Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l'homme, responsable d'otites sévères, de pneumonies, de bactériémies et de méningites. C'est une cause majeure de mortalité et de morbidité, essentiellement chez les enfants et les personnes âgées. Il a été récemment découvert que certaines souches virulentes de S. pneumoniae portent à leur surface des pili, considérés comme un important facteur de virulence. Cependant, contrairement aux bactéries à Gram-négatif, peu de choses sont connues sur la structure des pili des bactéries à Gram-positif. Les gènes requis pour la production des pili chez S. pneumoniae sont localisés sur un îlot de pathogénicité et codent pour 3 sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) et 3 protéines structurales (RrgB, qui forme le corps du pilus, RrgA et RrgC). Celles-ci contiennent un motif LPXTG, motif de reconnaissance des enzymes sortases. Dans ce travail, nous apportons de nouvelles informations structurale, biochimique et microbiologique sur le mécanisme de formation du pilus par (1) une reconstitution du corps de la fibre in vitro après avoir identifié SrtC-1 comme étant la principale pilus-polymérase; (2) une étude de microscopie électronique montrant que les fibres produites in vitro mimaient structuralement les pili ; (3) une étude in vivo confirmant les résultats obtenus in vitro; (4) la résolution de la structure par cristallographie aux rayons X de SrtC-1 et SrtC-3 qui révèle un site actif dont l'accès est contrôlé par un couvercle flexible, contrairement aux sortases non impliquées dans la biogenèse de pili. Ces observations suggèrent que la spécificité de substrat est dictée par une reconnaissance de surface couplée à une ouverture du couvercle. Dans un second temps, nous avons caractérisé la région du site actif de SrtC-1 : la triade catalytique mais aussi les deux résidus du couvercle qui s'ancrent dans le site actif. L'identification de résidus clés dans l'activité sortasique aussi bien que dans la stabilisation structurale a été ainsi mis en évidence.

Dans la première partie du travail, suite à deux épidémies à K. pneumoniae productrices de carbapénémases, nous avons défini une stratégie précise qui nous a permis de maîtriser et de stopper la première épidémie et de très rapidement contrôler la seconde. Des mesures similaires ont été appliquées avec succès dans d'autres hôpitaux en France, en Israël et aux USA. Ces deux épidémies étant liées à la diffusion de clone épidémique, nous avons étudié la prévalence des facteurs de virulence parmi une collection internationale de souches de K. pneumoniae multirésistantes aux antibiotiques. Nous avons pu établir un lien entre résistance et virulence avec, en particulier une forte prévalence (42%) d'un îlot de pathogénicité portant la yersiniabactine, Ybts, qui joue essentiel dans l'expression du phénotype hyper-virulent de Yersinia sp. Dans la deuxième partie, nous montrons que les souches de K. pneumoniae productrices de BLSE de type CTX-M-15, sont associées à des plasmides appartenant au groupe d'incompatibilité IncF alors que les plasmides portant les gènes blaSHV et ceux portant les carbapénémases, sont moins bien caractérisés et souvent non typables par la méthode de PCR. Ces résultats incitent au séquençage des plasmides. Nous avons procédé au séquençage et à l'annotation du premier plasmide portant à la fois KPC-2 et SHV-12 isolé d'une souche de K. pneumoniae. Cette analyse nous a permis de mettre en évidence un nouveau groupe d'incompatibilité (IncX) impliqué pour la première fois dans la multirésistance chez K. pneumoniae. Nous avons pu montrer l'insertion du transposon Tn4401 (KPC) au sein du transposon portant la BLSE de type SHV-12

Les épidémies virales constituent une menace majeure pour les cultures dans de nombreuses régions tropicales et subtropicales du monde. En Afrique de l'Ouest et Centrale, malgré la caractérisation d'une multitude de nouvelles espèces de géminivirus, les connaissances sur l'épidémiologie des maladies virales émergentes restent incomplètes, notamment concernant la diversité et l'identification précise des espèces virales incriminées. Paradoxalement, si l'on considère que la plupart des maladies émergentes causées par les géminivirus sont liées à des virus infectant naturellement les plantes sauvages, et qui se seraient adaptés aux plantes cultivées introduites, la diversité des populations virales dans leurs écosystèmes naturels reste très largement méconnue. De plus, le caractère non pérenne de la majorité des plantes maraîchères suggère l'existence de plantes hôtes alternatives ou réservoirs, qui permettent aux populations virales de se maintenir lors des périodes d'intercultures. Par conséquent, pour lutter contre ces nouvelles maladies virales dévastatrices, il est primordial d'acquérir de meilleures connaissances de la diversité des populations virales des plantes cultivées et sauvages, de leurs répartitions géographiques, de leurs liens phylogénétiques, de leurs pathogénicités et des principaux facteurs épidémiologiques à ''échelle des agro-écosystèmes. Ainsi, les travaux entrepris dans cette thèse ont porté sur l'analyse d’échantillons de plantes maraichères et non cultivées provenant de 48 localités réparties sur le territoire du Burkina Faso et de Côte d'Ivoire. Nos principaux résultats confirment à la fois la non-exhaustivité de notre connaissance de la diversité des géminivirus présent sur les cultures maraîchères, avec l'existence d’au moins cinq espèces de géminivirus impliqués dans la maladie du ToLCD-TYLCD, d'un gradient Nord-Sud de complexité des espèces de géminivirus au Burkina Faso, la prédominance du PepYVMLV sur les solanées cultivées et la présence de nombreuses plantes alternatives ou réservoirs. Au regard de la découverte d'un nouveau composant d'ADN-B en association avec le PepYVMLV, les principaux paramètres du pouvoir pathogène du PepYVMLV en infection simple ou mixte avec le composant d'ADN-B ont été évalués en conditions contrôlées. Nos résultats démontrent que même si le PepYVMLV n'est pas un bégomovirus bipartite strict, l'ADN-B représente à la fois un activateur fort de la virulence, de l'accumulation du virus dans la plante et de la transmission par son insecte vecteur Bemisia tabaci, qui semblent concourir à sa prédominance sur le terrain. Une diffusion plus large de ce composant d'ADN-B représenterait une menace majeure pour la culture de la tomate au Burkina Faso, en Afrique et plus largement dans le monde. L'élargissement des analyses par l'utilisation d'une approche métagénomique à non seulement permis de confirmer la présence d'une majorité des virus décrits préalablement avec les approches classiques, mais également la caractérisation de nouvelles espèces virales. L'analyse des réseaux d'associations virus-plantes hôtes et virus-virus ont montré des liens forts entre les populations virales associés à des groupes de genres de plantes cultivées et non cultivées soulignant la nécessité de considérer les agro-écosystèmes dans leur totalité pour lutter contre les maladies à géminivirus. L'ensemble de nos résultats soulignent l'importance des travaux d'épidémiosurveillance et d'inventaire des populations virales sur les plantes cultivées et sauvages afin de comprendre le fonctionnement des communautés virales à l'échelle des agroécosystèmes et l'impact des perturbations anthropiques sur les processus d’émergence de nouvelles maladies. / Geminiviruses have emerged to become one of the largest and most economically important groups of plant-infecting viruses, and geminivirus-induced diseases are a major threat to worldwide vegetable production, particularly in tropical and subtropical regions of the world. Importantly, the accumulated body of work on some of the most important geminiviral associated diseases clearly demonstrate the role of geminiviruses associated with wild plants on the emergence of disease on imported crops. Moreover, recent metagenomic data suggested that the vast majority of viruses characterized from crops represent only a small fraction of the phytoviruses in general. It is therefore of prime interest to obtain a better knowledge of viral diversity infecting crops and wild plants, the main epidemiological parameters involved in their emergence and their dynamic at the scale of agro-ecological systems. In this work, a survey of solanaceous crop fields and their surrounding uncultivated plants from 48 localities in Burkina Faso and Ivory Coast was performed. The sample analysis using classical molecular biology tools both confirm the incompleteness of our knowledge of the geminivial diversity and the existence of numerous alternative wild host plants. At least five species of begomovirus and mastrevirus were found in association with the ToLCD-TYLCD. A North to South increasing gradient of complexity of viruses populations was uncover with PepYVMLV being the most prevalent on cultivated solanaceous plants. The discovery of the association of a newly described DNA-B component with the PepYVMLV also lead to the study of the epidemiological parameters of this co-infection. Despite this association being relaxed, it was demonstrated that the virulence of the disease, the viral accumulation and the transmission by Bemisia tabaci were increased with the presence of the co-infection with the DNA-B component. All these factors are probably associated with the success of this association on the field. Because of the extreme severity of the resulting disease, the diffusion of this new DNA-B component at a larger scale would represent a major threat to tomato culture in Burkina Faso, Africa and the world in general. The use of a metagenomic approach, allow the generalization of our findings to full agro-ecological settings. Besides confirming previous species discovery, species yet undescribed in Burkina Faso along with completely new begomovirus species were described. The inspection of the virus-plant and virus-virus associations networks allow to uncover strong links existing between the viral corteges associated to groups of cultivated and uncultivated plants. These findings emphasized the necessity to consider full agro-ecological settings plant diversity rather than only crops in order to understand and prevent geminiviruses associated diseases. Globally, our results highlight the necessity to carry on the ongoing plant disease monitoring work and the inventory of viral populations associated with cultivated and uncultivated plants in order to understand the functioning of natural geminiviral community and the impact of human practices on the emergence of viral disease.

