A Lesão Renal Aguda (LRA) é a complicação mais grave da rabdomiólise. Nessa síndrome, a liberação do pigmento heme desencadeia uma lesão que se caracteriza por vasoconstrição glomerular e toxicidade celular direta com componente oxidativo. A lesão oxidativa desencadeada é uma das linhas fisiopatológicas mais intrigantes. A renoproteção com antioxidantes tem demonstrado efeito satisfatório. As proantocianidinas são antioxidantes naturais encontrados no extrato da semente da uva. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antioxidante da Vitis vinifera (extrato da semente de uva) sobre a função renal de ratos submetidos à lesão por rabdomiólise. Foram utilizados ratos Wistar, adultos machos, pesando entre 250-300 gramas. A LRA foi induzida pela administração de glicerol 50% i.m (intramuscular). Os animais foram distribuídos em 4 grupos: grupo Salina (6ml/Kg de NaCl 0,9% via intraperitoneal (i.p) 1 vez ao dia), grupo Glicerol (6ml/Kg de glicerol i.m, cada região femoral recebeu 3ml/Kg de glicerol, 1 vez ao dia), grupo Vitis vinifera (3mg/Kg v.o por 5 dias) e grupo Glicerol+Vitis vinifera que recebeu Vitis vinifera por 5 dias antes do glicerol. Foram avaliados o marcador de lesão muscular (CK), a função renal (FR), a função tubular (FENa e FEK), o perfil oxidativo (peróxidos urinários-FOX-2 e MDA-TBARS) , a histologia e morfometria renal. O grupo Glicerol tratado com Vitis vinifera apresentou melhora da FR e tubular, redução dos níveis da peroxidação lipídica e melhora da histologia renal. Os resultados deste estudo confirmaram a proteção antioxidante, com repercussão histológica, da Vitis vinifera na LRA induzida por glicerol. / The Acute Kidney Injury (AKI) is the worst complication of rhabdomyolysis. In this syndrome, the delivery of heme pigment induces an injury that distinguishes itself by glomerular vasoconstriction and direct cellular toxicity with oxidative component. The oxidative injury is an intriguing one of the pathophysiological mechanism. The renoprotection with antioxidants has demonstrated satisfactory effect. The proanthocyanidins are natural antioxidants found in grape seed extract. The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of Vitis vinifera (grape seed extract) on the renal function of rats submitted to the injury by rhabdomyolysis. Wistar rats, male, adults, weight ranging from 250-300 g were used. The AKI was induced intramuscular (i.m.) administration of glycerol 50%. The animals were distributed in 4 groups: Saline group (6ml/Kg of NaCl 0,9% intraperitoneal (i.p) once a day), Glycerol group (6ml/Kg of glycerol i.m, each femoral region received 3ml/Kg of glycerol, once a day), Vitis vinifera group (3mg/Kg v.o by 5 days) and Glycerol+Vitis vinifera group that has received Vitis vinifera by 5 days before glycerol. Marker of muscular injury (CK), renal function (RF), the tubular function (FENa and FEK), the oxidative profile (urinary peroxides -FOX-2 and MDA-TBARS), the histological and kidney morphometric were evaluated. The Glycerol group treated with Vitis vinifera has shown improvements in RF and tubular, reduction of levels of lipid peroxidation and amelioration of kidney histology. The results of this study have confirmed the antioxidant protection, with histological repercussion of Vitis vinifera in AKI induced by glycerol.

Orientador: Fernanda Gonçalves Basso / Resumo: A mucosite é um dos principais efeitos adversos do tratamento oncológico e apresenta influência significativa na morbidade e qualidade de vida dos pacientes submetidos a este tipo de tratamento. A etiopatogenia desta condição vem sendo relacionada não só a toxicidade direta dos quimioterápicos e radiação ionizante, mas também a uma ativação exacerbada da resposta inflamatória dos tecidos. Recentemente, o desenvolvimento e a severidade da mucosite oral também tem sido relacionada a expressão exacerbada de metaloproteinases (MMPs), que resulta na desorganização dos tecidos epitelial e conjuntivo e consequentemente, em atraso do processo de reparo. O manejo da mucosite oral tem sido baseado na utilização de agentes analgésicos tópicos, antibióticos e antifúngicos, bem como na aplicação da laserterapia de baixa intensidade (LBI). A LBI apresenta resultados positivos sobre as lesões de mucosite oral, porém, esta modalidade terapêutica requer a utilização de um equipamento de custo moderado e deve ser feita sob supervisão. Desta forma, novas estratégias preventivas e terapêuticas, que possam atuar na modulação da resposta inflamatória e na expressão de MMPs para diminuir a incidência e a severidade das lesões de mucosite oral e também acelerar o processo de reparo têm sido propostas. Estudos recentes demonstraram a efetividade de compostos naturais, como as antocianinas, na redução da incidência e severidade destas lesões. O objetivo desta pesquisa in vitro foi avaliar comparativam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mucositis is the major adverse effect of oncological treatment and presents huge impact on oncological patients' morbidity and quality of life. Etiopathogenesis of oral mucositis has been not only related to a direct toxicity of chemotherapy drugs and radiant therapy, but also to an extended inflammatory reaction. Recently, development and severity of oral mucositis has also been associated to increased expression of metalloproteinases (MMPs), that results in disorganization of epithelial and connective tissues, leading to a delayed tissue healing. Treatment of oral mucositis is based on the application of topic analgesic and antimicrobial compounds, as also low-level lasertherapy (LLLT). LLLT shows positive outcomes on oral mucositis, however, this therapy requires the use of a moderate cost equipament and professional supervision. Therefore, new preventive and therapeutic strategies that can act on the modulation of inflammatory response as well as on MMPs expression could decrease the incidence and severity of oral mucositis, therefore enhancing oral mucosa healing. Recent studies demonstrated the effectiveness of natural compounds, such as antocyanins on the decreased incidence and severity of these lesions. Consequently, the aim of the present in vitro study were to assess the effects of proanthocyanidins (PAs, grape seed extract), naringenin (NA, proanthocyanidins-derived synthetic compound), also denominated flavanones, and LLLT as modulators for synthesis of interleukin-6 and MMPs from gingival fibroblasts. Cells were isolated from the papillary gingival tissue of a young (24 years) and healthy individual by enzymatic digestion, then cultured and submitted to different treatments. The influence of two chemotherapeutic agents (5-fluorouracil - 5-FU and methotrexate - MTX) and inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and -8) on the induction of MMP-2 and -9 synthesis and gene expression were ... (Complete abstract electronic access below) / Mestre

En esta Tesis doctoral se han estudiado las proantocianidinas de pieles y semillas de uvas de las variedades Monastrell, Cabernet Sauvignon y Syrah, así como la transferencia de las mismas al vino y el efecto de algunas técnicas enológicas en la modulación de su extracción. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de estos compuestos es máxima al inicio de la maduración, disminuyendo conforme se acerca el momento de la vendimia. La cantidad de proantocianidinas en los vinos depende tanto de la variedad como de la técnica enológica aplicada. Tiempos de maceración largos y técnicas como la maceración prefermentativa en frío o el uso de enzimas de maceración promueven una mayor extracción de proantocianidinas, aunque las de las uvas de la variedad Syrah son mucho más fácilmente extraíbles que las de Monastrell, en igualdad de condiciones. / In this thesis, skin and seed proanthocyanidins of Monastrell, Cabernet Sauvignon and Syrah grape varieties have been studied, as well as their transfer from grapes to wine and the effect of some oenological techniques in modulating their extraction. The results show that the concentration of these compounds was maximum at the beginning of ripening, decreasing up to moment of harvest. The concentration of proanthocyanidins in wines depends both on the variety and the applied oenological technique. Long maceration times and techniques such as cold soak or the use of maceration enzymes promote a large extraction of proanthocyanidins, although, under similar conditions, the proanthocyanidins of Syrah grapes are more easily transferred to must/wine than those of Monastrell grapes.

