes do veículo de diluição do PTH por 21 dias; Grupo P21: injeções intermitentes de PTH por 21 dias. Os animais foram mortos e preparados para avaliação histomorfométrica dos seguintes parâmetros: I - extensão inicial do defeito, II - extensão do defeito remanescente, III - área do defeito ósseo remanescente, IV - densidade do osso neoformado, V - área do calo formado e marcação para TRAP, VI - área do cemento neoformado, VII - análise do retardo óptico (birrefringência) do ligamento periodontal reinserido sobre a raiz operada. A análise intergrupo demonstrou que os defeitos tinham tamanhos similares inicialmente e que a administração de PTH reduziu significativamente (p<0,05) a extensão e a área do defeito remanescente. Além disso, o PTH aumentou significativamente (p<0,05) a densidade do osso neoformado, a área do calo, o número de osteoclastos presentes no calo formado, a área de cemento neoformado e a birrefringência do ligamento periodontal reinserido. Conclui-se que a administração intermitente de PTH (1-34), em modelo experimental de reparo em de ratos, pode influenciar positivamente o processo de reparação óssea e periodontal. / Abstract: The intermittent PTH administration is known to contribute to bone formation in cases of osteoporosis and bone fractures. Also, it has been reported to reduce periodontitis-related bone loss. The aim of this study was to evaluate the effect of anabolic PTH on periodontal repair and mandibular bone defect in rats. Fenestration defects were created unilaterally at the buccal surface of distal roots of lower first molars in Wistar rats (n=32), and both periodontal ligament and cementum were removed. Animals were then assigned to 4 groups (n=8): 1) C14 - placebo administration for 14 days; 2) P14 - PTH administration for 14 days; 3) C21 - placebo administration for 21 days; and 4) P21 - PTH administration for 21 days. All groups were treated intermittently (3 times a week). All animals were killed and prepared to histomorphometric analysis considering the following parameters: I - extension of the initial defect; II - extension of the remaining defect; III - area of the remaining defect; IV - density of neoformed bone; V - total callus area and staining for tartrate-resistant acidic phosphatase (TRAP); VI - area of the neoformed cementum; VII - polarized light microscopic analysis of root periodontal ligament reattachment. Intergroup analysis showed that the bone defects were initially similar in size (p>0.05). The intermittent PTH administration decreased (p<0.05) both extension and area of the remaining defect, and increased (p<0.05) the neoformed bone density and the total callus area. An increase in TRAP-positive cells was observed in the PTH treated groups (p<0.05). The area of the neoformed cementum and reattachment of the periodontal ligament were also observed to increase concerning PTH-treated groups (p<0.05). Data analysis suggests that the intermittent PTH administration might contribute to bone and periodontal repair in rats. / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental