Les cellules invariantes « natural killer » T (iNKT) constituent un groupe de lymphocytes T non conventionnels se développant dans le thymus et exprimant un récepteur TCRab semi-invariant composé de la chaine Va14-Ja18 associée à Vb8, -7 ou -2, capables de reconnaître des glycolipidiques présentés par la molécule de classe I non polymorphique : le CD1d. Ces cellules interviennent dans diverses réponses immunes grâce à leur capacité à produire rapidement des cytokines et se différencient en trois sous-populations de cellules iNKT1, -2 et -17. Alors que le développement des cellules iNKT1 est à ce jour bien connu, le développement et les mécanismes de différenciation des cellules iNKT17 demeurent ignorés. Ainsi, dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à expliquer la faible distribution de la sous-population de cellules iNKT17 présente dans le thymus de la souris B6 ainsi qu’à définir la séquence d’acquisition de ces marqueurs lors de son développement thymique et de sa migration périphérique. Dans un second temps, nous avons étudié l’impact du facteur de transcription clé du développement des cellules iNKT : PLZF, dans la différenciation de cette sous-population. L’ensemble de ces nouvelles données permettent d’apporter un éclairage déterminant quant aux différentes étapes de maturation de la sous-population de cellules iNKT17 et aux mécanismes impliqués dans la divergence de ce lignage. / Invariant natural killer T (iNKT) cells constitute a group of unconventional T mphocytes developing in the thymus and expressing a semi-invariant TCRab receptor composed of the Va14-Ja18 chain associated with Vb8, -7 or -2, capable of to recognize glycolipids presented by the non-polymorphic class I molecule: CD1d. These cells are involved in various immune responses due to their ability to rapidly produce cytokines and differentiate into three subpopulations of iNKT1, -2 and -17 cells. While the development of iNKT1 cells is well known to date, the development and mechanisms of differentiation of iNKT17 cells remain ignored. Thus, we were initially interested in explaining the low distribution of the subpopulation of iNKT17 cells present in the thymus of the B6 mouse and in defining the acquisition sequence of these markers during its thymic development and its peripheral migration. In a second step, we studied the impact of the key transcription factor of the development of iNKT cells : PLZF in the differentiation of this subpopulation. All these new data allow us to clarify the different stages of maturation of the iNKT17 cell subpopulation and the mechanisms involved in the divergence of this lineage.

L’isoforme p200CUX1 est un répresseur transcriptionnel qui est clivé dans les NIH3T3 par la cathepsin L en isoforme pllOCUXl laquelle acquiert alors la capacité d’activer la transcription des gènes cibles. Dans le système digestif, CUX1 est exprimé dans l’iléon et le côlon proximal chez la souris adulte. Aucun rôle dans le contexte de l’épithélium colique n’a été attribué à ce jour aux isoformes p200CUX1 et p110CUX1. Le but de cette Thèse a donc été d’investiguer l’implication de p200CUX1 et p110CUX1 dans l’épithélium colique ainsi que dans la carcinogenèse colorectale. Une étude différentielle par criblage de micropuces à ADN a permis d’identifier le gène PLZF comme cible transcriptionnelle de CUX1 dans le côlon. Une analyse informatique a prédit 15 sites de liaison potentiels pour CUX1 dans la portion 5’-UTR et dans une région de 776 p.b. du promoteur du gène PLZF. Des essais de gel de rétention et d’immunoprécipitation de la chromatine ont démontré une interaction de CUX1 avec certains sites prédits du gène PLZF in vitro et in vivo. Des essais transcriptionnels ont rapporté une diminution de deux fois de l’activité transcriptionnelle du promoteur du gène PLZF par CUX1. Les sites # 13, 14 et 15 du promoteur du gène PLZF ont été identifiés comme étant les sites préférentiellement liés par CUX1. Une analyse Western a permis d’établir un patron d’expression réciproque entre les cellules qui expriment CUX1 et celles qui expriment PLZF. Ces travaux ont également permis d’identifier un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la production de l’isoforme p11OCUX1. Un traitement des cellules 293T, T84 et Caco2/15 