Orientador: Silvio Luis de Oliveira / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Eduardo Bagagli / Banca: Luis Florêncio Franco Margatho / Banca: Carlos Alberto Sorgi / Resumo: A Paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica humana causada por um fungo imperfeito e dimórfico denominado Paracoccidioides brasilienis (P.brasiliensis), sendo os conídeos sua forma infectante. Camundongos geneticamente selecionados para Resposta Inflamatória Aguda Máxima (AIRmax) e Mínima (AIRmin), foram usados como modelo experimental da paracoccidioidomicose. Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com P. brasiliensis (cepa 18) e sacrificados após 6, 12 e 24 horas e 3, 7 e 14 dias de infecção. Nestes períodos foram removidos fragmentos de baço, fígado e pulmão para avaliação do grau de infecção de células fúngicas nestes órgãos, avaliação da atividade macrofágica por macrófagos peritoneais e esplênicos pela determinação das concentrações de óxido nítrico e produção de citocinas pró e anti-inflamatórias de sobrenadantes de homogenatos de pulmão e baço. No presente trabalho observamos que as linhagens AIRmax apresentaram maior contenção do processo infeccioso que as linhagens AIRmin nos compartimentos analisados. Quanto a produção de NO observamos que animais AIRmax produziram mais deste metabólito em períodos tardios, o que pode ter ajudado esta linhagem na maior contenção do processo infeccioso nos órgãos analisados. Quanto a produção de citocinas observamos que a produção de INF- , TNF- , IL-1, IL- 6, IL-8, IL-12, estão aumentadas nas linhagens AIRmax na maioria dos órgãos e períodos analisados, contribuindo para a maior resistência destas linhagens frente à infecção pelo fungo em relação aos AIRmin, com exceção da IL-4 e IL-10 que apresentaram sua produção diminuída na linhagem AIRmax e aumentada na linhagem AIRmin reproduzindo seu efeito biológico supressor. Frente aos resultados observamos que a linhagem AIRmax apresentou maior contenção do processo infeccioso, com importante envolvimento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis is a systemic human mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), an imperfect dimorphic fungus whose conidia are its infectant form.Mice genetically selected for Maximum (AIRmax) and Minimum (AIRmin) Acute Inflammatory Response were used as an experimental paracoccidioidomycosis model. The animals were intraperitoneally inoculated with P. brasiliensis (strain 18) and sacrificed after 6, 12 and 24 hours and after 3, 7 and 14 days of infection. In these periods, fragments from their spleen, liver and lung were removed for evaluation of the level of infection by fungal cells in those organs, evaluation of macrophagic activity by peritoneal and splenic macrophages through the determination of the concentrations of nitric oxide (NO) and production of pro- and anti-inflammatory cytokines of lung and spleen homogenate supernatants. In the present study, it was observed that the AIRmax lineages presented greater control of the infectious process than did the AIRmin lineages in the analyzed compartments. As regards NO production, it was found that AIRmax animals produced more of such metabolite in late periods, which may have helped that lineage with the greater control of the infectious process in the analyzed organs. Concerning cytokine production, it was observed that the production of INF- , TNF- , IL-1, IL-6, IL-8 and IL-12 were increased for the AIRmax lineages in most analyzed organs and periods, thus contributing to the greater resistance exhibited by such lineages against infection with the fungus in relation to AIRmin, except for IL-4 and IL-10, which showed decreased production for the AIRmax lineage, reproducing its suppressive biological effect. From these results, it was observed that the AIRmax lineage showed greater control over the infectious process with an important involvement of the analyzed cytokines. These findings... (Complet abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: Raquel Cordeiro Theodoro / Banca: Patricia Albuquerque de Andrade Nicola / Banca: Adriana Pardini Vicentini / Banca: Silvio de Alencar Marques / Banca: Renata Castiglioni Pascon / Resumo: O solo é o provável habitat do fungo patogênico Paracoccidioides spp., devido à detecção molecular deste patógeno neste tipo de amostra, associada à frequente infecção de trabalhadores rurais e isolamento em animais silvestres (Dasypus novemcinctus e Cabassous centralis). O presente estudo visou detectar e diferenciar as espécies Paracoccidioides brasiliensis (complexo) e Paracoccidioides lutzii no ambiente, pelas técnicas de Nested PCR, FISH, respectivamente, em amostras ambientais aerossóis e solo de tocas de tatus provenientes de áreas endêmicas para a Paracoccidioidomicose nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Norte brasileiras. Além da detecção ambiental de Paracoccidioides sp. por métodos moleculares, foi estudada a ocorrência de tatus infectados com P. lutzii no centro-oeste brasileiro, região de maior prevalência desta espécie, onde nenhum animal havia sido avaliado até o presente momento. Obtivemos a detecção positiva para ambas as espécies de Paracoccidioides por ambas as técnicas de detecção (Nested PCR e hibridização in situ), além da diferenciação por ITS (Internal Transcribed Spacer) pudemos visualizar os espécimes fúngicos em algumas amostras aerossóis. Acreditamos que os dados refletem a real ocorrência dos fungos em seu nicho, no entanto, o isolamento animal em tatus demonstrou-se negativo para 7 animais avaliados no trabalho, o que pode indicar que a relação da espécie P. lutzii com os tatus pode não ser a mesma com os casos de tatus infectados com P. brasiliensis em outras regiões brasileiras / Abstract: Soil is probably the habitat of pathogenic fungi Paracoccidioides spp., due to the molecular detection of this pathogen in these samples, associated with the frequent of infection in rural workers and the isolation in wild animals (Dasypus novemcinctus and Cabassous centralis). This project aimed to detect and differentiate the species P. brasiliensis (complex) and P. lutzii in the environment, by the techniques of Nested PCR and FISH, respectively, in environmental aerosol samples and soil from armadillo's burrows, from endemic and non-endemic areas to Paracoccidioidomycosis in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. Besides the environmental detection of Paracoccidioides spp. by molecular methods, the occurrence of armadillos infected with P. lutzii the Brazilian center-west region with the highest prevalence of this kind, where no animals were evaluated at the present time will be studied. We achieved positive detection of both species of Paracoccidioides by both detection techniques (PCR and in situ hybridization), and further the differentiation by the ITS (Internal Transcribed Spacer) we could visualize fungal species in some aerosol samples also differentiating the two species. We believe of the data reflect the actual occurrence of fungi in their niche, however the animal isolation in armadillo's showed up negative for 7 animals evaluated at work, which indicated that the ratio of the species P. lutzii with armadillo may not be the same with cases of armadillo's infected with P. brasiliensis in other regions of Brazil / Doutor

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Luis Octávio Regasini / Banca: Eduardo Bagagli / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii são fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, que é uma micose humana sistêmica geograficamente confinada na América Latina. Vários antifúngicos podem ser utilizados para o tratamento dessa doença, tais como anfotericina B, sulfamídicos e azólicos (itraconazol) e de maneira geral seu uso é prolongado. As limitações frequentes dos antifúngicos e o aumento na incidência das infecções fúngicas sistêmicas têm ressaltado a necessidade da descoberta e do desenvolvimento de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi comparar a atividade antifúngica de anfotericina B, itraconazol e galatos de alquila anti-complexo de Paracoccidioides por métodos fenotípicos e proteômicos. Para tanto foi padronizado o teste de sensibilidade para selecionar o galato de maior potência, utilizando o documento M27-A2 (2002), modificado pela adição de Alamar Blue. Adicionalmente, análises proteômicas foram realizadas antes e após tratamento com o antifúngico selecionado para verificar o perfil das possíveis proteínas-alvo. A atividade antifúngica foi estudada contra isolados de P. brasiliensis (S1, S2 e PS3) e P. lutzii, (Pb01-like), e depois o teste foi estendido para mais seis isolados. O valor da CIM do ácido gálico variou de 31,25 a 0,250 mg/L para todos os isolados. Os galatos mostraram valores de CIM entre 16 a 0,004 mg/L. O menor valor de CIM foi observado para seis galatos que possuem uma substituição por uma cadeia relativamente longa de carbonos. O perfil proteico dos isolados Pl01 e Pb18 foi estudado por eletroforese 2D após contato com anfotericina B , itraconazol e o galato de decila (todos a uma concentração de 0,125 mg/L. Mais de 130 spots para ambos os fungos foram observados e a maioria destas