Penicillium expansum est un contaminant commun des pomaceae (pommes et poires) causant la pourriture bleue. Ce champignon est le principal responsable de la présence de patuline dans les pommes et ses produits dérivés. Actuellement, la voie de biosynthèse de la patuline n’est que partiellement élucidée et le cluster de gènes correspondant n’est décrit que chez Aspergillus clavatus, champignon tellurique incapable de se développer dans les pommes. La caractérisation moléculaire de la voie de biosynthèse de la patuline est la condition sine qua none à toute étude visant à comprendre la régulation de la biosynthèse de la patuline, mais également à toute action permettant de limiter sa synthèse. C’est pourquoi le premier objectif de cette thèse a été de caractériser le cluster de gènes spécifique de la voie de biosynthèse chez Penicillium expansum. Celui-ci est caractérisé par une taille de 40 kb et contient les 15 mêmes gènes qu’Aspergillus clavatus, les seules différences résidant dans l’organisation et l’orientation des gènes. La caractérisation de la seconde étape de la voie de biosynthèse de la patuline a été ensuite entreprise chez Aspergillus clavatus, organisme modèle. Le gène patG code pour l’acide 6-méthylsalicylique décarboxylase responsable de la conversion de l’acide 6-méthylsalicylique en m-crésol. Pour faire suite au premier objectif, la régulation de la voie de biosynthèse de la patuline a été étudiée. Pour cela, une souche mutante pour le facteur de régulation spécifique à la patuline patL a été généré puis la production de patuline ainsi que l’expression des gènes du cluster analysés. Les résultats de cette étude ont montré que le gène patL joue le rôle d’interrupteur au sein du cluster. L’absence de patL conduit à une extinction totale de l’expression des gènes du cluster et à une abscence de production de patuline par Penicillium expansum. Dans cette même étude, des tests de pathogénicité ont été entrepris sur des pommes de différentes variétés démontrant ainsi que la patuline peut être un facteur de virulence facilitant l’infection de certaines variétés de pommes telles que la Golden Delicious ou la Pink Lady. Enfin, l’influence de la lumière a été évaluée en analysant l’impact de différentes longueurs d’ondes sur la croissance et la production de patuline de Penicillium expansum. Que ce soit in-vitro ou in-vivo, la croissance et la production de patuline sont très affectés par les lumières blanche, bleue et rouge. Favoriser le stockage des pommes sous les lumières blanche, bleue ou rouge plutôt qu’à l’obscurité pourrait devenir un moyen de prévention contre la contamination par Penicillium expansum. En conclusion, cette thèse présente un aspect fondamental avec la caractérisation du cluster de gènes chez Penicillium expansum et la caractérisation de la seconde étape de la voie de biosynthèse de la patuline ; mais aussi un aspect appliqué avec l’utilisation des lumières de différentes couleurs comme méthode de prévention contre Penicillium expansum durant le stockage des pommes. / Penicillium expansum is the common contaminant of apples and the causal agent of blue mold rot. This fungus is the main patulin producer in apple based products. Actually, the patulin biosynthesis is partially elucidates and the gene cluster has been elucidated in Aspergillus clavatus, a telluric fungi unable to grow on apples. The molecular characterization of the patulin biosynthetic pathway is the key step for a better understanding of the mechanisms leading to patulin production and will help to define strategies to reduce its presence in apple products. The first objective of this thesis was the characterization of the patulin gene cluster in Penicillium expansum. The latter includes the same 15 genes as in Aspergillus clavatus but in a different order and orientation. Then, the second step of this biosynthetic pathway has been characterized and the patG gene encode for the 6-methylsalicylic decarboxylase involved in the 6- methylsalicylic acid conversion into m-cresol. The second objective consists of the study of the patulin regulation. For that, a patL mutated strain was generated and the patulin production and the patulin gene cluster expression were assessed. The mutation of this gene results in a down-regulation of the rest of the genes in the cluster associated with a lack of patulin production. Pathogenicity tests on apples revealed