avec deux inhibiteurs du protéasome, soit le MG132 et le bortezomib, résulte en une diminution de l’expression de l’isoforme p11OCUX1. Une rapide accumulation de l’isoforme p200CUX1 est observée après 4 heures de traitement des cellules T84 au MG132. L’utilisation d’extraits de protéines cytoplasmiques et nucléaires suggère que la protéolyse limitée de l’isoforme p200CUX1 en p11OCUX1 prend place dans le noyau. Une expérience de dégradation in vitro confirme que le protéasome est la seule protéase responsable du clivage protéolytique. Une analyse informatique de la séquence en acides aminés de CUX1 a prédit quatre régions susceptibles d’être clivées par le protéasome. Enfin, le présent travail a tenté de démystifier le rôle de p11OCUX1 dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques. Les résultats montrent que l’isoforme p110CUX1 n’est pas un agent transformant. Sa surexpression dans les cellules IEC-6 et DLD-1 ne mène pas à une modulation de la vitesse de prolifération cellulaire. Aucune polype n’est visible au niveau de l’intestin grêle et/ou du côlon suite à la surexpression de p11OCux1 et ce, même après une période latente de 12 mois. L’abolition de l’expression des isoformes de CUX1 par interférence à l’ARN dans les cellules IEC-6 conduit à une diminution significative de la prolifération cellulaire, alors que dans les cellules T84 et DLD-1, il y a un ralentissement modeste de la croissance cellulaire. Les cellules DLD-1 shCUX1 ne forment pas moins de colonies en indépendance d'ancrage. Les résultats de cette étude démontrent que le gène PLZF est une cible de CUX1, que le protéasome est impliqué dans la protéolyse limitée de p200CUX1 en p110CUX1 et que p110CUX1 n’est pas impliquée dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques et de cancer du côlon chez l’humain.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont des facteurs épigénétiques dont le rôle est de maintenir la répression de leurs gènes cibles au niveau de la chromatine via la modification des protéines histones. EZH2 est une protéine clé dans les mécanismes de régulation puisqu’elle catalyse la mise en place de la marque répressive H3K27me3. Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressée au modèle des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) dans lesquelles, contrairement à d’autres pathologies myéloïdes, des mutations affectant EZH2 ou des membres Polycomb ne sont retrouvées que très rarement (˂1%). Des études ont montré que dans ce type de leucémies, de nombreux gènes cibles d’EZH2 sont dérégulés bien que son activité répressive soit toujours présente, mettant en évidence d’éventuels défauts de recrutement de cette protéine. Parmi les facteurs de transcription susceptibles de réguler l’association des protéines PcG à la chromatine, se trouve PLZF qui est un candidat intéressant. En effet, le laboratoire a mis en évidence une interaction entre PLZF et la protéine Polycomb BMI-1 et a montré que la distribution génomique de PLZF concorde avec celle de certains composants des Polycomb. L’objectif de mon travail de thèse a donc été de déterminer dans quelle mesure PLZF intervient dans le recrutement ou l’activité d’EZH2. / Polycomb group (PcG) proteins are epigenetic factors which play a major role in maintaining epigenetic silencing via histone modifications at the chromatin level. EZH2 is a key regulator that catalyzes the trimethylation of H3K27, which is a repressive mark. During my PhD, I was interested in the acute myeloid leukemia (AML) model in which, unlike other myeloid malignancies, EZH2 or other PcG protein mutations are very rare (˂1%). Studies have shown that in this type of leukemia, many of EZH2 target genes are deregulated although its repressive activity is still present highlighting possible EZH2 recruitment defects. Among the transcription factors that regulate the association of PcG proteins to chromatin, the transcription factor PLZF is an interesting candidate. Indeed, the laboratory has demonstrated an interaction between PLZF and the Polycomb protein BMI -1 and showed that the genomic distribution of PLZF is consistent with that of some Polycomb components. The aim of my thesis was therefore to determine in which extent PLZF is involved in the recruitment or activity of EZH2.

