Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 430842.pdf: 2935464 bytes, checksum: 65b5bce8dd872e39bf663fce3ac30b27 (MD5) Previous issue date: 2011-01-27 / A natureza como fonte de inspira??o provou ter grande impacto ben?fico no desenvolvimento de novas metodologias computacionais. Neste cen?rio, an?lises de intera??es entre uma prote?na alvo e um ligante podem ser simuladas por algoritmos inspirados biologicamente (BIA). Neste trabalho, os algoritmos inspirados biologicamente, especialmente algoritmos evolutivos, s?o aplicados a simula??es de docking molecular, que podem ser usadas na busca de novos f?rmacos. Estes algoritmos de docking foram aplicados a sirtu?nas, que comp?em uma importante fam?lia de prote?nas - desacetilases dependentes de NAD - que regulam o silenciamento gen?tico, inibi??o transcricional, estabilidade cromoss?mica, ciclo de divis?o celular e apopt?tico e resposta c?lular a agentes causadores de danos no DNA. Essas prote?nas tem sido alvos moleculares emergentes no desenvolvimento farmac?utico de medicamentos para o tratamento de doen?as humanas. Em fun??o da import?ncia estrutural das prote?nas, neste trabalho foi realizada a modelagem por homologia molecular de SIRT1 humana, utilizando-se a estrutura cristalogr?fica de Sir2 de Thermotoga maritima como modelo. Al?m disso, foi aplicado o procedimento de virtual screening para a SIRT1 modelada contra duas bases de dados. Uma foi baseada em estruturas derivadas da nicotinamida e outra composta por mol?culas da Sigma-Aldrich. Com base nos resultados obtidos no virtual screening, foram utilizados os acoplamentos com valores mais baixos de energia livre de liga??o (Plant Score) para a sele??o das melhores mol?culas. Foi empregada a Similarity Ensemble Approach Tool (SEA), uma abordagem estrat?gica para analisar as rela??es entre as estruturas e a atividade farmacol?gica. Os resultados indicam que algumas mol?culas apresentaram alta afinidade com a SIRT1, sugerindo novos inibidores de SIRT1, e essas mol?culas mostram um elevado n?mero de refer?ncias de atividades farmacol?gicas. Nossos resultados sugerem novos compostos inibidores de SIRT1 que apresentam potencial aplica??o terap?utica

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431140.pdf: 1654374 bytes, checksum: 1465b8ac4be5cfbe78bdaa126071ddf5 (MD5) Previous issue date: 2011-04-01 / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deamina??o redutiva do GMP ? inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na convers?o dos nucleos?deos e nucleot?deos derivados de guanina a nucleot?deos de adenina. Al?m desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, tamb?m participa da reutiliza??o de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a express?o e a purifica??o da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cin?tico; bem como as caracter?sticas qu?micas e termodin?micas da rea??o catalisada. Estudos de velocidade inicial e titula??o de calorimetria isot?rmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cin?tico bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro ? enzima, seguido pela liga??o do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela libera??o do IMP. A titula??o calorim?trica tamb?m mostrou que a liga??o do GMP e IMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na cat?lise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para liga??o do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para liga??o do NADPH. Efeito isot?pico prim?rio demonstrou que a transfer?ncia do hidreto contribui para a etapa limitante da rea??o, enquanto que os efeitos isot?picos do solvente prov?m de um ?nico local de protona??o que possui um papel modesto na cat?lise. Efeito isot?pico m?ltiplo sugere que as etapas de protona??o e transfer?ncia do hidreto ocorrem no mesmo estado de transi??o, fornecendo evid?ncia de um mecanismo concerted. Os dados de cin?tica em estado pr?-estacion?rio indicam que a libera??o do produto n?o contribui para a etapa limitante da rea??o catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a rea??o catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transfer?ncia do hidreto e do pr?ton ocorrem no mesmo estado de transi??o. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cin?tico da GMP redutase, bem como, os res?duos fundamentais para cat?lise e/ou liga??o, al?m de fornecer informa??es sobre o estado de transi??o da rea??o

