A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença genética do tecido conjuntivo caracterizada por fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura sob mínimo ou nenhum trauma. O objetivo deste trabalho foi estudar características clínicas e moleculares de crianças e adultos com Osteogênese Imperfeita e analisar o efeito do tratamento medicamentoso com bifosfonados em relação aos biomarcadores metabólicos e ósseos em pacientes adultos. Esta tese se dividiu em dois capítulos onde 1) foi realizado um estudo retrospectivo sobre as características clínicas no momento do diagnóstico de OI, com ênfase nas características clínicas, especialmente em relação às fraturas ósseas; 2) avaliação clínica e análise da mutação c.-14C>T no gene IFITM5 foi estuda em uma população com características sugestivas de OI tipo V; e 3) estudo retrospectivo em adultos com OI divididos em 2 grupos tratados com bifosfonados e não tratados. Em relação ao tratamento com bifosfonados foram avaliados os seguintes parâmetros: tipo de droga e duração do tratamento, valores de biomarcadores metabólicos e ósseos por um período de 5 anos, incidência de fraturas num de período de 5 ou 10 anos e densidade mineral óssea da coluna lombar, quadril total e colo femural no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que 1) no momento do diagnósico de OI características como escleras azuladas, dentinogênese imperfeita, ossos wormianos e fraturas de membros inferiores e superiores podem ser observadas. Pacientes com formas mais graves de OI foram diagnosticados mais precocemente quando comparados com pacientes com formas leves. Nenhuma criança com OI apresentou fraturas posteromediais das costelas, fratura de escápula ou lesões metafisárias. Essas informações associadas a história da saúde da criança são relevantes para a realização do diagnóstico diferencial. 2) OI tipo V correspondeu a 4% dos casos de OI atendidos no Centro de Referência para OI do HCPA. Indivíduos com OI V associada a mutação c.-14C> T no gene IFITM5 apresentaram características clínicas distintas como formação de calo hiperplásico, calcificação das membranas interósseas, deslocamento da cabeça radial e deformidade de coluna, porém a expressão da doença é variável. 3) Observamos que o tratamento de adultos com OI a longo prazo não foi associado com redução na incidência das fraturas e não se refletiu de forma significativa nos níveis de biomarcadores metabólicos e ósseos, porém houve uma melhora significativa na densidade mineral óssea da coluna lombar associada à terapia. Por ser uma doença rara com prevalência variável e ampla variabilidade fenotípica e genotípica, estudos clínicos e moleculares bem como estudos sobre o efeito do tratamento medicamentoso são imprescindíveis, contribuindo no melhor entendimento da doença, aconselhamento genético acurado e propiciando melhores estratégias de prevenção e tratamento para esta população. / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic connective tissue disease characterized by bone fragility and susceptibility to fracture under minimal or no trauma. The aim of this study was to evaluate clinical and molecular features of children and adults with OI and analyze the effect of the drug treatment with bisphosphonates in regarding to metabolic and bone biomarkers in adult patients. This thesis was divided by two chapters: 1) a retrospective study was performed where the clinical characteristic at the moment of diagnosis of OI, the clinical characteristics specially related to bone fractures was evaluated; 2) clinical evaluation and mutation analysis of c.-14C>T in the IFITM5gene was studied in a population with clinical charcteristics suggestive of OI type V; and 3) retrospective study in adults with OI divided in two groups treated with biphosphonates and not treated. Bisphosphonate treatment was evaluated according to the parameters: type of drug and duration of treatment, metabolic and bone biomarkers values for a period of 5 years, incidence of fractures in a period of 5 or 10 years and bone mineral density of the lumbar spine, total hip and femoral neck at baseline and at the end of treatment. Our results showed that 1) at the time of OI diagnosis features such as bluish slerae, dentinogenis imperfecta, wormian bones, and fractures of upper and lower limbs can be observed. Patients with more severe forms of OI were diagnosed earlier when compared with patients with mild forms. No OI children presented posteromedial fractures of the ribs, scapula fracture or metaphyseal lesions. This information associated with the child's health history are relevant for carrying out the differential diagnosis. This information is relevant for carrying out the differential diagnosis. 2) OI type V corresponds to 4% of OI cases at the Reference Center for OI at HCPA. Subjects with OI V associated to the mutation c.-14C> T in the IFITM5 gene presented distinctives clinical features as hyperplastic callus formation, calcification of interosseous membranes, dislocation of the radial head and spinal deformity, but the expression of the disease is variable. 3) We observed that long-term treatment with bisphosphonates (BP) for adults with OI was not associated with reduced incidence of fractures and was not reflected significantly in the levels of metabolic and bone biomarkers, but there was a significant improvement in bone mineral density of the lumbar spine associated to the therapy. Because it is a rare disease with a prevalence variable and wide phenotypic and genotypic variability, clinical and molecular studies and studies of the effect of drug treatment are essential, contributing to the better understanding of the disease, accurate genetic counseling and providing better strategies for prevention and treatment for this population.