Loss of heterozygosity (LOH) of 16q is an early event occurring in 36-60% of primary sporadic breast cancers. CBFA2T3 (MTG16) is a putative breast cancer tumour suppressor gene, localized at chromosome band 16q24.3. CBFA2T3 (MTG16) belongs to the CBFA2T protein family and shares a high homology with other two members, CBFA2T1 (MTG8) and CBFA2T2 (MTGR1). CBFA2T1 and CBFA2T3 proteins form transcriptional repressor complexes with the DNA binding zinc finger proteins like BCL6, PLZF, Gfi1 and ZNF652. CBFA2T3 protein exists as isoform “a” and “b” that arise from alternate start sites. These isoform differ in their N-terminal sequences. Previous studies determined that CBFA2T3a localized to the nucleolus, while CBFA2T3b has a putative role as tumour suppressor protein. The present study confirms that the database entries of CBFA2T3a are incomplete and an extended N-terminus region is present to CBFA2T3a (NCBI NM_005187) isoform by RTPCR and DNA sequencing. Two rabbit polyclonal anti CBFA2T3 antibodies were raised against the region unique to CBFA2T3. These antibodies specifically detect the endogenous CBFA2T3 proteins and not CBFA2T1 and CBFA2T2. Cell fractionation studies show that endogenous CBFA2T3a localized to the cytoplasm, while CBFA2T3b targeted to the nucleus. The N-terminus region specific to “a” isoform determined the cytoplasmic localization. The detailed studies show that CBFA2T3a localized to centrosome and this was confirmed by co–localization with known centrosomal proteins γ- tubulin. This was further confirmed by immunoprecipitation of γ-tubulin with N-terminus regions of CBFA2T3a protein. Further investigation showed that CBFA2T3a localizes to the centrosome through out the centrosomal duplication. Presence of CBFA2T3a on procentriole was further confirmed by co-localization with known proteins having a crucial role in centrosome duplication like HsSAS6 and polyglutamilated tubulin. Experiments were conducted to determined if the different subcellular localization of “a” and “b” isoforms resulted into functional differences between two isoforms. Immunoprecipitation experiments with known DNA binding proteins like BCL6 and PLZF showed that CBFA2T3b interacts with BCL6, while no interaction was found with PLZF. Consistent with the known transcriptional co-repressor function, real time RT-PCR showed that CBFA2T3b has an additive effect on BCL6 mediated repression of its target cyclin D2, while no effect was observed with CBFA2T3a. Real time RT-PCR data also showed that BCL6 not only recruits CBFA2T3b to repress its target but also have repressive effects on CBFA2T3 transcription. CBFA2T3b transcription regulation by BCL6 was found to be mediated through one or two BCL6 putative binding sites in CBFA2T3b promoter. Immuno histochemical studies were carried out to analyse CBFA2T3b function as a breast cancer tumour suppressor. CBFA2T3 proteins are highly expressed in epithelial cell lineage of normal breast ducts, while its expression is lost in some tumours. CBFA2T3 expression was further analysed in a cohort of commercially available breast tumour sections. Data from these studies showed the loss of CBFA2T3 nuclear expression in some tumours, which was significantly correlated with tumours positive for HER2 expression, molecular subtypes and histological staging of the tumours. CBFA2T3 cytoplasmic expression was also down regulated in tumour sections. A significant association of CBFA2T3 cytoplasmic expression was observed with the TNM grading for tumour invasion and centrosomal abnormalities in BR701 TMA. Knock down studies using shRNA were conducted to investigate the role of CBFA2T3a. Following CBFA2T3 knock down in cells with minimal CBFA2T3b expression, an increase in centrosomal abnormalities was observed. These abnormalities were associated with a significant increase in metaphase anomalies. Since the “a” isoform is localized to cytoplasm and particularly centrosome, it was considered that this isoform is determining centrosome integrity. This work has provided a new insight into the localization pattern of CBFA2T3 isoforms, as CBFA2T3a and b isoforms were localized to different cellular compartments and were involved in distinct functions. CBFA2T3b function as a transcriptional co repressor, CBFA2T3b expression was lost in a group of breast tumours sections. Given that CBFA2T3a has a critical centrosomal function, the expression of this isoform would be expected to be maintained, even in the absence of the CBFA2T3b isoform in tumours. CBFA2T3a specific knock down studies may give a full insight on direct targets of CBFA2T3a, having a controlling role in normal centrosome duplication cycle. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1474414

Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT) représentent une sous-population particulière de cellules T qui se distingue par son développement, ses fonctions et les ligands qu’elle reconnaît. Chez l’homme, les cellules iNKT expriment le réarrangement Vα24-Jα18/Vβ11 et reconnaissent des glycosphingolipides présentés par la molécule monomorphe du CMH de classe I CD1d. De plus, elles produisent rapidement de grandes quantités de cytokines, et sont ainsi considérées comme des cellules T ayant des caractéristiques innées. Les mécanismes moléculaires qui régulent l’homéostasie descellules iNKT ne sont pas complètement compris. La protéine XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) est un inhibiteur physiologique des caspases 3, 7 et 9. Des mutations du gène XIAP sont à l’origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X de type 2 (XLP-2), un déficit immunitaire primitif (DIP) caractérisé par une susceptibilité accrue à l’infection par le virus Epstein Barr (EBV). Les patients souffrant du XLP-2 présentent une forte réduction de leur nombre de cellules iNKT dans le sang. Au cours de mon travail de thèse, j’ai montré que XIAP est requis pour la survie des cellules iNKT humaines. Cette fonction de XIAP corrèle avec un phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT qui n’est pas retrouvé dans les cellules T conventionnelles. La susceptibilité accrue à l’apoptose des cellules iNKT est observée en utilisant des stimuli de la voie intrinsèque ou extrinsèque de l’apoptose. Les cellules iNKT, contrairement aux cellules T conventionnelles expriment des quantités élevées de protéines pro-apoptotiques comme les caspases 3 ou 7 ou Bid. Ce phénotype proapoptotique est acquis de manière précoce, puisqu’il est déjà présent dans des cellules iNKT de thymus ou de sang de cordon. L’extinction de XIAP dans des cellules iNKT et l’analyse de patients déficients en XIAP indiquent que XIAP est un inhibiteur efficace de l’apoptose dans les cellules iNKT alors qu’il n’a qu’un effet modéré dans les cellules T conventionnelles. J’ai ensuite montré que le phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT est dépendant de l’expression du facteur de transcription PLZF. Celui-ci est déjà connu comme étant nécessaire à l’acquisition des fonctions effectrices de cescellules. De manière concordante, la surexpression de PLZF dans des cellules T conventionnelles conduit à un phénotype pro-apoptotique et à une augmentation de l’expression de la caspase 3. Récemment, une deuxième population de cellules T invariantes, les cellules MAIT (Mucosal Associated Invariant T) a été décrite. Ces cellules expriment un TCR semi-invariant Vα7.2-Jα33 et partagent avec les cellules iNKT certaines caractéristiques qui en font des cellules T innées comme les cellules iNKT. De la même manière que les cellules iNKT, les cellules MAIT ont un phénotype proapoptotiqueet sont diminuées dans le sang des patients déficients en XIAP. Ce phénotype proapoptotique est aussi dépendant de PLZF. De manière intéressante, un patient déficient en XIAP et ayant un nombre normal de cellules iNKT a été identifié. Ce patient n’a pas encore rencontré l’EBV, suggérant que la diminution des cellules iNKT chez les patients déficients en XIAP est due à une apoptose augmentée dans un contexte d’infection par l’EBV. Enfin, j’ai obtenu des données préliminaires suggérant que l’EBV utilise un mécanisme d’échappement aux cellules iNKT en diminuant l’expression de