Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2013-06-25T22:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 307869.pdf: 2942955 bytes, checksum: c02d78ab39a8ea822c0c2f236d2dc38e (MD5) / O objetivo do presente estudo foi investigar o papel do receptor B2 para as cininas na neuroinflamação induzida pelo peptídeo A?1-40 em camundongos. Há indícios de que o peptídeo A? tem um papel central na doença de Alzheimer e, de relevância para este trabalho, estudos recentes sugeriram o envolvimento do sistema calicreína-cininas na patofisiologia da doença em humanos, bem como sua contribuição em modelos experimentais desta doença. Para a realização dos experimentos, os animais foram pré-tratados com o antagonista seletivo do receptor B2, o HOE 140 (50 ?mol/sítio/ i.c.v.), 2 horas antes da injeção i.c.v do peptídeo A?1-40 (400 ?mol/sítio). Após 14 dias, os animais foram submetidos aos testes comportamentais e no dia seguinte (dia 15), os cérebros foram removidos para a realização da técnica de western blot. Ainda, o mesmo protocolo de tratamento foi seguido para a realização de coletas em tempos específicos (6h, 24h ou 8 dias) para a realização das análises de imunoistoquímica, nos tempos de expressão máximo da cada proteína. O pré-tratamento dos animais com HOE 140 preveniu o prejuízo cognitivo e o dano sinápico induzido pelo peptídeo A?1-40, avaliados através do teste de reconhecimento de objetos e pela expressão das proteínas sinápticas sinaptofisina e PSD-95, respectivamente. Além disso, o peptídeo A?1-40 induziu aumento na expressão do receptor B2 após 15 dias no hipocampo dos animais, e o bloqueio deste receptor com o HOE 140 preveniu esta alteração, sugerindo uma possível auto-regulação do receptor B2 pelo seu antagonista. Ainda, o processo inflamatório induzido pelo peptídeo A?1-40, evidenciado através do aumento da ativação microglial e do aumento na expressão das enzimas COX-2, iNOS e nNOS, foi prevenido pelo pré-tratamento com o HOE 140. Estes efeitos tóxicos iniciados pela administração de A?1-40 parecem ser mediados pela ativação de PKC (isoformas ? e ?) e, por conseguinte, das MAPKs p-38 e JNK, e dos fatores de transcrição NF?B e c-jun. Estes eventos parecem ser modulados pela ativação do receptor B2, uma vez que, o bloqueio deste receptor com o HOE 140 preveniu todas estas alterações induzidas pelo peptídeo A?1-40. Estes resultados, analisados em conjunto, fornecem evidências de que a toxicidade induzida por A?1-40 parece ser mediada pela ativação do receptor B2 e que o bloqueio deste receptor e das vias de sinalização por ele ativadas podem ser novos alvos para o tratamento do processo inflamatório característico na progressão da doença de Alzheimer. / The aim of this study was to investigate the role of the kinin B2 receptor in the A?-induced neuroinflammation in mice. There are recent evidences showing that the A? peptide has a central role in Alzheimer's disease. Relevantly, recent studies have suggested the involvement of the kallikrein-kinin system in the pathophysiology of Alzheimer's disease in both humans and experimental models. In this study, experimental procedures were carried out using Swiss mice pretreated with the selective B2 receptor antagonist, HOE 140 (50 ?mol/site, i.c.v.), given two hours prior the i.c.v. injection of A?1-40 peptide (400 ?mol/site). After 14 days, the animals were subjected to behavioral tests, and on day 15 the brains were removed to perform Western blot analysis. In addition, the same treatment protocol was used to carry out tissue collections, at specific time points (6h, 24h or 8 days), in order to perform immunohistochemical analysis. These time point were chosen based on the maximum expression level of each protein. The pretreatment of animals with HOE 140 prevented the cognitive impairment and synaptic injury induced by A?1-40 peptide, assessed using object recognition task and through evaluation of the expression of synaptic proteins, (synaptophysin and PSD-95), respectively. Furthermore, A?1-40 peptide increased B2 receptor expression, in the mice hippocampus after 15 days, and the pharmacological blockage of this receptor (with HOE 140) prevented this alteration, suggesting a possible auto-regulation mechanism for B2 receptor expression. Also, the A?1-40-induced inflammatory process was evidenced by increased microglial activation and increased expression of COX-2, iNOS and nNOS. All these alterations were prevented by the pretreatment with HOE 140. The toxic effects induced by A?1-40 administration seems to be mediated by activation of PKC (? and ? isoforms), which leads to the activation of p-38 MAPKs and JNK, and transcription factors NF?B and c-Jun. These events seems to be modulated by activation of B2 receptor, since blocking this receptor with HOE 140 prevented all these changes. These results, taken together, provide evidence that the A?-induced toxicity might be mediated by B2 receptor activation. Thus, the blockage of B2 receptor, and signaling pathways activated by it, might constitute new attractive targets for the treatment of the inflammation associated with of Alzheimer's disease progression.

