Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:10:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaCarolina_D.pdf: 3693187 bytes, checksum: 65dcd416d067ae66b391e67841a7b240 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é a micose sistêmica de maior incidência no Brasil. Estudos anteriores demonstraram que a resistência ou suscetibilidade a essa infecção podem ser associadas, respectivamente, a padrões de resposta Th1 ou Th2. Recentemente, foram descritas novas subpopulações de linfócitos T, dentre elas as células Th17, que tem se mostrado importantes na proteção contra infecções fúngicas, mas cujo papel ainda não foi estudado na PCM humana. A diferenciação de células T CD4+ é modulada após o reconhecimento do patógeno por células dendríticas (DCs) por meio de vários receptores de reconhecimento padrão (PRRs), os quais modulam a diferenciação de células Th1, Th2 e Th17. Neste trabalho investigamos o papel dos receptores TLR2, TLR4 e Dectina-1 no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis (Pb) por DCs derivadas de monócitos, assim como, a capacidade dessas DCs em modular a diferenciação de linfócitos T CD4+. Observamos que DCs expostas a células leveduriformes de Pb apresentam um fenótipo maduro (expressão de CCR7, CD83, CD86 e MHC II) e produzem citocinas (IL- ?, IL-6, IL-23, TNF-? e TFG- ?), levando à diferenciação de linfócitos T CD4+ produtores de IL-17, IFN-?, IL-22, IL-17/IL-22 e IL-17/IFN- ?. Também observamos que DCs estimuladas com células leveduriformes de Pb apresentam ativação de moléculas envolvidas na sinalização via TLRs e Dectina-1 (JNK, p38, Akt e ERK para os TLRs e Syk para Dectina-1), e que o bloqueio de Dectina-1 e/ou TLR2 resultou em um número menor de células Th17. Ao analisar a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico, observamos que pacientes com a FJ da PCM apresentam produção aumentada de IL-4 e que pacientes com a FA apresentam produção elevada de IL-17 e IFN- ?. Em conjunto nossos resultados demonstram que a Dectina-1 e TLR2 são os receptores mais importantes para o reconhecimento de leveduras de Pb por células dendríticas e que esse reconhecimento pode levar à diferenciação de linfócitos T efetores produtores de IL-17 e IFN- ?. Além disso, podemos concluir que a FA da PCM apresenta uma resposta imunológica mista, com participação de linfócitos Th17 / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), is the most prevalent systemic mycosis in Brazil. Previous studies showed that resistance or susceptibility to PCM can be associated to a Th1 or Th2 responses respectively. More recently, Th17 response was showed to be protective in fungal infections, but there is no data about Th17 cells in human PCM. T CD4+ differentiation is elicited and shaped after pathogen recognition by dendritic cells (DCs) through several PRRs, which modulate Th1, Th2 and Th17 generation. In this study we evaluated the role of TLR-2, TLR-4 and Dectin-1 in the recognition of Pb yeast cells by monocytes derived DCs, as well as, the capability of these DCs to modulate T CD4+ lymphocytes differentiation. We observed that DCs exposed to Pb presented a mature phenotype (expression of CCR7, CD83, CD80, CD86 and MHC II) and produce cytokines (IL-1, IL-6, IL-23, TNF-? and TGF- ) that promote the differentiation of TCD4+ lymphocytes producing IL- 7, IFN-?, IL-22, IL-17/IL-22 and IL-17/IFN-?. We also observed that DCs stimulated by Pb presented activation of molecules involved in the TLRs and dectin-1 signaling (JNK, p38, AKT, ERK - for TLRs and Syk for dectin- The blockage of dectin-1 and/or TLR2 diminished the differentiation of Th17 cells. We also analyzed PBMCs from patients with the acute/juvenile form (JF) or the chronic/adult form (AF) of PCM. Our results showed that patients with JF present elevated production of IL-4 and AF patients present higher production of IL-17. Altogether our results showed that Dectin-1 and TLR-2 are the most important receptors for human DCs to recognize Pb yeast cells and to produce cytokines such as IL- , IL- ? and TNF-?. After