CD1d à la surface des cellules B. Mon travail de thèse a donc permis d’identifier une voie de régulation inconnue des lymphocytes T innés qui dépend de XIAP et de PLZF. PLZF est donc un facteur clé pour la différentiation et l’homéostasie des cellules T innées en régulant l’acquisition de leurs fonctions effectrices et en limitant leur survie. Ces observations ont aussi permis d’identifier le premier DIP associé à un déficit en cellules MAIT. Enfin, ces résultats suggèrent un rôle des cellules iNKT dans le contrôle de l’infection par l’EBV. / Invariant natural killer T (iNKT) lymphocytes represent a peculiar T cell-lineage that differs from conventional T cells by its development, function, and ligands it recognizes. In humans, iNKT cells express an invariant TCR made of the V?24-J?18/V?11 rearrangement, which recognizes glycosphingolipids presented by the MHC class I monomorphic molecule CD1d. Moreover, they rapidly produce high amounts of cytokines when stimulated and are thus considered as innate-like T cells. The molecular mechanisms that control the homeostasis of iNKT are poorly understood. XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) is a physiological inhibitor of caspases 3, 7 and 9 and is mutated in the X-linked lymphoproliferation syndrome 2 (XLP-2), a rare primary immunodeficiency (PID) characterized by a peculiar susceptibility to Epstein-Barr virus (EBV) infection. Patients with a XIAP deficiency exhibit a strong reduction of their iNKT cells in blood. Here, I report that XIAP is required for the survival of iNKT cells in humans. The requirement of XIAP correlates with a pro-apoptotic phenotype of iNKT cells that is not observed in conventional T cells. The increased susceptibility to apoptosis of iNKT cells was observed upon stimuli that trigger either extrinsic or intrinsic apoptosis pathways. iNKT cells by contrast to conventional T cells express elevated amounts of pro-apoptotic molecules including caspases 3 or 7 and Bid. The pro-apoptotic phenotype of iNKT cells is early acquired since iNKT cells from cord blood and thymus display a similar pro-apoptotic phenotype. Knock-down of XIAP in iNKT cells and analysis of XIAP-deficient humans indicate that XIAP is a potent inhibitor of apoptosis in iNKT cells while it has only a moderate effect in conventional T cells. I also show that this pro-apoptotic phenotype of iNKT cells is dependent of the expression of the transcription factor PLZF. This factor is already known to be necessary for the acquisition of the effector functions of these cells. Conversely, over expression of PLZF in conventional T cells leads to a pro-apoptotic phenotype and to an increased expression of caspase 3. Recently, a second invariant T cell subpopulation, the mucosal associated invariant T (MAIT) cells was identified both in humans and mice. These cells express a semi-invariant TCR made of V?7.2-J?33 rearrangements and share with iNKT cells a number of developmental, functional and phenotypical features that lead to consider MAIT cells as innate-like T cells like iNKT cells. Similarly, MAIT cells also exhibit a pro-apoptotic phenotype and are decreased in XIAP-deficient humans. The pro-apoptotic phenotype of MAIT cells is also dependent on PLZF. Interestingly, one XIAP-deficient patient with normal iNKT cell number was identified. This patient has not yet encountered EBV, suggesting that reduction of iNKT cells in XIAP-deficient patients is likely due to increased apoptosis in the context of EBV infection. I also show that EBV might have an escape mechanism from iNKT cells by down-regulating the expression of CD1d on the surface of B cells. My thesis works identify a previously unknown pathway controlling innate T cell homeostasis depending on XIAP and PLZF. PLZF is thus a key factor involved in the differentiation and the homeostasis of innate T cells by regulating the acquisition of their effector functions and their survival. I also identified the first PID associated with a defect in MAIT cells. Finally, these results provide evidences that iNKT cells might play a role against EBV infection.