O peptídeo liberador da gastrina (GRP) está estabelecido como um fator de crescimento celular no câncer. Os fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação das células neoplásicas e progressão do câncer, estando envolvidos na invasão local, angiogênese, metástases à distância e apoptose. A super-expressão de receptores para fatores de crescimento em células malignas é geralmente um marcador de agressividade e está associada a um prognóstico reservado. Na busca por novas estratégias no tratamento do câncer, muitos esforços têm sido feitos para se identificar quais são esses receptores e desenvolver terapias dirigidas contra eles, explorando a especificidade molecular. O GRPR já foi identificado em diversas neoplasias humanas, mas até o presente momento não há nenhum dado na literatura quanto a sua expressão no carcinoma hepatocelular (HCC). Considerando que esta neoplasia é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, objetivamos avaliar, nesse estudo, o perfil de expressão de GRPR em lesões neoplásicas malignas do fígado. Através da técnica de imunoistoquímica, lesões hepatocelulares malignas de 61 pacientes foram selecionadas do arquivo de patologia do HCPA, entre o período de janeiro de 2004 a março de 2009 e avaliados quanto à expressão de GRPR. O receptor foi detectado em 77% das amostras tumorais, na maioria das vezes exibindo padrão de coloração difuso; moderado ou forte (57.4%). Os GRPRs foram, também, intensamente expressos em lesões hepatocelulares cirróticas adjacentes às malignas (48.4%), entretanto, no tecido hepático normal (não-neoplásico e não-cirrótico) os GRPRs foram fracos e moderadamente expressos (36 a 59% respectivamente). A expressão do GRPR mostrou-se significativamente associada com o estagio do tumor (p= 0.047), mas não houve relação com os parâmetros clínico-patológicos (idade, gênero, presença de infecção viral, de cirrose, tamanho do tumor e nível de AFP). Entretanto, a estratificação dos pacientes, baseada na expressão do GRPR, revelou que os pacientes, que tiveram uma alta expressão do GRPR, tenderam a apresentar a sobrevida global e a sobrevida livre de doença menor (p= 0.174). Esse estudo demonstrou, pela primeira vez, a expressão aberrante de GRPRs no HCC em seres humanos. / Gastrin-releasing peptide (GRP) is already established as a growth factor in cancer. Growth factors are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. Furthermore, the overexpression of growth factor receptors on the cell surface of malignant cells might be associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. Searching for new strategies for cancer treatment, much effort has been done to identify these receptors and to develop targeted therapies exploring their molecular specificity. The GRPR has been identified in many human malignancies, but to date, no information regarding its expression in hepatocellular cancer (HCC) was found in the literature. Considering that HCC is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in neoplasic hepatocelular lesions. Sections of paraffin-embedded hepatocelluar carcinomas and cirrhotic surrounding tissues from 61 patients with primary HCC were studied, as well as 22 samples from non-cirrhotic and non-neoplastic hepatic tissue. GRPR immune-expression was demonstrated in the parenchymal tumor cells in 77% of tumor tissue samples (47/61) and was moderately to strongly expressed in 57.4% of these cases. In the surrounding cirrhotic liver, GRP immunostaining was also observed, showing a high expression in 15/31 of cases (48.4%). In the normal hepatic tissue, GRPR was also expressed, mostly with a weak to moderate expression (36.4 and 59.1, respectively). GRPR expression was significantly associated with tumor stage (P=0.047), but no correlation was observed with other clinicopathologic parameters (age, gender, virus, liver cirrhosis, tumor size, and AFP level). Moreover, stratification of patients based on tumor GRPR expression revealed that the patients who had a high expression of GRPR tended to have a shorter overall survival (OS) time and a significantly shorter disease-free survival (DFS) time.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-29Bitstream added on 2014-11-10T11:58:48Z : No. of bitstreams: 1 000773281_20150701.pdf: 797370 bytes, checksum: 434b28b11c8cac6876c6e828292d965f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-07-01T11:47:24Z: 000773281_20150701.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-01T11:48:07Z : No. of bitstreams: 1 000773281.pdf: 6334511 bytes, checksum: ac228b59d3dede16f09efc26274c2ef6 (MD5) / O sistema toxina-antitoxina ParE-ParD é um sistema bacteriano de morte póssegregacional codificado numa ampla gama de hospedeiros. ParE é uma proteína pequena, de aproximadamente 12 kDa codificada pelo gene parE. ParD é uma antitoxina de cerca de 9 kDa, codificada pelo gene parD, capaz de complexar com ParE e neutralizá-la. Estudos têm mostrado o envolvimento da enzima DNA girase no processo de morte celular pela ParE, entretanto, não se tem disponível na literatura nenhuma evidência de inibição desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV. Embora encontrada numa ampla diversidade de microorganismos, ParE não possui função celular totalmente elucidada e seu mecanismo de citotoxicidade permanece ainda desconhecido. Com base na estrutura primária da proteína ParE de E. coli e nos escassos dados disponíveis para esta toxina, peptídeos miméticos foram racionalmente projetados visando compreender o mecanismo de inibição de ParE sobre a atividade da DNA girase, bem como, avaliar a ação destes miméticos na atividade da Topoisomerase IV e da Topo II humana. Estas sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. A capacidade de inibição destes peptídeos miméticos sobre a atividade das topoisomerases foi testada por ensaios de eletroforese em gel. Os peptídeos que apresentaram melhores resultados de inibição sobre a atividade das topoisomerases foram o ParERM3 e o ParEC3, projetados para conter os resíduos de aminoácidos L61-R100 e L69-R100, respectivamente, presentes na porção