Although the relationship between bone formation and the immune / inflammatory response is extremely important for the bone repair process, such interaction remains poorly understood. While an exaggerated immune / inflammatory response is associated with bone resorption, an ideal transient response of low magnitude is essential in the process. In this context, signaling mediated by Toll receptors (TLRs) and RAGE receptors plays a key role in initiating the immune / inflammatory response through the recognition of molecular patterns associated with damage (DAMPs). One of the major DAMPs recognized by TLR4 and RAGE is the HMGB1 protein. Once activated by HMGB1, these receptors are able to generate several important inflammatory mediators in the process of alveolar bone repair. Nevertheless, the mechanisms of "trigger" of the production of cytokines and inflammatory mediators with respect to the bone repair, nor the amount necessary, are not clear. In view of this, we aimed to investigate the influence of the HMGB1 ligand on the generation of immune / inflammatory response and on the bone repair subsequent to the extraction of the superior incisor of mice. For this, 40 mice were divided into two groups [Control Group - WT; Group GLY - treated with glycyrrhizin (HMGB1 inhibitor)] and analyzed for alveolar bone repair in the periods of 0, 7, 14, 21 days after exodontia. Samples were submitted to histological processing and analyzed under optical microscopy for histomorphometric characterization (qualitative and quantitative), and analyzed by MicroCt for description of bone structures. In the histomorphometric analysis, the results showed a higher clot density in the GLY group in the 14-day period (p <0.05); As well as more inflammatory cells in the period of 7 and 14 days compared to the control (p <0.05). As well, it presented higher density of fibroblasts in the periods of 7, 14 and 21 days and lower density of fibers in 7 days (p <0.05). The GLY group had lower vessel densities in the periods of 7, 14 and 21 days. (P <0.05). The GLY group presented lower osteoblasts and higher osteoclasts compared to the control group at 7 and 14 days (p <0.05). Regarding the MicroCt, the images of both groups were performed and did not present significant difference between the groups. Therefore, inhibiton of HMGB1 protein was not able to interfere in the kinetics of alveolar bone repair in mice, but showed differences in some components involved in alveolar bone repair kinetics. / Embora a relação entre a formação óssea e a resposta imune/inflamatória mostre-se extremamente importante para o processo de reparo ósseo, tal interação permanece pouco compreendida. Enquanto uma resposta imune/inflamatória exacerbada está associada à reabsorção óssea, uma resposta ideal transitória de baixa magnitude é essencial no processo. Nesse contexto, a sinalização mediada por receptores tipo Toll (TLRs) e receptores RAGE desempenha um papel fundamental no inicio da resposta imune/inflamatória através do reconhecimento de padrões moleculares associados a danos (DAMPs). Um dos principais DAMPs reconhecidos pelo TLR4 e RAGE é a proteína HMGB1. Uma vez ativados por HMGB1, estes receptores são capazes de gerar diversos mediadores inflamatórios importantes no processo de reparo ósseo alveolar. Ainda assim, não são claros os mecanismos de “trigger” da produção de citocinas e mediadores inflamatórios com relação ao reparo ósseo, nem a quantidade necessária. Visto isso tivemos como objetivo investigar a influencia do ligante HMGB1 na geração de resposta imune/inflamatória e no reparo ósseo subseqüente à extração do incisivo superior de camundongos. Para isso, foram utilizados 40 camundongos divididos em dois grupos [Grupo controle- WT; Grupo GLY – tratado com glicirrizina (inibidor de HMGB1)] e analisados quanto ao reparo ósseo alveolar nos períodos de 0, 7, 14, 21 dias após exodontia. Amostras foram submetidas ao processamento histológico e foram analisadas ao microscópio óptico para caracterização histomorfométrica (qualitativa e quantitativa), e analisadas por MicroCt para descrição de estruturas ósseas. Na análise histomorfométrica, os resultados mostram maior densidade de coágulo no grupo GLY no período de 14 dias (p<0,05); como também mais células inflamatórias no período de 7 e 14 dias comparado ao controle (p<0,05). Como também, apresentou maior densidade de fibroblastos nos períodos de 7, 14 e 21 dias e menor densidade de fibras em 7 dias ( p<0,05). O grupo GLY apresentou menores densidades de vasos nos períodos de 7, 14 e 21 dias. (p<0,05). Apensar de não demonstrar diferença singnificativa na formação óssea, o grupo GLY apresentou menores quantidades de osteoblastos e maiores de osteoclastos comparado ao grupo controle nos tempos de 7 e 14 dias (p<0,05). Quanto ao MicroCt, as imagens de ambos os grupos foram realizadas e não apresentou diferença significativa entre os grupos. Portanto, a inibição da proteína HMGB1 não foi capaz de interferir na cinética de reparo ósseo alveolar em camundongos, mas apresentaram diferenças em alguns componentes participantes da cinética do reparo ósseo alveolar. / Lagarto, SE

Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro sobre diferentes nanotopografias de titânio (Ti) funcionalizadas com o fator de crescimento GDF-5. Células osteogênicas derivadas de calvária de ratos recém-nascidos foram plaqueadas e cultivadas por até 14 dias sobre superfícies de discos de Ti: 1) Controle (usinada e polida); 2) 30&prime; (com nanotopografia de nanoporos menores, obtida por condicionamento em solução de H2SO4/H2O2 por 30 min); 3) 30&prime;+GDF-5 (nanotopografia de 30&prime;, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL); 4) 4h (com nanotopografia de nanoporos maiores, obtida por condicionamento em H2SO4/H2O2 por 4 h); 5) 4h+GDF-5 (nanotopografia de 4h, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL). A adsorção de GDF-5 foi realizada a 4 ºC por 12 h no dia anterior ao plaqueamento das células. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para a viabilidade celular em 1, 3 e 7 dias. Em 3 dias, as células estavam aderidas e espraiadas sobre todas as superfícies e acúmulos extracelulares extensos de OPN foram encontrados apenas sobre superfícies com nanotopografia de 4h e de 30&prime;+GDF-5. A expressão de RNAm para RUNX2 e ALP foi maior em 7 dias se comparada a 10 dias, sendo os menores valores encontrados para o grupo 4h+GDF-5. A expressão de OPN aumentou de 7 para 10 dias, exceto para 30&prime;+GDF-5, que se manteve inalterada. Enquanto que os níveis de RNAm para BSP aumentaram de 7 para 10 dias no Controle, redução significativa foi observada para os demais grupos, exceto para 30&prime;, em que se manteve constante. Culturas crescidas sobre nanotopografias funcionalizadas com GDF-5 exibiram os maiores valores de atividade de ALP em 10 dias e de áreas de matriz mineralizada/acúmulos de cálcio em 14 dias. Em conclusão, a funcionalização de nanotopografias de Ti com GDF-5 pode acelerar e/ou aumentar a expressão do fenótipo osteogênico in vitro. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular responses at the biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the development of the osteogenic phenotype in vitro on titanium (Ti) surface nanotopographies functionalized with growth and differentiation factor-5 (GDF-5). Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn rat calvarial bone and grown for periods of up to 14 days on the following Ti disc surfaces: 1) Machined; 2) 30&prime; Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min; 3) 30&prime;+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C); 4) 4h Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h; 5) 4h+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C). At 4 h, nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited a significantly lower proportion of spread cells. At days 1, 3 and 7 no major differences in terms of cell viability were detected among groups. At day 3, epifluorescence revealed large extracellular OPN accumulation only for 30&prime;+GDF-5, 4h and 4h+GDF-5. Real time PCR analysis showed for GDF-5 groups: i) lower mRNA levels for RUNX2, ALP e BSP at day 10; ii) higher RUNX2 and ALP expression at day 7 compared with day 10, with the lowest levels for 4h+GDF-5; iii) increased OPN levels from day 7 to day 10, except for 30&prime;+GDF-5, which remained unaltered. Cultures grown on nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited significantly higher values for ALP activity at 10 days and enhanced mineralized matrix formation at day 14. In conclusion, surface functionalization of Ti nanotopographies with GDF-5 can accelerate and/or increase the expression of the osteogenic phenotype in vitro.

Introdução: Os pacientes com fissura labiopalatina, com deficiências maxilares muito severas, geralmente são tratados com avanço maxilar por meio da osteotomia tipo Le Fort I. Entretanto, a distração osteogênica com o distrator externo rígido (RED) pode funcionar como uma alternativa terapêutica para a correção da discrepância esquelética. Proposição: O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos do avanço maxilar por meio da distração osteogênica com distrator externo rígido (RED), associada à osteotomia tipo Le Fort I, em pacientes com fissura transforame unilateral ou bilateral, quanto à quantidade de avanço maxilar e à sua estabilidade a médio e longo prazo. Materiais e Métodos: Para a realização deste estudo longitudinal e retrospectivo, foram usadas telerradiografias em norma lateral de 9 pacientes (6 do gênero masculino e 3 do gênero feminino), onde 4 apresentaram fissura transforame unilateral e 5 apresentaram fissura transforame bilateral, submetidos ao avanço maxilar por meio da distração osteogênica com distrator externo rígido (RED). Foram estabelecidos três tempos de avaliação: fase pré-distração (T1), fase pós-distração imediata (T2) e fase pós-distração controle, com o mínimo de 1 ano após a finalização da distração (T3). A demarcação dos pontos cefalométricos e a obtenção das medidas das variáveis cefalométricas foram realizadas através do software Dolphin Imaging®, versão 11.5. Para a análise dos resultados, o teste estatístico ANOVA de medidas repetidas foi utilizado, adotando-se o nível de significância de 5%. Resultados: No início da distração, a idade média foi de 14 anos e 4 meses (idade mínima de 9 anos, e máxima de 21 anos). O período médio de distração foi de 18 dias, com uma média de ativação no distrator de 1,0mm/dia. O avanço médio da maxila medido em LVR-A, em T2, foi de 15,6mm (p<0,001), com recidiva não estatisticamente significante de 21,79% (p=0,102), em T3. O aumento médio de SNA, em T2, foi de 14,8º (p<0,001), com recidiva não estatisticamente significante de 18,90% (p=0,130), em T3. Os valores médios das medidas SN.GoMe, 1.PP e IMPA não apresentaram variação estatisticamente significante (p>0,05) entre T1, T2 e T3. Conclusão: A terapia de distração osteogênica para avanço maxilar com o RED mostrou ser eficiente, com aumentos significantes das medidas cefalométricas lineares e angulares relacionadas ao avanço maxilar, demonstrando efeito predominantemente esquelético, e estabilidade no período pós-distração médio (T3) de 1 ano e 8 meses. / Introduction: Patients with unilateral and bilateral cleft lip and palate, with significant maxillary hypoplasia are commonly treated with maxillary advancement by Le Fort I osteotomy. However, distraction osteogenesis with a rigid external distraction (RED) device can function as an alternative option for treatment of the skeletal discrepancy. Purpose: The aim of this study is to assess the effects of maxillary advancement by distraction osteogenesis using a rigid external distraction (RED) device, associated with the Le Fort I osteotomy in patients with unilateral or bilateral cleft lip and palate, as the amount of maxillary advancement and their stability in the medium and long term. Materials and Methods: To perform this retrospective longitudinal study, lateral cephalograms of 9 patients (6 males and 3 females) were used, where 4 had unilateral cleft lip and palate and 5 had bilateral cleft lip and palate, who underwent maxilla advancement by distraction osteogenesis with RED device. Three stages of evaluation were established: pre-distraction (T1), immediate post-distraction (T2) post-distraction control, with a minimum of 1 year after completion of distraction (T3). The anatomic landmarks and measurements of cephalometric variables were performed by using the Dolphin Imaging® version 11.5 software. To evaluate the results, the ANOVA test for repeated measures was used, adopting a significance level of 5%. Results: At the start of distraction, mean age was 14 years and 4 months (minimum age 9 years old and maximum of 21 years old). The mean distraction period was 18 days, with a mean rate of distractor activation in 1.0 mm / day. The mean maxillary advancement in LVR-A, at T2, was 15.6 mm (p<0.001), with no statistically significant relapse of 21.79% (p=0.102) at T3. The SNA angle increase, at T2, was 14.8º (p<0.001), with no statistically significant relapse of 18.90% (p=0.130), at T3. The mean values of SN.GoMe, IMPA and 1.PP measures showed no statistically significant variation (p>0.05) between T1, T2 and T3. Conclusion: The therapy of distraction osteogenesis for maxillary advancement with RED is efficient, with significant increases in the linear and angular cephalometric measurements related to the maxilla advancement, demonstrating predominantly skeletal effect and stability in mean post-distraction period (T3) of 1 year and 8 months.