that patulin could act as a virulence factor in some apple varieties, like Golden Delicious or Pink Lady. In the last part of this thesis, the influence of different wavelength lights on the growth and the patulin production by Penicillium expansum were assessed in vitro and in vivo. In both cases, growth and patulin production were significantly affected under white, blue and red lights. Consequently, the apple storage under these lights could be a good alternative to the storage in the dark. In conclusion, this thesis presents a fundamental aspect that consist in the characterization of the patulin gene cluster in Penicillium expansum and the characterization of the second step of this pathway. An applied aspect is also provided by the use of the different wavelength lights to prevent the Penicillium expansum contamination during apple storage.

Blastocystis est un protozoaire anaérobie trouvé dans le tube digestif de l’homme et de nombreux animaux. Il est à ce jour le parasite intestinal le plus fréquemment retrouvé dans les selles humaines. Dix-sept sous-types (ST1 à ST17) ont été décrits en se basant sur la comparaison des séquences du gène de l’ARNr 18S. L’infection à Blastocystis est associée à une variété de troubles gastro-intestinaux et plusieurs études suggèrent une corrélation entre la pathogénicité et le ST du parasite. Trois différents axes de recherche ont été développés. Le premier s’est focalisé sur la prévalence et la biodiversité génétique de ce parasite dans les populations humaines. Des études épidémiologiques ont été menées en France et au Liban mais aussi en Afrique en réalisant la première enquête au Sénégal. Le sous-typage des isolats a été réalisé par PCR en temps réel en ciblant un domaine du gène de l’ARNr 18S suivi d’un séquençage direct du produit de PCR. Au Liban, la prévalence de Blastocystis était de 20% dans la population globale avec une corrélation entre le ST1 et le développement de symptômes gastro-intestinaux. Dans le même pays, cette prévalence dépassait les 60% chez des patients symptomatiques et des écoliers. Au Sénégal, la prévalence observée est la plus importante jamais décrite pour ce parasite puisqu’elle atteignait 100% dans une population d’une centaine d’enfants vivant en milieu rural. Ces données soulignent l’impact socioéconomique de la blastocystose dans les pays en développement où les conditions sanitaires sont souvent précaires. En France, une prévalence importante de 18% a pourtant été observée dans une large étude épidémiologique englobant des patients présentant ou non des symptômes et suivis dans 11 hôpitaux répartis sur tout le territoire français. Le ST3 est prédominant suivi des STs 1, 2 et 4 comme dans une majorité de pays à travers le monde. Le deuxième axe s’est concentré sur l’identification des facteurs de risque de transmission de Blastocystis à l’homme. Le parasite a été recherché dans les selles de vaches et de patients ainsi que dans des échantillons d’eau consommée par l’homme et les animaux dans une région géographique limitée du Nord Liban. 30% des échantillons humains, 69% des échantillons d'eau et 80% des échantillons de bovins étaient positifs pour le parasite. Le ST3 était prédominant dans les échantillons humains et d’eau suivi des ST1, ST2 et ST4. Par contre, ST10 et ST14 étaient prédominants chez les bovins mais ces deux STs n’ont pas été retrouvés dans les autres types d’échantillons. Pour expliquer l'absence des ST10 et ST14 dans ces échantillons, une transmission de ces STs par contact direct entre les bovins et/ou l'absence de formes kystiques transmissibles pour ces STs ont été proposées. Ce parasite a aussi été recherché dans les selles de nombreux groupes d’animaux du zoo de La Palmyre en France. Nous avons montré que près de 40% des selles analysés étaient positives pour Blastocystis et identifié de nouveaux réservoirs d'infections pour l’homme chez les carnivores. La prévalence du parasite atteignait 60% chez les primates chez lesquels les ST1 à ST5 identifiés sont identiques à ceux observés chez l'homme confirmant la faible spécificité d’hôte de ces STs. Dans une autre étude, la prévalence de Blastocystis était de seulement 3,5% dans une population de chiens en France suggérant que cet animal n'est pas un hôte naturel de Blastocystis. Enfin, pour clarifier la pathogénicité de ce parasite, le troisième axe de mes travaux a souligné le caractère invasif