Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-10-24T11:23:13Z No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-10-26T15:45:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BRUNA_FERREIRA_LEAL_TES.pdf: 9428836 bytes, checksum: 9ef80f04ac10ad1e26b54ce86ddd80ce (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Rhipicephalus microplus is a tick that infests preferably bovines and cause a great damage in the livestock. The main control method against ticks is the use of acaricides, which lead to the emergence of resistant populations, in addition to increasing costs and risk of contamination of meat, milk and environment. Thus, vaccine antigens have been identified and characterized as an alternative to acaricides. Salivary molecules of hematophagous parasites can inhibit responses associated to homeostasis and modulate the host immune system and, therefore, are options in the search for anti-tick vaccines. This work characterized a glycine rich-protein and the paramyosin of R. microplus. Glycine rich-proteins are secreted in tick saliva and are essential in the attachment and blood feeding. Paramyosin is able to evade the host immune system and proved to be an important allergen of mites and vaccine antigen against helminths. The cDNA and amino acid sequences of the R. microplus glycine rich-protein (RmGRP) were identified and analyzed, revealing two distinct portions of the protein (glycine residues presented dispersed in the N-terminal region and in repeated patterns along the C-terminal region). Cloning, expression and purification of RmGRP were performed and the recombinant protein was tested for recognition by sera from naturally and experimentally infested bovines, indicating their antigenicity, but also displaying a high heterogeneity in protein recognition between individuals and among infestations in the same individual. In addition, recombinant RmGRP was recognized by sera from rabbits immunized with saliva and salivary gland from partially and fully engorged females and eggs, but not from sera from rabbits immunized with gut. Expression of the gene encoding RmGRP (rmgrp) in different female tissues and tick development stages was evaluated by qRT-PCR. Gene transcription was found in eggs, larvae, adult males, salivary glands, fat bodies and ovaries of partially and fully engorged females, with the highest expression levels in 1-day-old larvae and salivary glands of fully engorged females. rmgrp was not expressed in 3- and 6-day-old eggs and in guts of partially and fully engorged females, corroborating to the aforementioned result. Effects of RNAm silencing corresponding to RmGRP and RmPRM were evaluated, which resulted in egg laying reduction in the group in which the RmPRM gene was silenced and in the reduction of larval hatching rate in the two groups. Therefore, it is suggested that both proteins are important during larval development, but only RmPRM is required in egg formation and/or laying. Cloning of the coding DNA regions and expression of N-terminal, internal and Cterminal fragments of R. microplus paramyosin (RmPRM) in Escherichia coli and of the complete RmPRM in Pichia pastoris were confirmed by SDS-PAGE and western-blot. From the data obtained, both RmGRP and RmPRM have characteristics that make them possible candidates to compose a cocktail vaccine against R. microplus. / O Rhipicephalus microplus ? um carrapato que infesta preferencialmente bovinos, causando um grande preju?zo ? pecu?ria. O principal m?todo de controle ? o uso de acaricidas, os quais selecionam popula??es resistentes, al?m de aumentar o custo e o risco de contamina??o da carne, do leite e do ambiente. Desta forma, ant?genos vacinais t?m sido identificados e caracterizados como alternativa aos acaricidas. Mol?culas salivares de parasitos hemat?fagos podem inibir respostas associadas ? homeostase e modular o sistema imune do hospedeiro e, portanto, s?o op??es na busca por vacinas anti-carrapato. Neste contexto, este trabalho caracterizou uma prote?na rica em glicinas e a paramiosina do R. microplus. Prote?nas ricas em glicinas s?o secretadas na saliva e s?o essenciais na fixa??o e na alimenta??o do parasito. J? a paramiosina ? capaz de evadir o sistema imune do hospedeiro e mostrou-se um importante alergeno em ?caros e ant?geno vacinal contra helmintos. As sequ?ncias de cDNA e amino?cidos da prote?na rica em glicinas de R. microplus (RmPRG) foram identificadas e analisadas, revelando duas por??es