As células-tronco são definidas como células capazes de auto-renovação e diferenciação em células especializadas. Dentre as células-tronco adultas, as mesenquimais ocupam uma posição de destaque. São células multipotentes que podem originar células de origem mesodérmica, como osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Além disso, vários estudos demonstraram que essas células também podem se diferenciar em células de origem extra-mesenquimal, como neurônios e hepatócitos, fenômeno este denominado plasticidade. Aspectos moleculares envolvidos com a plasticidade das células-tronco adultas, bem como durante o processo de comprometimento e diferenciação em células especializadas não estão completamente elucidados. Considera-se que as células-tronco expressam, embora em baixos níveis, uma gama diversa de genes relacionados aos diferentes destinos de diferenciação. Durante a diferenciação o repertório de genes expressos seria reduzido, acompanhado do aumento nos níveis de expressão de uma coleção menor de genes que orientariam a especialização celular. Para o presente estudo adotamos essa hipótese e elaboramos um sistema-modelo experimental no qual células-tronco mesenquimais de medula óssea humana foram induzidas in vitro à diferenciação em osteoblastos. As células-tronco mesenquimais foram obtidas de três doadores saudáveis de medula óssea e induzidas quimicamente à diferenciação em osteoblastos (meio -MEM acrescido de dexametasona, ácido ascórbico e - glicerofosfato) durante 24 h, 48 h, 7 dias e 21 dias. O RNA total foi extraído das culturas de células indiferenciadas (0h) e durante o processo de diferenciação (24 h, 48 h, 7 d e 21 d). Todo o processo de diferenciação foi monitorado com ensaios bioquímicos e por imunocitoquímica. Para avaliar a expressão gênica das célulastronco e durante o processo de diferenciação utilizamos a tecnologia dos cDNA microarrays. Os dados foram analisados com auxílio de programas de bioinformática especializados. Um banco público de dados de expressão gênica (GNF Symatlas) também foi consultado, o que nos auxiliou na interpretação dos dados. Sondas de cDNA fluorescentes (Cy3) oriundas das amostras de RNA foram hibridizadas com os cDNA microarrays (4.500 seqüências alvo). Um pool de cDNAs irrelevantes marcados com Cy5 foi usada como referência na hibridização. A expressão gênica diferencial durante a diferenciação foi analisada pelo método SAM (significance analysis of microarrays) (FDR < 5%). Os genes diferencialmente expressos foram classificados segundo sua representação tecidual de acordo com os valores de expressão obtidos do banco de dados GNF Symatlas. Além disso, foi avaliada por RT-PCR semiquantitativa, a expressão de genes relacionados à osteogênese (ALPL, osteocalcina, COL1A1, RUNX2 e osteopontina), e um marcador de adipócitos, PPARG. Observamos que as células-tronco mesenquimais no seu estado tronco expressam, em níveis similares, genes característicos das linhagens osteo e adipocítica. Entretanto, ao longo do comprometimento com a linhagem osteoblástica o número de genes modulados (reprimidos e induzidos) é crescente. Revelamos que nas fases iniciais da diferenciação osteoblástica in vitro os genes que representam células-tronco adultas foram reprimidos. Entretanto, com o avanço do comprometimento com a linhagem osteoblástica observamos que certos genes foram induzidos como, por exemplo, BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8, GDF10 e SCARB2, todos relacionados à osteogênese. Nossos resultados são importantes para um melhor entendimento das bases genético-moleculares associadas ao potencial plástico e de diferenciação das células-tronco mesenquimais. / Stem cells (SC) are defined by their property of self-renewal and differentiation into specialized cells. The adult mesenchymal stem cells (MSC) correspond to a special type of them. MSC are multipotent and can differentiate into several cell types of mesodermal origin, including osteoblasts, adipocytes and condroblasts. Also, their capacity to differentiate into extra-mesenchymal cells, such as neurons and hepatocytes, was demonstrated and this phenomenon was termed plasticity. Nevertheless, the molecular basis of adult SC plasticity, as well during their commitment and differentiation into specialized cells isnt completely elucidated. It was hypothesized that SC express, although at low levels, many genes related to the differentiation cues that they could assume. According to this hypothesis, the repertory of genes is reduced during differentiation, at the same time that upregulating the expression of specialized genes, which characterize the future tissue. In this study, we adopted this hypothesis and to test it we used an in vitro osteogenic differentiation model-system. Mesenchymal stem cells were obtained from bone marrow of three healthy donors and induced to differentiate into osteoblasts in -MEM media supplemented with dexametasone, ascorbic acid and betaglycerol phosphate during 24 h, 48 h, 7 and 21 days. The differentiation process was monitored by biochemical and immunocytochemistry assays. The total RNA was obtained from undifferentiated (0 h) and differentiated cells. To evaluate gene expression during the differentiation, we used the cDNA microarray technology. Fluorescent Cy3 cDNA probes originated from SC RNA samples were hybridized with a cDNA microarray containing 4,500 target sequences. A pool of irrelevant cDNA was labeled with Cy5 and used as reference. The differential gene expression during differentiation was analyzed by SAM (Significance Analysis of Microarrays) method (FDR < 5%). The public gene expression database (GNF Symatlas) was used to annotate the tissue representation of the modulated genes. The expression of some specific genes related to osteogenesis (ALPL, osteocalcin, COL1A1, RUNX2 e osteopontin) and an adipocyte marker (PPARG) was evaluated by semiquantitative RT-PCR. It was observed that MSC in their stem state express, at similar levels, representative genes of the osteo and adipocyte lineages. However, during the osteoblastic differentiation process the number of modulated genes (repressed or induced) increased. It was observed that at early in vitro osteoblastic differentiation, adult SC characteristics genes were downregulated. Conversely, the osteoblastic commitment of these cells displayed upregulation of specific genes related to bone formation (BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8, GDF10 and SCARB2). These results are important to provide a better understanding of the genetic and molecular basis of the plasticity and commitment phenomenon of adult MSC.

