Análise proteômica das glândulas de veneno e acessória durante o ciclo de produção de veneno e a influência da inervação noradrenérgica na síntese de proteínas foi verificada. Nossos dados mostram que a síntese de proteínas envolvidas no processo de síntese e secreção de proteínas está aumentada nos estágios ativados da glândula de veneno e que a estimulação da inervação noradrenérgica regula a síntese de algumas proteínas importantes para estes processos. Mostramos pela primeira vez, a presença de várias toxinas no estágio quiescente da glândula e que a produção e secreção de toxinas ocorrem de maneira não sincronizada. Na glândula acessória verificamos uma modulação na síntese de algumas proteínas da glândula após a extração de veneno. Mostramos também a presença de várias toxinas e de inibidores de enzimas do veneno nesta glândula. A composição proteômica das glândulas do aparelho glandular de veneno de serpente contribuirá para um melhor conhecimento dos mecanismos de produção e secreção de veneno e para os estudos das toxinas e suas diversidades. / Proteomic analysis of venom gland and accessory gland during venom production cycle and the influence of noradrenergic innervation on protein synthesis of venom gland were verified. Our data show that the synthesis of proteins involved in the process of synthesis and secretion of proteins is increased in activated stages of venom gland and the sympathetic outflow regulates the synthesis of some proteins that is important to this process. For the first time we showed that many toxins are present in quiescent stage of venom gland and the production and secretion of toxins is not synchronized. Regarding the accessory gland, we verify that the syntheses of some protein of gland were regulated after venom extraction. We also showed the presence of some toxins of the venom and enzyme inhibitors in this gland. The proteomic composition of snake venom gland apparatus will contribute to better understand the mechanisms involved in venom gland activation and consequently, venom production. These data will also contribute to the studies on snake toxins and their diversities.

Diante da ausência de tratamentos eficazes para a esclerose múltipla (EM) e sabendo que compostos animais têm sido usados como protótipos para o desenvolvimento de novas drogas, avaliamos o efeito do Tnp, um peptídeo cíclico inédito e com potencial antiinflamatório derivado do veneno de Thalassophryne nattereri, na encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo representativo da EM. Demonstramos que o Tnp em distintos esquemas de tratamento por mecanismos também dependentes de IL-10 consegue diminuir a intensidade dos sintomas clínicos e adiar o pico de aparecimento dos sintomas graves na EAE por suprimir DC convencionais e propiciar DC plasmocitóides; por bloquear a infiltração de leucócitos e a reativação de clones Th1, Th17, microglia e macrófagos no SNC; por favorecer o aumento de células reguladoras e ainda por ultrapassar a BHE e alcançar o órgão alvo. O Tnp atenua a neuroinflamação e previne a desmielinização, refletindo assim na melhoria dos sinais clínicos na EAE, tornando-se um importante candidato para o tratamento da EM. / Given the lack of effective treatments for multiple sclerosis (MS) and knowing that venomous have been used as prototype for the development of new drugs here we evaluated the effect of the Tnp, a described antiinflammatory cyclic peptide identified in the venom of Thalassophryne nattereri, on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a representative model of MS. We found that distinct treatments of Tnp by mechanisms also dependent on IL-10 significantly reduced the clinical severity of EAE. Tnp was related with: suppression of the activation state of conventional DC and the emergence of plasmacytoid DC; blocking the leukocyte infiltration and the reactivation of Th1, Th17, microglia cells and macrophages in the CNS; increasing of regulatory cells and also Tnp can overcome the BBB and reach the target organ. Tnp can reduce the severity of symptoms and delay the peak of onset of severe symptoms. These results shed light on the role of Tnp a small molecule in the regulation of inflammation and provides a new therapeutic opportunity for the treatment of MS.

A Nattectina é uma toxina isolada do veneno de Thalassophryne nattereri que possui homologia com lectinas tipo C. Este estudo consistiu em avaliar a ação da Nattectina sobre as funções de macrófagos e a influência de citocinas Th1/Th2 nessa ativação. Nossos resultados mostram que a Nattectina induziu o aumento da expressão de moléculas coestimuladoras dependente da sinalização MAPK p38 e PI3K em macrófagos derivados da medula óssea, e também um aumento na capacidade endocítica e expressão de MHC de classe II dependentes da sinalização ERK1/2 e da ligação da Nattectina ao carboidrato. Verificamos ainda que alterações induzida pela Nattectina nos macrófagos são consistentes com a ativação clássica M1 dependente de IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g, e regulada negativamente por IL-4, IL-10 e IL-13. Por fim, verificamos uma ação coadjuvante da IL-4 com IFN-<font face=\"Symbol\">g na mobilização de SPMs (Small Peritoneal Macrophages) para cavidade peritoneal e na ativação de macrófagos. Dessa forma, a Nattectina pode ser considerada um importante agente imunomodulador capaz de modular as funções de macrófagos. / Nattectin is a toxin isolated from Thalassophryne nattereri fish venom that has homology with C-type lectin. This study was carried out to evaluate the action of Nattectin on macrophage functions and the influence of Th1/Th2 cytokines in this activation. Our results show that Nattectin induced the increased expression of costimulatory molecules dependent on MAPK p38 and PI3K signaling in bone marrow-derived macrophages, and also an increase in endocytic capacity and MHC class II expression dependent on ERK1/2 signaling and binding of Nattectin to carbohydrate. We also found that modifications induced by Nattectin in macrophages are consistent with classical (M1) activation of macrophages dependent on IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g cytokines, and negatively regulated by IL-4, IL-10 and IL-13. Finally, it was demonstrated an adjuvant role of IL-4 with IFN-<font face=\"Symbol\">g in mobilization of SPMs (Small Peritoneal Macrophages) to peritoneal cavity and also in macrophage activation. Thus, Nattectin can be considered an important immunomodulatory agent able to modulate macrophage functions.

Diante da ausência de tratamentos eficazes para a esclerose múltipla (EM) e sabendo que compostos animais têm sido usados como protótipos para o desenvolvimento de novas drogas, avaliamos o efeito do Tnp, um peptídeo cíclico inédito e com potencial antiinflamatório derivado do veneno de Thalassophryne nattereri, na encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo representativo da EM. Demonstramos que o Tnp em distintos esquemas de tratamento por mecanismos também dependentes de IL-10 consegue diminuir a intensidade dos sintomas clínicos e adiar o pico de aparecimento dos sintomas graves na EAE por suprimir DC convencionais e propiciar DC plasmocitóides; por bloquear a infiltração de leucócitos e a reativação de clones Th1, Th17, microglia e macrófagos no SNC; por favorecer o aumento de células reguladoras e ainda por ultrapassar a BHE e alcançar o órgão alvo. O Tnp atenua a neuroinflamação e previne a desmielinização, refletindo assim na melhoria dos sinais clínicos na EAE, tornando-se um importante candidato para o tratamento da EM. / Given the lack of effective treatments for multiple sclerosis (MS) and knowing that venomous have been used as prototype for the development of new drugs here we evaluated the effect of the Tnp, a described antiinflammatory cyclic peptide identified in the venom of Thalassophryne nattereri, on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a representative model of MS. We found that distinct treatments of Tnp by mechanisms also dependent on IL-10 significantly reduced the clinical severity of EAE. Tnp was related with: suppression of the activation state of conventional DC and the emergence of plasmacytoid DC; blocking the leukocyte infiltration and the reactivation of Th1, Th17, microglia cells and macrophages in the CNS; increasing of regulatory cells and also Tnp can overcome the BBB and reach the target organ. Tnp can reduce the severity of symptoms and delay the peak of onset of severe symptoms. These results shed light on the role of Tnp a small molecule in the regulation of inflammation and provides a new therapeutic opportunity for the treatment of MS.

Análise proteômica das glândulas de veneno e acessória durante o ciclo de produção de veneno e a influência da inervação noradrenérgica na síntese de proteínas foi verificada. Nossos dados mostram que a síntese de proteínas envolvidas no processo de síntese e secreção de proteínas está aumentada nos estágios ativados da glândula de veneno e que a estimulação da inervação noradrenérgica regula a síntese de algumas proteínas importantes para estes processos. Mostramos pela primeira vez, a presença de várias toxinas no estágio quiescente da glândula e que a produção e secreção de toxinas ocorrem de maneira não sincronizada. Na glândula acessória verificamos uma modulação na síntese de algumas proteínas da glândula após a extração de veneno. Mostramos também a presença de várias toxinas e de inibidores de enzimas do veneno nesta glândula. A composição proteômica das glândulas do aparelho glandular de veneno de serpente contribuirá para um melhor conhecimento dos mecanismos de produção e secreção de veneno e para os estudos das toxinas e suas diversidades. / Proteomic analysis of venom gland and accessory gland during venom production cycle and the influence of noradrenergic innervation on protein synthesis of venom gland were verified. Our data show that the synthesis of proteins involved in the process of synthesis and secretion of proteins is increased in activated stages of venom gland and the sympathetic outflow regulates the synthesis of some proteins that is important to this process. For the first time we showed that many toxins are present in quiescent stage of venom gland and the production and secretion of toxins is not synchronized. Regarding the accessory gland, we verify that the syntheses of some protein of gland were regulated after venom extraction. We also showed the presence of some toxins of the venom and enzyme inhibitors in this gland. The proteomic composition of snake venom gland apparatus will contribute to better understand the mechanisms involved in venom gland activation and consequently, venom production. These data will also contribute to the studies on snake toxins and their diversities.

Crotamina é um peptídeo de baixo peso molecular composto de 42 resíduos de aminoácidos. A presença de nove resíduos de lisina e três pontes dissulfeto confere a crotamina compactibilidade elevada, estabilidade, carga positiva líquida, apresentando similaridade estrutural com defensina, um peptídeo antimicrobiano do epitélio humano. Crotamina até 10,0 mM é inócua para células normais (e.g., fibroblastos humanos e células-tronco embrionárias de murinos), mas letal para células tumorigênicas CHO-K1. Aqui, nós demonstramos que 1 mg crotamina (0,2 mM) foi citotóxica para céluas B16-F10, Mia Paca-2 e SK-Mel-28 células in vitro, como se provou pelos ensaios de MTT, coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio. Adicionalmente, nós avaliamos o efeito citotóxico da crotamina sobre a invasão do melanoma cutâneo primário produzido pela implantação de células B16-F10 em camundongos C57BL/6J. O efeito da crotamina em melanoma cutâneo foi estudado em dois grupos de camundongos (tratados com crotamina e não tratados), sendo cada grupo composto por 35 camundongos. Cada animal do grupo, tratado com crotamina, recebeu diariamente 1,0 mg/100 mL de crotamina (2 mM) , enquanto aqueles não tratados receberam apenas placebo. O tratamento com crotamina durou 21 dias. O atraso da implantação do tumor e redução da mortalidade foi observado para o grupo tratado com crotamina quando comparados ao grupo controle não-tratados. O peso médio d o tumor no grupo não tratado foi 4,60 g, enquanto nos tratados com crotamina foi de apenas de 0,27 g, quando detectados. O cálculo de sobrevida estimado de Kaplan Meier indicou que o grupo tratado com crotamina apresentou diferenças significativas, número de sobreviventes (n = 28/35), em comparação ao grupo não tratado (n = 7/35). Os dados de nossa pesquisa demonstram que a crotamina possui in vitro e in vivo uma atividade citotóxica específica e seletiva contra tipos de tumores de crescimento rápido e agressivo. / Crotamine is a low molecular weight peptide composed of 42 amino acid residues. The presence of nine lysine residues and three disulfide bonds confers to crotamine high compactness, stability, net positive charge, and overall structural similarity to b-defensin 2, an antimicrobial peptide from the human epithelia. Crotamine, up to 10.0 mM, is innocuous to normal cells (e.g., human fibroblasts and murine embryonic stem cells), but lethal for tumorigenic CHO-K1 cells. Herein, we demonstrated that 1 mg of crotamine (0,2 mM) was cytotoxic for B16-F10, Mic PaCa-2 and SK-Mel-28 cells in vitro, as proved by MTT assay, Hoechst 33342 and Propidium iodide staining. Additionally, we evaluate the cytotoxic effect of crotamine on primary invasion of cutaneous melanoma produced by injection of B16-F10 cells into C57Bl/6J mice. The effect of crotamine on cutaneous melanoma was studied on two groups of mice (crotamine-treated and non-treated), each composed by 35 mice. Each animal in crotamine-treated group received daily 1 mg/100 mL of crotamine (2 mM), while those non-treated received placebo. Crotamine treatment lasted for 21 days. The delay of tumor implantation and reduction of death was observed for crotamine-treated group when compared to control non-treated group. Average weight of tumor in non-treated group was 4.60 g, while in crotamine-treated, was only about 0.27 g, if detectable. The Kaplan Meier estimator indicated that crotamine-treated group present significant survival number (n=28/35) in comparison with non-treated group (n=7/35). Data from our research demonstrate that crotamine possesses in vitro and in vivo specific and selective cytotoxic activity against aggressive and fast growing types of tumor.

Novos agentes terapêuticos que preservem as células <font face=\"Symbol\">&#946 do pâncreas e o controle do peso são importantes para o diabetes melittus tipo 2 (DM-2), constituindo uma importante área de investimento farmacêutico. Com o objetivo de contribuir com a toxinologia comparada de venenos de répteis e com a eventual descoberta de novos agentes insulinotrópicos, o presente estudo realizou a prospecção de compostos hipoglicemiantes análogos à exendina-4 (isolada de lagartos Heloderma) ou inibidores da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) no veneno da serpente Bothrops jararaca. A espectrometria de massas identificou uma K49 Fosfolipase A2 inédita neste veneno. Inibidores da DPP-IV não foram encontrados. Porém, a existência de frações polipeptídicas deste veneno sem similares estruturais descritos, sem efeito na pressão arterial média, imunologicamente similares à exendina-4 e com efeito hipoglicemiante e provável capacidade de ligação ao receptor do peptídeo glucagon-símile tipo 1, caracterizaram, pela primeira vez, a ação de veneno de serpente sobre o metaboloma. / New therapeutic agents that protect pancreatic <font face=\"Symbol\">&#946 cells and regulate body mass are important to diabetes mellitus type 2 (DM-2). The search for these agents is one of the main objectives of investments made by pharmaceutical industries. To contribute to the comparative toxinology studies of reptile venoms and to reveal new insulinotropic agents, the present investigation searched for hypoglycemiant compounds such as exendin-4 analogues (isolated from Heloderma lizards) or dipeptidyl-peptidase IV (DPP-IV) inhibitors in the venom of the snake Bothrops jararaca. The mass spectrometry analysis identified a novel K-49 Phospholipase A2 in this venom. DPP-IV inhibitors were not found. However, the existence of polypeptide fractions from this venom without structural similarity with reported compounds, without effect on mean arterial blood pressure and with immunological similarity with exendin-4 and probable ability to bind to glucagon-like peptide type 1 receptor, led to the first characterization of snake venom activity on metaboloma.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.

Novos agentes terapêuticos que preservem as células <font face=\"Symbol\">&#946 do pâncreas e o controle do peso são importantes para o diabetes melittus tipo 2 (DM-2), constituindo uma importante área de investimento farmacêutico. Com o objetivo de contribuir com a toxinologia comparada de venenos de répteis e com a eventual descoberta de novos agentes insulinotrópicos, o presente estudo realizou a prospecção de compostos hipoglicemiantes análogos à exendina-4 (isolada de lagartos Heloderma) ou inibidores da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) no veneno da serpente Bothrops jararaca. A espectrometria de massas identificou uma K49 Fosfolipase A2 inédita neste veneno. Inibidores da DPP-IV não foram encontrados. Porém, a existência de frações polipeptídicas deste veneno sem similares estruturais descritos, sem efeito na pressão arterial média, imunologicamente similares à exendina-4 e com efeito hipoglicemiante e provável capacidade de ligação ao receptor do peptídeo glucagon-símile tipo 1, caracterizaram, pela primeira vez, a ação de veneno de serpente sobre o metaboloma. / New therapeutic agents that protect pancreatic <font face=\"Symbol\">&#946 cells and regulate body mass are important to diabetes mellitus type 2 (DM-2). The search for these agents is one of the main objectives of investments made by pharmaceutical industries. To contribute to the comparative toxinology studies of reptile venoms and to reveal new insulinotropic agents, the present investigation searched for hypoglycemiant compounds such as exendin-4 analogues (isolated from Heloderma lizards) or dipeptidyl-peptidase IV (DPP-IV) inhibitors in the venom of the snake Bothrops jararaca. The mass spectrometry analysis identified a novel K-49 Phospholipase A2 in this venom. DPP-IV inhibitors were not found. However, the existence of polypeptide fractions from this venom without structural similarity with reported compounds, without effect on mean arterial blood pressure and with immunological similarity with exendin-4 and probable ability to bind to glucagon-like peptide type 1 receptor, led to the first characterization of snake venom activity on metaboloma.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.