DC activation and cytokine production these cells are able to induce Th1 and Th17 differentiation through these receptors. Also we showed that Th17 cells are a major population in AF patients / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), que acomete preferencialmente o pulmão, sendo este um dos poucos órgãos que está em continua e intensa interação com o meio ambiente e o sistema imune. O grande desafio para o sistema imune pulmonar é discriminar o que é nocivo e reagir de acordo. As células dendríticas (DCs) são apresentadoras de antígenos \"profissionais\" capazes de fazer o processamento do antígeno e a apresentação de peptídeos a linfócitos T e são ideais para manter este equilíbrio delicado entre a tolerância e uma resposta imune efetora. Sabendo da importância dessas células no sistema imune e que a infecção por P. brasiliensis ataca preferencialmente o pulmão, células de lavado broncoalveolar (BAL), após infecção experimental com leveduras de P. Brasiliensis, foram analisadas. Nós observamos um significante aumento de DCs no BAL após 24hrs da infecção intratraqueal com 104 leveduras de P. brasiliensis. A caracterização das DCs mostraram que essas células expressaram CD11c, MHC-II e DEC205. A fim de verificar a capacidade de migração das DCs, as mesmas foram diferenciadas a partir de células de medula óssea e pulsadas com leveduras de P. brasiliensis, marcadas com CFSE e injetadas intratraquealmente em camundongos. Como controle negativo, utilizamos PBS e DCs não pulsadas com o fungo. Os resultados mostraram, que após 12 horas de infecção, as DCs (CFSE+CD11c+), migraram para os linfonodos torácicos. No entanto, a quantidade destas células diminui discretamente após 24 horas de infecção. Além disso, não observamos DCs nos linfonodos regionais, quando analisamos os grupos controle. Dessa forma, as células pulmonares também foram marcadas in vivo injetando-se intratraquealmente o corante CFSE juntamente com leveduras de P. brasiliensis. Verificamos que após 12 horas, as DCs pulmonares, dos animais infectados com o fungo, migraram para os linfonodos regionais. Esses resultados comprovam que o fungo P. brasiliensis foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para linfonodos regionais, e induziu nesse órgão uma resposta por células T evidenciada pela produção preferencial de IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), which mainly affects the lungs. They are one of the few organs that are in constant and intense interaction with the environment and the immune system. The great challenge for the pulmonary immune system is to discriminate what is harmful and react accordingly. Dendritic cells (DCs) are \"professionals\" antigen-presenting cells and they can do the antigen processing. They can also do the presentation of peptides to T lymphocytes and are ideal for maintaining this delicate balance between tolerance and an effector immune response. Knowing the importance of these cells in the immune system and that the infection by P. brasiliensis preferentially attacks the lungs, cells from bronchoalveolar lavage (BAL), after experimental infection with yeasts of P. Brasiliensis, were analyzed. We observed a significant increase of DCs in BAL after 24 hours of intratracheal infection with 104 of yeast cells of P. brasiliensis. The characterization of these cells showed that DCs expressed CD11c, MHC-II and DEC205. In order to verify the ability of migration of DCs, they were differentiated from bone marrow cells and pulsed with yeasts of P. brasiliensis, they were also labeled with CFSE and injected intratracheally into mice. As a negative control, we used PBS and DCs that were not pulsed with the fungus. The results showed that after 12 hours of infection, the DCs (CFSE + CD11c +), migrated to the thoracic lymph nodes. However, the quantity of these cells decreases slightly after 24 hours of infection. Furthermore, we observed no DCs in regional lymph nodes when we analyzed the control groups. Thus, the lung cells were also labeled in vivo by injecting the CFSE dye intratracheally with yeasts of P. brasiliensis. We found that after 12 hours, pulmonary DCs of the animals infected with the fungus migrated to regional lymph nodes. These results indicate that the fungus P. brasiliensis was able to activate DCs, inducing their migration to regional lymph nodes, and inducing a response in that organ by T cells as evidenced by preferential production of IL-10.