O laser de baixa potência é utilizado no tratamento odontológico visando diminuir o tempo do reparo ósseo. O osteoblasto quando diferenciado pouco prolifera, são as células precursoras que o fazem. Células precursoras de osteoblastos exercem um papel essencial nesse processo e o sucesso da formação óssea depende da sua adesão, proliferação celular e diferenciação osteoblástica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a capacidade de adesão, proliferação e síntese de proteínas (proteína total e fosfatase alcalina), expressão do fenótipo osteoblástico (BSP, COL, OC e RUNX2) e formação de matriz mineralizada em células osteoblásticas derivadas da sutura palatina mediana de ratos e submetidos à disjunção ortopédica maxilar e aplicação de laser de baixa intensidade As-Ga-Al (DMC®-Laser de aplicação pontual, com &lambda; = 830 &eta;m, 56 J/cm2). Após 24 horas, 48 horas e 7 dias da disjunção palatina e aplicação do laser de baixa potência, fragmentos ósseos da sutura palatina mediana foram submetidos à digestão enzimática para extração das células. As células foram cultivadas em garrafas T75 na presença de meio essencial mínimo suplementado com soro fetal bovino e substâncias que favorecem a diferenciação em osteoblastos: dexametasona, ácido ascórbico e &beta;-glicerol fosfato (MTS 10%). Após confluência na superfície da garrafa, um número estimado de células (2 x 104/poço) foi transportado para as placas de cultura, com 24 poços. Os grupos não irradiados serviram como controles. A avaliação da proliferação celular dos animais sacrificados após expansão rápida da maxila e aplicação do laser de baixa potência indicou que o grupo tratado com laser teve um aumento no número de células assim como na atividade de fosfatase alcalina, na expressão gênica e na mineralização em todos os períodos estudados. Portanto os resultados obtidos indicam que o laser de diodo As-Ga-Al estimulou a formação de células osteoblásticas. Podemos concluir com esses resultados que a radiação do laser diodo de As-Ga-Al estimula a expressão do fenótipo osteoblástico em células derivadas do osso alveolar de ratos após expansão rápida da maxila. / The low-power laser is used in dental treatment to reduce the time of bone healing. Differentiated osteoblasts have poor proliferation. It is rather done by osteoblast cell precursors. Precursor cells of osteoblasts exert a key role in the process of bone formation and its success depends on its adhesion, proliferation and differentiation. The objectives of this study were to evaluate the ability of adhesion, proliferation and synthesis of proteins (total protein and alkaline phosphatase) of osteoblastic cells derived from palatine suture median of rats that underwent orthopedic maxillary disjunction and application of low-intensity laser As- Ga-Al (DMC® Laser-off of application, with &lambda; = 830 &eta;m, 56 J/cm2), as well as the expression of the osteoblast phenotype (BSP, COL, OC and RUNX2) and the formation of mineralized matrix..After 24 hours, 48 hours and 7 days of the palate disjunction and application of the low-energy laser, bone fragments of the median palatine suture were submitted to enzyme digestion in order to extract the cells. The cells were grown in T75 bottles in the presence of minimum essential medium supplemented with fetal bovine serum and substances which favour the differentiation into osteoblasts: dexamethasone, ascorbic acid and &beta;-glycerol phosphate (10% MTS). After confluence on the surface of the cylinder, an estimated number of cells (2 x 104/poço) were transported to the culture plates with 24 wells. The non-irradiated groups served as controls. The assessment of cell proliferation in animals sacrificed after the rapid expansion of maxilla application of low-energy laser indicated that the group treated with laser had an increase in the number of cells as well as of the activity of alkaline phosphatase, gene expression and mineralization in all periods studied. Therefore, the results indicate that the laser diode of the As-Ga-Al stimulated formation of osteoblastic cells. We conclude that the radiation of the laser diode As-Ga-Al stimulates expression of osteoblast phenotype in cells derived from alveolar bone of rats after rapid expansion of the maxilla.