proteínas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii are dimorphic fungi, etiological agents of paracoccidioidomycosis, which is a systemic human mycosis geographically restricted to Latin America. Various antifungal agents may be used to treat this disease, such as amphotericin B, sulfamidic agents and itraconazole, and these drugs are used in long-term therapies. The limitations of antifungals and increased incidence of systemic fungal infections has underscored the need for discovery and development of new drugs. The objective of this study was to compare the antifungal activity of amphotericin B, itraconazole and alkyl gallates anti-Paracoccidioides complex by phenotypic and proteomic methods. Thus, the susceptibility test was applied to select the most potent gallate, using the document M27-A2 (2002), modified by the addition of Alamar Blue. Finally, proteomic analyses was developed before and after the treatment with the antifungal agent selected, to study the protein profile after this treatment. The antifungal activity was evaluated against isolates of P. brasiliensis (S1, S2 and PS3) and P. lutzii (PB01-like), and after, the test has been extended to six isolates. The MIC values of gallic acid varied from 31.25 to 0.250 mg/L for all isolates. The gallates showed MIC values ranging from 16 to 0,004 mg/L. The lowest MIC value was observed for six gallates bearing a substitution for a long side chain. The protein profile of isolates Pb18 and Pl01 was studied by 2D electrophoresis after contact with amphotericin B, itraconazole and decyl gallate, all in the concentration of (0.125 mg/L ). More than 130 spots for both species were observed, and the most of these proteins... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eduardo Bagagli / Banca: Patrícia Sammarco Rosa / Banca: Paulo Sérgio Rodrigues Coelho / Resumo: Não disponível / Abstract: Taking into account that paracoccidioidomycosis infection occurs by inhalation of the asexual conidia produced by Paracoccidioides sp. in its saprobic phase, this work presents the collection of aerosol samples as an option for environmental detection of this pathogen, by positioning a cyclonic air sampler at the entrance of armadillo burrows. Detection strategies included: direct culture, extinction technique culture and Nested PCR of the ITS1-5.8S-ITS2 region, as well as the evaluation of one armadillo (D. novemcinctus) as positive control for the studied area. Although the pathogen could not be isolated by the culturing strategies, the aerosol sampling associated with molecular detection by Nested PCR proved the best method for detecting Paracoccidioides sp. in the environment. Most of the ITS sequences obtained herein presented high similarity with the homologous sequences of P. lutzii from GenBank database, suggesting that this Paracoccidioides species may be not exclusive to mid-western Brazil as proposed so far / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-06T11:45:45Z No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-03T17:27:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-03T17:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) Previous issue date: 2008-04 / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é um fungo saprófito e dimórfico de importância clínica, pois seus propágulos, quando inalados por humanos, desencadeiam a doença conhecida como paracoccidioidomicose. No ano de 2005 foi publicado o transcriptoma do Pb, apontando diversos alvos potenciais de drogas, mas ainda assim uma parte significativa dos transcritos seqüenciados não possui proteínas homólogas identificadas. Esse trabalho sugere que alguns desses RNAs possam ser não-codificadores (ncRNAs), uma classe de moléculas biologicamente funcionais que no entanto não codificam para nenhum produto protéico. Para tanto foi feita uma abordagem exclusivamente computacional, utilizando exemplos conhecidos de mRNAs e ncRNAs para treinamento de dois algoritmos de aprendizado de máquina: naive Bayes (nB) e Máquinas de Vetores de Suporte (MVS). Diversos programas descritos na literatura e desenvolvidos localmente foram usados para obter propriedades dos transcritos e de seus produtos protéicos, de forma que os algoritmos de aprendizado de máquina fossem capazes de diferenciar satisfatoriamente um mRNA de um ncRNA. O uso de várias medidas de eficiência mostra que ambos algoritmos, MVS e nB, induziram classificadores que discriminam as duas classes de RNAs de forma muito eficiente, mas também indicam que o MVS possui uma vantagem significativa em relação à sua detecção de ncRNAs. Acurácia média mensurada por validação cruzada de 10 vezes para o MVS foi de 92,4%, e para o nB, 75,3%. Quando usados no transcriptoma de Pb, o MVS e o nB detectam, respectivamente, 970 e 262 ncRNAs, dos quais a maior parte é de transcritos sem anotação e singlets, duas características que apóiam a possibilidade de que esses transcritos sejam realmente ncRNAs. Comparações a programas relacionados mostram que o programa aqui descrito apresenta um ganho em velocidade computacional sem perda de acurácia. Foi desenvolvido nesse trabalho um programa computacional de análise ab initio, designado PORTRAIT, especializado em detecção de ncRNAs em transcriptomas de organismos pouco caracterizados. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a saprophytic and dimorphic fungus of clinical importance because its propagules, when inhaled by humans, cause the disease known as paracoccidioidomycosis. In the year 2005 the Pb transcriptome was published, pointing out several potential drug targets, but still a significative amount of sequenced transcripts lack identified homologous proteins. This work suggests that these RNAs may be non-coding RNAs (ncRNAs), a class of biologically functional molecules that do not code for any protein product. Aiming this, a strictly computational approach was made, using known examples of mRNAs and ncRNAs for training two machine learning algorithms: naive Bayes (nB) and Support Vector Machines (SVM). Several programs available from literature and locally developed were used to obtain properties from transcripts and its corresponding protein products, in such a way that machine learning algorithms could successfully discriminate between mRNA and ncRNA. Several efficiency measurements show that both algorithms, SVM and nB, induced classifiers able to efficiently discriminate the two classes of RNAs, and also indicate that SVM has a significative advantage regarding ncRNA detection. Mean accuracy as estimated by 10-fold cross-validation procedure was 92.4% for SVM and 75.3% for nB. When used in the Pb transcriptome, SVM and nB detect, respectively, 970 and 262 ncRNAs, of which the majority is composed of singlets and unnanotated transcripts, two characteristics that support the possibility that these transcripts are real ncRNAs. Comparison to related works indicates that the described program offers a computational speed improvement without hindering accuracy. This work describes the design of a computational program for ab initio analysis, named PORTRAIT, specialized in detection of ncRNAs in transcriptomes from poorly characterized organisms.

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica que tem como agente etiológico o P. brasiliensis e afeta os pulmões, áreas mucocutâneas e o sistema mononuclear-fagocitário. Trabalhos anteriores usando camundongos BALB/c atímicos e eutímicos demonstraram que os animais deficientes de células T são mais suscetíveis à infecção pelo P. brasiliensis e indicaram que a imunidade celular e natural são fundamentais para promover a resistência e o controle da doença. Com base nestes dados, nosso trabalho teve por objetivo demonstrar a importância de alguns mediadores da resposta imune natural durante a PCM murina. Utilizamos como abordagem experimental a depleção de IFN-γ, IL-12, leucócitos PMN e células NK em camundongos BALB/c atímicos e eutímicos infectados por via intratraqueal com leveduras de P. brasiliensis. Nossos resultados indicaram que a depleção de leucócitos PMN não alterou a gravidade da doença, entretanto essas células parecem exercer importante papel na modulação da síntese de citocinas em animais atímicos. A IL-12, por sua vez, demonstrou ter ação relevante na resposta ao P. brasiliensis em animais deficientes de células T, pois a sua neutralização levou ao aumento do número de leveduras viáveis recuperadas nos órgãos de disseminação (fígado e baço). Os animais eutímicos que foram tratados com AcM anti IL-12 apresentaram exacerbação da doença pulmonar e esplênica mas em ambas as linhagens não encontramos quaisquer alterações nas reações de HTT e no tempo de sobrevida. Os nossos experimentos confirmaram o papel fundamental do IFN-γ no controle doença tanto nos animais eutímicos que apresentaram redução das reações de HTT e exacerbação da doença, como também nos deficientes de células T que demonstraram, além do aumento da gravidade da doença, a redução do tempo de sobrevida. Analisamos também a participação da célula NK por serem consideradas fontes expressivas da síntese de IFN-γ. Observamos a exacerbação da doença pulmonar e a disseminação do fungo para o fígado e baço nos animais