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a infecção fúngica sistêmica de maior prevalência na América Latina, cujo agente etiológico, Paracoccidioides brasiliensis, é um fungo com estrutura de parede celular complexa constituída de proteínas, glicoproteínas, polissacarídeos, lipídeos, polipeptídios e melanina que reúnem condições físico-químicas e biológicas para atuarem como antígenos. Anticorpos direcionados contra antígenos presentes na parede de P. brasiliensis podem interferir no curso da doença. Os mecanismos com os quais anticorpos específicos medeiam à proteção contra fungos estão em processo de elucidação por vários grupos de pesquisadores. No entanto, estas moléculas podem ser protetoras, proporcionando o aumento da eficácia de células efetoras do hospedeiro contra o fungo e modular a produção de citocinas, entre outros processos. O tratamento da PCM é relativamente eficiente, porém, é muito longo, por isso alguns pacientes desistem ou não seguem adequadamente o tratamento, resultando em reativação do foco infeccioso. Nesse sentido, avaliamos o efeito da transferência passiva de anticorpos policlonais contra glicolipídios acídicos por meio de protocolos profiláticos e terapêuticos em animais infectados com P. brasiliensis. Nos ensaios in vivo, os resultados mostraram que os animais tratados apresentaram diminuição significante da carga fúngica e de danos nos tecidos dos pulmões. A dosagem de citocinas apontou aumento de IFN-? e IL-12, modulando a resposta imune para o padrão Th1. Ensaios in vitro demonstraram que o tratamento com anticorpos policlonais gerados contra os glicolipídios acídicos foram capazes de aumentar a atividade fagocítica, a produção de óxido nítrico e morte das leveduras de Pb 18, por macrófagos peritoneais J774. O tratamento com anticorpos policlonais contra antígenos de natureza glicolipídica mostrou ser importante ferramenta para a busca da cura da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection most prevalent in Latin America, whose etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, is a yeast with a complex cell wall structure consisting of proteins, glycoproteins, polysaccharides, lipids, and melanin polypeptides that gather physical, chemical and biological conditions to serve as antigens. Antibodies against antigens present in the wall of P. brasiliensis can interfere with the course of the disease. The mechanisms by which antibodies mediate protection against fungi are in the process of elucidation by several research groups. However, these molecules may be protective, providing increased efficiency of effector cells of the host against the fungus and modulating the production of cytokines, among other things. Treatment of PCM is relatively efficient, however, it takes long time and some patients drop out before it ends or do not follow the treatment properly resulting in reactivation of infectious focus. Accordingly, we evaluated the effect of passive transfer of antibodies against acidic glycolipids by prophylactic and therapeutic protocols in animals infected with P. brasiliensis. The results of in vivo tests, showed that the treated animals had a significant reduction in fungal load and tissue damage in the lungs. The noted increase in cytokine IFN-? and IL-12 modulated the immune response to Th1. In vitro assays have shown that treatment with polyclonal antibodies generated against the acidic glycolipids were able to increase the phagocytic activity, production of nitric oxide and killing of yeast Pb 18 by peritoneal macrophages. Treatment with antibodies against glycolipids antigens proved to be an important tool to search for the cure of PCM.