Tem sido sugerido que um adequado reparo ósseo pode ser obtido por biomateriais híbridos, produzidos pela combinação de células e materiais substitutos ósseos macroporosos. O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a aplicação do biomaterial híbrido formado pelo arcabouço de PLGA/CaP e células-tronco mesenquimais e osteoblastos derivados de medula óssea na engenharia de tecido ósseo. Para verificar qual o tamanho de poro deste arcabouço é mais adequado para este fim, foram realizados experimentos in vitro, que avaliaram a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e expressão quantitativa de genes marcadores do fenótipo osteoblástico em células cultivadas sobre os arcabouços; e in vivo, que avaliaram a formação óssea após implantação do arcabouço em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Também foi avaliado o efeito do tamanho dos poros sobre o carreamento celular através da força centrifuga. Para avaliar o efeito do soro fetal bovino, utilizado na suplementação do meio de cultura celular, na resposta tecidual in vivo, arcabouços expostos ao soro foram implantados em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. O efeito da retirada do soro fetal bovino do meio de cultura sobre osteoblastos foi analisado através da proliferação celular, atividade de ALP, conteúdo de proteína total e mineralização. Para avaliar o efeito do estágio de diferenciação celular sobre a formação óssea, células em diferentes estágios de diferenciação osteoblástica associadas ao arcabouço de PLGA/CaP foram implantadas de forma autóloga em defeitos ósseos críticos de calvária de ratos. Arcabouços com tamanhos de poros de aproximadamente 1000 µm promovem maior diferenciação osteoblástica e melhor carreamento celular, enquanto arcabouços com poros de aproximadamente 500 µm promovem maior formação óssea e vascular in vivo. O soro fetal bovino influenciou negativamente a resposta tecidual e a formação óssea. A retirada do soro fetal bovino do meio de cultura reduziu a proliferação celular e a atividade de ALP sem afetar o conteúdo de proteína total e a formação de matriz mineralizada. Células-tronco mesenquimais indiferenciadas e em fase inicial de diferenciação osteoblástica (7 dias) promoveram maior formação óssea, portanto permitiriam a obtenção de um biomaterial híbrido com maior potencial osteogênico. / It has been suggested that an adequate bone repair can be obtained by hybrid biomaterials, produced by combining osteoprogenitor cells and macroporous bone substitutes. The aim of this study was to evaluate the application of hybrid biomaterial formed by PLGA/CaP scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts in bone tissue engineering. The effect of scaffold pore size was evaluated in vitro assessing cell growth, alkaline phosphatase (ALP) activity, and quantitative gene expression of osteoblastic phenotype markers in osteoblasts cultured on scaffolds; and in vivo assesseing bone formation after implantation of scaffolds in critical size rat calvaria defects. It was also evaluated the effect of pore size on cell seeding by centrifugal force. To evaluate the effect of fetal calf serum used to supplement the cell culture medium on in vivo tissue response, scaffolds exposed to serum were implanted in critical size rat calvaria defects. The effect of withdrawal of fetal calf serum in the culture medium on osteoblasts was analyzed by cell growth, ALP activity, total protein content and mineralization. To evaluate the effect of cell differentiation stage on bone repair, cells either undifferentiated or in different stages of osteoblast differentiation associated with the PLGA/CaP were implanted autologously in critical size rat calvaria. Scaffolds with pore sizes of around 1000 µm would favor the osteoblast differentiation and display a better cell seeding, while the scaffolds with pore sizes of around 500 µm would favor increased bone and vascular formation. The fetal calf serum influenced negatively the in vivo tissue response and bone formation. The withdrawal of fetal calf serum in the culture medium reduced cell growth and ALP activity without affecting the total protein content and the formation of mineralized matrix Mesenchymal stem cells and osteoblats at the early stage of differentiation (7 days) promoted greater bone formation, therefore they would allow the obtention of a hybrid biomaterial with higher osteogenic potential.

O sucesso do tratamento com implantes osseointegráveis dependente do processo de reparo da ferida e do potencial osteogênico das células. Com o objetivo de aumentar a formação óssea na superfície dos implantes, vários tratamentos têm sido propostos, entre eles, a terapia com laser de baixa intensidade. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito do laser diodo de Arseneto-Gálio-Alumínio (AsGaAl) em culturas osteogênicas humanas crescidas sobre titânio. Após exposição das culturas, aos 3 e 7 dias, a uma dose de 3 J/cm2, foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) proliferação celular aos 10 e 14 dias; 2) atividade de fosfatase alcalina (ALP) em 10, 14 e 17 dias; 3) formação de matriz mineralizada em 17 dias; 4) imunolocalização de proteínas não-colágenas e do antígeno nuclear Ki-67 por fluorescência indireta em 8, 10, 14 e 17 dias; 5) expressão de genes relacionados ao desenvolvimento do fenótipo osteoblástico aos 14 dias. Os resultados dos ensaios de proliferação celular mostraram que a radiação laser aumentou a proliferação de 10 para 14 dias, mas tanto a atividade de ALP como a formação de matriz mineralizada aparentemente não foram afetadas. A análise das culturas por epifluorescência mostrou que as culturas controle e irradiadas apresentaram comportamento distintos. Aos 14 dias, foi demonstrado que a exposição à radiação laser, na dose utilizada, promoveu aumento na expressão relativa dos genes ALP, OC, BSP, BMP-7 e OPG e redução dos níveis de expressão de Runx2 e osteopontina, mas não afetou a expressão gênica de COL I, RANK-L e ICAM. As culturas irradiadas apresentaram áreas sem células após 24 h da última irradiação, que posteriormente foram repovoadas por células mais proliferativas e menos diferenciadas. Em conclusão, os resultados indicam que a radiação do laser diodo de AsGaAl estimula a expressão do fenótipo osteoblástico de culturas osteogênicas humanas crescidas sobre titânio. / The success of treatment with osseointegrated implants depends on wound healing and the osteogenic potential of cells. Aimed