This diploma thesis deals with study of crystalline structure of polyhydroxybutyrate (PHB), which contains different types of additives for studying of their nucleation activity and which were prepared by mixing. It is about boronitrid (BN), sacharin, hydroxapatit, plasticizer Tegmer a tree types of talc. Crystal structure was analysed by differential scanning calorimetry and x-ray diffraction, supramolecular structure was observed by optical microscopy (polarized and confocal laser scanning). Nucleating activity was evaluated by isothermal and non-isothermal crystallization made on calorimeter and heated table of optical microscope. There is not influence of additives on crystallographic structure, but additives affects number and size of spherulites including crystal domains defects, which can have impact on final mechanical properties. BN and talcs react as nucleating agents, other additives during low and high cooling speeds (vc) inhibit nucleation and in middle cooling speeds are without effect. Nucleating activity is not evaluated by numerically, because decrease of crystallization temperature together with vc is not linear. Results of direct methods are based on picture analysis, which is great benefit for understanding of crystal behaviour of PHB.

Das Biopolymer-produzierende Knallgasbakterium Ralstonia eutropha H16 gilt mit seinem außergewöhnlichen Stoffwechsel als vielversprechender Produktionsstamm für die weiße Biotechnologie. Es wächst auf einer Vielzahl organischer Substrate sowie chemolithoautotroph mit H2 und CO2 als einzige Energie- bzw. Kohlenstoffquelle. Unter anaeroben Bedingungen ist es zudem zur Denitrifikation befähigt. In dieser Arbeit wurde das Proteinprofil von R. eutropha unter chemolithoautotrophen sowie anaeroben Bedingungen mittels GeLC-MS/MS untersucht. Beide Proteomstudien offenbarten, dass die Nutzung unterschiedlicher Elektronendonoren bzw. -akzeptoren mit zahlreichen Veränderungen im Proteinbestand der Zellen einherging. Hierbei waren neben Proteinen metabolischer und Transportprozesse auch jene der Zellbewegung betroffen. Die Ergebnisse stellen im Vergleich zu vorangegangenen Studien den bisher umfassendsten Überblick zum Proteinbestand beim H2-basierten sowie anaeroben Wachstum in R. eutropha dar. Von besonderer Bedeutung war dabei das Einbinden der Analyse der Membran als Ort wichtiger Energie- und Transportprozesse. Besonderes Interesse galt einem unter H2/CO2-Bedingungen abundanten Zweikomponentensystem. Sequenzvergleiche zeigten Ähnlichkeit zum Regulationssystem der Katabolitrepression des Biphenylabbaus in Acidovorax sp. KKS102. Die Deletion des Response-Regulator-Gens führte zu vielfältigen Wachstumseffekten auf Substraten wie Fructose, Glycerin sowie auf H2/CO2. Der pleiotrope Phänotyp sowie die Ergebnisse von Genexpressionsstudien und der Suche nach Regulator-Bindestellen lassen eine globale Rolle des Systems im Energie- und/oder Kohlenstoffmetabolismus von R. eutropha H16 annehmen. Histidin-Kinase und Response Regulator wurden in GloS bzw. GloR umbenannt. Die vorliegende Arbeit zeigt eindrucksvoll das Potential der Proteomik als Teil der funktionellen Genomik für den Anstoß neuer Forschungsansätze zur Evaluierung des biotechnologischen Potentials von Mikroorganismen. / Due to its remarkable metabolism the bioplastic-producing “Knallgas” bacterium Ralstonia eutropha H16 is ranked as a promising production strain for white biotechnology. It grows on a wide range of organic substrates as well as lithoautotrophically on H2 and CO2 as sole energy and carbon source, respectively. Under anaerobic conditions it thrives by denitrification. This thesis focused on characterizing the protein profiles of lithoautotrophically and anaerobically grown R. eutropha cells. Proteome analyses revealed an extensive protein repertoire adapting the organism to alternative electron donors and acceptors, respectively. Changes concerned proteins involved in metabolic and transport processes as well as in cell movement. Compared to previous studies the results reported here offer the most comprehensive proteomic survey regarding the H2-based as well as anaerobic lifestyle of R. eutropha so far. In this context analyzing the cell membrane as a place for a number of energy, transport and signal transduction processes was of particular importance. Special interest aroused the identification of a two-component system upregulated on H2/CO2. Sequence analysis offered high similarity to the regulatory system for catabolite control of biphenyl degradation in Acidovorax sp. KKS102. Deletion of the response regulator gene led to versatile growth effects on substrates such as fructose and glycerol as well as H2/CO2. This pleiotrophic phenotype as well as the results of gene expression studies and the search for regulator binding sites suggests that the two-component system is a global player in energy and/or carbon metabolism in R. eutropha and possibly other bacteria. Thus, histidine kinase and response regulator have been renamed GloS/R. Since their characterization was initiated by proteomic data this study impressively elucidates the power of functional genomics in terms of revealing new research approaches to evaluate the biotechnological use of microbes.

L’accumulation de biopolymère de réserve (PolyHydroxyAlcanoates ou PHA) par la souche Cupriavidus necator, à partir de substrats de type acides gras volatils (acide butyrique, acide propionique et acide acétique) a été étudiée. Elle est induite par une limitation phosphore. Les performances atteintes lors des cultures se situent parmi les meilleures de la littérature pour ce type de substrat : jusqu’à 66 g.L-1 de biomasse totale avec un pourcentage d’accumulation massique de 88% en PHB –PolyHydroxyButyrate- ou en PHB-co-HV -PolyHydroxyButyrate-co-HydroxyValerate- comportant jusqu’à 52% de motifs d’HV.Pour chaque source carbonée, une caractérisation cinétique et stœchiométrique de la souche a été réalisée en l’absence d’effets inhibiteurs dus aux substrats acides grâce à des cultures de type Fed-Batch avec des apports non limitants et non inhibiteurs en carbone. Il a été dégagé :- un taux de croissance maximal de la souche de 0,33 h-1 pour les trois acides étudiés- une relation entre vitesse spécifique de production de PHA et taux de croissance fixée par la disponibilité et les flux de production de NADPH2 avec un découplage inverse pour les taux de croissance supérieurs à 0,05 h-1 et un couplage partiel pour les taux de croissance inférieurs- un optimum de 0,35 Cmole.Cmole-1.h-1, associé à un taux de croissance de l’ordre de 0,05 h-1.- une amélioration de la production de PHB en termes de vitesses spécifiques mais également en termes de rendements si une faible croissance résiduelle est maintenueLa réponse de la souche à un excès de substrat acide a été caractérisée via l’étude de régimes transitoires induits par des pulses sur des cultures continues préalablement stabilisées en régime permanent. Il a été montré qu’en excès de phosphore, face à un brusque excès de substrat, la souche est incapable d’adapter rapidement son taux de croissance. L’excès est donc dirigé vers la production de PHA dont les voies sont plus rapidement mobilisables. En conditions limitantes de phosphore, le substrat excédentaire est utilisé pour la production de PHA. L’inhibition par les acides se traduit par une diminution des capacités de biosynthèse de la biomasse et des PHA entrainant une réduction de l’assimilation du carbone puis une diminution des rendements de conversion. D’autre part la sensibilité d’un système continu à un excès de substrat dépend du point de fonctionnement choisi : plus il est optimal en termes de vitesse, moins le système est robuste. L’acide propionique est très inhibiteur comparé aux autres acides étudiés (dès 3-4 mM contre 30-40 mM). Il n’agit pas simplement via une accumulation excessive dans le cytoplasme mais il exerce également une inhibition spécifique des voies métaboliques.Un antagonisme entre les substrats (acide acétique et butyrique) a été constaté et expliqué grâce à une analyse des flux métaboliques. L’acide acétique est assimilé préférentiellement pour produire la biomasse, l’énergie et les cofacteurs nécessaires à la production de PHA, alors que l’acide butyrique est utilisé pour la synthèse de PHB. La proportion maximale d’acide acétique admise dans l’alimentation en fonction des conditions fixées en régime permanent est calculée et peut être limitée à 40% du carbone.Enfin il a été déterminé que si une croissance résiduelle est assurée grâce à un apport en phosphore, le pourcentage maximal d’HV dans le polymère dépend du taux d’acide propionique dans l’alimentation et ne peux dépasser 33 ± 5% sur acide propionique pur. Par contre, si aucune croissance résiduelle n’est assurée, il est possible de convertir l’acide propionique en motifs d’HV uniquement / Reserve Biopolymer (PolyHydroxyAlkanoates or PHA) accumulation by the strain Cupriavidus necator, from Volatile Fatty Acids (VFA, like butyric acid, propionic acid and acetic acid) was investigated. This production is induced by a phosphorus limitation. For this type of substrates, performances reached during cultures are among the best listed in the literature: up to 66 g.L-1 of total biomass with 88% (w/w) of PHB –PolyHydroxyButyrate- or PHB-co-HV -PolyHydroxyButyrate-co-HydroxyValerate- with a HV content up to 52 Mole%.For each carbon source, kinetic and stoechiometric characterization has been carried out thanks to Fed-Batch cultures with non-limiting and non-inhibitory carbon feed. It has been established:- a maximal growth rate of 0,33 h-1 for the three acid investigated- a relationship between specific PHA production rate and growth rate which is set by the availability and production flux of NADPH2. For growth rate above 0,05 h-1, there is an inverse coupling. For growth rate under 0,05 h-1, there is a partial coupling.- an optimum of 0,35 Cmole.Cmole-1.h-1 is associated with a growth rate of 0,05 h-1.- if a low residual growth rate is maintained, an improvement of PHB production is recorded in terms of specific production rate and yieldsThe response of the strain to an excess of acid substrate was characterized through the investigation of transient state induced by pulsed addition of substrate during continuous cultures stabilized in steady state. It was shown that in excess of phosphorus, when there is a substrate excess, the strain is unable to quickly adapt its growth rate, so the excess is directed to PHA production whose ways seem to be more easily mobilized. Under phosphorus limitation, an excess of substrate is used for PHA production. Acid inhibition results in a decrease in biomass and PHA production capacity which leads to a decrease in carbon assimilation and conversion yields. The sensitivity of a continuous system to an excess of substrate depends on the chosen operating point: the more it is optimal in terms of specific production rate, the less the system is robust. Propionic acid is highly inhibitory compared to the other acids studied (from 3-4 mM versus 30-40 mM). It does not act only via an excessive accumulation in the cytoplasm but also exerts a specific inhibition of metabolic pathways.An antagonism between substrates (acetic and butyric acid) has been established and explained thanks to the Metabolic Flux Analysis. Acetic acid is preferentially used to produce biomass, energy and cofactors for PHA synthesis, whereas butyric acid is used to product PHB. According to the conditions set during steady state, maximal content of acetic acid admitted in the feed can be calculated. It can be limited to 40% of the carbon in the feed.Finally if a growth rate is maintained thanks to a phosphorus supply, the maximal HV content in polymer is function of propionic acid in the feed and cannot exceed 33 ± 5 Mole% on pure propionic acid. Conversely, if there is no residual growth, a total conversion of propionic acid into HV is allowed

In drei inhaltlich abgeschlossen Teilen werden Fragestellungen bearbeitet, die sich mit dem Einsatz von Polyhydroxybutyraten als Scaffoldmaterialien für das Tissue Engioneering von Knochen beschäftigen. Zunächst wird ein Prozess optimiert, in dem mittels Verpressen und Auslösen von Platzhaltern (Porogen) poröse Träger (Scaffolds) aus Poly-3-hydroxybuttersäure (P3HB) sowie aus P3co4HB hergestellt werden. Diese Scaffolds werden in der Folge mechanisch und strukturell charakterisiert, wobei Druckfestigkeit, Dauerfestigkeit und Viskoelastizität untersucht werden. Im Ergebnis finden sich mehrere Kandidaten, die für die weitere Testung im Tierversuch in Frage kommen. Weiter wird das Abbauverhalten von schmelzgeponnenen P3HB-Fäden untersucht. Dabei wird ein beschleunigtes Modellsystem gewählt, das noch möglichst nahe am physiologischen Fall aber ohne biologisch aktive Komponente (zB. Enzyme) definiert wurde. Die Charakterisierung bedient sich hier der Gelpermeationschromatographie (GPC), des gasgestützten Elektronenrastermikroskops (ESEM), der differentiellen Thermoanalyse (DSC) und der Rasterkraftmikroskopie. Als Ergebnis zeichnete sich ab, dass neben der hydrolytischen Degradation im Gegensatz zu PHB mit kleinerer spezifischer Oberfläche bei den Fäden auch Erosion zum Abbau beiträgt. Eine partikuläre Freisetzung wird nicht beobachtet. Im dritten Teil werden textile Scaffolds aus P3HB mit einer künstlichen extrazellulären Matrix aus Chondroitinsulfaten (CS) und Kollagen versehen. Dem CS kann hier ein positiver Einfluss auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) nachgewiesen werden. Dies wird zum einen durch die verstärkte Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie durch die Hochregulation von Proteinen ersichtlich, die bei der osteogenen Differenzierung essentiell sind. In wenigen Gene-Arrays lässt sich ebenfalls erkennen, dass die osteogene Differenzierung durch CS positiv beeinflusst wird. Insbesondere frühe Marker wie ZBTB16 und IGFBPs werden hier identifiziert. Basierend auf den Teilergebnissen wird am Ende ein Beitrag geliefert, der das Tissue Engineering insbesondere für überkritische Röhrenknochendefekte als Methode interessant erscheinen lässt. Dabei werden mechanische Lasten durch konventionelle Fixateure aufgenommen und der Defektraum durch den mehrfachen Einsatz von bio-funktionalisierten flachen Scaffolds gefüllt.