C-terminal da estrutura da proteína ParE de Escherichia coli. A sequência “LNIES” (L101 a S105), quando presente nos peptídeos miméticos atenuou a toxicidade dos mesmos frente às topoisomerases, provavelmente por interferir na interação peptídeo-topoisomerase. Embora não existam... / The toxin-antitoxin system ParE-ParD is a bacterial system of post-segregational death encoded in a wide range of hosts. ParE is a small protein of approximately 12 kDa encoded by parE gene. ParD is an antitoxin about 9 kDa, encoded by the parD gene, able of complexing with ParE and neutralize it. Studies have shown the involvement of the enzyme DNA gyrase in the cell death process by ParE, however, is not available in the literature any evidence of inhibition of this protein on the activity of topoisomerase IV. Although found in a wide variety of micro-organisms, the ParE function has not been fully elucidated and its cytotoxic mechanism remains unknown. Based on the primary structure of the E. coli ParE and the limited data available for this toxin, mimetic peptides were rationally designed aiming at understanding the mechanism of inhibition of ParE on the activity of DNA gyrase, as well as on the topoisomerase IV and human topoisomerase II activities. These peptides sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. The ability of these mimetics to inhibit the activity of topoisomerases was tested by electrophoresis on agarose gel. The peptides that showed better results on the inhibition activity of topoisomerases were ParERM3 and ParEC3 , designed to contain the L61-R100 and L69-R100 amino acids sequence, respectively, found of the C-terminal portion of the ParE structure of Escherichia coli. The LNIES sequence (L101 to S105), when present in the mimetic peptides, attenuated the toxicity of the peptides on topoisomerases activity, probably by interfering in the topoisomerase - peptide interactions. Despite the absence of data in the literature regarding the toxicity of ParE protein on the topo IV and human topo II activities, the peptides ParERM3 and ParEC3 showed better inhibitory activity on these enzymes when compared...

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-22T10:27:56Z No. of bitstreams: 1 2017_JacquelineCoimbraGonçalvesMoser.pdf: 1159029 bytes, checksum: 49e731453f09cbb3f5cfea7b4d12a13c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-22T10:28:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JacquelineCoimbraGonçalvesMoser.pdf: 1159029 bytes, checksum: 49e731453f09cbb3f5cfea7b4d12a13c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T10:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JacquelineCoimbraGonçalvesMoser.pdf: 1159029 bytes, checksum: 49e731453f09cbb3f5cfea7b4d12a13c (MD5) Previous issue date: 2018-05-22 / Um dos grandes desafios da saúde pública atual é o tratamento de dores crônicas e/ou recorrentes, visto que em cerca de 50-70% dos casos, analgésicos sistêmicos e terapias conservadoras não são eficazes para o alivio da dor e podem causar graves efeitos adversos. Uma classe de peptídeos presente na peçonha de vespas tem despertado o interesse de diversos pesquisadores, pois demonstra grande potencial para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos, antitumorais e analgésicos. Esses peptídeos multifuncionais são chamados mastoparanos e, apesar de suas excelentes atividades in vitro e in situ, a administração sistêmica dessa classe de peptídeos tem induzido efeitos adversos, como citotoxicidade e neurotoxicidade. O propósito desta tese foi desenvolver uma nova molécula com propriedades antinociceptivas (NeuroVAL) a partir do mastoparano Agelaia – MP, com baixos efeitos adversos, além disso, estudar o mecanismo de ação do novo peptídeo. Quando administrado por via i.c.v., uma potente atividade antinociceptiva do NeuroVAL em camundongos Swiss foi observada, em dois modelos de indução de dor térmica (placa quente e retirada de cauda). Sua ação antinociceptiva foi inibida na presença de cloridrato de naloxona (4 mg/kg) e de toxina pertussis (0.25 μg/animal), indicando que a ação pode ser causada pela interação com receptores opióides. Quando testado in situ em vias neurais periféricas, foi observado que o NeuroVAL (1 mM) é capaz de reduzir aproximadamente 80% do potencial de ação composto do nervo ciático de rã, sendo esse efeito reversível após a lavagem do meio. Outra ação interessante é a capacidade de bloquear correntes de canais de sódio voltagem dependentes do tipo 1.7, de forma parcialmente reversível quando testado em ensaios eletrofisiológicos no patch clamp. Comparando-se os peptídeos Agelaia – MP e NeuroVAL quanto aos efeitos adversos, houve uma redução nos seguintes parâmetros avaliados: hemólise e alterações de comportamentos espontâneos, demonstrando a importância da síntese bioinspirada para o desenvolvimento de fármacos promissores. Muito se avançou no conhecimento da atividade neurofarmacológica dos mastoparanos e do NeuroVAL, embora ainda se faça necessário estudos com a determinação estrutural e as interações moleculares entre os peptídeos e os receptores alvo, dessa forma será possível conhecer mais sobre a dor, antinocicepção e seus mecanismos moleculares. / Currently, one of the major challenges faced by public health involves the treatment of chronic and / or recurrent pain, considering that in around 50-70% of the cases, systemic analgesics and conservative therapies are not effective for pain relief and can cause serious adverse effects. On this aspect, a class of peptides found in the venom of wasps has drawn the attention of several researchers, considering its potential for the development of new antimicrobial, antitumor and analgesic drugs. These multifunctional peptides are known as mastoparans, and even though they have shown excellent in vitro and in situ activity, systemic administration of this class of peptides has induced adverse effects such as cytotoxicity and neurotoxicity. Considering this, the purpose of this study was to develop a molecule (called Neuroval) obtained from mastoparan Agelaia - MP with antinociceptive properties