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença que atinge primariamente os pulmões, podendo também ocorrer de forma sistêmica e, é causada pelo fungo termo dimórfico Paracoccidioides spp. Os principais medicamentos para o tratamento da PCM são quimioterápicos poliênicos, compostos sulfanilamídicos e os azóis. Uma possível ferramenta para tratar e/ ou prevenir a PCM é o uso de vacinas para a geração de resposta imune principalmente do tipo Th1, produtora de IFN-gama, citocina com papel importante para o controle da doença. Um dos candidatos vacinais mais estudados para a PCM, é a vacina com base no peptídeo P10, formado por 15 resíduos de aminoácidos (aa), derivado da glicoproteína de 43 kDa de P. brasiliensis. Com o objetivo de se aprimorar o efeito imunomodulador do peptídeo P10, foi proposto neste trabalho a sua complexação com nanopartículas poliméricas de quitosana. A quitosana foi escolhida em função das suas características físico-químicas e biológicas tais como biocompatibilidade e mucoadesividade, características essenciais para o trabalho em questão. As nanopartículas de quitosana complexadas com o peptídeo P10 em diferentes concentrações foram produzidas a partir da técnica de gelificação iônica e, posteriormente caracterizadas em função do seu tamanho, índice de poli dispersão (PDI) e potencial Zeta (potencial Z). A eficiência de encapsulação foi avaliada utilizando-se o Qubit™ Protein Assay Kit e a toxicidade verificada por ensaios de hemólise e viabilidade celular de macrófagos murinos, da linhagem J774.16. As nanopartículas apresentaram tamanho médio de 220 nm, PDI abaixo de 0,5 e potencial Zeta de + 20 mV. A eficiência de encapsulação foi maior que 90% e não houve citotoxicidade nas primeiras 24 horas. O tratamento com as nanopartículas contendo diferentes concentrações do peptídeo P10 foi eficiente na redução da carga fúngica pulmonar, durante a PCM murina. Estes resultados mostram que a nanopartícula é estável e apresenta as características físico-químicas desejáveis para este trabalho, sendo elas capazes de reduzir de 4 a 20 vezes a concentração usual padrão do peptídeo P10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a disease caused by the thermo-dimorphic fungal species of Paracoccidioides spp. that mainly affects the lungs and can also occur systemically. The main drugs for the treatment of PCM are polyene chemotherapeutics, sulfanilamidic compounds and azoles. As an alternative for treating and / or preventing PCM, the use of vaccines has been explored, allowing the generation of a Th1-type immune response, with IFN-γproduction, important for the control of the disease. One of the most studied vaccine candidates is the P10 peptide-based vaccine, consisting of 15 amino acids (aa), which is derived from the 43 kDa glycoprotein of P. brasiliensis. In order to improve the immunomodulatory effect of P10 peptide, the complexation with chitosan polymer nanoparticles is being proposed in this project. Chitosan was chosen according to its physico-chemical and biological characteristics such as: biocompatibility and mucoadhesiveness, essential characteristics for this project. The nanoparticles complexed with P10 peptide at different concentrations were produced from the ionic gelation technique and their size, poly dispersion index (PDI), and Zeta potential (Z potential) were analyzed. The encapsulation efficiency was assessed using the Qubit™ Protein Assay Kit and the toxicity verified by hemolysis and cell viability assays with murine J774.16 macrophages. The nanoparticles obtained presented a size of approximately 220 nm, PDI below 0.5 and Zeta potential of approximately + 20 mV. The encapsulation efficiency was greater than 90% and there was no cytotoxicity in the first 24 hours. Treatment with the nanoparticles containing different concentrations of P10 peptide was efficient in reducing lung fungal load during murine PCM. These results show that the nanoparticle is stable and presents the physicochemical characteristics desirable in this project, being able to reduce from 4 to 20 the usual standard concentration of the peptide P10 peptide.