atímicos. A depleção dessas células em animais eutímicos induziu somente o agravamento da infecção pulmonar, sem maior comprometimento de outros órgãos. A reação de HTT e a taxa de mortalidade não sofreram alterações em ambas as linhagens. As células NK demonstraram atuar como moduladoras da síntese de imunoglobulinas em animais atímicos e de citocinas em eutímicos e também participaram da quimiotaxia de leucócitos PMN nos períodos iniciais da PCM. Em conclusão, usando um modelo experimental homogêneo (cepa infectante e linhagens de hospedeiros definidos) pudemos, pela primeira vez, demonstrar que o IFN-γ é o mais importante mediador da imunidade natural na imunoproteção ao P. brasiliensis. Verificamos também a contribuição relativa da IL-12 e dos leucócitos PMN na proteção da PCM pulmonar. Além disso, também pela primeira vez, foi caracterizada in vivo a importância das células NK no controle da infecção pelo P. brasiliensis. / The Paracoccidioidomicose (PCM) is a systemic infection caused by P. brasiliensis and affects the lungs, mucocutaneous areas and the mononuclear-phagocitary system. Previous works using athymics and euthymics BALB/c mice demonstrated that T cells deficient animals are more susceptible to the infection and indicated that the cellular and natural immunity is essential to promote the resistance and the control of disease. Based in these data, the objective of our work was demonstrated the importance of some natural mediators during murine PCM immune response. As experimental protocols we used the systemic depletion of IFN-γ, IL-12, PMN leukocytes and NK cells in athymics and euthymics BALB/c mice infected by intratracheal route with P. brasiliensis yeasts. Our results indicated that PMN leukocytes depletion did not alter the severity of infection; however these cells showed to exert important function in the cytokines synthesis modulation in athymics mice. In turn, the IL-12 demonstrated relevance action in T cells deficient mice response to P. brasiliensis infection, its neutralization induces an increased of viable yeasts numbers recovered in the dissemination organ (liver and spleen). The euthymics animals treated with anti IL-12 MAb presented an exacerbation of pulmonary and spleenic disease but in both species did not finds any alteration in the HTT reaction or survival times. Our experiments confirm the fundamental action of IFN-γ in disease control in both strains that showed decreased in the HTT reaction, disease exacerbation. These depletion in T cells deficient mice it also induced a decreased in survival times. We also analyzed the NK cells participation because are considered important sources of IFN-γ synthesis. We observed in athymics mice an exacerbation of pulmonary disease and fungal dissemination to liver and spleen. This depletion, in euthymics, mice induces only the pulmonary infection aggravation, other organs were not affected. The HTT reaction and mortality alterations were not observed in both strains. We demonstrated that NK cells acting as immunoglobulins synthesis modulators in athymics mice and the cytokines in euthymics mice and also participated of PMN leukocytes attractive in early PCM. In conclusion, using an experimental homogeneous model (infectant agent and strains hosts defined) we demonstrated for the first time that the IFN-γ is the most important mediator of the natural immunity in the immunoprotection to the P. brasiliensis. We also verificated the relative contribution of IL-12 and PMN leukocytes in the PCM pulmonary protection. Moreover, we also characterized, for the first time in vivo, the NK cells importance to the control of P. brasiliensis infection.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4510_1.pdf: 1312401 bytes, checksum: 103b70bf03d8851fef2766e8bd0290f9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico e agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de evolução aguda ou crônica que se não diagnosticada e tratada a tempo pode ser fatal. Um método molecular para caracterização e detecção de P. brasiliensis foi desenvolvido a partir da clonagem e do sequenciamento de um fragmento de DNA de ~750 pb, obtido por RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), presente em isolados virulentos e ausente em isolados avirulentos deste fungo. Uma região interna do fragmento de DNA seqüenciado foi usada para desenhar primers que posteriormente foram utilizados em uma reação de hemi-nested PCR em tubo único. A reação de PCR específica foi capaz de amplificar DNA de três isolados de P. brasiliensis reconhecidamente virulentos e três isolados recentemente