and low intrinsic adverse effects. When administered via intracerebroventricular in Swiss mice, NeuroVAL showed potent antinociceptive activity, as tested in the two thermal pain induction models (hot plate and tail flick). NeuroVAL’s antinociceptive action was inhibited in the presence of naloxone hydrochloride (4 mg / kg) and pertussis toxin (0.25 μg / animal), indicating that its action may be caused by its interaction with opioid receptors. When tested in situ in peripheral neural pathways, it was observed that NeuroVAL (1 mM) is able to reduce approximately 80% of the action potential in frog's sciatic nerve, being a reversible effect after washing the medium. Another interesting effect was NeuroVAL’s ability to block type 1.7 voltage-dependent sodium channel, as seen in patch clamp electrophysiological tests. Comparing Agelaia-MP and NeuroVAL peptides adverse effects, it was evident that there was a reduction in the parameters evaluated: hemolysis and changes in spontaneous behaviors, suggesting the importance of bioguided synthesis of promising drugs. Great progress has been achieved in the understanding of neuropharmacological activity of mastoparans such as NeuroVAL, although new studies are still necessary to determine the structural and molecular interactions between peptides and target receptors, thus, permiting a better understanding about pain, antinociception and its molecular mechanisms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular. 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-14T15:56:45Z No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-15T11:52:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-15T11:52:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / A escassez de novas ferramentas para controle dos agentes microbianos responsáveis por infecções humanas consiste em um grande desafio nos dias atuais. Muitas pesquisas têm sido focadas na busca e caracterização de peptídeos antimicrobianos, categorizados como modelos promissores de novos fármacos antinfeciosos. Neste sentido as plantas constituem um amplo campo de descoberta para novos peptídeos, que podem ser usados como uma ferramenta para a produção biotecnológica de novos compostos. O peptídeo MBP-1 (Maize Basic Peptide), anteriormente relatado em sementes de milho, faz parte de uma classe de peptídeos antimicrobianos (hairpin-like) que tem chamado atenção devido a um novo tipo de enovelamento descrito, caracterizado pela presença de duas hélices conectadas entre si por duas pontes dissulfeto. Desta forma neste trabalho, o peptídeo MBP-1 foi sintetizado quimicamente e sua atividade antimicrobiana avaliada. O mesmo se apresentou efetivo contra as bactérias Gram-negativas patogênicas humanas Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, mas foi ineficiente contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, assim como contra o fungo Aspergillus fumigatus. O peptídeo apresentou ainda baixa atividade hemolítica nas concentrações testadas. Foram realizados testes com variantes sintéticos do MBP-1 que tiveram suas cisteínas ou triptofano substituídos por alanina a fim de melhor entender seu mecanismo de ação. Este teste demonstrou que a ausência de cisteínas ou triptofano diminui ou anula a atividade do peptídeo, evidenciando assim a importância destes resíduos para atividade. Ao relacionar as atividades de cada peptídeo com os modelos gerados por homologia, pode-se notar que a estabilização das porções terminais das α- hélices por uma ponte dissulfeto parece ser mais importante para atividade bactericida do que estabilizar o interior da molécula. Em geral, estes resultados são úteis para compreensão de algumas características necessárias a atividade do peptídeo MBP-1 e possivelmente dos peptídeos hairpin-like, contribuindo assim com aplicações futuras em ferramentas biotecnológicas que possam ser usadas no tratamento de infecções. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lack of novel tools for microbial agents control responsible for human infections consists of a great challenge today. Currently, many researches have been focused on the search and characterization of antimicrobial peptides, which have been classified as models for innovative promising anti-infective drugs. In this sense, the plants provide a wide contribution to the field of discovery for unusual peptides that can be used as tools for biotechnological products. The MBP-1 (Maize Basic Peptide), previously reported in corn, is part of a class of antimicrobial peptides (hairpin-like) that has drawn attention due to a new type of folding recently described, characterized by the presence of two -helices connected by two disulfide bonds. Thus, in this work, the MBP-1 was chemically synthesized and its functional characterization activity was further performed. The MBP-1 was active against Gram-negative human pathogenic E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa but was ineffective against the Gram-positive S. aureus, as well as against the fungus A. fumigatus. The peptide also presented low hemolytic activity at evaluated concentrations. Furthermore, bioassays were performed with MBP-1 synthetic variants that had their cysteines or tryptophan replaced by alanine, in order to better understand the peptide mechanism of action. Those assays demonstrated that the absence of cysteine or tryptophan reduces or suppresses the antimicrobial peptide activity, thus evidencing the importance of these residues for bactericidal activity. By linking the activities of each peptide with the three-dimensional models generated by homology modeling, it can be noted that the stabilization of the terminal portions of α-helices with a disulfide bond seems to be more important for bactericidal activity than to stabilize the interior of the molecule. In general, these results here presented could be useful for a better understanding of some features necessary for activity of MBP-1 and possibly for the hairpin-like peptides, thus contributing to future applications in biotechnology tools that could be used to treat infections.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T15:40:17Z No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T18:06:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T18:06:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / O presente trabalho avaliou as atividades antirretroviral e citotóxica de 9 peptídeos sintetizados a partir da análise transcritômica parcial de bibliotecas de cDNA obtidas das glândulas de peçonhas de diferentes espécies de escorpiões. Foram utilizados o Vírus da Imunodeficiência Símia/SIV e o HIV defectivo, em linhagens celulares humanas linfoblásticas, leucocitárias primárias e estabelecidas aderentes para a detecção de atividade antirretroviral, assim como citotóxica dos peptídeos sintéticos. Incluíram-se ensaios de viabilidade celular com azul de Tripan, citotoxicidade quantificando-se LDH e citometria de fluxo com detecção de Anexina/Iodeto de propídio. Os peptídeos escorpiônicos 1, 2, 4 e 6 reduziram a produção de SIV em células HUT-78 e 174X100, dentre os quais, os peptídeos 1 e 6 reduziram em 50% a viabilidade celular, em concentrações de 50 μM e 12,5 μM, respectivamente, tornando-os mais adequados aos ensaios. Em análises finais, o peptídeo 6 a 3,12 μM reduziu em 75% a produção viral em relação ao controle de células unicamente infectadas. Células HUT-78 tratadas com o peptídeo 6 e infectadas com SIV, unicamente produziram IL-8, enquanto que os leucócitos primários apresentaram níveis detectáveis de IFN-γ, IL-4, IL-6 e IL- 10. Em estudos de morfologia ultra-estrutural detectou-se o brotamento de virions de SIV unicamente em leucócitos primários infectados, enquanto que os tratados com o peptídeo 6 e AZT, infectados com SIV, não se detectou o brotamento viral. Observou-se lesões citoplasmáticas, extravasamento de material nuclear e acúmulo de cromatina na membrana perinuclear em leucócitos primários tratados com o peptídeo 6, compatível com os resultados obtidos por citometria de fluxo. Exclui-se a possiblidade de lise celular por destruição de membranas, visto que virions infectivos tratados em altas concentrações do peptídeo 6 não inibiram a infecção viral. Ensaios preliminares com células HeLa P4 previamente tratadas com o peptídeo 6 e transfectadas com plasmídeo pCHIV carreando o genoma defectivo de HIV, apresentaram redução da progênie viral quando comparada à produção de células transfectadas sem tratamento, células transfectadas e tratadas posteriormente com peptídeo 6 e tratadas com AZT. De modo geral, os experimentos de cultivo celular com o peptídeo 6 e posterior infecção viral, demonstraram que, nos intervalos iniciais, ocorre forte redução do número de células nas populações em tratamento, no entanto, após 96 horas as células proliferam, ultrapassando o número de células não tratadas, exercendo forte impacto quando avalia-se a interferência nos mecanismos de replicação viral, resultando na redução de progênie viral. Propõe-se que os mecanismos de proteção celular, em resposta à toxicidade do peptídeo 6, induz a expressão de citocinas, dosadas neste estudo e, muito provavelmente, fatores de restrição viral induzidos principalmente por IFN-γ, e modulados por IL-6, IL-10 e IL-4, ademais de outras citocinas e quimiocinas que não foram quantificadas neste estudo. / The present work evaluated the antiretroviral and cytotoxic activity of 9 synthetized peptides based on the transcriptome of the partial cDNA library of different Scorpions venenom glands. The Simian Immunodeficiency Virus/SIV and the defective HIV were utilized in human cell lineages, lymphoblastic cells, primary leucocytes and adherent cells, to screen for antiretroviral activity as also the peptides cytotoxicity. There were included assays for cell viability with trypan blue, citotoxicity quantifying LDH and flow citometry for detection of annexin/propidium iodide. The scorpionic peptides 1, 2, 4 and 6 reduced the SIV production in HUT-78 and 174XCEM cell lines, and among them, the peptides 1 and 6 reduced by 50 % the cell viability at 50 μM and 12,5 μM concentration, respectively, which was more suitable for the assays. In final analyses, the peptide 6 at 3,12 μM concentration reduced at 75 % the SIV production compared to untreated cells but infected. HUT-78 cells treated with peptide 6 and SIV infected solely produced IL-8 while the primary leucocytes displayed detectable levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10. In morphological ultrastructural studies it could be detected the budding of SIV virions exclusively in infected primary leucocytes, while among leucocytes treated with peptide 6, AZT and SIV infected, no virions budding were observed. Cytoplasmatic lesions, leaking of nuclear material and chromatin condensation in the perinuclear region were evident in leucocytes treated with peptide 6, which was compatible with the results obtained by flow cytometry analysis. It was excluded the possibility of cell lysis by membrane destruction, as infectious virions treated with high concentrations of peptide 6 did not inhibit viral infection. Preliminary assays with HeLa P4 cells previously treated with peptide 6 and transfected with the pCHIV plasmid carrying a defective HIV genome, showed viral progenie reduction when compared with the production of transfected cells without treatment, transfected cells subsequently treated with pepetide 6 and cells treated with AZT. In a general way, the cell culture experiments with peptide 6 and subsequent viral infection showed that, in the initial intervals, a strong cell number reduction occur, but after 96 hours the cells proliferate, outnumbering the untreated cells, exerting significative effect when evaluating the interference in the mechanisms of viral replication, which culminates in the reduction of viral progenie. It is proposed that the mechanisms of cell protection, in response to the peptide 6 toxicity, induce the expression of cytokines, quantified in this work and, very probably, viral restriction factors mainly triggered by IFN-γ, and modulated by IL-6, IL-10 e IL-4, besides other cytokines and chemokines that were not quantified here.

Uma série de derivados quirais (e.e. > 99%) foram sintetizados a partir do meso- exo-(3R,5S)-3,5-dihidróximetilenotriciclo[5,2.1.02,6]decano com altos rendimentos, usando catálise enzimática (lipases) em reações de transesterificação. A resolução do respectivo diéster racêmico através da hidrólise catalisada com esterase (PLE) não forneceu o monoéster opticamente enriquecido; enquanto que a dessimetrização do anidrido usando indutores quirais (quinina e quinidina) resultou no monoéster opticamente enriquecido (e.e.≅ 60%). O respectivo amino-álcool protegido foi preparado. Alguns análogos inéditos de peptídeos restritos incorporados do triciclodecano foram sintetizados.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-15T19:13:01Z No. of bitstreams: 1 2017_MaurícioGonçalvesdaCostaSousa.pdf: 3712664 bytes, checksum: 5241969273057f8bbafbab7a9b03bb79 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-18T16:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MaurícioGonçalvesdaCostaSousa.pdf: 3712664 bytes, checksum: 5241969273057f8bbafbab7a9b03bb79 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T16:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MaurícioGonçalvesdaCostaSousa.pdf: 3712664 bytes, checksum: 5241969273057f8bbafbab7a9b03bb79 (MD5) / Terapias regenerativas recentes como a revascularização pulpar vem ganhando espaço na endodontia em dentes permanentes imaturos. Porém o uso das medicações difundidas para técnica como a pasta dupla antibiótica (DAP) contendo metronidazol (MTZ) e ciprofloxaxino (CIP) ou tripla antibiótica (TAP) contendo CIP, MTZ e minociclina pode causar resistência, citotoxicidade e manchamento dentinário. Em contrapartida, peptídeos de defesa do hospedeiro (PDHs) podem apresentar atividade antimicrobiana e imunomodulatória, surgindo como uma opção para a revascularização pulpar. Desta forma, este estudo objetivou avaliar o potencial antimicrobiano e imunomodulador de peptideos sintéticos (DJK-6, IDR-1018, IDR-1002 e LL-37), comparados à TAP e DAP em um modelo de infecção endodôntica in vitro. O estudo foi dividido em 3 etapas: (1) avaliação do potencial antimicrobiano dos fármacos de TAP e DAP (sozinhos ou em combinação) e dos PDHs contra as bactérias Staphylococcus aures (S.a.) e Enterococcus faecalis (E.f.) e o potencial sinérgico do CIP juntamente com IDR-1002; (2) comparação das concentrações encontradas neste estudo com as concentrações clínicas de TAP e DAP, através da viabilidade celular por MTT e produção de óxido nítrico (NO) pela reação de Griess, em linhagem de macrófagos RAW 264.7 e fibroblastos L929; (3) avaliação imunomodulatória, pela produção das citocinas IL-1α, IL-6, IL-12 e IL-10 e fator de necrose tumoral (TNF-α), por ELISA, além do NO em RAW 264.7 (RAW) e da IL-6 e NO em L929, com ou sem o recombinante de interferon gama (rIFN-γ) e antígenos mortos pelo calor (heat killed - HK)-S.a. ou HK-E.f. Na primeira etapa, o CIP se apresentou como o melhor antimicrobiano presente nas pastas e o IDR-1002, como o melhor PDH. Ademais, a combinação entre CIP e IDR-1002 apresentou ação sinérgica. A viabilidade celular não foi reduzida por nenhum dos grupos e TAP estimulou a produção de NO em RAW. Finalmente o PDH LL-37 reduziu significamente a viabilidade de células L929 e TAP, a viabilidade de RAW. Na ausência de estímulos antigênicos, TAP e DAP apresentaram um perfil pró-inflamatório na ausência dos estímulos antigênicos, aumentando na produção de IL-1α, TNF-α e IL-6 em células RAW e IL-6 em L929. Na adição dos estímulos antigênicos e rIFN-γ, as pastas apresentaram um perfil pró e anti-inflamatório: TAP reduziu a produção de IL-1α, IL-12 e IL-6 em RAW e aumentou TNF-α e NO, e a DAP reduziu a produção de IL-1α, IL-10 e IL-6 em RAW e aumentou IL-12. CIP, LL-37, IDR-1002 e a combinação de CIP com IDR-1002 apresentaram um perfil anti-inflamatório, reduzindo principalmente IL-6 e IL-12 na presença dos estímulos antigênicos e rIFN-γ. Em suma, a combinação sinérgica de CIP com IDR-1002 foi eficaz contra ambas bactérias e apresentou um papel anti-inflamatório neste modelo de infecção in vitro, podendo surgir como uma opção promissora para aplicações biotecnológicas envolvendo a revascularização pulpar. / Recent regenerative therapies such as pulpal revascularization have been diffused in endodontics in immature permanent teeth. However, the use of medications such as double antibiotic paste (DAP) containing metronidazole (MTZ) and ciprofloxaxin (CIP) or triple antibiotic paste (TAP) containing CIP, MTZ and minocycline may cause resistance, cytotoxicity and dentin discoloration. On the other hand, host defense peptides (HDPs) have antimicrobial and immunomodulatory effects, emerging as an option for pulpal revascularization. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial and immunomodulatory potential of synthetic peptides (DJK-6, IDR-1018, IDR-1002 and LL-37) compared to TAP and DAP, in an in vitro endodontic infection model. For this, the study was divided in three stages: (1) antimicrobial potential of TAP and DAP drugs (alone or in combination) and HDPs against the bacteria Staphylococcus aures (S.a.) and Enterococcus faecalis (E.f.) and the synergistic potential of CIP and IDR-1002; (2) comparison of the findings of this study with TAP and DAP clinical concentrations, through cell viability by MTT and nitric oxide (NO) production by the Griess reaction, in RAW 264.7 macrophages and L929 fibroblasts; (3) immunomodulatory stage, by the evaluation of cytokines by ELISA: IL-1α, IL-6, IL-12, IL-10 and tumor necrosis factor (TNF-α), as well as NO in RAW 264.7 (RAW) and IL-6 and NO, in L929 with or without the recombinant interferon gamma (rIFN-γ) and heat killed antigens HK-S.a. or HK-E.f. In the first stage, CIP presented the best antimicrobial activity comparing to TAP and DAP containing antibiotics and IDR-1002, the best HDP. In addition, the combination between CIP and IDR-1002 was synergistic. The viability was not reduced by any groups and TAP stimulated NO production in RAW cells. Finally, LL-37 significantly reduced the viability of L929 and TAP, the RAW viability. Without any antigenic stimuli, TAP and DAP presented a pro-inflammatory profile up regulating IL-1α, TNF-α and IL-6 in RAW and IL-6, in L929. However, the addition of antigenic stimuli and rIFN-γ, TAP and DAP presented pro and anti-inflammatory profile reducing IL-1α, IL-12 and IL-6 in RAW and increasing TNF-α and NO, and reducing IL-1α, IL-10 and IL-6 in RAW and increasing IL-12. CIP, LL-37, IDR-1002 and the combination of CIP with IDR-1002 showed an anti-inflammatory profile, mainly reducing IL-6 and IL-12 with antigenic and rIFN-γ stimuli. In conclusion, the synergistic combination of CIP with IDR-1002 was effective against both bacteria and presented an anti-inflammatory role in this in vitro infection model may emerge as a promising option for biotechnological applications involving pulp revascularization.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-01-02T17:14:02Z No. of bitstreams: 1 2017_MichelGarciaMaciel.pdf: 1254032 bytes, checksum: 13e7a13f88290292e44b5aaeafad0cae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-03-02T20:14:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MichelGarciaMaciel.pdf: 1254032 bytes, checksum: 13e7a13f88290292e44b5aaeafad0cae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-02T20:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MichelGarciaMaciel.pdf: 1254032 bytes, checksum: 13e7a13f88290292e44b5aaeafad0cae (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Introdução: A obesidade é um dos principais problemas de saúde mundial e diversas são as doenças a ela associadas. A terapia com agonistas do receptor de GLP-1 (GLP-1R) vem ganhando grande importância clínica no tratamento da obesidade, por seus efeitos favoráveis sobre o metabolismo da glicose e sobre o peso corporal. A redução de peso é atribuída à ativação do GLP-1 hipotalâmico, que promove saciedade e redução da ingestão de energia. Dados de alguns estudos experimentais sugerem também a associação entre o uso de agonistas do GLP-1R e aumento do gasto energético. Objetivo: Analisar, por meio de revisão sistemática da literatura, o efeito do GLP-1 ou de agonistas do GLP-1R sobre o gasto energético. Métodos: Foi realizada busca nas bases de dados PubMed/MEDLINE, Science Direct e Web of Science, sem restrição de data ou idioma, de ensaios clínicos e estudos observacionais em humanos que analisaram os efeitos do uso do GLP-1 ou de agonistas do GLP-1R sobre o gasto energético, estruturada de acordo com recomendações do PRISMA e a estratégia PICOS. A qualidade metodológica dos estudos foi avaliada com a utilização da ferramenta Effective Public Health Practice Project. Resultados: Foram encontrados 1954 artigos e selecionados 26, dos quais apenas 18 preencheram os critérios de inclusão. Os artigos, em sua maioria (66,6%), foram publicados a partir de 2012, envolveram homens e mulheres eutróficos e com excesso de peso, com e sem diabetes mellitus tipo 2. Apenas 1 estudo incluiu sujeitos com obesidade secundária (obesidade hipotalâmica). Todos os estudos utilizaram a calorimetria indireta como método de avaliação do gasto energético. Não foi observado aumento do gasto energético em resposta ao tratamento com GLP-1 ou agonistas do GLP-1R na maioria dos estudos. Apenas 2 estudos foram considerados de qualidade metodológica baixa. Conclusão: Os dados da presente revisão sugerem que o GLP-1 e os agonistas sintéticos de seu receptor não promovem aumento do gasto energético em humanos, nos esquemas posológicos em que são utilizados. / Introduction: Obesity is one of the major global health problems and is associated with several diseases. Glucagon like peptide 1 (GLP-1)-based therapies have gained great importance in obesity given its favorable effects on glucose homeostasis and weight. Weight loss is attributed to the hypothalamic action of GLP-1 in promoting society and reduced energy intake. However, data from pre-clinical studies suggest that GLP-1R agonists may also increase energy expenditure. Aims: To analyze, through a systematic review of the literature, whether GLP-1 or GLP-1 receptor agonists affect energy expenditure in humans. Methods: PubMed / MEDLINE, Science Direct, and Web of Science databases were searched from inception to 4th July 2017, without language restriction for clinical trials and observational studies in humans that analyzed the effects of GLP-1 or GLP-1R agonists on energy expenditure, structured according to PRISMA recommendations and the PICOS strategy. The methodological quality was evaluated using the Effective Public Health Practice Project. Results: We found 1954 articles and selected 26, of which only 18 met all inclusion criteria. The majority of the studies were published after 2012 (66.6%), and included eutrophic or overweight men and women, with and without type 2 diabetes. Only 1 study investigated subjects with secondary obesity (hypothalamic obesity). All the studies used indirect calorimetry to evaluate energy expenditure and most studies found no effects of GLP-1 or GLP-1R on energy expediture. Only 2 studies were considered of low methodological quality. Conclusion: Data from the present review suggest that GLP-1 and GLP-1R agonists do not promote increased energy expenditure in humans at doses currently used.

O peptídeo liberador da gastrina (GRP) está estabelecido como um fator de crescimento celular no câncer. Os fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação das células neoplásicas e progressão do câncer, estando envolvidos na invasão local, angiogênese, metástases à distância e apoptose. A super-expressão de receptores para fatores de crescimento em células malignas é geralmente um marcador de agressividade e está associada a um prognóstico reservado. Na busca por novas estratégias no tratamento do câncer, muitos esforços têm sido feitos para se identificar quais são esses receptores e desenvolver terapias dirigidas contra eles, explorando a especificidade molecular. O GRPR já foi identificado em diversas neoplasias humanas, mas até o presente momento não há nenhum dado na literatura quanto a sua expressão no carcinoma hepatocelular (HCC). Considerando que esta neoplasia é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, objetivamos avaliar, nesse estudo, o perfil de expressão de GRPR em lesões neoplásicas malignas do fígado. Através da técnica de imunoistoquímica, lesões hepatocelulares malignas de 61 pacientes foram selecionadas do arquivo de patologia do HCPA, entre o período de janeiro de 2004 a março de 2009 e avaliados quanto à expressão de GRPR. O receptor foi detectado em 77% das amostras tumorais, na maioria das vezes exibindo padrão de coloração difuso; moderado ou forte (57.4%). Os GRPRs foram, também, intensamente expressos em lesões hepatocelulares cirróticas adjacentes às malignas (48.4%), entretanto, no tecido hepático normal (não-neoplásico e não-cirrótico) os GRPRs foram fracos e moderadamente expressos (36 a 59% respectivamente). A expressão do GRPR mostrou-se significativamente associada com o estagio do tumor (p= 0.047), mas não houve relação com os parâmetros clínico-patológicos (idade, gênero, presença de infecção viral, de cirrose, tamanho do tumor e nível de AFP). Entretanto, a estratificação dos pacientes, baseada na expressão do GRPR, revelou que os pacientes, que tiveram uma alta expressão do GRPR, tenderam a apresentar a sobrevida global e a sobrevida livre de doença menor (p= 0.174). Esse estudo demonstrou, pela primeira vez, a expressão aberrante de GRPRs no HCC em seres humanos. / Gastrin-releasing peptide (GRP) is already established as a growth factor in cancer. Growth factors are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. Furthermore, the overexpression of growth factor receptors on the cell surface of malignant cells might be associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. Searching for new strategies for cancer treatment, much effort has been done to identify these receptors and to develop targeted therapies exploring their molecular specificity. The GRPR has been identified in many human malignancies, but to date, no information regarding its expression in hepatocellular cancer (HCC) was found in the literature. Considering that HCC is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in neoplasic hepatocelular lesions. Sections of paraffin-embedded hepatocelluar carcinomas and cirrhotic surrounding tissues from 61 patients with primary HCC were studied, as well as 22 samples from non-cirrhotic and non-neoplastic hepatic tissue. GRPR immune-expression was demonstrated in the parenchymal tumor cells in 77% of tumor tissue samples (47/61) and was moderately to strongly expressed in 57.4% of these cases. In the surrounding cirrhotic liver, GRP immunostaining was also observed, showing a high expression in 15/31 of cases (48.4%). In the normal hepatic tissue, GRPR was also expressed, mostly with a weak to moderate expression (36.4 and 59.1, respectively). GRPR expression was significantly associated with tumor stage (P=0.047), but no correlation was observed with other clinicopathologic parameters (age, gender, virus, liver cirrhosis, tumor size, and AFP level). Moreover, stratification of patients based on tumor GRPR expression revealed that the patients who had a high expression of GRPR tended to have a shorter overall survival (OS) time and a significantly shorter disease-free survival (DFS) time.