La tesis doctoral "Contribución al estudio de los factores que afectan la astringencia del vino tinto" aborda el estudio de la astringencia del vino y de algunos de los factores que la condicionan.Por una parte, se describe una nueva metodología que permite medir la astringencia del vino de forma objetiva y reproducible utilizando para ello una proteína de fácil disponibilidad: la ovoalbúmina, y patrones de ácido tánico. Basados en está metodología se estudian la influencia sobre la astringencia de algunos de los componentes no fenólicos de la matriz "vino", como son pH, concentración de etanol y de glicerol y el uso de la goma arábiga, como ejemplo de polisacárido. Los resultados obtenidos indican que dentro de los intervalos habituales de pH, concentración de etanol y de glicerol, las posibles variaciones de astringencia serían moderadas. Por el contrario, la adición de goma arábiga al vino produce una importante disminución de la astringencia. Además, se compara la ovoalbúmina con el conjunto de proteínas salivares frente al ácido tánico (tanino usado como patrón), proantocianidinas de diferentes composición monomérica y diferentes grados de polimerización y vinos comerciales de diferentes procedencias. Observando que ambos modelos de proteínas presentan una alta correlación estadística, lo que indicaría un comportamiento similar frente al ácido tánico y las proantocianidinas, a pesar de presentar diferentes afinidades. El estudio de los vinos dio resultados estadísticamente similares en más del 80 % de los mismos. Por lo que consideramos que, dadas las dificultades metodológicas que entraña la utilización de proteínas de la saliva, la utilización de ovoalbúmina como agente precipitante parece ser una buena solución para la determinación objetiva de la astringencia en vinos.Por otra parte, se describen dos experiencias donde se aplica la metodología desarrollada: - La influencia del tiempo de maceración sobre los compuestos fenólicos y la astringencia sobre las pieles, semillas y raspones a tres diferentes grados de madurez. Las conclusiones más importantes de este experimento han sido corroborar que, a medida que la uva madura, disminuye el aporte de tanino de la semilla y, de forma paralela, decrece su astringencia. Por el contrario, en las pieles y el raspón, el aporte de tanino aumenta al madurar la uva si bien la astringencia decrece. Los taninos de las pieles y de los raspones se liberan rápidamente, estabilizándose hacia el día 5 de la maceración. Por el contrario los taninos de las semillas se solubilizan más lentamente y tardan más en estabilizarse, especialmente cuando la uva está verde. Estos resultados deberían tenerse en cuenta para determinar el tiempo de maceración: cuando las uvas estén bien maduras el tiempo de la maceración debería seleccionarse en función del estilo del vino que deseemos producir. Sin embargo, cuando las uvas no han madurado bien, una maceración larga no es conveniente ya que conduciría a un exceso de la extracción del tanino de semilla, lo que produciría vinos demasiado astringentes. - Los efectos de la microoxigenación antes de la crianza en barrica sobre la astringencia del vino tinto. De este experimento se concluyó que los vinos microoxigenados serían percibidos con un color levemente menos intenso y ligeramente más evolucionado, presentando una mayor concentración de antocianos, especialmente monoglucósidos y sus derivados acetilados y cumarilados. Sorprendentemente no se observaron diferencias en los niveles de vitisinas entre el vino microoxigenado antes de crianza respecto al que sólo estuvo en barrica, pero si existieron diferencias en el grado de polimerización media de las proantocianidinas. En ambos grupos experimentales se observó una clara disminución de la astringencia respecto al vino de partida. Esta disminución fue significativamente mayor en el vino microoxigenado. De acuerdo con estos resultados la aplicación de la microoxigenación al vino antes de la crianza en barricas de roble sería aconsejable en vinos muy astringentes tales como vinos de prensa o los vinos obtenidos de las uvas no muy maduras. / The PhD thesis "Contributions to the study of the factors that affect the red wine astringency " approaches the study of wine astringency and some factors that determine it.On one hand, a new and reproducible methodology is described that allows measuring wine astringency, using a protein of easy availability: the ovalbumin, and tannic acid as standards. Based on this methodology was studied the influence of some not phenolic components of the wine as pH, ethanol concentration, glycerol concentration and the use of the Arabic gum, as example of polysaccharide, on the astringency. The results show that inside the usual intervals of pH, concentration of ethanol and of glycerol, the likely astringency variations would be moderate. On the contrary, the addition of Arabic gum to the wine produces an important decrease of the astringency. Besides, we compare the ovalbumin and the whole salivary proteins reactivity with tannic acid (tannin used as standards), different proanthocyanidins, and different degrees of polymerization and commercial wines of different origins. Both models of proteins present a high statistical correlation, which would indicate a similar behaviour when reacting with tannic acid and the proanthocyanidins, in spite of different affinities. The study of the wines gave statistically similar results in more than 80 % of case, concluding that utilization of ovalbumin as precipitation agent seems to be a good solution for the objective determination of the astringency in wines.On the other hand, two experiments are described where the new methodology is applied: - The study of the influence of the ripening stage and maceration time (1-23 days) on the contribution of each cluster grape components to phenolic composition and astringency in wine simulated macerations. In general terms, proanthocyanidin extraction from skins, stems and especially from seeds increased with maceration time. The ripening stage also had a major influence on tannin extraction and astringency. The tannin contribution from skins and stems increased with ripening but the contribution from the seeds decreased. The contribution to astringency from all cluster components was clearly higher when the grapes were unripened. The mean degree of polymerization of the tannins from skin and seed components was unaffected by ripening and maceration length.- The study of the micro-oxygenation used to complement aging in order to improve the quality of very astringent and herbaceous red wines. When this technique is applied prior to oak aging, the wine has slightly less intense red color and significantly higher levels of combined and free anthocyanins and ethyl bridged anthocyanin-flavanol pigments, too higher mean degree of proanthocyanidin polymerization and a drastically lower astringency. These wines also present a clearer impact of wood aromas.

Las proantocianidinas de extractos de pino (PYC), cacao (CCX) y semillas de uva (GSPE) inducen una disminución de la síntesis de novo de triacilgliceroles (TG) y colesterol en células HepG2. Combinando un sistema in vivo administrando GSPE a un grupo de ratas, con un sistema in vitro en células HepG2, las proantocianidinas biodisponibles en el suero de los animales disminuyen la síntesis hepática de TG. El GSPE (375mg/Kg) presenta efecto antihipertensivo a las 6 horas post-administración en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y en ratas con síndrome metabólico. El efecto esta mediado principalmente por la liberación de NO y prostaciclina I2, con una reducción leve del estrés oxidativo en las ratas SHR. Adicionalmente esta misma dosis de GSPE disminuye la síntesis hepática de triacilgliceroles en un modelo de SM El GSPE presenta efecto corrector simultáneo de la síntesis de TG hepáticos y de la tensión arterial elevada en un modelo animal de síndrome metabólico inducido por la dieta. / The proanthocyanidins present in pine, cocoa, and grape extracts induce a decrease in de novo cholesterol synthesis, triglycerides and cholesterol esters in hepatic cells (HepG2). The proanthocyanidins present in the rat serum after the administration GSPE oral doses, could reduce triglycerides synthesis in HepG2. The GSPE (375mg/Kg) has antihypertensive effect at 6 hours post-administration in spontaneously hypertensive rats and rats with SM. The effect is primarily mediated by the release of nitric oxide (NO) and prostacyclin I2, with a slight decrease in oxidative stress in the SHR. The other side GSPE (375mg/kg) decreases hepatic TG synthesis in vivo in an animal model of metabolic syndrome. The GSPE presents simultaneous effect corrector on hepatic lipid synthesis and high blood pressure in an animal model of metabolic syndrome.

Submitted by Edileide Reis (leyde-landy@hotmail.com) on 2013-04-22T14:46:07Z No. of bitstreams: 5 André Barreiros 5.pdf: 1310338 bytes, checksum: d59dc4bf426cac1e442be4eb9ee6d894 (MD5) André Barreiros 4.pdf: 1401764 bytes, checksum: 07e4fdbbe9dd39da5506e4d366f674d3 (MD5) André Barreiros 3.pdf: 1612776 bytes, checksum: 615c8ab2914ba19f8eb7af1b4c5d83cf (MD5) André Barreiros 2.pdf: 1211895 bytes, checksum: c2f0cb1c002d0263b0c0a42dbdda2a14 (MD5) André Barreiros 1.pdf: 239109 bytes, checksum: d5ef73879c018bc308a7c7bb697a9ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-22T14:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 5 André Barreiros 5.pdf: 1310338 bytes, checksum: d59dc4bf426cac1e442be4eb9ee6d894 (MD5) André Barreiros 4.pdf: 1401764 bytes, checksum: 07e4fdbbe9dd39da5506e4d366f674d3 (MD5) André Barreiros 3.pdf: 1612776 bytes, checksum: 615c8ab2914ba19f8eb7af1b4c5d83cf (MD5) André Barreiros 2.pdf: 1211895 bytes, checksum: c2f0cb1c002d0263b0c0a42dbdda2a14 (MD5) André Barreiros 1.pdf: 239109 bytes, checksum: d5ef73879c018bc308a7c7bb697a9ebc (MD5) Previous issue date: 2005 / O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico de Dioclea violacea Mart. além da avaliação das atividades antioxidante e imunomoduladora das substâncias isoladas. Dioclea violacea é uma trepadeira pertencente à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae (Papilionoideae), tribo Phaseoleae, que ocorre no litoral desde a Guiana até o estado de São Paulo. O caule de um espécime foi coletado no município de Umburanas, Bahia, em área de vegetação de caatinga e relevo de tabuleiro. Após secagem e moagem o material foi submetido à maceração com metanol. O extrato metanólico obtido foi particionado fornecendo os extratos hexânico, clorofórmico e acetato de etila. Os extratos foram submetidos a purificação separadamente, sendo seus constituintes isolados e purificados através de técnicas de CC e CCDP em gel de sílica 60, 60H, 60PF, Poliamida 6 e 11 e permeação em gel de Sephadex LH20. Deste modo, as substâncias isoladas tiveram suas estruturas elucidadas através da análise de dados de RMN de 1H, 13C incluindo experimentos DEPT, ?nOe diff?, além de técnicas bidimensionais como HETCOR, HOMO/COSY, HMQC, HMBC, NOESY, auxiliadas por EMIE, FAB, UV, IV, [a]D25 e CD. Do extrato hexânico foram isolados e identificados a-tocoferol, estigmast-4-en-3-ona, b-sitosterol, estigmasterol, lupeol e b-amirina. Do extrato clorofórmico foram isolados ácido oleanólico, a nova flavanona 7,4?-diidroxi-6-metoxiflavanona, além das 7-hidroxi-6-metoxiflavanona, 5,7-diidroxiflavanona, 5,7-diidroxi-8-metoxiflavanona, 7-hidroxiflavanona, 4?,7-diidroxiflavanona, 7,3?,4?-triidroxiflavanona já anteriormente isoladas de outras fontes. Além disso, foram também isolados deste extrato o 7-hidroxi-6-metoxiflavanonol, 2?,4? diidroxichalcona, 2?,4,4?-triidroxi-3-metoxichalcona, 2?,3,4,4?-tetraidroxichalcona, além da lactona lasiodiplodina e de um novo biflavonóide a,b?-epoxi,-2,2?,4?-triidroxichalcona-(b®4?)-7,4?-diidroxi-6-metoxiflavanona. Enquanto que, do extrato acetato de etila foram isolados a epicatequina, a proantocianidina do tipo A denominada 3?,4?,7-triidroxiflavana-(2b®7,4b®8)-3-prenil-fustina, e outras duas proantocianidinas do tipo A2; epicatequina-(2b®7,4b®8)-epicatequina e epigalocatequina-(2b®7,4b®8)-epicatequina. As substâncias isoladas foram submetidas a testes de atividade antioxidante pelos métodos de inibição da autooxidação do b-caroteno, e seqüestro do radical livre DPPH, sendo que a epicatequina e as proantocianidinas epicatequina-(2b®7,4b®8)-epicatequina e epigalocatequina-(2b®7,4b®8)-epicatequina foram as mais ativas. Algumas das substâncias foram submetidas a testes de atividade imunomoduladora pelos métodos de inibição da proliferação de linfócitos e inibição da síntese de NO, onde a 7 hidroxiflavanona demonstrou maior atividade. A substância mais ativa 7-hidroxiflavanona foi sintetizada a partir da reação de esterificação do ácido cinâmico com o resorcinol em presença de ácido polifosfórico, seguida de rearranjo de Fries e ciclização, porém com baixo rendimento (1,6%). Os produtos principais da reação foram a 7-hidroxi-3,4-diidro-4-fenilcumarina (68,7%) e a 5-hidroxi-3,4-diidro-4-fenilcumarina (11,2%). / Salvador

Orientador: Alba Regina Monteiro Souza Brito / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:33:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_FelipeMeirade_D.pdf: 5634635 bytes, checksum: 78374f3fbaac985834cc384c5652485c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As doenças inflamatórias intestinais (DII) compreendem doença de Crohn e reto-colite ulcerativa inespecífica, ambas caracterizadas por processo inflamatório crônico e descontrolado no intestino mediado por células do sistema imune. DII tem sido objeto de extensas pesquisas nos últimos anos; indefinição sobre etiologia e ausência de tratamento eficaz os justificam. Nesse cenário, produtos naturais surgem como alternativas terapêuticas, uma vez que moléculas com atividade farmacológica pronunciada, especialmente compostos fenólicos, têm merecido destaque. Neste trabalho foram avaliadas três frações orgânicas (aquosa - Aq, butanólica - BuOH, e acetato de EtOAc) obtidas a partir das cascas de Rhizophora mangle em modelos experimentais de colite induzida por dextrana sal sódico (DSS) em camundongos e ácido 2,4,6-tri-nitro-benzeno-sulfônico (TNBS) em ratos. BuOH (0.5 e 1.5 mg.Kg-1) e EtOAc (1.5 mg.Kg-1) foram efetivas no modelo de colite por DSS, enquanto BuOH 0.5 mg.K-1 e EtOAc 1.5 mg.Kg-1 mostraram-se eficazes na colite aguda por TNBS. No modelo sub-crônico de colite os tratamentos BuOH e EtOAc reduziram novamente os danos causados pelo TNBS, embora BuOH tenha se mostrado mais eficiente. A avaliação de mediadores envolvidos nesses modelos experimentais mostrou que tanto BuOH quanto EtOAc exercem ação sobre a atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px) e mieloperoxidase (MPO) bem como sobre os níveis das citocinas pró-inflamatórias fator de necrose tumoral-? (TNF-?), interferon-? (IFN-?), interleucinas 1?, 6 e 12 (IL-1?, IL-6 e IL-12), além de reduzirem a expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) no modelo de DSS. No modelo sub-crônico de colite induzida por TNBS, às duas frações atuaram sobre a atividade da GSH-Px e catalase (CAT) e sobre os níveis de glutationa (GSH), TNF-? e IL-12; EtOH também reduziu os níveis de IL-6 e levou ao aumento de citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10), BuOH por sua vez mostrou-se eficaz em reduzir o índice de peroxidação lipídica (TBARS) e atividade da MPO, atuando também sobre a expressão de ciclo-oxigenase-1 (COX-1). A análise fitoquímica revelou presença de procianidinas oligoméricas nas duas frações ativas, BuOH e EtOAc, sugerindo que estas substâncias sejam responsáveis pelos efeitos produzidos pelos tratamentos experimentais. As frações BuOH e EtOAc apresentaram efeitos importantes sobre os componentes imune, inflamatório e oxidante em modelos experimentais de colite induzida por TNBS e DSS em doses consideradas baixas para uma mistura de substâncias. As procianidinas de R. mangle surgem então como alternativa terapêutica interessante sobre as DII / Abstract: Inflammatory bowel diseases (IBD) comprises Crohn's disease and ulcerative colitis, both are characterized by an immune-mediated chronic inflammatory process in the gut. IBD have been studied over the past few years; undefined etiology and the absence of effective treatments justify these studies. In this scenario, natural products arises as therapeutic alternative, once various studies in animal models have shown efficient treatments. Nowadays, molecules with pronounced pharmacological activities, especially phenolic compounds, have been highlighted. In this work three organic fractions (aqueous - Aq, butanolic - BuOH and ethyl acetate - EtOAc) obtained from Rhizophora mangle barks were evaluated in experimental models of dextran sodium sulphate (DSS)-induced colitis in mice and 2,4,6-tri-nitro-benzene sulphonic acid (TNBS)-induced colitis in rats. BuOH (0.5 and 1.5 mg.Kg-1) and EtOAc (1.5 mg.Kg-1) were effective in the DSS-induced model, while BuOH (0.5 mg.Kg-1) and EtOAc (1.5 mg.Kg-1) were also effective in acute TNBS-induced model of colitis, which lead to the evaluation of these last ones in sub-chronic TNBS-induced models of colitis. In this model, both treatments reduced the injury provoked by the instillation of TNBS, although BuOH has shown more efficiency. The evaluation of the mediators involved in these experimental models showed that either BuOH as EtOAc act on the glutathione peroxidase (GSH-Px) and myeloperoxidase activities as well as on pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor- (TNF-?), interferon- (IFN-?) and interleukins -1?, 6 and 12 (IL-1, IL-6 and IL-12) levels, and down-regulation of ciclo-oxygenase-2 (COX-2) expression in the DSS-induced model of colitis. Whereas in the sub-chronic TNBS-induced model of colitis, both fractions showed effects on the GSH-Px and catalase (CAT) activities, and glutathione (GSH), TNF-? and IL-12 levels; EtOAc also reduced IL-6 levels and lead to the enhancement of the levels of an anti-inflammatory cytokine, interlukin-10 (IL-10), on the other hand BuOH showed to be efficient in reducing lipid peroxidation index (TBARS) and MPO activity, acting on the upregulation of cyclo-oxygenase-1 (COX-1). Phytochemistry analysis reveals the presence of oligomeric procyanidins in both fractions, BuOH and EtOAc, suggesting that these substances are responsible for the effects produced by the experimental treatments. BuOH and EtOAc fractions presented important effects on the immune, inflammatory and oxidant components in the experimental models of TNBS and DSS-induced colitis using doses, considered, lower for a mixture of substances. The procyanidins of R. mangle became an interesting alternative therapeutic for IBD / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

A cultura popular atribui ao gênero Passiflora várias propriedades medicinais e funcionais. Frutas frescas e secas, cascas, infusões e suco da polpa de maracujás silvestres são consumidos e comercializados para controlar ansiedade, insônia, tremores, diabetes e obesidade, entre outras indicações. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram caracterizar e comparar as folhas e frutos (pericarpo, polpa e sementes) das espécies P. edulis Sims variedades BRS Sol do Cerrado, Ouro Vermelho e Gigante Amarelo, P. alata Curtis, P. setacea DC e P. tenuifila Killip em relação ao seu potencial funcional, avaliando-se conteúdos de compostos fenólicos totais, proantocianidinas, vitamina C, alcaloides, tipos e teores de flavonoides, controle potencial de glicemia pós-prandial (inibição de α-amilase e α-glicosidase in vitro) e capacidade antioxidante in vitro. O principal flavonoide encontrado tanto em folhas como em frutos foi a homoorientina e as maiores concentrações foram encontradas em folhas, seguido de pericarpo. Os maiores teores de alcaloides foram detectados nas polpas dos frutos de P. edulis (0,1-0,2 mg/100 g b.s.). As maiores concentrações de compostos fenólicos foram detectadas nas folhas de P. edulis e P. alata, porém as sementes de P. tenuifila e principalmente P. setacea apresentaram os teores mais elevados em comparação com as outras frações. Em relação às proantocianidinas, este é o primeiro estudo que mostra a presenças destes compostos em Passiflora spp, em concentrações significativamente maiores nas sementes. Além disso, o estilbeno piceatanol (3,4,3\',5\'-tetrahidroxi-trans-estilbeno) também foi encontrado nas sementes de P. edulis variedades BRS Ouro Vermelho (2 mg/100 g b.s.) e Gigante Amarelo (3 mg/100 g b.s.) e P. alata (10 mg/100 g b.s.). Os compostos fenólicos encontrados nas sementes de todas as espécies de Passiflora analisadas se mostraram potentes inibidores das enzimas α-amilase e α-glicosidase. Este trabalho mostrou que os frutos e as folhas de Passiflora spp podem ser considerados boas fontes de compostos bioativos, especialmente com atividade antioxidante, apresentando, portanto, potenciais efeitos benéficos sobre a saúde humana. / Folk culture assigns to the genus Passiflora various medicinal and functional properties. Fresh and dried fruits , barks , teas and wild passion fruit pulp juice are consumed and sold to control anxiety, insomnia , tremor , diabetes and obesity , among other indications .Thus, the aim of this study were to characterize the leaves and fruit (pericarp , pulp and seeds) of the species P. edulis Sims varieties BRS Sol do Cerrado, Ouro Vermelho e Gigante Amarelo, P. alata Curtis, P. setacea DC e P. tenuifila Killip in relation to their functional potential , evaluating content of total phenolic compounds , proanthocyanidins , vitamin C , alkaloids , types and levels of flavonoids, potential control of postprandial glycemia (inhibition of α-amylase and α-glucosidase in vitro) and in vitro antioxidant capacity. The main flavonoid found in both leaves and fruits was homoorientina and the highest concentrations were found in leaves, followed by pericarp . The highest levels of alkaloids were detected in the pulp of the fruits of P. edulis ( 0.1-0.2 mg/100 g b.s. ) . The highest concentrations of phenolic compounds were identified in the leaves of P. edulis and P. alata, but the seeds of P. tenuifila and especially P. setacea showed higher levels compared with the other fractions . With respect to proanthocyanidin, this is the first study to show the presence of these compounds in Passiflora spp at concentrations significantly increased in seeds. Furthermore, piceatannol stilbene ( 3,4,3\',5\'- tetrahydroxy -trans- stilbene ) was also found in the seeds of P. edulis varieties BRS Ouro Vermelho (2 mg/100 g d.w.) and Gigante Amarelo (3 mg/100 g d.w.) and P. alata (10 mg/100 g d.w.). Phenolic compounds found in the seeds of all species analyzed are good inhibitors of α-amylase and α-glicosidase. This work showed that the fruit and leaves of Passiflora spp. can be considered good sources of bioactive compounds, especially with antioxidant activity, thus presenting potential beneficial effects on human health.

[EN] Alfalfa (Medicago sativa L.), is a forage legume with a significant content of protein, being the most widely cultivated forage around the world. In this species, the protein content decreased during growth processes as well as other resources used by the plant during the flowering process. Alfalfa also contains a lower concentration of condensed tannins or proanthocyanidins (PAs), less than required to remedy the digestive disorder of ruminant livestock causing pasture bloat by production of greenhouse gases as result of the microbial fermentation and the excessive desamination of proteins in the rumen (by-pass effect). These defects on nutrition are reflected in the yield and production of ruminants. Both problematics are difficult to improve by conventional methods. The overall objective of this thesis is to develop molecular tools useful for genetic manipulation of certain traits of agronomic interest in alfalfa, to enhance their nutritional value. At a first step, we have developed an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol via somatic embryogenesis applicable to various genotypes of alfalfa to produce viable embryos in the 50% of the inoculated explants. Chimaeric plants or scapes were almost not detected because most of the transgenic plants contained the T-DNA with all the transgenes incorporated, having thus the indispensable tool to perform the other two objectives. We have isolated two orthologs of the TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) gene from alfalfa (MsTFL1c and MsTFL1a). Both genes were constitutively expressed in A. thaliana, and later on in alfalfa, to evaluate their possible use as biotechnological tool for the improvement of the nutritional value of this forage legume, producing a delay in the flowering time and thereby an increase of vegetative development. MsTFL1a performs the same functions as TFL1 in Arabidopsis y its overexpression in this plant produces a remarkable delay of flowering time. In alfalfa, its constitutive expression also produces a delay in flowering. However, this phenotype was not associated to an increase of vegetative growth, being plants of reduced size that appears tied to a limitation in cell proliferation. Moreover, the limitation in cell proliferation was associated with a reduction in the expression levels of certain cell division effector genes, as it is the case of cyclins. Our results support the hypothesis that TFL1-like genes could also participate in signaling pathways that regulate cell differentiation in plants. M. sativa could be a good model to study the possible range of biochemical diversification of these proteins. On the other hand, we have made a multigenic construct in the modular cloning system GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). In a first step, it was functionally validated by transient expression in N. benthamiana. In addition, this construct was introduced by stable transformation in two experimental models (A. thaliana and N. tabacum) and later on in M. sativa, where it has been studied the integration capacity and expression levels of the different transgenes. In N. tabacum it has been achieved the activation of both the anthocyanin and PAs biosynthetic pathways. However, it was not able to activate both routes in alfalfa. The TFs Delila and Rosea1 were not able to activate the genes involved in the regulation of these metabolic pathways in alfalfa, or were not sufficient levels of expression of both TFs for this purpose. Therefore, this multigenic construct does not resulted a good biotechnological tool for the activation of PAs biosynthesis in alfalfa. Our results suggest that the mechanisms of transcriptional control of both biosynthetic pathways could be different between plant species, and that additional specific genetic information on the anthocyanin and PAs biosynthesis in legumes is needed to efficiently activate both pathways in this species. / [ES] La alfalfa (Medicago sativa L.), es una leguminosa forrajera con un importante contenido en proteína, siendo la más cultivada a nivel mundial. En esta especie, los contenidos protéicos se ven mermados por los procesos de crecimiento y los recursos utilizados por la planta en el proceso de floración. Además, la alfalfa contiene una concentración de taninos condensados o proantocianidinas (PAs) muy inferior a la requerida para subsanar el desorden digestivo del ganado rumiante que genera hinchamiento por gases de efecto invernadero o meteorismo y la excesiva desaminación de las proteínas en el rumen producida por las fermentaciones de la flora microbiana ruminal. Ambas problemáticas son difíciles de abordar mediante métodos convencionales de mejora. El objetivo general de esta Tesis es desarrollar herramientas moleculares de utilidad para la manipulación genética de determinados caracteres de interés agronómico en la alfalfa, con objeto de incrementar su valor nutricional. Para ello, hemos puesto a punto un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens vía embriogénes somática aplicable a varios genotipos de alfalfa, que permite la producción de embriones viables capaces de germinar y producir plantas completas en el 50% de los explantes inoculados. Prácticamente no se detectó la presencia de quimeras o escapes ya que la mayoría de las plantas obtenidas contenían el T-DNA con todos los transgenes incorporados, disponiéndose por tanto de la herramienta imprescindible para la realización de los otros dos objetivos. Hemos aislado dos ortólogos del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) de alfalfa (MsTFL1c y MsTFL1a). Ambos genes se sobreexpresaron constitutivamente en A. thaliana y después en alfalfa para su posible uso como herramienta biotecnológica para producir un retraso en el tiempo de floración y con ello un posible aumento del desarrollo vegetativo. MsTFL1a extiende la fase vegetativa e inflorescente y retrasa la floración en Arabidopsis. En alfalfa su expresión constitutiva también produce retraso de la floración. Sin embargo, a este fenotipo no se le asocia un incremento del desarrollo vegetativo, presentando las plantas un tamaño más reducido que parece vinculado a una limitación en la proliferación celular. Hemos comprobado que este hecho se asocia a una reducción en los niveles de expresión de determinados genes efectores de la división celular, como es el caso de las ciclinas. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que los genes TFL1-like podrían participar adicionalmente en vías de señalización que regulan la diferenciación celular en plantas. También, hemos realizado una construcción multigénica mediante el sistema de clonaje por módulos GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). Se ha validado su funcionalidad mediante expresión transitoria en N. benthamiana y se ha introducido de manera estable en dos modelos experimentales: A. thaliana y N. tabacum, y en M. sativa, donde se ha estudiado su capacidad de integración, así como la de expresión de los transgenes. Hemos comprobado que esta construcción multigénica es capaz de activar la ruta de biosíntesis de antocianinas y de PAs en N. tabacum, pero no fue capaz de activar ambas rutas en alfalfa. Los factores transcripcionales Delila y Rosea1 no fueron capaces de activar los genes implicados en la regulación de ambas vías metabólicas en esta especie, o no fueron suficientes sus niveles de expresión para este fin. Por tanto, esta construcción no es una buena herramienta biotecnológica que procure la activación de la ruta de biosíntesis de PAs en la alfalfa. Nuestros resultados sugieren que los mecanismos de control transcripcional de la biosíntesis de antocianinas y PAs son diferentes entre las distintas especies, y que se necesita información genética adicional específica de la biosíntesis de antocianinas y PAs en leguminosas para poder diseñar eficientemente herrami / [CA] L'alfals (Medicago sativa L.), és una lleguminosa farratgera amb un important contingut en proteïna, sent la més cultivada a nivell mundial. En aquesta espècie, els continguts proteics es veuen desfavorits amb els processos de creixement i els requeriments utilitzats per la planta en el procés de floració. A més, l'alfals conté una concentració de tanins condensats o proantocianidines (PAs) molt inferior a la requerida per a esmenar el desorde digestiu del bestiar remugant que genera unflament per gasos o meteorisme per la producció de gasos d'efecte hivernacle, i l'excessiva desaminació de les proteïnes en el rumen produïda per les fermentacions de la flora microbiana. Ambdós problemàtiques són difícils d'abordar per mitjà de mètodes convencionals de millora. L'objectiu general d'aquesta Tesi és desenvolupar ferramentes moleculars d'utilitat per a la manipulació genètica de determinats caràcters d'interés agronòmic en l'alfals, a fi d'incrementar el seu valor nutricional. Per a això, hem posat a punt un protocol de transformació mediada per Agrobacterium tumefaciens via embriogènesi somàtica aplicable a diversos genotips d'alfals que permet la producció d'embrions viables capaços de germinar i produir plantes completes en el 50% dels explants inoculats. Pràcticament no es va detectar la presència de fugues, ja que la majoria de les plantes obtingudes contenien el T-DNA amb tots el transgens introduïts, tenint per tant la ferramenta imprescindible per a la realització dels altres dos objectius. Es van aïllar i sobreexpressar constitutivament dos ortòlegs del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) d'alfals (MsTFL1c i MsTFL1a) en A. thaliana i en alfals per al seu possible ús com a ferramenta biotecnològica, procurant un retard en el temps de floració i amb això un augment del desenvolupament vegetatiu. MsTFL1a estén la fase vegetativa i inflorescent i retarda la floració en Arabidopsis. En alfals la seua expressió constitutiva també produïx retard de la floració. No obstant això, a aquest fenotip no se li associa un increment del desenvolupament vegetatiu, sent les plantes d'una grandària més reduït que pareix vinculat a una limitació en la proliferació cel·lular. Hem comprovat que la limitació en la proliferació cel·lular s'associa a una reducció en els nivells d'expressió de determinats gens efectors de la divisió cel·lular, com és el cas de les ciclines. Els nostres resultats recolzen la hipòtesi que els gens TFL1-like podrien participar adicionalment en vies de senyalització que regulen la diferenciació cel·lular en plantes. Hem realitzat una construcció multigénica per mitjà del sistema de clonatge per mòduls GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). S'ha validat funcionalment per mitjà d'expressió transitòria en N. benthamiana. A més, s'ha introduït de manera estable en dos models experimentals (A. thaliana amb N. tabacum), i finalment en M. sativa, en els que s'ha estudiat la seua capacitat d'integració, així com la d'expressió dels transgens. Hem mostrat que aquesta construcció multigénica és capaç d'activar la ruta de biosíntesi d'antocianines i de PAs en N. tabacum. No obstant això, no van ser capaços d'activar la ruta de biosíntesi d'antocianines i per tant, la de PAs, en alfals. Els factors transcripcionals Delila i Rosea1 no són capaços d'activar els gens implicats en la regulació d'ambdues vies metabòliques en aquesta espècie, o alternativament no van ser prou els seus nivells d'expressió per a este fi. Per tant, aquesta construcció multigénica no és una bona ferramenta biotecnològica per activar la ruta de biosíntesi de PAs en l'alfals. Els nostres resultats suggerixen que els mecanismes de control transcripcional de la biosíntesi d'antocianines i PAs són diferents entre les distintes espècies, i que es necessita informació genètica addicional específica de la biosíntesi d'antocianines i PAs en lleguminoses per a / Fresquet Corrales, S. (2015). Diseño y validación de herramientas biotecnológicas para la mejora del valor nutricional de la alfalfa (Medicago sativa L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/59240

Tesis por compendio / [ES] El cultivo del caqui ha crecido enormemente en la región Valenciana en los últimos 20 años al presentarse como una alternativa interesante al cultivo de cítricos. Sin embargo, su cultivo se enfrenta a tres problemas importantes. En primer lugar, su producción es monovarietal y se centra en la variedad Rojo Brillante, lo que conlleva un riesgo sanitario y de mercado importante que pone de manifiesto la necesidad de aumentar el número de variedades disponibles. En segundo lugar, el cambio climático pone en peligro la producción de caqui en zonas mediterráneas debido a un aumento en la salinidad del agua y suelo. La salinidad afecta especialmente al caqui debido a sus efectos sobre la producción, calidad y postcosecha de la fruta. La falta de patrones tolerantes a la salinidad compatibles con las condiciones de cultivo además agrava este problema, por lo que es necesario el desarrollo de patrones clonales tolerantes a la salinidad. En tercer lugar, la industria del caqui está basada en la aplicación de tratamientos postcosecha de desastringencia. Aunque existen variedades naturalmente no astringentes, su uso en el Mediterráneo es complicado debido a la incompatibilidad con los patrones existentes. Además, la salinidad afecta gravemente la eficacia del tratamiento de desastringencia. Por ello, cabe destacar que se necesita más información acerca de los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo de la astringencia para poder desarrollar nuevas variedades y/o unos tratamientos de desastringencia más efectivos. En el contexto de la mejora genética y la biología molecular, pueden distinguirse tres objetivos para mejorar las condiciones de cultivo en esta región: el desarrollo de nuevas variedades de caqui con una época de madurez distinta a Rojo Brillante, el desarrollo de patrones clonales tolerantes a la salinidad y compatibles con variedades no astringentes y la obtención de nuevos conocimientos acerca de las bases moleculares del mecanismo de regulación de la astringencia para optimizar los tratamientos postcosecha. La presente tesis ha contribuido a estos tres objetivos. Respecto a la obtención de nuevas variedades, se ha desarrollado un análisis de diversidad genética del banco de germoplasma del IVIA, lo que es un recurso importante para la planificación de cruces. Para asegurar una mejora genética eficiente y evitar redundancias en la colección, se ha efectuado un análisis de diversidad usando secuencias microsatélites. El análisis ha arrojado datos de gran utilidad, como el descubrimiento de alelos únicos, que permiten la identificación rápida de variedades, o la división de la colección de acuerdo con el tipo de astringencia del fruto, confirmando el fondo genético común de las accesiones que comparten este carácter. Además, el mapa de las relaciones filogenéticas generado será de gran utilidad para la planificación futura de cruces dentro del programa de mejora de caqui. Para abordar el problema de la salinidad, se han realizado distintos ensayos de estrés salino en invernadero con distintas poblaciones de especies utilizadas como patrón de caqui: Diospyros virginiana (tolerante a salinidad), Diospyros kaki (sensible a salinidad y compatible) y Diospyros lotus (sensible a salinidad). Además, debido a los caracteres de gran interés presentes en estas dos especies, se incluyó en los ensayos una población proveniente de un retrocruce entre D. kaki y D. virginiana. Como resultado, varios individuos de estas poblaciones se han seleccionado debido a su tolerancia a la salinidad, ya que podrían tener las características adecuadas para ser patrones clonales. Complementariamente, se han usado aproximaciones fisiológicas, transcriptómicas y de secuenciación masiva de transcriptoma para hacer una primera descripción de los mecanismos de tolerancia a la salinidad presentes en estas especies. Como resultado, se han descrito los principales caracteres relacionados con la tolerancia a la salinidad en el género Diospyros, como la compartimentalización de iones, la expresión en raíz de un gen similar a HKT-1, la abundancia de canales de cloruro o la arquitectura de raíz. Finalmente, para obtener más información sobre la biosíntesis de proantocianidinas, la molécula responsable de la astringencia, se formuló la hipótesis de la existencia de un complejo proteico del tipo MBW (MYB-bHLH-WD40) que podía regular la ruta molecular de forma análoga a la regulación existente en otras especies estudiadas. En primer lugar se secuenció un gen tipo WD40, posible ortólogo de TTG1 de Arabidopsis thaliana. El papel de este gen y otros genes del hipotético complejo (MYB2, MYB4 y MYC1) han sido estudiados mediante un análisis transcriptómico en distintos estadios de madurez de frutos astringentes y no astringentes. Además, se ha observado mediante microscopía la localización celular de estos genes mediante la expresión transitoria con fusión con fluorescencia en hojas de Nicotiana benthamiana y hemos analizado su interacción mediante ensayos de doble híbrido en levadura y BiFC (complementación bimolecular de fluorescencia) mediante expresión transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana. Finalmente, hemos analizado los efectos de estos genes y de sus interacciones en la ruta de biosíntesis de proantocianidinas usando el promotor del gen ANR (antocianidin reductasa) y promotores de los genes reguladores MYC1 y MYB4, fusionándolos con una luciferasa como gen delator y coexpresándolos con distintas combinaciones de los genes del complejo MBW mediante expresión transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana. Los resultados de estos ensayos confirman la interacción nuclear de estos genes y su papel en la regulación de la producción de la astringencia, dando lugar a un modelo básico con algunas diferencias a los propuestos en otras especies. / [EN] Persimmon culture has vastly grown in the last 20 years as an alternative to citrus production in the Valencian region. However, its production faces three important problems. First, monovarietal production based on Rojo Brillante is a sanitary and market risk that requires to increase the number of varieties available. Second, climate change has threatened persimmon production in the Mediterranean areas because the salinity increase in water and soil. Salinity severely affects production, quality and postharvest life of the fruit. The lack of salt-tolerant rootstocks compatible with the cultural conditions aggravates the problem; hence clonal salt-tolerant rootstocks are needed. Third, persimmon industry relies on the postharvest deastringency treatment of the varieties. Even though there are varieties that are naturally non-astringent, its culture in the Mediterranean area is limited due to rootstock incompatibility. Additionally, the costly postharvest treatment is also affected by salinity. Consequently, more information is needed about the molecular mechanism of astringency biosynthesis in persimmon fruit in order to develop new varieties and/or more effective treatments for removing astringency of the fruit. In the context of breeding and molecular biology, three goals need to be approached in order to improve the cultural conditions: development of new persimmon varieties with maturity date different from Rojo Brillante, development of salt-tolerant clonal rootstocks compatible with non-astringent varieties and research on the molecular bases of the mechanism of astringency production to optimize the postharvest treatments. This research contributes and provides knowledge to address these goals. Concerning breeding of new varieties, the IVIA persimmon germplasm collection is an important resource for breeding of new varieties. To ensure efficient breeding and avoid redundancy in the collection, a SSR analysis was carried out to solve this problem. This analysis has provided useful data, such as the discovery of unique alleles, that allows rapid identification of varieties or the division of the population according to its astringency type, confirming the common genetic background of the accessions concerning to this trait. The generated genetic diversity map will be useful for designing crosses in the breeding program. To address the salinity problem, several salt-stress assays were done in greenhouse using different persimmon rootstocks populations: Diospyros virginiana (salt-tolerant), Diospyros kaki (salt-sensitive fully compatible) and Diospyros lotus (salt-sensitive). Furthermore, due to the desirable characters present in these species, a backcross progeny between D. kaki and D. virginiana was obtained and included in the salt-stress assays. Thus, several individuals from all the populations have been selected, which are tolerant to salinity and could meet the desired characteristics for appropriate persimmon clonal rootstocks. Furthermore we have used physiological, transcriptomic and mass transcriptome sequencing approaches in order to discover the physiological and genetic bases of salinity tolerance in these species. As a result, we described the main facts related to salinity tolerance mechanisms in Diospyros species, such as ion compartmentalization, HKT-1-like root expression, abundancy of chloride channels and root architecture. Finally, in order to get a deeper insight on the biosynthesis of proanthocyanidins, the responsible molecule of astringency, we hypothesized the presence of a MBW protein complex (MYB-bHLHWD40) in persimmon fruit, involved in the regulation of the proanthocyanidins synthesis pathway in a similar way to other species. We firstly sequenced the putative persimmon WD40 orthologue of TTG1 gene from Arabidopsis thaliana. The role of this gene and other genes of the complex (MYB2, MYB4 and MYC1) was studied through transcriptomic analysis in different stages of nonastringent and astringent fruit. Furthermore, we have observed through microscopy the subcellular localization of these genes using fluorescent protein fusions and transient expression in Nicotiana benthamiana leaves, and analyzed its interaction through yeast twohybrid assays and BiFC (bimolecular fluorescence complementation) experiments in Nicotiana benthamiana leaves. In addition, we have analyzed the effects of these interactions in the pathway of proanthocyanidin biosynthesis using the ANR (anthocyanidin reductase) gene promoter and the promoters of some of these genes (MYB4 and MYC1) fused with a luciferase reporter, together with the coexpression of the MBW genes using transient expression in Nicotiana benthamiana leaves. The results of these assays have confirmed the nuclear interaction of these genes and its role in the regulation of astringency biosynthesis, providing a basic model with some differences with respect to the models proposed in other species. / [CA] El cultiu del caqui ha crescut enormement en la regió Valenciana en els últims 20 anys al presentar-se com una alternativa interessant al cultiu de cítrics. No obstant, el seu cultiu s’enfronta a tres problemes importants. En primer lloc, la seua producció es monovarietal i està centrada en la varietat Rojo Brillante, el que suposa un risc sanitari i de mercat important que posa de manifest la necessitat de augmentar el nombre de varietats disponibles. En segon lloc, el canvi climàtic posa en perill la producció de caqui a la zona mediterrània degut a un augment en la salinitat del aigua i del sòl. La salinitat afecta de forma especialment al caqui degut al seus efectes sobre la producció, qualitat i vida post collita de la fruita. La falta de patrons tolerants a salinitat compatibles amb les condicions de cultiu a més agreuja aquest problema, pel que es necessari el desenvolupament de patrons clonals tolerants a salinitat. En tercer lloc, la industria del caqui esta basada en la aplicació de tractaments post collita de deastringència. Encara que existixen varietats naturalment no astringents, el seu us al mediterrani es complicat degut a la incompatibilitat en els patrons existents. A més, la salinitat afecta gravement a la eficàcia del tractament post collita de deastringència. Per això, cal destacar que es necessita conèixer millor els mecanismes moleculars que controlen el desenvolupament de la astringència per a la obtenció de noves varietats i/o uns tractaments post collita més efectius. En aquest context de millora genètica i biologia molecular, es poden distingir tres objectius per a millorar les condicions del cultiu en aquesta regió: el desenvolupament de noves varietats de caqui en una època de maduresa distinta a la de Rojo Brillante, el desenvolupament de patrons clonals tolerants a salinitat i compatibles amb varietats no astringents i la obtenció de nous coneixements sobre les bases moleculars del mecanisme de producció de astringència per optimitzar els tractaments post collita. La present tesi ha contribuït a aquests tres objectius. En el que respecta a la obtenció de noves varietats, s’ha desenvolupat un anàlisi de diversitat genètica del banc de germoplasma de l’IVIA, el qual es un recurs important per a la planificació de creuaments. Per a assegurar una millora genètica eficient i evitar redundàncies a la col·lecció, s’ha efectuat un anàlisi en microsatèl·lits. El anàlisi ha resultat en dades de gran utilitat, com el descobriment de al·lels únics, que permiteixen la identificació rapida de varietats, o la divisió de la col·lecció d’acord en el tipus d’astringència del fruit, confirmant el fons genètic comú de les accessions que comparteixen aquest caràcter. A més, el mapa de les relacions filogenètiques elaborat serà de gran utilitat per a la planificació futura de creuaments dins del programa de millora de caqui. Per a abordar el problema de la salinitat, s’han realitzat distints assajos d’estrés salí en hivernacle amb distintes poblacions de patró de caqui: Diospyros virginiana (tolerant a salinitat), Diospyros kaki (sensible a salinitat i amb compatibilitat) i Diospyros lotus (sensible a salinitat). A més, degut als caràcters de gran interès presents en aquestes dos espècies, es va incloure en els assajos una població provenient de un retrocreuament entre D. kaki i D. virginiana. Com a resultat, diversos individus d aquestes poblacions s’han seleccionat degut a la seua tolerància a salinitat, ja que podrien tindre les característiques adequades per a ser patrons clonals. Complementàriament, s’han utilitzat aproximacions fisiològiques, transcriptòmiques i de seqüenciació massiva de transcriptoma per a fer una primera descripció dels mecanismes de tolerància a salinitat presents en aquestes espècies. Com a resultat s’han descrit els principals caràcters relacionats amb la tolerància a la salinitat en el gènere Diospyros, com la compartimentalització de ions, la expressió en arrel de un gen similar a HKT-1, la abundància de canals de clorur o la arquitectura de la arrel. Finalment, per a obtenir mes informació sobre la biosíntesi de proantocianidines, la molècula responsable de la astringència, es va formular la hipòtesi de la existència de un complex proteic del tipus MBW (MYB-bHLH-WD40) que podria regular la ruta molecular de forma anàloga a la regulació existent en altres espècies estudiades. En primer lloc, es va seqüenciar el gen ortòlog putatiu del tipus WD40 de TTG1 de Arabidopsis thaliana. El paper de aquest gen i altres gens del hipotètic complex (MYB2, MYB4 i MYC1) han sigut estudiats mitjançant un anàlisi transcripcional en diferents estats de maduresa de fruits astringents i no astringents. A més, s’ha observat amb microscòpia la localització cel·lular de aquestos gens mitjançant la expressió transitòria amb fusió a fluorescència en fulles de Nicotiana benthamiana i hem analitzat la seua interacció amb un assaig de doble híbrid en llevat i BiFC (complementació bimolecular de fluorescència) mitjançant expressió transitòria en fulles de Nicotiana benthamiana. Finalment hem analitzat els efectes de aquests gens i de les seues interaccions en la ruta de biosíntesi de proantocianidines utilitzant el promotor del gen ANR (antocianidin reductasa) i promotors dels gens reguladors MYC1 i MYB4 fusionant-los amb una luciferasa com a gen delator i coexpressant-los amb diferents combinacions dels gens del complex MBW mitjançant expressió transitòria en fulles de Nicotiana benthamiana. Els resultats de aquests assajos confirmen la interacció nuclear de aquestos gens i el seu paper en la regulació de la producció de la astringència, donant lloc a un model bàsic amb algunes diferències als proposats en altres espècies. / Gil Muñoz, F. (2020). Biotechnological tools applied to the improvement of persimmon (Diospyros kaki Thunb) culture [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153155 / Compendio