obtidos de pacientes com paracoccidioidomicose. A especificidade desta PCR foi confirmada pela ausência de produtos amplificados com DNA genômico de isolados de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Mycobacterium tuberculosis, Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, DNA genômico humano (leucócitos) e de isolados de P. brasiliensis reconhecidamente avirulentas. A amplificação de cDNA de um isolado virulento sugere tratar-se de um gene expresso. A detecção específica de isolados virulentos de P. brasiliensis sugere ser este um candidato a marcador de virulência para este fungo. O potencial diagnóstico da PCR específica foi verificado com DNA extraído de aspirado de linfonodo de um paciente com paracoccidioidomicose

Orientador: Maria Heloísa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:53:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SaradeJesus_D.pdf: 1409092 bytes, checksum: 77c1f0b5742ae7b24491a77030821e3f (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina, acometendo hoje mais de 10 milhões de pessoas e apresentando as maiores taxas de mortalidade nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. A infecção se dá pela via respiratória sendo que a grande maioria de indivíduos que entram em contato com o fungo, não desenvolve a doença. Esta condição chamada PCM-infecção ocorre em indivíduos que moram em áreas endêmicas e apresentam teste cutâneo de HTT positivo aos antígenos do fungo. A progressão de infecção para doença origina duas formas clínicas principais: a forma aguda ou juvenil (FJ), de maior gravidade e a forma adulta ou crônica (FA), mais localizada e menos agressiva. Com o objetivo de estudar a epidemiologia e o perfil imunológico da PCM humana na cidade de Campinas, analisamos as características gerais (sexo, idade profissão) de pacientes atendidos no HC da UNICAMP e a incidência da doença na região, juntamente com seus fatores de risco e suas formas clínicas. Avaliamos também a resposta imune celular (proliferação de linfócitos a antígenos do fungo e produção de citocinas do tipo Th1 e Th2), em pacientes com as formas adulta e juvenil da doença, indivíduos portadores da infecção e controles saudáveis (teste cutâneo de HTT negativo). Nossos resultados mostraram que a PCM é endêmica em Campinas e região, acometendo em sua maioria, indivíduos adultos do sexo masculino, trabalhadores rurais e da construção civil. No entanto, encontramos elevado número de pacientes do sexo feminino e crianças com a forma juvenil da doença, mais grave e disseminada. Esses pacientes apresentam resposta imune celular suprimida, caracterizada por teste cutâneo negativo e proliferação de linfócitos reduzida a antígenos do fungo, enquanto produzem citocinas do tipo Th2, com aumento de IL-4 e IL-5, juntamente com baixos níveis de IFN-?, TNF-? e IL-12. Apresentam também, no período inicial da infecção, número elevado de eosinófilos no sangue periférico e em biópsias de linfonodos. Ao contrário, indivíduos portadores da PCM-infecção apresentam proliferação de linfócitos bastante acentuada a antígenos do fungo, teste cutâneo positivo, ausência de anticorpos e padrão de resposta Th1 com produção de IFN-?, IL-2, TNF-? e IL-12, e níveis basais de IL-4, IL-5 e IL-10. Já os pacientes com a forma adulta apresentam resposta imune celular preservada, com teste cutâneo que variam de acordo com a forma unifocal ou multifocal da doença. De modo geral, produzem menores níveis de IL-4 e IL-5 e níveis aumentados de TNF-? e IL-12. Esses resultados nos permitiram situar a forma adulta da paracoccidioidomicose como intermediária entre o padrão Th2 de resposta imune apresentado pela forma juvenil e o padrão Th1 desenvolvido pelos indivíduos portadores da PCM-infecção / Abstract: We studied the clinical-seroepidemiological characteristics of patients with paracoccidioidomycosis (PCM) attended at the University Hospital at UNICAMP (Campinas, São Paulo, Brazil). The study group consisted of 584 individuals (492 M, 92 F) with ages ranging from 5 to 87 years. The highest incidence of the disease occurred between the ages of 41 and 50 years for men and 11 and 40 for women. Rural activities were the principal occupation of 46% of the patients. The diagnosis was confirmed by histopathological examination and by demonstration of fungus in scrapings, secretions or in the sputum. Serological tests for PCM were positive in 80% of the 584 patients studied. The significant number of patients, including 33 children under 14 years old, is an indication of the fungus? presence in the area and indicates that this region is an important endemic