de Blastocystis dans un cas de péritonite appendiculaire chez une fillette de 9 ans de retour du Maroc. Seul Blastocystis a été détecté dans les selles, l’appendice, le liquide péritonéal et le sac de Douglas de cette patiente. Une gastro-entérite s’est de plus déclarée simultanément chez 26 membres de la famille de l'enfant suggérant une épidémie qui pourrait trouver son origine dans la consommation commune d’une eau contaminée. / Blastocystis sp. is an anaerobic parasitic protozoa found in the digestive tract of humans and numerous animals. To date, it is the most common intestinal parasite found in human feces with worldwide distribution. Seventeen subtypes (ST1-ST17) have been described based on the comparison of SSU rRNA gene sequences. Blastocystis infection is associated with various gastrointestinal disorders and many studies suggest a correlation between Blastocystis STs and pathogenicity. My work was developed on three different topics. The first concerned the prevalence and the genetic biodiversity of the parasite in human populations. Epidemiological studies were conducted in France and Lebanon but also in Africa by performing the first survey of this parasite in Senegal. Subtyping of the isolates was performed by real-time PCR targeting a domain of the SSU rRNA gene followed by direct sequencing of the PCR product. In Lebanon, the prevalence of Blastocystis reached 20% in the general population and we demonstrated a correlation between ST1 infection and the presence of symptoms. In the same country, this prevalence was 60% in schoolchildren and patients presenting gastrointestinal symptoms. Strikingly, the prevalence of Blastocystis in a population of one hundred children living in a rural area reached 100% in Senegal and more than half of the infected children by the parasite presented gastrointestinal disorders. These latter studies highlighted the socioeconomic impact of blastocystosis in developing countries with poor hygiene sanitation. In France, a large-scale molecular epidemiological study was performed including patients presenting or not gastrointestinal symptoms. Stool samples were collected during winter and summer in 11 hospitals spread all over the French territory. We observed a high prevalence of Blastocystis in the french population with an average of 18.2% and the predominance of ST3 followed by ST1, ST4 and ST2 as in numerous countries. We also identified seasonal variations since the average prevalence of the parasite is 13.6% in winter and 23.1% in summer. The second topic focused on the identification of the risk factors of Blastocystis transmission to humans. We searched this parasite in bovid and human stools as well as in drinking water samples consumed by bovids and breeders in a limited geographic area of North-Lebanon. 30% of human samples, 69% of water samples and 80% of bovid samples were positive for the parasite. Interestingly ST3 is predominant in human and water samples followed by ST1, ST2 and ST4. ST10 and ST14 were predominant in bovid but both STs are lacking in human and water samples. To explain the lack of ST10 and ST14 in human and water samples, we suggested a transmission of these STs occurring through direct contact between bovid and / or the absence of transmissible cystic forms of these STs. Furthermore, this parasite was searched in the stools of numerous animal groups in the zoo of La Palmyre in France. We showed that nearly 40% of the analyzed stools were positive for Blastocystis and identified new reservoirs of human infections in carnivores. The prevalence of the parasite reached 60% in primates in which the identified ST1 to ST5 are identical to those observed in humans confirming the limited host specificity of these STs. In another study, we showed that the prevalence of Blastocystis was of only 3.5% in a population of one hundred dogs in France suggesting that this pet is not a natural host of Blastocystis. Finally, to clarify the pathogenicity of this parasite, the third topic highlighted the invasive character of Blastocystis observed in a case of appendicular peritonitis in a 9-year old girl returning from Morocco. Only Blastocystis was detected in stools, appendix, peritoneal liquid and Douglas pouch of the patient. Interestingly, simultaneous gastroenteritis occurred in 26 members of the child’s family suggested an outbreak with contaminated water as probable origin.

Bacillus cereus est une bactérie connue pour être le deuxième agent responsable de Toxi-Infections Alimentaires Collectives (TIAC) en France depuis 2012. Plusieurs cas d'infections locales et systémiques à B. cereus ont également été signalés. Par sa capacité à former des biofilms et à sporuler, B. cereus pose de vrais problèmes en agroalimentaire et en santé publique en résistant aux procédures de nettoyage et désinfection. Il reste néanmoins beaucoup d’interrogations sur les différences de toxicité observées chez les souches de B. cereus, des souches étant inoffensives pour l’Homme alors que d’autres sont mortelles. Or, les industries agroalimentaires et les hôpitaux ont besoin de savoir si une souche retrouvée dans leur environnement présente un danger et nécessite une intervention qui pourra avoir des répercussions économiques et humaines. Pour répondre à ces enjeux, mon travail a consisté à collecter et caractériser 564 souches isolées dans le cadre de TIAC et 56 souches isolées suite à des cas d’infections non-gastro-intestinales dans le but de les comparer avec des souches environnementales de B. cereus non reliées à des infections et identifier ce qui les différencie.A la suite de l’analyse complète des données épidémiologiques et cliniques des souches de B. cereus ainsi que leur typage et leur caractérisation sur un modèle de caractérisation génétique basé sur la détection de dix gènes présumés impliqués dans la virulence, des souches d’intérêts ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une étude approfondie de toxicité et de transcriptomique. Cette première partie du travail a également permis d’approfondir les connaissances portant sur les foyers de TIAC causés par B. cereus et aussi de mettre en évidence des cas de contaminations croisées survenues au sein de plusieurs hôpitaux français pouvant conduire au décès du patient.L’étude portant sur la toxicité in vitro des souches sur trois modèles cellulaire eucaryotes a montré des différences significatives entre des B. cereus qui ont causé des infections et ceux non reliés à des infections. L’étude de trancriptomique différentielle a permis d’identifier une liste de marqueurs qui pourraient être utilisés, après validation, pour différencier les souches pathogènes et environnementales considérées comme non pathogènes. À la suite d’un transfert de connaissance et de méthode, ces marqueurs pourront être utilisés par les laboratoires de terrain en agro-alimentaire et les laboratoires d’analyses médicales pour aider à la prise de décision en cas de contamination à B. cereus. / Bacillus cereus is the second cause of foodborne outbreaks (FBO) in France since 2012. Several cases of local and systemic infections caused by B. cereus were also reported. By its ability to form biofilms and spores, B. cereus arises real problems in the food industry and public health by resisting to cleaning and disinfection procedures. It remains many questions about the toxicity differences observed among B. cereus strains, several are harmless to humans while others can cause death. But the food industry and hospitals need to know if a strain found in their environment is unsafe and requires intervention that can have an economic and human impact. Face to these challenges, my work was to collect and characterize 564 strains isolated from FBO and 56 strains isolated from patients following cases of non-gastrointestinal infections in order to compare them with environmental strains of B. cereus and identify what differentiates them to others.By a full analysis of epidemiological and clinical data of B. cereus strains and their molecular typing and characterization by a genetic model based on the detection of ten genes potentially involved in virulence, interest strains have been selected to deal with toxicity and transcriptomic in depth. This first part has also allowed increasing knowledge about FBO caused by B. cereus and also to highlight cross-contaminations occurred in several French hospitals leading to death.The in vitro toxicity studies performed on three eukaryotic cell models showed significant differences between toxicity levels of B. cereus strains that have caused infections and those no linked to infections. The differential trancriptomic study has allowed identifying a list of markers that could be used, after validation, for differentiating pathogenic strains from those considering as non-pathogenic. Following the transfer of knowledge and methods, these markers could be used by food safety laboratories and medical laboratories to be a decision aid in case of B. cereus contamination.

Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) permettent de restaurer la fonction des protéines oxydées sur leur résidus Methionine. Dans un premier temps, le mécanisme catalytique de la MsrA et de la MsrB de la protéine PilB de la bactérie pathogène Neisseria meningitidis a été étudié. Les deux classes de Msr, qui sont structuralement différentes, partagent un même mécanisme catalytique en trois étapes avec formation d'un intermédiaire acide sulfénique suivie de la formation d'un pont disulfure intra moléculaire qui est réduit par la thiorédoxine (Trx). Elles présentent en revanche une stéréospécificité de substrat inverse vis-à-vis de la fonction sulfoxyde. Dans un deuxième temps, les trois étapes du mécanisme catalytique de la MsrB ont été caractérisées au niveau cinétique. L'étude du rôle des acides aminés du site actif dans la catalyse, la caractérisation biochimique de l'interaction MsrB-Trx et, enfin, l'étude du rôle du métal coordiné ont également été abordées.

L'activité de PrfA, régulateur transcriptionnel de nombreux gènes de virulence de Listeria monocytogenes, dont hly, est inhibée par des sucres rapidement métabolisés comme le glucose et le fructose. Cette inhibition ne suit pas le mécanisme général de répression catabolique des firmicutes, car l'inactivation de ccpA (catabolite control protein A) ne lève pas la répression de l'expression des gènes de virulence exercée par le glucose ou le fructose. Dans le but de tester si le co-répresseur P-Ser-HPr serait impliqué dans la régulation de l'activité de PrfA, nous avons utilisé la souche BUG1199 de B. subtilis, qui contient intégrés à son génome, prfA sous contrôle du promoteur pspac qui est inductible à l'IPTG, et la fusion hly-lacZ. La formation de la P-Ser-HPr requiert l'intervention d'une enzyme bifonctionnelle l'HPr kinase/phosphorylase (HPrK/P), qui en fonction de la concentration de certains métabolites, soit phosphoryle HPr sur sa Ser-46, soit déphosphoryle la P-Ser-HPr. L'allèle hprKV267F codant pour une HPrK/P qui a conservé une activité kinase normale mais ne possédant quasiment plus d'activité phosphorylase, favorise l'accumulation de la P-Ser-HPr dans la cellule. L'introduction de la mutation hprKV267F dans BUG1199 inhibe fortement l'activité de PrfA. La substitution dans HPr de la Ser-46 par une alanine empêche la formation de la P-Ser-HPr et restaure l'activité de PrfA, alors que l'inactivation de CcpA n'a aucun effet. Cependant l'interruption de ccpA dans BUG1199 à hprK sauvage, inhibe l'activité de PrfA. Cette répression de l'activité de PrfA dans le mutant ∆ccpA est probablement due aussi à l'accumulation de P-Ser-HPr dans la cellule, car elle est levée lorsque la Ser-46 dans HPr est remplacée par une alanine. Outre sa phosphorylation sur la Ser-46, HPr est également phosphorylée sur son His-15 par l'enzyme I (EI) via la cascade de phosphorylation PEP-dépendante du PTS (Phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphoTransferase System). Cependant la P-Ser-HPr est un mauvais substrat pour l'EI, ce qui favorise probablement l'inhibition de PrfA. En effet, l'interruption des gènes codant pour HPr et/ou EI, inhibe également l'activité de PrfA. Ainsi pour être active, PrfA a besoin d'un PTS fonctionnel.

Les infections à Pseudomonas aeruginosa sont un problème de santé publique important et peu de solutions thérapeutiques sont disponibles face à des souches isolées multi-résistantes. Le séquençage de souches de P. aeruginosa a montré qu'en plus du génome cœur, il existe de nombreux gènes accessoires. La souche PA14 est un isolat clinique hautement virulent, de part la présence de deux îlots de pathogénicité, PAPI-1 et PAPI-2, contribuant de manière individuelle et synergique à la virulence. L'îlot PAPI-1, de 108 kb, est un élément intégratif et conjugatif (ICE), capable de s'auto-transférer à des souches de Pseudomonas par un mécanisme de conjugaison. Le mécanisme de transfert fait intervenir un pilus de type IVb encodé dans l'îlot PAPI-1.Mon travail de thèse a eu pour objectif d'identifier les régulateurs de ce locus pilPAPI-1. Ce travail a montré que ce locus est faiblement exprimé mais qu'il peut être induit par l'ajout d'acide caprique. Par une approche de mutagénèse aléatoire, j'ai démontré qu'il existe au moins deux gènes de fonctions inconnues présents dans PAPI-1 nécessaires à l'activation du locus et au transfert de l'îlot : RL103, qui coderait pour un régulateur transcriptionnel de type Ribbon-Helix-Helix (RHH) et RL102, qui coderait pour une protéine de partitionnement chromosomique. Par une approche transcriptomique, j'ai démontré que ces deux régulateurs sont aussi impliqués dans l'activation de l'expression de plus de 35% des gènes de PAPI-1. Dans leur ensemble, ces résultats ont mis en évidence que RL103 et RL102 sont deux activateurs du transfert de PAPI-1 et ont montré le premier exemple de régulateur de type RHH impliqué dans le transfert d'un ICE. / P. aeruginosa infections have become a serious threat to public health and are very difficult to treat due to the increasingly emergence of strains resistant to all known antibiotics. Sequencing of P. aeruginosa strains showed, that in addition to a conserved core genome, there are variable accessory genes. The PA14 strain is a highly virulent clinical and this is mainly due to two pathogenicity islands, PAPI-1 and PAPI-2, that contribute individually and synergistically to the virulence. The 108 kb PAPI-1 pathogenicity island is an integrative and conjugative element (ICE), capable of self-transferring to any recipient Pseudomonas strain by a conjugative mechanism. The transfer mechanism is mediated by a type IVb pilus, encoded within the PAPI-1 island. My PhD work was aimed to identifying the regulators of this pilPAPI-1 locus. This work showed that this locus is weakly expressed but may be induced by the addition of capric acid. Using a random mutagenesis approach, i have shown that there are at least two genes of unknown function (present in PAPI-1) necessary for activation of the locus pilPAPI-1 and the transfer of the island : RL103, which would encode a Ribbon Helix Helix-like transcriptional regulator and RL102, which would encode a partitioning chromosome protein. Using a transcriptomic approach with microarrays, I demonstrated that these two regulators are also involved in the activation of the expression of more than 35% of PAPI-1 genes. Taken together, these results show that Cpr and RL102 are two activators of the PAPI-1 transfer of PA14 and show the first example of a Ribbon-Helix-Helix transcriptional regulator involved in the transfer of an ICE.

Au cours de l’infection par le virus Ebola (EBOV), plusieurs glycoprotéines solubles sont massivement libérées à partir de cellules infectées mais le rôle précis de ces protéines virales n’a pas encore été identifié. Nous émettons l'hypothèse que l'altération de l’hémostase et du système et vasculaires observée au cours de l'infection à virus Ebola pourrait être, au moins en partie causée par ces glycoprotéines solubles. Ainsi pour la première fois, nous avons identifié les cibles cellulaires de la protéine soluble « shed GP » d’Ebola et nous avons démontré que sa partie glycosylé peut activer les cellules dendritiques et les macrophages non infectés, induisant, par le récepteur TLR4, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Nous démontrons aussi que l'activité de la shed GP est neutralisé lors de l'addition de la MBL, une protéine connue pour interagir avec certains motifs glycosylés présents à la surface de différents micro-organismes. Nous avons également montré que la shed GP active la perméabilité des HUVEC de façon directe et indirecte, via la libération de cytokines. En conclusion, cette étude suggère que la shed GP peut être l'un des principaux facteurs responsables de la stimulation précoce des cellules immunitaires qui produisent alors de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires, des éléments qui, combinés avec la réplication massive du virus et les dommages cellulaires induits par le virus, peuvent conduire à un syndrome de type choc septique et une mortalité élevée. / During Ebola virus (EBOV) infection several soluble glycoproteins are released in high amounts from infected cells but as yet still no clear role has been identified for these viral proteins. We hypothesized that the impairment of coagulation and vascular systems observed during EBOV infection could be, at least in part, due to these soluble glycoproteins.Here, for the first time we identify the cellular targets of EBOV soluble protein shed GP and provide evidence that through its glycosylation, shed GP can activate non-infected dendritic cells and macrophages, inducing, through TLR4, the secretion of pro-inflammatory cytokines. We also demonstrate that shed GP activity is negated upon addition of Mannose-Binding sera Lectin (MBL), a molecule known to interact with sugar arrays present on the surface of different microorganisms. We have also revealed that shed GP activates permeability of HUVECs both directly and indirectly through cytokine release. Overall, this study suggests that shed GP may be one of the principal factors responsible for the early stimulation of immune cells that then produce high amounts of proinflammatory cytokines that, combined with massive virus replication and virus-induced cell damage, can lead to a septic shock-like syndrome and high mortality.