distintas da prote?na (com glicinas isoladas ao longo da regi?o N-terminal e padr?es repetidos contendo glicinas ao longo da regi?o C-terminal). A clonagem, express?o e purifica??o da RmGRP foram realizadas e a prote?na recombinante foi testada quanto ao reconhecimento por soros de bovinos naturalmente e experimentalmente infestados, indicando a sua antigenicidade, mas tamb?m uma alta heterogeneidade no reconhecimento da prote?na entre indiv?duos e entre infesta??es no mesmo indiv?duo. Al?m disso, a RmGRP recombinante foi reconhecida pelos soros de coelhos imunizados com saliva e gl?ndula salivar de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas e ovos, mas n?o por soros de coelhos imunizados com intestino. A express?o do gene codificante para a RmGRP (rmgrp) em diferentes tecidos de f?meas e fases do desenvolvimento do carrapato foi avaliada por qRT-PCR. A transcri??o do gene foi encontrada em ovos, larvas, machos adultos, al?m de gl?ndulas salivares, corpos gordurosos e ov?rios de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, apresentando os maiores n?veis de express?o nas larvas de 1 dia e nas gl?ndulas salivares de f?meas totalmente ingurgitadas. rmgrp n?o foi expresso nos ovos de 3 e 6 dias e no intestino de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, corroborando o resultado anterior. Ainda foram avaliados os efeitos do silenciamento do RNAm correspondente ? RmGRP e ? RmPRM, o que resultou na redu??o da taxa de postura de ovos no grupo em que o gene da RmPRM foi silenciado e da eclos?o de larvas em f?meas tratadas nos dois grupos. Portanto, sugere-se que as duas prote?nas s?o importantes durante o desenvolvimento larval, mas s? a RmPRM seja necess?ria na forma??o e/ou postura dos ovos. Tamb?m foi realizada a 8 clonagem da regi?o codificante e express?o dos fragmentos N-terminal, interno e C-terminal da paramiosina de R. microplus (RmPRM) em E. coli e da RmPRM completa em P. pastoris, sendo confirmadas por SDS-PAGE e western-blot. A partir dos dados obtidos, ambas RmGRP e RmPRM apresentam caracter?sticas que fazem delas poss?veis candidatas a comporem uma vacina coquetel contra o R. microplus.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:48:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 399881.pdf: 3533066 bytes, checksum: e2d1ae8a7aab3f836474380e9a96e7c0 (MD5) Previous issue date: 2008-01-14 / As prote?nas s?o polipept?deos formados por uma longa cadeia covalente de res?duos de amino?cidos que, em condi??es fisiol?gicas (ambiente nativo), adota uma topologia 3D ?nica. Estas macromol?culas est?o envolvidas na maior parte das transforma??es moleculares nas c?lulas vivas. A estrutura nativa dita a fun??o bioqu?mica espec?fica da prote?na. Conhecer a estrutura 3D da prote?na implica em tamb?m conhecer a sua fun??o. Assim, conhecendo a sua estrutura ? poss?vel interferir ativando ou inibindo a sua fun??o, como nas doen?as onde os alvos dos f?rmacos s?o as prote?nas. Experimentalmente, a estrutura 3D de uma prote?na pode ser obtida atrav?s de t?cnicas de cristalografia por difra??o de raios X ou por resson?ncia magn?tica nuclear. Por?m, devido ?s diversas dificuldades, incluindo o alto custo e o elevado tempo demandado por estas t?cnicas, a determina??o da estrutura 3D de prote?nas ainda ? um problema que desafia os cientistas. Diversos m?todos de predi??o in s?lico foram criados durante os ?ltimos anos buscando a solu??o deste problema. Estes m?todos est?o organizados em dois grandes grupos. Ao primeiro, pertencem os m?todos de modelagem comparativa por homologia e m?todos baseados em conhecimento como os de alinhavamento (threading). Ao segundo, pertencem os m?todos ab initio e os m?todos de novo. No entanto, estes m?todos de predi??o possuem limita??es: m?todos baseados em modelagem comparativa por homologia e alinhavamento somente podem realizar a predi??o de estruturas que possuem seq??ncias id?nticas ou similares ? outras prote?nas armazenadas no Protein Data Bank (PDB). M?todos de novo e ab initio, por sua vez, tornam poss?vel a obten??o de novas formas de enovelamento. Entretanto, a complexidade e a grande dimens?o do espa?o de busca conformacional, mesmo para uma pequena mol?cula de prote?na, torna o problema da predi??o intrat?vel computacionalmente (Paradoxo de Levinthal). Apesar do relativo sucesso obtido por estes m?todos para prote?nas de pequeno tamanho, muitos esfor?os ainda s?o necess?rios para o desenvolvimento de estrat?gias para extra??o e manipula??o de