area for paracoccidioidomycosis. Cellular immune response to Paracoccidiodes brasiliensis antigens (PbAg) was evaluated in patients with the juvenile (JF) and adult (AF) forms of paracoccidioidomycosis (PCM) as well as in a group of infected individuals living in the endemic area but without any clinical manifestation of the disease. The immune profile of this group of PCM-infected (PI) individuals was characterized by: 1) a positive skin test to P. brasiliensis antigen, 2) absence of specific antibodies, 3) a vigorous lymphoproliferative response to PbAg, and 4) a typical Th1 pattern of cytokines, with production of IFN-?, IL-2, IL-12 and TNF-? and basal levels of IL-4, IL-5 and IL-10. At the opposite end of the spectrum were the JF patients whose proliferative response to PbAg was significantly impaired and whose cytokine pattern was characteristically Th2, i.e., lower IFN-? TNF-? and IL-12 secretion and significantly higher levels of IL-4 and IL-5. These profiles are compatible with forms of higher and lower resistance, respectively. Intermediate immune responses were observed in AF patients, whose specific lymphoproliferative response was lower than in the PI group but higher than in the JF patients. The secretion of IFN-? and IL-10 did not differ from the JF group, although IL-4 and IL-5 levels were significantly lower, and TNF-? and IL-12 higher. Since AF patients are able to control fungal dissemination for decades, they can be considered more resistant than JF patients, who manifest the disease soon after infection / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fornazim_MarciaCristina_D.pdf: 1869002 bytes, checksum: b2e5012f736532c7b201f92582544179 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resposta Th1 com a ativação eficiente de macrófagos constituiu o principal mecanismo de defesa na infecção causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Componentes do sistema imune inato que induzem a polarização a resposta adaptativa como as células dendríticas (DCs) e seus produtos foram pouco explorados, principalmente na doença humana. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente e funcionalmente DCs obtidas a partir de monócitos do sangue periférico (MSP) de indivíduos saudáveis (C), pacientes com a forma adulta (FA) e juvenil (FJ) da paracoccidioidomicose (PCM), estimuladas in vitro por células leveduriformes do fungo P. brasiliensis das cepas Pb18 (alta virulência) e Pb265 (baixa virulência). Em uma segunda etapa pretendeu-se verificar se estas DCs eram capazes de ativar linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos. Os MSP foram cultivados na presença de IL-4 e GM-CSF por 7 dias e posteriormente submetidos à estimulação por células leveduriformes do fungo (Pb18 ou Pb265) ou CD40L (controle positivo) ou somente meio (SE) por 18 horas. DCs derivadas de monócitos do sangue periférico dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) se diferenciam em DCs maduras na presença de células leveduriformes do fungo. Nos pacientes com as FA e FJ as células leveduriformes Pb18 e Pb265 induzem maturação semelhante nas DCs que passam a expressar características morfológicas e fenótipo de células maduras com aumento da expressão dos marcadores de maturação (CD83 e CCR7), das moléculas de coestimulação (CD80/B7-1 e CD86/B7-2), das moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (HLA-I e HLA-II), dos receptores envolvidos no reconhecimento de antígenos (TLR2, TLR4 e dectina-1) e diminuição da expressão do CD1a e CD209. No grupo C foram observadas as mesmas características de fenótipo acima mencionadas, mas de forma mais evidente em DCs que foram estimuladas com as células leveduriformes da cepa Pb265, quando comparada a Pb18. DCs estimuladas com CD40L mostraram potencial máximo de expressão dos marcadores de superfície. Constatou-se também em DCs do grupo controle uma diminuição da capacidade fagocítica, após 18h de contato com as células leveduriformes do fungo, comprovando o processo de maturação, que foi mais efetivo na presença de Pb265. A análise da expressão gênica demonstrou que ambas as células leveduriformes do fungo induziram a expressão de TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 e TGF- . A estimulação das DCs com as células leveduriformes da cepa Pb265 induziu aumento da expressão de IL-6 (C, FA, FJ). Em relação à IL-10 as células leveduriformes Pb265 induziram maior expressão somente nos pacientes (FA e FJ). Na segunda etapa do estudo verificou-se que DCs fenotipicamente competentes foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos de forma mais acentuada quando