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica, que tem como agentes etiológicos fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides. A produção de melanina por vários fungos interfere no mecanismo da patogênese, como ocorre na paracoccidioidomicose. O presente projeto visou avaliar a produção de melanina pelos isolados de P. lutzii, e seus efeitos in vitro, avaliando o processo de fagocitose. Os resultados obtidos durante este trabalho mostraram que os isolados de P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 e Pb8334) melanizam de formas diferenciadas entre eles e quando comparados com isolados de P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 e Pbcão). Ensaios de fagocitose, com os isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, mostraram que a melanina reduziu a porcentagem de fagocitose das leveduras não tratadas de Pb18 e Pb60855, e o contrário aconteceu com Pb01. As análises dos perfis proteicos e enzimáticos dos isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, permitiram determinar que o isolado Pb01 produz uma menor quantidade de proteínas que Pb18 e Pb60855 nas condições ensaiadas. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a granulomatous systemic mycosis, whose etiological agents are dimorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Melanin production by various fungi interferes in the mechanism of pathogenesis, as in paracoccidioidomycosis. Thus, this project aimed to evaluate the production of melanin by isolates of P. lutzii and its in vitro effects by assessing the process of phagocytosis. The results obtained during this work showed that the isolates of P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 and Pb8334) produce melanin in different ways between them and also when compared with isolates of P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 and Pbcão). Phagocytosis assays, with Pb18, Pb60855 and Pb01, showed that melanin reduced the percentage of phagocytosis of untreated yeast of Pb60855 and Pb18 and the opposite happened with Pb01. The analysis of the protein and enzymatic profiles, of the isolates Pb18, Pb60855 and Pb01, enabled to determine that the isolated Pb01 produces a smaller amount of proteins compared with Pb18 and Pb60855 in the tested conditions.

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis e é considerada a 10º causa de morte dentre doenças infecciosas e parasitárias no Brasil. As células dendríticas (DCs) são as mais eficientes na apresentação de antígenos, e sendo de 100 a 1000 vezes mais eficientes que um adjuvante não específico. P10, motivo específico de 15 aminoácidos derivado da gp43 excretada pelo fungo, é reconhecido por linfócitos T, direciona para resposta Th1 e confere proteção no modelo experimental. Nesse sentido, analisamos a capacidade de DCs pulsadas com P10 em ativar uma resposta protetora. In vitro observamos que a proliferação de esplenócitos foi maior quando a reestimução era feira com P10 e DCs juntos. In vivo, camundongos infectados e tratados com DCs pulsadas com P10 apresentaram diminuição da carga fúngica e melhoria do tecido pulmonar, aumento de IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 e diminuição de IL-4/IL-10. Esses resultados evidenciam o potencial das DCs atuando como adjuvante para o P10 em uma vacina para o tratamento e cura da PCM. / Paracoccidiodomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis. In Brazil, it is ranked as the tenth cause of death among the chronic infectious and parasitic diseases. Dendritic cells (DCs) are the most efficient antigen presenting cells, and they are at least 100-1000 times more efficient than a non specific adjuvant. The P10, 15-amino acid peptide motif derived from gp43 secreted by the fungus, is recognized by T cells, induces Th1 response and protects mice in a murine model of the disease. In the present work we analyzed the ability of DCs pulsed with P10 to elicit a protective response. In vitro results showed that a stronger proliferation of the splenocytes was reached when induced by DCs with P10. In vivo, mice infected and treated with DCs pulsed with P10 showed reduce of the fungi burden with less inflamed areas, higher levels of IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 and lower levels of IL-10/IL-4. All that point out the importance of the adjuvant role of DCs when developing a vaccine using P10 for the treatment or cure of PCM.

A paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica e endêmica em diversos países da América Latina, é um importante problema de saúde pública. Embora exista tratamento, o mesmo é prolongado e casos de recidiva são comuns. Nesse sentido, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, como as vacinas, são importante. Além disso, é imprescindível compreender a participação de algumas células na resposta vacinal. Desse modo, o objetivo dessa tese foi comprovar se os neutrófilos são importantes para a resposta vacinal utilizando modelo experimental de paracoccidioidomicose. Nós observamos que a vacina terapêutica reduziu a carga fúngica pulmonar em animais com 15 ou 30 dias de infecção. Além disso, foi observado redução de neutrófilos e formação de NETs nos pulmões dos animais infectados por 15 dias. Assim, nós concluímos que a vacina pode alterar a infiltração dos neutrófilos no local da infecção e isso parece depender do tempo de infecção. Além disso, nós observamos que os neutrófilos parecem ter um envolvimento durante o momento em que a vacina é administrada. / Paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis and endemic in several Latin American countries, is an important public health problem. Although there is treatment, it is prolonged and cases of relapse are common. In this sense, the development of new therapeutic approaches, such as vaccines, are important. In addition, it is imperative to understand the participation of some cells in the vaccine response. Thus, the aim of this thesis was to verify if neutrophils are important for the vaccine response using an experimental model of paracoccidioidomycosis. We observed that the therapeutic vaccine reduced lung fungal load in animals with 15 or 30 days of infection. In addition, neutrophil reduction and NET formation were observed in the lungs of infected animals for 15 days. Thus, we conclude that the vaccine may alter the infiltration of neutrophils at the site of infection and this seems to depend on the time of infection. In addition, we note that neutrophils appear to be involved during the time the vaccine is administered.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a micose sistêmica mais frequente no Brasil. Na última década, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as células dendríticas utilizando o anticorpo &#945;DEC205 e na presença de um estímulo de maturação, o resultado é a indução de uma resposta imunológica. Verificamos que o anticorpo &#945;DEC fusionado ao peptídeo P10 induziu uma resposta por células produtoras de IFN-&#947; após uma única dose em relação à administração de P10, mesmo tendo sido administrado em uma concentração menor. Entretanto, essa resposta não se manteve após segunda dose do anticorpo. Após desafio dos animais com P. brasiliensis, imunizados com duas doses do anticorpo quimérico, detectamos níveis de IFN-&#947; e IL-4 no tecido pulmonar estatisticamente maiores no grupo &#945;DEC/P10 e ISO/P10 em relação à administração de P10, todos em presença de Poly I:C. Em ensaios de terapia, verificamos no pulmão de camundongos tratados com o anticorpo quimérico, principal órgão envolvido em modelo animal de PCM, baixa concentração de IFN-&#947; e IL-10 em relação aos controles. Em adição, ficou evidente que nos animais tratados com o anticorpo &#945;DEC/P10 o tecido pulmonar está compatível com o tecido de animais não infectados, enquanto que na ausência de tratamento adequado encontramos aglomerados de leveduras e um tecido com aumento no infiltrado celular. Esses achados indicam uma boa evolução clínica em animais tratados e indicam que o direcionamento do P10 através do anticorpo quimérico &#945;DEC/P10, na presença de Poly I:C, é uma estratégia promissora para terapia contra P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most common systemic mycosis in Brazil. In the last decade, it was demonstrated that antigens can be directly target to the dendritic cells using the antibody &#945;DEC205 in the presence of a maturation stimulus, resulting in the induction of a strong immune response. We found that &#945;DEC205 antibody fused to peptide P10 induced great response by IFN-&#947; producing cells after a single dose in relation to the administration of P10, although it has been administered in a lower concentration. However, this response was not maintained after second dose of antibody. Animals challenge with P. brasiliensis, after immunization with two doses of the chimeric antibody, produced high levels IFN-&#947; and IL-4 in lung tissue significantly higher in &#945;DEC/P10 group in relation to the administration of P10, all in the presence of Poly I:C. In therapy assays, we found in the lungs of mice treated with the chimeric antibody, the main organ involved in an animal model of PCM, low concentration of IFN-&#947; and IL-10 compared to controls. In addition, it became evident that animals treated with &#945;DEC/P10 antibody have a lung tissue much closer to that of non-infected tissue, while in the absence of suitable treatment we find clusters of yeasts and tissue filled with cellular infiltrates. Altogether, these findings show a clinical improvement in treated animals and indicate that targeting of P10 through the chimeric antibody &#945;DEC/P10 in the presence of Poly I:C, is a promising strategy for therapy against P. brasiliensis.