Les CSH sont responsables de la production de toutes les cellules sanguines et possèdent une double capacité d'auto-renouvellement et de différenciation en progéniteurs incluant les progéniteurs lymphoïdes B. Étant donné l’importance des CSH, leur physiologie est étroitement contrôlée par une pléthore de signaux qui équilibrent quiescence, prolifération, auto-renouvellement et différenciation. La diminution de la fonction des CSH au cours du vieillissement dépend de plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques, y compris l’accumulation des ROS au cours du vieillissement. Lorsque les taux de ROS intracellulaires deviennent excessifs, ils provoquent une sénescence ou une apoptose, entraînant un épuisement prématuré des CSH et un dysfonctionnement hématopoïétique. La régulation et les effets des ROS sont donc liés au destin des CSH. Notre laboratoire a dévoilé l'activité antioxydante de la protéine TP53INP1. En effet, les souris KO développent un stress oxydatif chronique. Le gène codant pour TP53INP1 est exprimé au niveau basal dans tous les types de cellules de la MO et est fortement surexprimé lorsque la moelle osseuse lors du vieillissement. L'analyse des compartiments cellulaires de la MO a montré que l'absence de TP53INP1 a un impact important sur la différenciation des cellules B, qui est étonnamment maintenue dans la moelle osseuse des souris KO âgées, et réduite chez les souris WT âgées. Ces cellules B produisent IgM et IgG et sont fonctionnelles. Le traitement antioxydant inverse le phénotype observé. Enfin, nous démontrons que la maintenance des lymphocytes B chez les souris KO âgées est dépendant de la voie de signalisation IL-7Rα / pSTAT5. / HSCs are responsible for the production of all blood cells and possess the dual ability to self-renew and differentiate into progenitor including precursors of B cells which complete their differentiation in the spleen. Given their importance, their physiology is tightly controlled by a plethora of signals that balance quiescence, proliferation, self-renewal and differentiation. The decreased repopulation and differentiation capacity of HSC during aging is believed to depend on several intrinsic and extrinsic factors, including aging-associated accumulation of ROS. At physiological level, ROS can regulate various cellular functions, including HSCs and lineage precursors proliferation, differentiation and mobilization. However, when intracellular ROS levels become excessive, they cause senescence or apoptosis, resulting in a premature exhaustion of HSCs and hematopoietic dysfunction. In this condition many signaling molecules are activated. Our laboratory has previously unveiled TP53INP1; indeed, TP53INP1- KO mice develop a chronic oxidative stress. The gene encoding TP53INP1 is expressed at basal level in all BM cell types, and strongly over-expressed when the BM upon aging. Analysis of BM cell compartments showed that the absence of TP53INP1 strongly impacts on B cell differentiation, which is surprisingly maintained in old KO BM while reduced in old WT. As shown by immunization assays, these B cells produce IgM and IgG showing that they are functional. Antioxidant treatment that scavenges ROS reverses the phenotype observed in old KO BM. Finally, we demonstrate that the B cell maintenance observed in KO old BM is due to an enhanced IL-7Rα/ pSTAT5 signaling pathways.

Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT) représentent une sous-population particulière de cellules T qui se distingue par son développement, ses fonctions et les ligands qu'elle reconnaît. Chez l'homme, les cellules iNKT expriment le réarrangement Vα24-Jα18/Vβ11 et reconnaissent des glycosphingolipides présentés par la molécule monomorphe du CMH de classe I CD1d. De plus, elles produisent rapidement de grandes quantités de cytokines, et sont ainsi considérées comme des cellules T ayant des caractéristiques innées. Les mécanismes moléculaires qui régulent l'homéostasie descellules iNKT ne sont pas complètement compris. La protéine XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis) est un inhibiteur physiologique des caspases 3, 7 et 9. Des mutations du gène XIAP sont à l'origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l'X de type 2 (XLP-2), un déficit immunitaire primitif (DIP) caractérisé par une susceptibilité accrue à l'infection par le virus Epstein Barr (EBV). Les patients souffrant du XLP-2 présentent une forte réduction de leur nombre de cellules iNKT dans le sang. Au cours de mon travail de thèse, j'ai montré que XIAP est requis pour la survie des cellules iNKT humaines. Cette fonction de XIAP corrèle avec un phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT qui n'est pas retrouvé dans les cellules T conventionnelles. La susceptibilité accrue à l'apoptose des cellules iNKT est observée en utilisant des stimuli de la voie intrinsèque ou extrinsèque de l'apoptose. Les cellules iNKT, contrairement aux cellules T conventionnelles expriment des quantités élevées de protéines pro-apoptotiques comme les caspases 3 ou 7 ou Bid. Ce phénotype proapoptotique est acquis de manière précoce, puisqu'il est déjà présent dans des cellules iNKT de thymus ou de sang de cordon. L'extinction de XIAP dans des cellules iNKT et l'analyse de patients déficients en XIAP indiquent que XIAP est un inhibiteur efficace de l'apoptose dans les cellules iNKT alors qu'il n'a qu'un effet modéré dans les cellules T conventionnelles. J'ai ensuite montré que le phénotype pro-apoptotique des cellules iNKT est dépendant de l'expression du facteur de transcription PLZF. Celui-ci est déjà connu comme étant nécessaire à l'acquisition des fonctions effectrices de cescellules. De manière concordante, la surexpression de PLZF dans des cellules T conventionnelles conduit à un phénotype pro-apoptotique et à une augmentation de l'expression de la caspase 3. Récemment, une deuxième population de cellules T invariantes, les cellules MAIT (Mucosal Associated Invariant T) a été décrite. Ces cellules expriment un TCR semi-invariant Vα7.2-Jα33 et partagent avec les cellules iNKT certaines caractéristiques qui en font des cellules T innées comme les cellules iNKT. De la même manière que les cellules iNKT, les cellules MAIT ont un phénotype proapoptotiqueet sont diminuées dans le sang des patients déficients en XIAP. Ce phénotype proapoptotique est aussi dépendant de PLZF. De manière intéressante, un patient déficient en XIAP et ayant un nombre normal de cellules iNKT a été identifié. Ce patient n'a pas encore rencontré l'EBV, suggérant que la diminution des cellules iNKT chez les patients déficients en XIAP est due à une apoptose augmentée dans un contexte d'infection par l'EBV. Enfin, j'ai obtenu des données préliminaires suggérant que l'EBV utilise un mécanisme d'échappement aux cellules iNKT en diminuant l'expression de CD1d à la surface des cellules B. Mon travail de thèse a donc permis d'identifier une voie de régulation inconnue des lymphocytes T innés qui dépend de XIAP et de PLZF. PLZF est donc un facteur clé pour la différentiation et l'homéostasie des cellules T innées en régulant l'acquisition de leurs fonctions effectrices et en limitant leur survie. Ces observations ont aussi permis d'identifier le premier DIP associé à un déficit en cellules MAIT. Enfin, ces résultats suggèrent un rôle des cellules iNKT dans le contrôle de l'infection par l'EBV.