dados experimentais, bem como o desenvolvimento de metodologias que fa?am utiliza??o destas informa??es com o prop?sito de predizer corretamente, a partir apenas da seq??ncia de amino?cidos de uma prote?na, a sua estrutura 3D. Nesta disserta??o ? apresentada uma nova proposta para a predi??o in s?lico da estrutura 3D aproximada de polipept?deos e prote?nas. Um novo algoritmo foi desenvolvido, baseando-se na an?lise de informa??es obtidas de moldes do PDB. T?cnicas de minera??o de dados, representa??o de intervalos e de manipula??o das informa??es estruturais s?o utilizadas neste algoritmo. Os intervalos de varia??o angular de cada res?duo de amino?cido da cadeia polipept?dica s?o reduzidos como o objetivo de encontrar um intervalo fechado que cont?m a conforma??o com a menor energia potencial. Seis estudos de caso demonstram a aplica??o do m?todo desenvolvido.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458957.pdf: 14358950 bytes, checksum: 7458b8a1472071b48772b030a52573a6 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Analysis by Transcriptogram was developed as a solution to noise reduction, usually present in the microarray measuring technique of the Transcriptome, and has demonstrated potential to be applied as a method of disease diagnostics. The noise reduction in the measure is achived by the protein interaction network ordering, allowing gene expression analysis in whole genome scale. The Transcriptogram's efficiency to noise reduction was analyzed, however, it still lacks an analisys of the ordering quality, so that the best parameter setting for the ordering algorithm is used by the Transcriptogram. So far, this analysis is hindered by the high runtime of the ordering algorithm. In this work, an analysis of the ordering algorithm stages allows some optimizations, and consequent reduction in execution time, also allowing further analysis on which parameters settings have the greatest influence on the ordering quality. Applying the Transcriptogram to a diagnostic problem, the diagnostic measure is used to characterize the influence of the parameters of the ordering algorithm to achive better diagnoses. The results show that the protein network used in previous works doesn't produce the best diagnostics. Moreover, the ordering minimization, achieved by executing the ordering algorithm for longer periods, does not necessarily increase the probability to find better diagnosis compared to random ordering. Eventhough the experimental diagnostic results could not statistically difFerentiate random ordering from optimized ordering, these results cannot be considered conclusive since a single disease has been evaluated. / A an?lise por Transcriptograma foi desenvolvida como uma solu??o para a redu??o de ru?do, comum nas medidas do Transcriptoma provenientes da t?cnica de microarranjo, e tem demonstrando potencial se aplicada como m?todo para diagn?sticos de doen?as. A redu??o do ru?do existente nas medidas se d? pelo ordenamento da rede de intera??es proteicas do organismo, permitindo a an?lise da express?o g?nica em escala de genoma completo. A efici?ncia do Transcriptograma para a redu??o do ru?do j? foi analisada, entretanto, ainda carece a avalia??o da qualidade do ordenamento, definindo para isso, amelhor configura??o de par?metros para o algoritmo de ordenamento utilizado pelo Transcriptograma. At? o momento, essa an?lise ? dificultada pelo elevado tempo de execu??o do algoritmo de ordenamento. Neste trabalho, uma an?lise das etapas do algoritmo de ordenamento possibilita a realiza??o de otimiza??es, e consequente redu??o no tempo de execu??o, al?m de permitir a an?lise mais aprofundadadas configura??es dos par?metros que tem maior influ?ncia na qualidade do ordenamento. Aplicando o Transcriptograma a um problema de diagn?stico, utiliza-se a medida do diagn?stico para caracterizar a influ?ncia dos par?metros do algoritmo de ordenamento na obten??o de melhores diagn?sticos. Observa-se nos resultados, que a rede proteica utilizada em trabalhos anteriores n?o apresenta os melhores diagn?sticos. Al?m disso, a minimiza??o do ordenamento, alcan?ada por meio da execu??o prolongada do algoritmo de ordenamento, n?o necessariamente aumenta a probabilidade de encontrar um melhor diagn?stico comparado com o ordenamento aleat?rio. Mesmo que os resultados experimentais com o diagn?stico n?o diferenciem estatisticamente o ordenamento aleat?ria do ordenamento otimizado, estes resultados n?o podem ser considerados conclusivos pois uma ?nica doen?a foi avaliada.