eram provenientes de pacientes. Nestes grupos (FA e FJ) também foi constatada uma diminuição da frequência de linfócito T CD4+/CD8+/CD45RA+ e um aumento da frequência células CD4+/CD8+/CD45RO+ e CD4+/CD8+/CD69+. Inesperadamente, os resultados também mostraram que DCs dos 3 grupos estudados, que foram estimuladas com células leveduriformes do fungo, induziram a proliferação de linfócitos T CD3+CD4+CD25+Foxp3+, em relação às DCs que não receberam estímulos (SE). DCs de pacientes que foram estimuladas por ambas as células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IL-2, IL-17, IL- 10 e IFN- por LT/CD3+CD8(neg), quando comparada com DCs do grupo C. Por outro lado, DCs dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) que foram estimuladas células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IFN- por LT/CD3+CD8+. Em conjunto os resultados do nosso estudo mostraram que a estimulação com células leveduriformes do fungo induz uma população heterogênea de DCs, capazes de dar origem a uma resposta linfocitária mista com proliferação de linfócito Th1 (produtoras de IFN-?), Th17 (produtoras de IL-17) e células com fenótipo regulatório Foxp3+ (produtoras de IL-10) / Abstract: A Th1 response with an efficient activation of macrophages is the main mechanism of defense in Paracoccidioides brasiliensis infection. Components of the innate immune system that induce the polarization of the adaptive response such as dendritic cells (DCs) and their products have been little explored, particularly in human disease. The aim of this study was to phenotypically and functionally characterize DCs obtained from peripheral blood monocytes (PBM) of healthy individuals (C), patients with the adult form (AF) and juvenile form (JF) of paracoccidioidomycosis (PCM), induced in vitro by P. brasiliensis yeasts cells of Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) strains. In a second step we sought to determine whether these DCs were capable of activating autologous CD4/CD8 T cells. PBM were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 7 days and then stimulated by yeasts cells (Pb18 or Pb265) or CD40L (positive control) or medium only (WE), for 18 hours. PBM of the 3 groups (C, AF, JF) acquired the capacity to differentiate into DCs in the presence of P. brasiliensis yeasts cells. In patients with FA and FJ yeast cells induced maturation of DCs with increased expression of maturation markers (CD83 and CCR7), co-stimulatory molecules(CD80/B7-1 and CD86/B7-2), antigen presentation molecules (HLA-I and HLA-II), receptors involved in antigen recognition (TLR2, TLR4 and dectin-1) and decreased expression of CD1a and CD209. DCs from group C showed the same phenotypic characteristics, more evident in DCs that were stimulated with Pb265 when compared to Pb18. DCs stimulated with CD40L showed maximum expression of surface markers. A decrease in phagocytic capacity was detected in DCs of the control group after stimulation with yeast cells, demonstrating the maturation process, which was more effective in the presence of Pb265. The gene expression analysis showed that both strains of yeasts cells induced expression of TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 and TGF- mRNA. Stimulation of DCs with Pb265 induced increased expression of IL-6 in all groups. Pb265 also induced a higher expression of IL-10 mRNA only in patients (AF and JF). Our study also showed that phenotypically competent DCs were able to stimulate the proliferation of autologous CD4+/CD8+ cells, mainly in patients. In these groups (FA and FJ) it was also observed a reduction in the frequency of CD4+/CD8+/CD45RA+ and na increased frequency of CD4+/CD8+/CD45RO+ and CD4+/CD8+/CD69+. Unexpectedly, the results also showed that DCs stimulated with the yeast cells induced proliferation of T lymphocytes CD3+CD4+CD25+Foxp3+, compared to DCs that received no stimulation. DCs from patients stimulated by both strains of yeast cells induced a higherr production of IL-2, IL-17, IL-10 e IFN- by LT/CD3+CD8(neg) compared with DCs from group C. Moreover, DCs from the 3 groups also induced a stronger IFN-? production by CD3+/CD8+T cells. Altogether the results showed that stimulation with P. brasiliensis yeast cells induces a heterogeneous population of DCs, capable of giving rise to a mixed lymphocyte response with proliferation of Th1, Th17, and Foxp3+ cells / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_D.pdf: 7669317 bytes, checksum: eeec29689d95e50ddec45928c2c76343 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro / Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular