Submitted by Eunice Novais (enovais@uepg.br) on 2018-02-22T13:31:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Nauana Hay Paiva.pdf: 2299112 bytes, checksum: d9eac670828127f267396863b468ab2f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-22T13:31:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Nauana Hay Paiva.pdf: 2299112 bytes, checksum: d9eac670828127f267396863b468ab2f (MD5) Previous issue date: 2017-07-07 / As vilosidades intestinais são estruturas digitiformes da camada mucosa do intestino delgado que ampliam a superfície desse órgão, otimizando o processo de absorção dos nutrientes. A morfogênese das vilosidades intestinais ocorre de forma indireta em galinhas. Primeiramente, surgem projeções longitudinais da mucosa. Essas projeções sofrem dobramento e adquirem padrão zigue-zague, que é a base para a formação das vilosidades. Estudo anterior do nosso grupo relatou pela primeira vez que as projeções da mucosa de embriões de galinhas se bifurcavam. Entretanto, embora vários aspectos morfológicos da morfogênese das vilosidades intestinais de galinhas sejam conhecidos, não há na literatura dados a respeito da bifurcação das projeções da mucosa. O objetivo do presente trabalho foi compreender o papel da bifurcação na morfogênese das vilosidades intestinais no jejuno de embriões de galinhas. Análises histológicas, avaliação da proliferação celular pela incorporação de BrdU e reação de PAS foram realizadas durante o período de ocorrência da bifurcação. Para avaliar a proliferação celular, a injeção de BrdU in ovo foi padronizada. As análises histológicas permitiram estabelecer que a bifurcação ocorre entre o 13º e 15º dia e definir a sequência de mudanças morfológicas do processo. A avaliação da proliferação celular mostrou que as células do epitélio da mucosa e as envolvidas no processo de bifurcação estavam proliferando. A reação de PAS revelou a presença de membrana basal nas células envolvidas na bifurcação. Os dados permitem concluir que o processo de bifurcação envolve mudanças morfológicas correlacionadas à proliferação de células epiteliais que culminam com a formação das pré-vilosidades. / The intestinal villi are finger-like projections of the small intestinal mucosa that extend its surface, optimizing the process of nutrient absorption. The intestinal villi morphogenesis of the chick occurs indirectly. At first, longitudinal previllous ridges appear in the intestine. The previllous ridges fold into zigzag pattern, and finally individual villi are formed. Our previous study reported, for the first time, the bifurcation of the previllous ridges on chick embryos. Although morphological aspects of the intestinal villi morphogenesis of the chickens are known, there are no data from the previllous ridges bifurcation. The present work aimed to understand the role of bifurcation in the intestinal villi morphogenesis of the chick embryos. Histological analysis, evaluation of cell proliferation by incorporation of BrdU and PAS reaction were performed during the period of bifurcation. To evaluate cell proliferation, injection of BrdU in ovo was standardized. The histological analyses allowed to establish that the bifurcation occurs between the 13th and 15th day and to define the sequence of morphological events during the process. The evaluation of cell proliferation showed that cells of the mucosal epithelium and involved in the bifurcation were proliferating. The PAS reaction revealed the presence of basement membrane in the cells involved in the bifurcation process. The data allow us to conclude that the morphological changes of the bifurcation are correlated to the proliferation of epithelial cells and culminate to formation of previllous.

O aparelho propulsor mandibular é utilizado na odontologia para modular o crescimento da cartilagem condilar, por meio de forças geradas pela alteração postural da musculatura. Neste estudo foi avaliado o papel de integrinas ligantes de fibronectina (FN) na transdução das forças mecânicas geradas pelo aparelho, em ratos. Por meio de imuno-histoquímica e PCR em tempo real verificou-se que, in vivo, o uso do aparelho modulou a expressão das subunidades <font face=\"symbol\">1, <font face=\"symbol\">5, e <font face=\"symbol\">v de integrinas, FN e PCNA, um marcador de proliferação celular. In vitro, forças distensivas cíclicas aplicadas sobre células da cartilagem condilar aumentaram a expressão de mRNA para FN, fatores de crescimento IGF-I e IGF-II e PCNA. A adição do peptídeo GRGDSP, que bloqueia a ligação de algumas integrinas à FN, inibiu todos os efeitos, exceto na expressão de IGF-II. Esses resultados sugerem que integrinas ligantes de FN desempenham papel importante na mecano-transdução neste sistema e contribuem para o entendimento das bases moleculares envolvidas na ortopedia funcional dos maxilares / The mandibular propulsor appliance is widely used in dentistry to modulate the growth of the condylar cartilage, through forces generated by postural changes in the orofacial musculature. The aim of this study was to evaluate the role of fibronectin (FN)-binding integrins in the transduction of mechanical forces generated by the appliance in rats. By immunohistochemistry and real time PCR it was observed that, in vivo, the appliance´s use modulated the expression of the integrin subunits <font face=\"symbol\">1, <font face=\"symbol>\"5, and <font face=\"symbol\">v, FN and PCNA, a cell proliferation marker. In vitro, the application of cyclic distension forces on condylar cartilage cells increased the expression of FN, IGF-I, IGF-II and PCNA mRNA. Addition of the peptide GRGDSP, which blocks the binding of some integrins to FN, inhibited all the effects except the increase in IGF-II mRNA. These results suggest that FN-binding integrins play an important role in mechanotransduction in this system, contributing to the understanding of the molecular basis involved in maxillary functional orthopedic therapy.

INTRODUÇÃO: O sucesso a longo prazo da intervenção coronária percutânea, inicialmente realizada apenas com balão, era limitado pelo recolhimento elástico da artéria e pela hiperplasia neointimal. Com o advento dos stents convencionais (BMS) houve melhora nesse cenário e diminuição da reestenose, que é resultante de uma complexa cadeia de eventos iniciada após a injúria causada na parede vascular pela insuflação de balões e da aposição das hastes do stent. A proliferação excessiva de células musculares lisas (VSMC) tem papel fundamental na formação da neoíntima no contexto da reestenose intra-stent com a consequente redução da luz arterial. Com o advento dos stents farmacológicos (DES) houve diminuição importante da hiperplasia neointimal e um dos fármacos que se mostrou efetivo nesse papel é o sirolimo, que atua se ligando à proteína de ligação 12 e o heterodímero resultante se liga à mTOR impedindo sua ativação e causando parada do ciclo celular entre as fases G1 e S, desse modo inibindo a proliferação e migração de VSMC e das células endoteliais (HUVEC). Portanto a intervenção coronária acaba interferindo diretamente no endotélio, interferindo na produção das HUVEC não apenas no aspecto quantitativo, mas também na função das mesmas, e a qualidade funcional do endotélio é tão fundamental quanto à sua presença. Após o implante dos DES, principalmente os de primeira geração, ocorre disfunção endotelial cujo principal marcador é a perda da capacidade do relaxamento do vaso. Há correlação também entre cobertura das hastes incompleta e ocorrência de trombose dos stents. Consequentemente há espaço para o aprimoramento dos DES, para que se tornem dispositivos com eficácia já alcançada na prevenção da reestenose porém com um perfil de segurança maior. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as alterações causadas pelos DES nas HUVEC e nas VSMC em cocultura na presença e na ausência do soro rico em plaquetas. MATERIAIS E MÉTODOS: Utilizamos células HUVEC e VSMC em modelos de monocultura e cocultura, na presença e na ausência de soro rico em plaquetas, tratadas com BMS ou DES. Realizamos a determinação da IC50 do inibidor da mTOR, avaliação da citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT, determinação da formação de peróxidos lipídicos, avaliação das fases do ciclo celular e da expressão de marcadores de controle de proliferação e inflamação. RESULTADOS: Na avaliação da citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT e determinação da IC50 as VSMC foram menos sensíveis ao sirolimo que as HUVEC (IC50 em 24/48 horas 14,85/10,47uM e 9,48/22,24 uM, respectivamente para HUVEC e VSMC). As plaquetas e fatores solúveis potencializam o estresse oxidativo gerado pela presença dos stents possivelmente por ampliar o ambiente inflamatório. Houve parada do ciclo celular na fase G0/G1 causada pelos DES somente com adição das plaquetas ao meio de cultura. Nos modelos de cultura celular sem as plaquetas a parada do ciclo celular foi em G2/M. Não houveaumento das células na fase DNA fragmentado (sub-G0) evidenciando que não houve indução de morte celular. CONCLUSÃO: As VSMC foram menos sensíveis ao sirolimo que as HUVEC. Nos modelos de cocultura com adição das plaquetas os DES eluídores de sirolimo causaram parada do ciclo celular na fase G0/G1 sem indução de morte celular, sugerindo que o sirolimo exerce seus efeitos anti-inflamatórios nessas populações celulares e consequentemente reduz a hiperplasia neointimal por um mecanismo citostático / INTRODUCTION: The long-term success of percutaneous coronary intervention, initially performed only with a balloon, was limited by the elastic recoil of the artery and by neointimal hyperplasia. There was improvement in this scenario with the advent of bare metal stents (BMS), because they decrease in restenosis, that resulting from a complex network of events initiated after the injury caused in the vascular wall by insufflation of balloons and apposition of the stent struts. Excessive proliferation of smooth muscle cells (VSMC) plays a key role in neointimal hyperplasia in the context of intrastent restenosis with consequent reduction of arterial lumen. With the advent of drug-eluting stents (DES) there was a significant decrease in neointimal hyperplasia and one of the drugs that proved effective in this role is sirolimus, which acts by binding to the binding protein 12 and the resulting heterodimer binds to mTOR preventing its activation and causing cell cycle arrest between G1 and S phases and thereby inhibiting the proliferation and migration of VSMC and also inhibiting endothelial cells (HUVEC). Therefore, coronary intervention interferes directly in the endothelium, interfering in the production of endothelial cells, not only in the quantitative aspect, but also in their function, and the functional quality of the endothelium is as fundamental as its presence. After the implantation of DES, especially those of the first generation, endothelial dysfunction occurs, whose main marker is the loss of the capacity of the vessel relaxation. There is also correlation between incomplete stem coverage and stent thrombosis. Consequently, it is possible to improve of the DES, so that they become devices with already achieved effectiveness in the prevention of restenosis but with a greater safety profile. The present study aims to evaluate the changes caused by DES in human HUVEC and VSMC in co-culture in the presence and absence of platelet-rich serum. MATERIALS AND METHODS: We used HUVEC and VSMC in monoculture and co-culture models in the presence and absence of platelet rich serum treated with BMS or DES. We performed the determination of IC50 for mTOR inhibitor, cytotoxicity evaluation by the colorimetric method of MTT, determination of lipid peroxide formation, cell cycle and expression of necrosis and inflammation markers. RESULTS: In the assessment of cytotoxicity by the MTT colorimetric method and determination of the IC50, VSMC were less sensitive to sirolimus than HUVEC (IC50 in 24/48 hours 14.85 uM/10.47uM and 9.48 uM/ 22.24 uM, respectively for HUVEC and VSMC). Platelets potentiate the oxidative stress generated by the presence of stents, possibly by increasing the inflammatory environment. Drug-eluting stents arrested VSMC and HUVEC in the G0/G1 phase of the cell cycle only with the addition of platelets to the culture medium. In cell culture models without platelets the cell cycle arrest was in G2/M. There was no increase of the cells in the fragmented DNA phase (sub-G0) evidencing that there was no induction of apoptosis. CONCLUSION: Human aorta smooth muscle cells of the were less sensitive to sirolimus than HUVEC. In coculture models with platelet addition, DES with sirolimus caused cell cycle arrest in the G0/G1 phase without induction of apoptosis, suggesting that sirolimus exerts its antiinflammatory effects in these cellular populations and consequently reduces neointimal hyperplasia via a cytostatic mechanism

Os receptores do tipo Toll (TLRs) são as primeiras proteínas do sistema imune a identificarem distúrbios, reconhecem patógenos como bactérias, fungos e vírus. Como o processo inflamatório possui um importante papel em diversas doenças, os TLRs foram considerados potenciais alvos em estratégias terapêuticas, incluindo o tratamento de câncer. No entanto, o papel dos TLRs permanece ambíguo. Esse estudo teve como objetivos analisar os níveis de expressão dos TLRs presentes em membrana plasmática, TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (grau II-IV), tumor mais prevalente do Sistema Nervoso Central (SNC). Nós demonstramos que a expressão dos TLRs foi mais alta em amostras de astrocitomas comparadas com tecido cerebral não-neoplásico, por qRT-PCR. A expressão gênica e proteica foi observada em células de linhagem de glioblastoma (GBM) U87MG e A172, mostrando sua presença em células tumorais. Foi observada expressão associada entre os heterodímeros TLR1- TLR2. Em GBMs, o subtipo mesenquimal mostrou maior nível de expressão dos TLRs comparados aos subtipos clássico e proneural. Com o objetivo de identificar o papel dos TLRs nas células tumorais, foi selecionado dentre os TLRs o que apresentou maior nível de expressão, o TLR4, e realizamos ensaios funcionais estimulando a U87MG com LPS, um agonista natural para TLR4. A taxa de proliferação da célula tratada com LPS foi similar a não tratada. No entanto, foi observado a ativação do NF-kB após 12hrs do estímulo com LPS. Quando a sinalização do receptor foi inibida por um composto químico (VGX-1027), o nível de proliferação da U87MG decaiu. Adicionalmente, análise in silico revelou uma forte associação dos TLRs hiperexpressos com aumento da expressão de genes relacionados à sinalização do ciclo celular, inflamassoma e ripoptossoma. O que sugere serem os TLRs alvos para complementação do tratamento do câncer / Toll-like receptors (TLRs) are the first to identify disturbances in the immune system, recognizing pathogens such as bacteria, fungi, and viruses. Since the inflammation process plays an important role in several diseases, TLRs have been considered potential therapeutic targets, including treatment for cancer. However, TLRs\' role in cancer remains ambiguous. This study aims to analyze the expression levels of plasmatic cell membrane TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6) in different grades (II-IV) of human astrocytoma, the most prevalent tumor of CNS. We demonstrated that TLR expressions were higher in astrocytoma samples compared to non-neoplastic brain tissue, by qRT-PCR. The genes and proteins expressions were observed in U87MG and A172 GBM cell lines, proving their presence in the tumor cells. Associated expressions between the known heterodimers TLR1-TLR2 were found in diffusely infiltrative astrocytoma. In GBM, the mesenchymal subtype showed higher levels of TLR expressions in relation to classical and proneural subtypes. Aiming to indentify the role of TLRs in tumor cells, we chose the highest TLR expressed in GBM cells, the TLR4, and performed functional assays stimulating U87MG-GBM cell line with LPS, a natural agonist for TLR4. The proliferation rate was similar in treated and non-treated cell with LPS. However, NF-kB activation was detected after 12hrs of LPS stimulation. When TLR4 signaling pathway was inhibited by a chemical compound (VGX-1027) a decrease in the proliferation rate was observed. Additionally, in silico analysis revealed a strong association of TLRs upregulation with increased expression level of genes related to cell cycle, inflammasome and ripoptosome pathways, further highlighting TLRs as interesting targets for cancer complementary treatment

Um dos fatores que regula o córtex adrenal é o hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, no entanto, o fator de crescimento de fibroblastos do tipo 2, FGF2, e os peptídeos N-terminais da pro-opiomelanocortina, N-POMC, também podem estar envolvidos. As vias de sinalização das proteínas quinases: ERK, JNK e p38, juntamente com outras vias como PKA, PKC e PI3K/Akt são importantes para a definição trófica das células. Nós analisamos a importância destas vias de sinalização e sua influência na viabilidade, proliferação e morte celular, induzidas pelo ACTH, FGF2 e N-POMC, utilizando inibidores farmacológicos e moleculares em culturas primárias de células adrenocorticais, células glomerulosa e fasciculadas/reticulares. Nossos resultados mostram que as vias mediadoras envolvidas na resposta proliferativa do FGF2 e da N-POMC são, respectivamente, as vias ERK/JNK e ERK/JNK/Akt. Por outro lado, a resposta pró-apoptótica promovida pelo ACTH é mediada pela via p38, provavelmente associada à ausência de ativação das vias relacionadas com a sobrevivência, como as vias ERK e JNK. / One of the factors that regulate adrenal cortex is the adrenocorticotrophic hormone, ACTH, however, the fibroblast growth factor type 2, FGF2) and pro-opiomelanocortin N-terminal peptides, N-POMC, might also be involved. The mitogen-activated protein kinase pathways: ERK, JNK and p38, together with other signaling pathways such as PKA, PKC and PI3K/Akt are important for cells trophic definition. We analyze the importance of these pathways and their influence in viability, proliferation and cell death stimulated by ACTH, FGF2 and N-POMC, using pharmacological and molecular inhibitors in primary culture of adrenocortical cells, glomerulosa and fasciculata/reticularis cells. Our results show that the mediating signaling pathways involved in FGF2 and N-POMC proliferative effects are, respectively, ERK/JNK and ERK/JNK/Akt. On the other hand, the pro-apoptotic response promoted by ACTH is through p38 signaling, probably associated with the absence of activation of other pathways involved with cell survival, like ERK and JNK.

Células tronco hematopoéticas (CTH) de sangue de cordão umbilical (SCU) possuem grande potencial em terapia celular. Mesmo sendo bem caracterizadas quanto às suas propriedades funcionais e fenotípicas, a regulação da auto-renovação de CTH e os genes envolvidos são pouco conhecidos. Investigou-se através da curva de crescimento, ensaio clonogênico e citometria de fluxo, a expansão e diferenciação de CTH cultivadas sem e com suplementação dos mitógenos estradiol e LiCl. A expressão da subunidade da telomerase teve aumento significativo em todas as condições, bem como a expressão de Nanog e Oct4 relacionados a pluripotência e auto-renovação. Observou-se também a expressão de Nanog, Oct4, Sox2 e FoxD3 em células CD133, células CD3 de sangue periférico e células de colônias hematopoéticas. Concluiu-se que o meio sem suplementação já é suficiente na expansão de CTH, mantendo suas características, relacionadas à proliferação, auto-renovação e pluripotência celular. / Hematopoietic stem cells (HSC) from umbilical cord blood (UCB) have a great potencial for hematopoietic reconstitution. Although these stem cells have been well characterized by their functional and fenotipics properties, self-renewal regulation and genes involved are still unknown. Analyses of cell growth, clonogenic assay and flow cytometry revealed the expansion and differentiation of HSC grown in medium with or without suplementation of the mitogens estradiol and LiCl. Expression of the subunit of telomerase increased in all treatments. As well as the expression of Nanog and Oct4, related to plutipotency and self-renewal. Nanog, Oct4, Sox2 and FoxD3 expression was also high in CD133 cells, in CD3 cells from peripherical blood and in clonogenic assay derived cells. Conclusion: medium without the suplementation is sufficient for expansion of HSC, keeping their characteristcs, realted to proliferation, self-renewal and pluripotency.

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

A expressão do gene Dermicidina (DCD) no câncer de mama promove aumento na proliferação e sobrevivência celular, porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Através de um ensaio de microarranjos de DNA demonstramos que o DCD desempenha atividade de fator de crescimento pela modulação da via de sinalização EGF/ErbB. Estes dados foram confirmados através de silenciamento gênico, superexpressão e tratamento com a proteína recombinante. O silenciamento diminuiu a expressão de EGFR e seus ligantes, e reduziu a ativação da via de sinalização EGF/ErbB. O tratamento da linhagem celular MDA-MB-361 com DCD recombinante resultou em uma curva de proliferação em forma de sino com concomitante aumentou a expressão de EGFR e seus ligantes. A superexpressão de DCD na linhagem MCF-7 também resultou no aumento da expressão dos receptores EGFR e HER-2 e de seus ligantes, além da ativação de suas vias de sinalização. Este trabalho sugere que o DCD é capaz de modular a expressão e ativação da família EGF/ErbB resultando no aumento do crescimento e sobrevivência celular. / The expression of the gene Dermicidin (DCD) in breast cancer promotes increased in cell growth and survival, however the mechanisms involved are unknown. Using a DNA microarray assay we demonstrated that the DCD activity plays by modulating growth factor signaling phathway of EGF/ErbB. These data were confirmed by gene silencing, overexpression and treatment with the recombinant protein. The silencing decreased the expression of EGFR and its ligands, and reduced the activation of the EGF/ErbB signaling pathways. The treatment of MDA-MB-361 cell line with recombinant DCD resulted in a proliferation curve bell-shaped with a concomitant increased in the expression of the EGFR and its ligands. The overexpression of the DCD in the MCF-7 cell line also resulted in increased expression of the receptors HER-2 and EGFR and its ligands, and activation of theirs signaling pathways. This work suggests that DCD is able to modulate the expression and activation of the EGF/ErbB family resulting in increased of cellular growth and survival.