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 396435.pdf: 5923930 bytes, checksum: 9836e0a21f7fba5b0893387a40431ee7 (MD5) Previous issue date: 2007-07-12 / Nos ?ltimos anos, um dos grandes desafios da Ci?ncia da Computa??o perante a Bioinform?tica ? o desenvolvimento de algoritmos, os quais, em um tempo h?bil, consigam gerar as estruturas terci?rias de prote?nas a partir da seq??ncia linear de seus amino?cidos. Embora existam alguns m?todos que consigam gerar estruturas quando se possui outra prote?na com um alto grau de similaridade, quando n?o se possui o mesmo, os m?todos at? ent?o desenvolvidos n?o consigam realizar esta predi??o de forma n?o onerosa computacionalmente. Este trabalho apresenta um algoritmo recursivo capaz de predizer a topologia de polipept?deos, utilizando apenas os ?ngulos da cadeia principal de prote?nas com estruturas tridimensionais (3D) j? conhecidas. O mesmo se mostra eficaz quando aplicado ? mini-prote?na Trp-Cage (c?digo PDB 1L2Y) que possui apenas 20 amino?cidos, tendo uma estrutura predita de RMSD igual 3,7 ?; no entanto, para uma prote?na de 34 amino?cidos Mini-Prote?na Estabilizada por Pontes Dissulfeto (c?digo PDB 1ZDD) o mesmo se mostra ineficiente, gerando a melhor prote?na com o RMSD igual a 7,2 ?, devido ao fato de n?o ter sido percorrido todo o espa?o conformacional esperado para a mesma. Os resultados e as suas conseq??ncias s?o discutidos no trabalho.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 422465.pdf: 2691735 bytes, checksum: 1455a538e61f307699a636bd9041725c (MD5) Previous issue date: 2010-01-28 / A homeostasia sist?mica e celular do ferro ? regulada por uma s?rie de prote?nas que controlam a capta??o, o transporte, o armazenamento e a utiliza??o deste metal. O per?odo neonatal ? cr?tico para o estabelecimento da concentra??o de ferro no c?rebro adulto. Al?m disso, tamb?m se sabe que a concentra??o de ferro aumenta nas regi?es cerebrais durante o processo de envelhecimento. N?veis anormalmente elevados de ferro s?o observados no c?rebro de pacientes que apresentam doen?as neurodegenerativas, entretanto os mecanismos envolvidos no ac?mulo de ferro ainda n?o s?o claros. Neste estudo n?s investigamos os efeitos do envelhecimento e da sobrecarga de ferro neonatal na express?o de RNAm de prote?nas criticamente envolvidas no controle da homeostasia do ferro: Receptor de Transferrina (TfR), H-ferritina, IRP2, Transportador de Metal Divalente 1 (DMT1), Ceruloplasmina (CP) e Hepicidina. Ratos Wistar filhotes receberam uma ?nica dose di?ria de ve?culo (5% sorbitol em ?gua) ou ferro (10 mg/kg de peso corporal de Fe2+), do 12? ao 14? dia de vida p?s-natal. As express?es de RNAm destas prote?nas foram analisadas por RT-PCR, um m?todo semi-quantitativo, no c?rtex, hipocampo e estriado de ratos sacrificados em tr?s diferentes idades (15 dias; 90 dias e 2 anos de idade). Os resultados indicaram que a express?o de RNAm de TFR, H-ferritina a IRP2 foram diferentemente afetadas pelo envelhecimento e pelo tratamento neonatal com ferro nas diferentes regi?es do c?rebro estudadas. Tamb?m se observou que a express?o de RNAm de DMT1 e CP ? influenciada pela idade nos ratos controle. Al?m disso, nossos resultados sugerem que o tratamento neonatal com ferro afeta de forma diferente a express?o de RNAm de DMT1 no c?rtex e estriado de ratos jovens; e a express?o de RNAm de CP no c?rtex de ratos jovens, e no hipocampo de ratos velhos. Com rela??o ? Hepicidina, os resultados indicam que o tratamento com ferro no per?odo neonatal induz um aumento nos n?veis de RNAm no hipocampo de animais jovens. Estes resultados podem ajudar a entender de que maneira as altera??es na homeostasia do ferro podem estar associadas ? patog?nese das doen?as neurodegenerativas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 423973.pdf: 5152815 bytes, checksum: 3f42470496ad512568213b1ba315237c (MD5) Previous issue date: 2010-03-03 / O processo de envelhecimento ? caracterizado por altera??es morfologias e fisiol?gicas ao longo do tempo. No c?rebro, este processo ? marcado por altera??es estruturais e funcionais levando a disfun??o e ao decl?nio cognitivo. Nos mam?feros o ferro ? encontrado em diversas ?reas do c?rebro, sendo essencial em muitos processos bioqu?micos que s?o importantes no desenvolvimento e manuten??o das fun??es neurobiol?gicas normais. Estudos revelam que h? aumento do conte?do de ferro tanto em c?rebros de ratos velhos como em humanos idosos quando comparados com indiv?duos jovens, indicando que durante o processo de envelhecimento existe um desequil?brio no metabolismo desse metal. Com o avan?o da idade, h? aumento da morte celular programada que est? relacionada a desordens neurol?gicas. A apoptose envolve cascatas de sinaliza??o que s?o ativadas em diversas situa??es. Dentre as proteases envolvidas, a Par-4 e caspase-3 apresentam importante papel na sinaliza??o apopt?tica. Par-4 foi primeiramente identificada entre genes pr?