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In drei inhaltlich abgeschlossen Teilen werden Fragestellungen bearbeitet, die sich mit dem Einsatz von Polyhydroxybutyraten als Scaffoldmaterialien für das Tissue Engioneering von Knochen beschäftigen. Zunächst wird ein Prozess optimiert, in dem mittels Verpressen und Auslösen von Platzhaltern (Porogen) poröse Träger (Scaffolds) aus Poly-3-hydroxybuttersäure (P3HB) sowie aus P3co4HB hergestellt werden. Diese Scaffolds werden in der Folge mechanisch und strukturell charakterisiert, wobei Druckfestigkeit, Dauerfestigkeit und Viskoelastizität untersucht werden. Im Ergebnis finden sich mehrere Kandidaten, die für die weitere Testung im Tierversuch in Frage kommen. Weiter wird das Abbauverhalten von schmelzgeponnenen P3HB-Fäden untersucht. Dabei wird ein beschleunigtes Modellsystem gewählt, das noch möglichst nahe am physiologischen Fall aber ohne biologisch aktive Komponente (zB. Enzyme) definiert wurde. Die Charakterisierung bedient sich hier der Gelpermeationschromatographie (GPC), des gasgestützten Elektronenrastermikroskops (ESEM), der differentiellen Thermoanalyse (DSC) und der Rasterkraftmikroskopie. Als Ergebnis zeichnete sich ab, dass neben der hydrolytischen Degradation im Gegensatz zu PHB mit kleinerer spezifischer Oberfläche bei den Fäden auch Erosion zum Abbau beiträgt. Eine partikuläre Freisetzung wird nicht beobachtet. Im dritten Teil werden textile Scaffolds aus P3HB mit einer künstlichen extrazellulären Matrix aus Chondroitinsulfaten (CS) und Kollagen versehen. Dem CS kann hier ein positiver Einfluss auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) nachgewiesen werden. Dies wird zum einen durch die verstärkte Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie durch die Hochregulation von Proteinen ersichtlich, die bei der osteogenen Differenzierung essentiell sind. In wenigen Gene-Arrays lässt sich ebenfalls erkennen, dass die osteogene Differenzierung durch CS positiv beeinflusst wird. Insbesondere frühe Marker wie ZBTB16 und IGFBPs werden hier identifiziert. Basierend auf den Teilergebnissen wird am Ende ein Beitrag geliefert, der das Tissue Engineering insbesondere für überkritische Röhrenknochendefekte als Methode interessant erscheinen lässt. Dabei werden mechanische Lasten durch konventionelle Fixateure aufgenommen und der Defektraum durch den mehrfachen Einsatz von bio-funktionalisierten flachen Scaffolds gefüllt.:1. Vorwort 3 2. Allgemeine Einführung 5 2.1 Der Knochen 5 2.1.1 Die Knochenbildung 5 2.1.2 Zur Anatomie und Physiologie des Knochens 7 2.2 Tissue Engineering 11 2.2.1 Zelltypen für das Tissue Engineering von Knochen 12 2.2.2 Scaffold Design im Tissue Engineering von Knochen 13 2.3 Polyhydroxyalkanoate 13 2.4 Tissue Engineering am Röhrenknochen 16 2.4.1 Poly(3-hydroxybutyrat)-Scaffolds für das Tissue Engineering von Knochenersatz 17 2.4.2 Matrix Engineering 18 2.5 Ziel der Arbeit 19 3. Mechanik poröser PHB-Scaffolds 21 3.1 Einleitung 21 3.2 Materialien und Methoden 23 3.2.1 Polyhydroxybutyrate und Porogene 23 3.2.2 Uniaxiales Heißpressen 24 3.2.3 Mikrographie 26 3.2.4 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 26 3.2.5 Mechanische Druckversuche 26 3.2.6 Mikrocomputertomographie (μCT) 27 3.2.7 Zellviabilität auf den Scaffolds 28 3.3 Ergebnisse 29 3.3.1 Mikrographie 29 3.3.2 Mikrocomputertomographie (μCT) 33 3.3.3 Druckversuche 37 3.3.4 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 40 3.3.5 Zellviabilität 40 3.4 Diskussion 40 3.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 46 4. Degradation von P3HB-Fasern 47 4.1 Degradation von Polyhydroxyalkanoaten 47 4.2 Materialien und Methoden 49 4.2.1 Herstellung und Vorbehandlung textiler P3HB-Konstrukte 49 4.2.2 Mechanische Prüfung 50 4.2.3 Beschleunigte Degradation 50 4.2.4 Untersuchung der Oberfläche 50 4.2.5 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 51 4.2.6 Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) 51 4.3 Ergebnisse 52 4.3.1 Mechanische Tests 52 4.3.2 Die Charakterisierung der Oberfläche 52 4.3.3 Thermische Fasereigenschaften.55 4.3.4 Untersuchung der Molekulargewichte in der GPC 58 4.4 Diskussion 60 4.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 64 5. hMSC auf textilen Scaffolds 67 5.1 Einleitung 67 5.2 Material und Methoden 68 5.2.1 Erzeugung der P3HB-Scaffolds 68 5.2.2 Die Immobilisierung der EZM-Komponenten auf den Scaffolds 69 5.2.3 Isolation, Vorkultur, Besiedlung und Kultur der humanen mesenchymalen Vorläuferzellen 69 5.2.4 Kombinierte Bestimmung von ALP, MTT und Proteingehalt 71 5.2.5 Mikroskopische Untersuchungen 72 5.2.6 Nachweis der Kalziummineralisierung 73 5.2.7 Quantitative real time reverse transcribing polymerase chain reaction (rt-PCR) 73 5.2.8 cRNA Microarray-Untersuchung 74 5.2.9 Zusätzliche Experimente 75 5.3 Ergebnisse 76 5.3.1 Vorhergehende Untersuchung 76 5.3.2 Rasterelektronen-Mikroskopie 77 5.3.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 79 5.3.4 ALP-Aktivität, SDH-Aktivität und Proteingehalt 82 5.3.5 Mineralisierende Kalziumabscheidung 86 5.3.6 rt-PCR 87 5.3.7 cRNA Microarray-Untersuchung 90 5.3.8 Kulturen von hMSC mit Chondroitinsulfat als gelöstem Zusatz 93 5.4 Diskussion 93 5.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 98 6. Zusammenfassung 101

We now report an in depth analysis of the successful in vitro enzymatic synthesis of PHB utilizing the three-enzyme system from the bacteria Cupriavidus necator. Using HPLC methodology developed in this laboratory, and by adding each enzyme in a step-wise manner, we follow each individual stage in the three-enzyme route for PHB synthesis and delineate all stoichiometric relationships. We report the construction of the first metabolic model developed specifically for analyzing in vitro enzymatic PHB synthesis. We developed a hands-on student laboratory for culturing, producing, isolating, and purifying the bacterial biopolyesters PHB. We now report the first structural characterizations of iso-CoA, acetyl-iso-CoA, acetoacetyl-iso-CoA, and beta-hydroxybutyryl-iso-CoA using MS, MS/MS, and homo- and hetero-nuclear NMR analyses.We describe HPLC methodology to separate the isomers of several iso-CoA-containing compounds and report the first examples of iso-CoA-containing compounds acting as substrates in enzymatic acyl-transfer reactions. We describe a simple regioselective synthesis of iso-CoA from CoA. We also demonstrate a plausible mechanism, which accounts for the existence of iso-CoA isomers in commercial preparations of CoA-containing compounds. Herein we report that phenylaminoethyl selenide compounds protect DNA from peroxynitrite-mediated single-strand breaks. The mechanism of protection against peroxynitrite mediated DNA damage was investigated by HPLC. The chemistry of the reaction between peroxynitrite and HOMePAES was investigated using HPLC and HPLC/MS. The unique chemistry of the reaction between peroxynitrite and HOMePAES was investigated using HPLC and HPLC/MS. We report the development of novel CDB derivatives, which are selective COX-II inhibitors. A series of compounds were assayed with an in vitro colorimetric inhibitor screening and with a whole blood ELISA screening and the results indicate that MST is a selective inhibitor of COX-II.