Le thymus est un organe permettant le développement des lymphocytes T, partie intégrante du système immunitaire. Ces cellules sont communément associées au système immunitaire adaptatif, bien que certaines populations, dont les lymphocytes iNKT et Tγδ, soient associées au système immunitaire inné. De manière générale, ces lymphocytes " innés " sont capables de répondre très rapidement à différents signaux d'activation, par la production rapide et massive d'IL-4, d'IFN-γ et d'IL-17. Notre laboratoire a mis en évidence l'existence de deux sous-populations de lymphocytes iNKT, iNKT conventionnels et iNKT17, ayant deux voies de différenciation thymique bien distinctes, mais dont les mécanismes de détermination sont encore inconnus. Il a été montré que " SLAM-associated protein " (SAP) est indispensable au développement des lymphocytes iNKT, puisqu'ils sont absents chez les souris déficientes en SAP. D'autre part, ces mêmes souris montrent également une déficience de la réponse Th2. Nous avons alors émis l'hypothèse que SAP pourrait être impliqué dans la production d'IL-4 par les lymphocytes iNKT, et dans la détermination des deux sous-populations de lymphocytes iNKT conventionnel ou producteur d'IL-17. Dans une première partie, nous avons utilisé des souris triple mutantes Sap-/- Vα14Tg-ROR(γt)-Egfp, permettant l'étude des sous-populations de lymphocytes iNKT malgré la déficience en SAP. Nous avons ainsi montré que SAP est indispensable à l'acquisition thymique de la capacité de production d'IL-4 par les lymphocytes iNKT conventionnels. Chez ces souris déficientes en SAP, nous avons observé une augmentation de la fréquence des lymphocytes iNKT17 RORγtpos producteurs d'IL-17, ce qui montre clairement que SAP n'est pas nécessaire pour l'acquisition des propriétés fonctionnelles des lymphocytes iNKT17. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction de SAP dans le développement thymique des cellules iNKT productrices d'IL-4. De plus, nos résultats montrent que SAP est un point de contrôle obligatoire déterminant l'orientation de la différenciation thymique des cellules iNKT vers les cellules iNKT17 ou vers les cellules iNKT conventionnelles. En parallèle des lymphocytes iNKT17 présents dans le thymus, nous avons également analysé une autre population T particulière : des thymocytes TCRαβposCD4pos matures et producteurs d'IL-17, les lymphocytes Th17 naturels. Nous avons mis en évidence que ces lymphocytes expriment le facteur de transcription RORγt. Ces lymphocytes T CD4posCD8negCD44hiRORγtpos sont capables de produire rapidement et massivement de l'IL-17, mais requièrent l'IL-23 pour co-produire l'IL-22. De plus, ils se distinguent des lymphocytes Th17 induits, ou conventionnels, par l'expression du facteur de transcription PLZF et par leur capacité à répondre très rapidement à des stimuli pro-inflammatoires, nommément l'IL-23 associé à l'IL-1β et un agoniste TLR4. Les résultats obtenus durant cette thèse ouvrent donc de nombreuses perspectives de recherches fondamentale et thérapeutique, domaine dans lequel l'IL-17 est devenu une cible privilégiée pour le traitement des maladies auto-immunes.

Glioblastoma (GBM) is the most common high-grade brain tumor diagnosed in patients who are more than 50 years of age. The standard of care treatment is surgery, followed by radiotherapy and chemotherapy. The median life expectancy of patients is only between 12 to 15 months after receiving current treatment regimes. Hence, identification of new therapeutic compounds and gene targets are highly warranted. This thesis describes four interlinked studies to attain this goal. In study 1, we explored drug combination effects in a material of 41 patient-derived GBM cell (GC) cultures. Synergies between three compounds, pterostilbene, gefitinib, and sertraline, resulted in effective killing of GC and can be predicted by biomarkers. In study 2, we performed a large-scale screening of FDA approved compounds (n=1544) in a larger panel of GCs (n=106). By combining the large-scale drug response data with GCs genomics data, we built a novel computational model to predict the sensitivity of each compound for a given GC. A notable finding was that GCs respond very differently to proteasome inhibitors in both in-vitro and in-vivo. In study 3, we explored new gene targets by RNAi (n=1112) in a panel of GC cells. We found that loss of transcription factor ZBTB16/PLZF inhibits GC cell viability, proliferation, migration, and invasion. These effects were due to downregulation of c-MYC and Cyclin B1 after the treatment. In study 4, we tested the genomic stability of three GCs upon multiple passaging. Using molecular and mathematical analyses, we showed that the GCs undergo both systematic adaptations and sequential clonal takeovers. Such changes tend to affect a broad spectrum of pathways. Therefore, a systematic analysis of cell culture stability will be essential to make use of primary cells for translational oncology. Taken together, these studies deepen our knowledge of the weak points of GBM and provide several targets and biomarkers for further investigation. The work in this thesis can potentially facilitate the development of targeted therapies and result in more accurate tools for patient diagnostics and stratification.