-apopt?ticos ativados em resposta a insultos ?s c?lulas cancerosas na pr?stata. A caspase executora caspase-3, pertence a fam?lia de enzimas proteol?ticas com res?duo ciste?na no seu s?tio catal?tico que cliva prote?nas em res?duos aspartato. Esta protease ? importante no controle da apoptose no tecido nervoso respons?vel pela transdu??o e execu??o dos sinais de morte. Devido ? car?ncia de estudos que relacionem as prote?nas pr?apopt?ticas Par-4 e caspase-3 em modelos de neurodegenera??o incluindo a aus?ncia de trabalhos que relacionem estas proteases com estudos sobre os efeitos do ferro no sistema nervoso, este trabalho teve como objetivo avaliar altera??es destas prote?nas nas regi?es do hipocampo, estriado e c?rtex de ratos adultos (3 meses) e idosos (24 meses) controles ou tratados com ferro durante o per?odo neonatal atrav?s de imunohistoqu?mica. Para tanto, os animais controles foram tratados com dose oral di?ria de 5% sorbitol em ?gua e os animais experimentais com 10 mg Fe2+/kg de peso corporal do 12? ao 14? dia de vida p?s-natal. Os resultados obtidos mostram aumento da imunorreatividade de ambas prote?nas nas regi?es CA1, CA3 e c?rtex ao longo do envelhecimento normal. Imunorreatividade de Par-4 mostrou significante aumento nas regi?es CA1, CA3, DG e c?rtex nos animais adultos tratados com ferro e significante diminui??o nos animais velhos tratados com ferro em rela??o aos seus respectivos controles. Imunorreatividade de caspase-3 mostrou significante aumento nas regi?es CA1, CA3 e c?rtex nos animais adultos tratados com ferro e significante diminui??o nos animais velhos tratados com ferro. N?o houve diferen?a significativa no estriado para ambas prote?nas. Os resultados indicam que a sobrecarga de ferro no per?odo neonatal ocasiona maior apoptose na fase adulta, aumentando as chances de desenvolvimento de desordens neurol?gicas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431688.pdf: 567174 bytes, checksum: 5a3c8a6c18361741aa700b9c3a83b24f (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / A artrite reumat?ide ? uma doen?a do sistema auto-imune que atua atrav?s de uma inflama??o nas articula??es tornando-se cr?nica com o passar dos anos, podendo desenvolver uma deformidade e destrui??o destas articula??es devido ? eros?o da cartilagem e do osso. Esta doen?a atinge pessoas de ambos os sexos com idades vari?veis. O diagn?stico da doen?a depende de uma s?rie de combina??es de sintomas cl?nicos, diagn?sticos laboratoriais e radiogr?ficos. A etiologia da AR ? multifatorial, resultando da intera??o de fatores ambientais, hormonais e gen?ticos, que contribuem para sua ocorr?ncia e express?o. Evid?ncias epidemiol?gicas mostram que fatores gen?ticos s?o relatados como risco para o aumento da AR. Acredita-se que v?rios genes possam estar envolvidos com o aparecimento da AR, e um deles ? o gene MBL2, respons?vel pela codifica??o da prote?na Lectina de Liga??o ? Manose. A MBL ? uma prote?na da fam?lia das colectinas importante para o sistema imunol?gico, relacionada com a promo??o de fagocitose de microorganismos, modula??o da resposta inflamat?ria e apoptose. Os baixos n?veis s?ricos de MBL est?o associados com muta??es gen?ticas atrav?s de polimorfismos do gene MBL2. Tr?s polimorfismos de base ?nica (SNPs) foram localizados no ?xon 1 nos c?dons 52 (alelo variante D), 54 (alelo variante B) e 57 (alelo variante C). A presen?a de qualquer uma dessas variantes ? chamada de alelo O, enquanto que a aus?ncia das variantes em qualquer uma das tr?s posi??es ? chamada alelo A. Neste estudo, analisamos o polimorfismo do gene MBL2 em 322 pacientes brasileiros com AR e 343 indiv?duos saud?veis atrav?s da t?cnica de sequenciamento.Quando comparamos indiv?duos saud?veis euro-descendentes e afro-descendentes observamos uma diferen?a significativa nas frequ?ncias genot?picas e al?licas, isto devido a frequ?ncia maior do alelo C (pacientes euro-descendentes 0.0220 vs. Pacientes Afro-descendentes 0.205, controles euro-descendentes 0.029 vs. Controles afro-descendentes 0.144, valores P<0.001). Tamb?m analisamos o gen?tipo MBL em rela??o a manifesta??es extra-articular. Quando consideramos as variantes MBL juntas, n?s encontramos um aumento da frequ?ncia do gen?tipo OO em pacientes com n?dulos reumat?ides (P=0.031). Estes achados sugerem uma associa??o do gen?tipo OO e a severidade da doen?a, entretanto mais estudos s?o necess?rios pra esclarecer a verdadeira fun??o da MBL na AR.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432086.pdf: 1674235 bytes, checksum: 2ed5ea531f6750c937a1c83b125d4be9 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / L?tio tem sido o principal tratamento para desordens bipolares desde 1950, oferecendo um efeito profil?tico e agudo contra os epis?dios man?acos e depressivos, apesar dos desafios encontrados na sua administra??o durante a gravidez e o per?odo perinatal. Os mecanismo por tr?s dos efeitos do l?tio ainda n?o foram descritos completamente mas existem evidencias de um efeito sobre a via Wnt-?-catenina devido a sua capacidade de inibi??o sobre a GSK-3?. Neste estudo n?s avaliamos os efeitos da exposi??o ao l?tio durante o desenvolvimento inicial de Zebrafish incluindo caracteriza??es comportamentais e moleculares do sistema Wnt-?-catenina-Caderina. Embri?es foram tratados individualmente por 72hpf com LiCl 0.05, 0.5 e 5 mM. N?o foram observadas malforma??es significativas nem efeitos embriot?xicos. Em 10 dpf animais tratados com 0.5 e 5 mM de l?tio demonstraram habilidades locomotoras similares a s?ndrome induzida por l?tio em humanos Floppy baby syndrom. An?lises atrav?s da t?cnica de Western blot demonstraram uma express?o aumentada nos n?veis de ?-catenina e diminu?da para N-caderina. Animais com 10dpf reestabeleceram seus n?veis de express?o proteica de acordo com o controle. An?lises atrav?s da t?cnica de qPCR n?o demonstraram nenhum efeito sobre os n?veis de ?-catenina ou N-caderina, sugerindo a ocorr?ncia de mudan?as p?s-transcricionais. Enquanto os n?veis de c-myc n?o foram alterados, houve uma diminui??o nos n?veis de Cyclin D1 em larvas de 3dpf, enquanto os n?veis de CamkIV ocilaram

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-10-01T18:36:32Z No. of bitstreams: 1 475353 - Texto Completo.pdf: 4655532 bytes, checksum: c5dbc2135d9425bffb99fb72fd2f27dd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-01T18:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 475353 - Texto Completo.pdf: 4655532 bytes, checksum: c5dbc2135d9425bffb99fb72fd2f27dd (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / the second responsible for most of the deaths worldwide. The latest estimates of WHO showed that 9 millions of new cases of TB occurred in 2013 and 1.5 million of deaths. The emergence of new drug resistant M. tuberculosis strains is becoming a serious increasing problem as the treatment of infected patients with multi drug-resistant TB and extensively drug-resistant TB strains is much more difficult and costly. This brings discussions about the drastic situation of virtually untreatable TB cases and shows the urgent need to introduce new and effective anti-TB drugs. The research for the development of new antimycobacterial agents becomes a necessity, as well as the identification of new targets for future drugs. The histidine biosynthetic pathway is comprised of ten enzyme steps catalyzed by eight enzymes. This pathway is present in prokaryotic organisms, lower eukaryotic organisms and plants, but is absent in animals, which is in accordance with the principles of selective toxicity. Mutagenesis studies have shown that the genes of this pathway are essential for the survival of M. tuberculosis. The histidinol dehydrogenase enzyme, encoded by hisD, performs the last two steps in the biosynthesis of histidine, converting L-histidinol to L-histidine. The essentiality of the hisD gene in M. tuberculosis mutants with referred gene knockout is already described in the literature. This work describes kinetic studies using thermodynamic parameters, fluorescence spectroscopy, and pre-stationary states to better understand the enzymatic mechanism of MtHisD. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial HisD is important to structure-based drug development. The data from enzyme?s kinetic characterization were the starting point for HisD specific inhibitors planning, selection, and testing. A series of eleven hydrazones derived from L-histidine was synthesized, from which four compounds were identified as showing a competitive inhibition profile for L-histidinol substrate. The interactions of these compounds with the enzyme were analyzed by molecular docking to understand the inhibitory mechanism. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial histidine metabolism. Moreover, data from inhibition studies with the synthesized compounds, serve as the starting point for the development of new molecules to enhance the enzyme inhibition and to inhibit the M. tuberculosis growth. / Dentre as doen?as infecciosas que acompanham o homem ao longo da hist?ria, a tuberculose (TB), atualmente, ? a segunda respons?vel pelo maior n?mero de mortes no mundo. As ?ltimas estimativas da Organiza??o Mundial da Sa?de apontam 9 milh?es de novos casos de TB em 2013 e 1,5 milh?es de mortes. O surgimento de novas linhagens de M. tuberculosis resistentes aos f?rmacos utilizados no tratamento est? se tornando um problema s?rio e crescente, uma vez que o tratamento de pacientes infectados com cepas de tuberculose resistente ? m?ltiplos f?rmacos e extensivamente resistente ? f?rmacos ? muito mais dif?cil e oneroso. Isso remete a discuss?es sobre a dr?stica situa??o de casos de TB virtualmente incur?veis e aponta para a urgente necessidade de introduzir novos e eficazes medicamentos anti-TB no mercado. A pesquisa para o desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos torna-se necess?ria, bem como a identifica??o de novos alvos para futuros medicamentos. A via de bioss?ntese de histidina compreende dez etapas enzim?ticas catalisadas por oito enzimas. Esta via est? presente nos organismos procari?ticos, organismos eucari?ticos inferiores e em plantas, mas est? ausente em animais, corroborando com os princ?pios de toxicidade seletiva. Estudos de mutag?nese demonstraram que os genes desta via s?o essenciais para a sobreviv?ncia do M. tuberculosis. A enzima histidinol desidrogenase, codificada pelo gene hisD, catalisa a ?ltima etapa da bioss?ntese de histidina, convertendo L-histidinol para L-histidina. A essencialidade do gene hisD em mutantes de M. tuberculosis, com o referido gene nocauteado, j? est? descrita na literatura. Este trabalho trata sobre o aprofundamento dos estudos cin?ticos, utilizando ensaios para determina??o de par?metros termodin?micos, fluorimetria e ensaios em estado pr?estacion?rio. A caracteriza??o da rea??o catalisada pela enzima HisD micobacteriana ? uma etapa importante para o desenvolvimento de novos f?rmacos de a??o espec?fica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados de caracteriza??o cin?tica da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, sele??o e teste de inibidores seletivos contra a HisD de M. tuberculosis. Uma s?rie de onze hidrazonas derivadas da Lhistidina foi sintetizada, foram identificados quatro compostos com perfil de inibi??o competitiva pelo substrato L-histidinol. As intera??es destes compostos com a enzima foram analisadas por docagem molecular para melhor compreens?o do mecanismo inibit?rio. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreens?o do metabolismo da bioss?ntese de histidina em micobact?rias. Al?m disso, os dados dos estudos de inibi??o com os compostos aqui sintetizados servem como ponto de partida para o desenvolvimento de novas mol?culas visando a otimiza??o da inibi??o da enzima e a da inibi??o do crescimento do M. tuberculosis.

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In Brazil, the highest mortality rate among the systemic mycoses is caused by an endemic disease named paracoccidioimycosis, which the etiologic agent is the dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The worldwide increased resistance to the commercially available antifungal agents, their limited spectrum of activity against some fungal pathogens and concerns with their toxic side effects are reasonable evidence of the necessity of novel therapeutic strategies, especially the development of new antifungal agents. Thus, the essential gene rim8 was identified by comparative genomics as an orthologous sequence in the genome of human pathogenic fungi absent in the human genome. In filamentous fungi and yeasts, gene expression regulation by the ambient pH involves components of a signaling pathway that mediate proteolytic activation of the transcription factor PacC/Rim101 in response to alkaline environmental pH. The rim8 gene in yeasts, also called palF in filamentous fungi, performs an essential step in this signaling