at increasing bone formation onto implant surfaces, several treatments have been proposed and low-intensity laser therapy is one of them. Thus, the purpose of this study was to investigate the effect of the Gallium-Aluminum-Arsenic (GaAlAr) diode laser on human osteogenic cultures grown on titanium. After irradiation of osteogenic cultures with 3 J/cm2 of GaAlAr laser at the days 3 and 7, the following parameters were evaluated: 1) cell proliferation at 10 and 14 days; 2) alkaline phosphatase activity (ALP) at 10 days; 3) mineralized matrix formation at day 17, 4) non-collagenous bone proteins and nuclear antigen Ki-67 immunolocalization by indirect fluorescence at 8, 10, 14 and 17 days; and 5) Expressions of a panel of genes related to osteoblastic phenotype at day 14. Apparently cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation were not significantly different between irradiated and control cultures in any period. Epifluorescence revealed that control and irradiated cultures had presented different behaviors. At 24 h after irradiation procedures, irradiated cultures displayed areas with no cells, which were repopulated later on by proliferative and apparently less-differentiated cells. Laser radiation increased relative gene expression of ALP, OC, BSP, BMP-7, and OPG; reduced the gene expression of Runx2 and OPN; and did not affect the expression of COL-1, RANK-L and ICAM. Altogether these results indicated that the GaAlAr laser stimulates the expression of osteoblastic phenotype of human osteogenic culture cells grown on titanium.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-06T13:33:40Z No. of bitstreams: 1 paulanascimentoalmeida.pdf: 3051854 bytes, checksum: c36b0671447013a9e1d5bde016a6ebe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T04:00:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paulanascimentoalmeida.pdf: 3051854 bytes, checksum: c36b0671447013a9e1d5bde016a6ebe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T04:00:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paulanascimentoalmeida.pdf: 3051854 bytes, checksum: c36b0671447013a9e1d5bde016a6ebe9 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Neurofibromatose Tipo 1 (NF1) é uma doença genética caracterizada por hiperpigmentação na pele (manchas ‘café com leite’) e neurofibromas, e também apresenta outras manifestações clínicas, dentre elas as anomalias ósseas, que atingem até 50% dos pacientes. Modelos animais como roedores e mesmo a Drosófila têm sido importantes na elucidação de mecanismos moleculares e celulares decorrentes da NF1, mas estes modelos apresentam limitações. Camundongos transgênicos homozigotos (NF1-/-) têm morte ainda no útero no 12o./14o dias de gestação, enquanto que camundongos heterozigotos (NF1+/-), embora viáveis, não desenvolvem neurofibromas e manchas ‘café com leite’ in vivo. Dessa forma, há a necessidade de desenvolvimento de novos modelos. As célulastronco são células indiferenciadas capazes de se autorrenovar e se diferenciar para uma linhagem celular específica. Elas podem ser classificadas de acordo com sua origem em dois tipos principais: embrionárias (CTEs) ou adultas (CTAs). O uso das CTAs em pesquisas visando à terapia celular e bioengenharia tecidual é importante e apresenta vantagens em comparação com as CTEs, uma vez que sua diferenciação é mais controlada e, quando introduzidas no organismo, dificilmente produz tumores. Dentre as células-tronco adultas, destacam-se as células-tronco da polpa dentária (CTPDs). As CTPDs apresentam um perfil molecular semelhante às células embrionárias humanas, possuem capacidade de se diferenciar espontaneamente sob condições de cultura apropriadas, além de terem origem pósnatal, tendo sido utilizadas para o estudo in vitro de diversas doenças. Propomos utilizar as CTPDs como um modelo de estudo in vitro também para a NF1. O objetivo do presente trabalho foi comparar as células-tronco da polpa de dente decíduo de um paciente com Neurofibromatose do Tipo 1, com células-tronco de polpa dentária de pessoas saudáveis, avaliando especificamente a taxa de proliferação e de senescência destas células, bem como a diferenciação osteogênica das mesmas, seguida de quantificação do cálcio. A análise da proliferação celular sugere que as CTPDs do paciente têm elevada taxa de proliferação em relação aos controles. A análise da senescência celular sugere que estas células entram em senescência de forma tardia quando comparadas às células controles. A análise conjunta da proliferação e senescência celular mostra que as CTPDs de um paciente NF1 já apresenta perfil tumoral. Isto pode nos ajudar a entender a formação de neurofibromas por toda a extensão corporal. Visando responder se as CTPDs são um excelente modelo de estudo in vitro, uma vez que o modelo animal apresenta limitações, foi realizada a diferenciação osteogênica com essas células e a quantificação de cálcio nas células NF1 diferenciadas. Os resultados obtidos sugerem uma baixa produção de cálcio pelas células NF1 quando comparadas com as células controle. A análise estatística revelou diferença significativa entre as amostras. Nossa conclusão mostra que as CTPDs são um excelente modelo para estudo in vitro de diversas doenças humanas em função do potencial que essas células apresentam. / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a genetic disorder characterized by hyperpigmentation of the skin (Café-au-lait spots) and neurofibromas and also has other clinical manifestations, among them the bone abnormalities, affecting up to 50% of patients. Animal models such as rodents and even Drosophila have been important in elucidating the molecular and cellular mechanisms resulting from NF1, but these models have limitations. Homozygous transgenic mice (NF1-/-) die in womb in 12º/14º days of gestation, whereas heterozygous mice (NF1 +/-), although viable and do not develop neither neurofibromas nor Café-au-lait spots in vivo. Thus, there is a need to develop new models. Stem cells are undifferentiated cells capable of self renew and differentiate into a specific cell lineage. They can be classified according to their origin into two main types: embryonic (ESCs) or adult (ASCs). The use of ASCs in research aiming at cell therapy and tissue bioengineer is important and provides advantages compared to ESCs, since their differentiation is more controlled and, when introduced into the body, is unlikely to produce tumors. Among the adult stem cells, we highlight the