pathway. It is important for host-pathogen interaction, leading to increased virulence and pathogen survival. Thus, Rim8 is a very interesting and promising drug target. The aim of this work is to optimize heterologous expression and purification of Rim8 protein from P. luzii to further perform its structural and functional characterization and also, to use it as a molecular target for drugs development. The rim8 gene was chemically synthesized with a histidine tag and cloned into a pET-21a vector. Heterologous expression of the gene was made using two strains of E. coli, obtaining the best conditions using LB medium with 0.5% glucose at 30 ??C for 2 hours and 0.25 mM IPTG and adding protease inhibitor cocktail. The Rim8 heterologous protein was purified using a nickel affinity chromatography column. Expression and purification results were analyzed by SDS-PAGE and in some cases, confirmed by western blot. Immunization of BALB/c mice was performed with the purified protein to obtain anti- Rim8 antibodies. The antibody production was confirmed by ELISA test. The protein immunocitolocalization in P. lutzii cells showed a difuse protein-plasma membrane association at acidic pH. At neutral pH the fluorescence pattern is showed as localized foci in plasma membrane and later, with extracellular alcalinization, it migrates into the cytosol. Thus, it can be inferred that this work gives some contribution to the development of new antifungal drugs, but still must undergo further production steps, proteolysis reduction and protein purification to allow structural and functional characterization of Rim8. / Infec????es f??ngicas invasivas s??o um problema de sa??de p??blica no mundo, j?? que aumentam a morbidade e o tempo de interna????o de pacientes. A micose sist??mica com o maior ??ndice de mortalidade no Brasil, onde ?? considerada end??mica, ?? a paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dim??rfico Paracoccidioides spp. A tend??ncia global de aumento da resist??ncia aos agentes antif??ngicos dispon??veis comercialmente, o espectro limitado de atividade contra alguns fungos patog??nicos e a preocupa????o com a toxicidade s??o evid??ncias da necessidade de novas estrat??gias terap??uticas, sobretudo do desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas. Nesse sentido, o gene essencial rim8 foi identificado por gen??mica comparativa como uma sequ??ncia ort??loga no genoma de fungos patog??nicos humanos e ausente em humanos. Em fungos filamentosos e leveduras, a regula????o da express??o g??nica pelo pH envolve componentes de uma via de sinaliza????o que levam ?? ativa????o proteol??tica do fator de transcri????o PacC/Rim101 em resposta ?? alcaliniza????o do pH externo. O gene rim8 em leveduras ou palF em fungos filamentosos possui um papel essencial nessa cascata de sinaliza????o, sendo importante para a intera????o pat??geno-hospedeiro, aumento de virul??ncia e sobreviv??ncia do pat??geno. Por isso, Rim8 ?? um alvo molecular promissor e bastante interessante para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste trabalho ?? otimizar a express??o heter??loga e purifica????o da prote??na Rim8 de P. lutzii, visando realizar a caracteriza????o estrutural e funcional da prote??na para futuramente utiliz??-la como alvo molecular para o desenvolvimento de drogas. O gene rim8 foi sintetizado quimicamente com cauda de histidinas e foi clonado em vetor pET-21a. A express??o heter??loga do gene foi padronizada usando duas estirpes de E. coli, obtendo as melhores condi????es para purifica????o com o uso de meio LB contendo 0,5% de glicose a 30??C por 2 h e 0,25 mM de IPTG e coquetel de inibidores de proteases. Os resultados da express??o e purifica????o foram analisados por SDS-PAGE e/ou confirmados por western blot. Realizou-se a imuniza????o de camundongos BALB/c com a prote??na purificada para obten????o de anticorpos anti-Rim8. A produ????o dos anticorpos foi confirmada por ELISA. A imunocitolocaliza????o em c??lulas de P. lutzii mostrou que a prote??na se encontra associada ?? membrana plasm??tica de forma difusa em pH ??cido, em seguida apresenta focos localizados em resposta a um pH pr??ximo da neutralidade e, por fim, migra para o interior da c??lula em pH alcalino. Sendo assim, pode-se inferir que o trabalho apresenta contribui????es para o desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas, al??m de auxiliar o entendimento do processo biol??gico no qual a prote??na RIM8 est?? envolvida.