dental pulp stem cells (DPSCs). The DPSCs show a molecular profile similar to human embryonic cells, have the capacity to differentiate spontaneously under appropriate culture conditions, and have postnatal origin, being used to in vitro study of various diseases. We propose to use the DPSCs also as a model for in vitro NF1 study. The aim of this study is to compare the stem cells from the pulp of deciduous teeth of a patient with Neurofibromatosis Type 1, with dental pulp stem cells of healthy people, specifically evaluating the rate of proliferation and senescence of these cells, as well as osteogenic differentiation followed by calcium quantification. The analysis of cell proliferation suggests that the patient's DPSCs have a high proliferative rate relative to controls. The analysis of cellular senescence suggests that these cells enter in a delayed senescence compared to control cells. A pooled analysis of cellular proliferation and senescence shows that NF1 patient’s DPSCs already presents tumor profile. This can help us understand the formation of neurofibromas throughout the body extension. In order to answer whether the DPSCs are an excellent model for in vitro study, once the animal model has limitations, osteogenic differentiation and NF1 differentiated cells calcium quantification was performed. The results suggest low NF1 cells calcium production compared to control cells. Statistical analysis revealed significant differences between the samples. Our conclusion shows that DPSCs are an excellent model for in vitro study of several human diseases due to the potential that these cells present.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricia Costa.pdf: 508722 bytes, checksum: a02bd42feee52e02068566c6c8bdfd6e (MD5) Previous issue date: 2010-04-16 / The treatment of several affections of the musculoskeletal system with anti-inflammatory drugs is very frequent. However, the effects of such drugs on boné neoformation and osseointegration after fractures or bone surgeriesare not well understood yet. This study aimed at evaluating the effect of ketoprofen (NSAID) and dexamethasone (SAID) on osteogenesis around a dense hydroxiapatite (DHA) implant in the left tibia and left parietal bone, and on the femur bone resistance. Fifteen fifty-day-old Wistar rats (Rattus norvegicus albinus) weighing on average 250±30 g were used. The animals were separated into three groups (n=5): control (CT); non-steroidal anti-inflammatoryl (NSAID); and steroidal anti-inflammatory (SAID). After anesthesia with IM ketamine/xylazine, a 3 mm cavity was made in the left parietal bone and in the proximal epiphysis of the left tibia. A DHA bioceramic was implanted in the tibia. The periosteum and the skin were repositioned by suturing their borders. The animals were treated subcutaneously during 30 days as follows: NSAID group: ketoprofen at the dose of 12/Kg/day; SAID group: dexamethasone, 0,10 mg/kg/day. The CT group received saline through the same route. All the animals received the same solid diet and water ad libitum. The daily water and ration consumption were calculated to evaluate the animals nutritional conditions. After 30 days of experiment, the animals wereeuthanized, and their femurs collected for the mechanical test, while their tibia and parietal sites were prepared for the histomorphometrical analysis. The daily consumption of water and ration was satisfactory, showing neither dehydration nor protein undernourishment. Microscopically, the SAID and NSAID groups showed a lower volume of neoformed bone. In addition, the NSAID and SAID group femurs required lower maximum force for complete rupture when compared with the CT group. It was concluded that ketoprofen and dexamethasone interfered with osteogenesis and decreased bone resistance by altering the bone tissue metabolism, mainly by inhibiting the COX-2 and decreasing prostaglandins. Therefore, the use of ketoprofen and dexamethasone after boné surgeries can compromise the stability and maintenance of implants. / O tratamento de diversas afecções do sistema musculoesquelético com anti-inflamatórios é muito freqüente. Entretanto, os efeitos da utilização dessas drogas na neoformação óssea e osseointegração após fraturas ou cirurgias ósseas permanecem pouco esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do cetoprofeno (AINES) e da dexametasona (AIES) na osteogênese ao redor de implante de hidroxiapatita densa (HAD) na tíbia esquerda, no osso parietal esquerdo, e na resistência óssea do fêmur. Utilizaram-se 15 ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar), pesando em média 250±30 g, com 50 dias de idade. Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos (n=5): controle (CT), anti-inflamatório não esteroidal (AINES) e anti-inflamatório esteroidal (AIES). Após a anestesia com quetamina/xilazina IM, foi produzido no osso parietal esquerdo e na epífise proximal da tíbia esquerda uma cavidade de 3 mm. Na cavidade da tíbia foi implantada a biocerâmica hidroxiapatita densa. O periósteo e a pele foram reposicionados através da sutura de suas bordas. Os animais do grupo AINES foram submetidos ao tratamento com cetoprofeno na dose de 12 mg/Kg/dia, e os do grupo AIES receberam doses de 0,10 mg/kg/dia de dexametasona por via subcutânea durante 30 dias. Os animais do grupo CT receberam solução salina pela mesma via de administração. Todos os animais receberam a mesma dieta sólida e água ad libitum. Foram calculados os consumos diários de água e ração para avaliar o estado nutricional dos animais. Após 30 dias de experimento os animais sofreram eutanásia, os fêmures coletados, para teste mecânico, e os locais do implante das tíbias e o osso parietal, para análise histomorfométrica. O consumo diário de água e de ração foi satisfatório entre os grupos, mostrando não haver desnutrição protéica e desidratação. Microscopicamente observamos menor volume de osso neoformado nos animais dos grupos AINES e AIES. Além disso, os animais dos grupos AINES e AIES necessitam de menor força máxima para a ruptura completa dos fêmures quando comparados com o grupo CT. Concluímos que o cetoprofeno e a dexametasona interferiram na osteogênese e ao redor do implante de HAD e no osso parietal, e diminuiu a resistência óssea por alterar o metabolismo do tecido ósseo, principalmente pela inibição da COX2 e diminuição das prostaglandinas. Assim,o uso do cetoprofeno e da dexametasona pós-cirurgias ósseas pode comprometer a estabilidade e manutenção do implante.