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431138.pdf: 1089028 bytes, checksum: b3d0bb2ab98885aab405ecc4329e3335 (MD5) Previous issue date: 2011-03-10 / Entre as doen?as infecciosas, a tuberculose se destaca, como sendo a principal causa de morte humana, principalmente em pa?ses em desenvolvimento. Entre os alvos identificados no genoma de Mycobacterium tuberculosis, as enzimas da via do chiquimato merecem aten??o especial, pois s?o essenciais para a sobreviv?ncia dos microorganismos e ausente em mam?feros. O objeto do nosso estudo ? a quinta enzima desta via, a Chiquimato Quinase (SK). Foram aplicados m?todos de virtual screening, a fim de identificar novos potenciais inibidores para esta enzima. Neste trabalho n?s empregamos o programa MOLDOCK em todas as simula??es de docking molecular. A precis?o do docking enzima-ligante foi validada em um conjunto de 12 complexos de SK- ligante, para aquelas estruturas cristalogr?ficas que estavam dispon?veis, gerando um RMSD abaixo de 2,0 ?. A aplica??o deste protocolo em um banco de dados comercialmente dispon?vel permitiu a identifica??o de novas mol?culas com potencial para se tornar drogas contra tuberculose. Al?m disso, foram identificados os res?duos da cavidade de liga??o que s?o essenciais para as intera??es intermoleculares desta enzima

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432438.pdf: 2038170 bytes, checksum: 505895940d1e38c8e3925441d22f197d (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / Vermes do g?nero Angiostrongylus s?o parasitos intra-arteriais em roedores. A. costaricensis vive no sistema mesent?rico, enquanto A. cantonensis habita as art?rias pulmonares de ratos. No homem, hospedeiro acidental destas parasitoses, elas causam a gastroenterite eosinof?lica e meningite devido ? migra??o de adultos jovens de A. cantonensis nos tecidos do sistema nervoso central. O exame parasitol?gico de fezes n?o pode ser utilizado para diagn?stico humano das angiostrongil?ases porque n?o s?o encontradas larvas nas fezes, o que torna importante o desenvolvimento de t?cnicas moleculares. Os m?todos de imunodiagn?stico empregando ant?genos brutos apresentam reatividade cruzada com outras parasitoses e tamb?m resultados falso-negativos. Com o objetivo de aprimorar o diagn?stico molecular das angiostrongil?ases, direcionamos os esfor?os na tentativa de reduzir a complexidade dos extratos de ant?genos a fim de encontrar prote?nas mais espec?ficas e sens?veis para o diagn?stico. Primeiramente foi testado o uso de ant?genos de A. cantonensis para o diagn?stico de A. costaricensis pela t?cnica de ELISA. A partir disso, ant?genos de tubo reprodutor (TR) de f?meas de A. cantonensis foram fracionados por diversas t?cnicas e sua reatividade a soros controle foi testada por Western blot (WB). Colunas de prote?na A foram incubadas com soro de pacientes infectados, por?m este fracionamento n?o teve sucesso. Foi realizado o fracionamento subcelular dos extratos TR e com a fra??o de ant?genos de membrana celular (F2) foi realizado o fracionamento por ponto isoel?trico. As fra??es de pH apresentaram reatividade espec?fica aos soros controle positivos quando submetidas ao WB, sugerindo que as prote?nas encontradas possam ser importantes alvos para o diagn?stico das angiostrongil?ases. A possibilidade de clonar as prote?nas de interesse para produ??o em grande escala, poder? constituir fonte permanente de ant?genos com redu??o do volume de trabalho e do emprego de animais no laborat?rio

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437677.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2012-01-13 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC). By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30.7 gram of dry cell weight and 0.9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ?C, in Terrific Broth medium under isopropil ?-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biof?rmacos s?o, na sua maioria, prote?nas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnol?gicas. Prepara??es de L-asparaginase que atualmente est?o no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, t?m sido utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento efetivo de leucemia linfobl?stica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a prepara??es terap?uticas atualmente em uso. Isso ? particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a s?rios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho ? aplicar uma combina??o de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produ??o de L-asparaginase II recombinante homog?nea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em c?lulas hospedeiras de E. coli. Neste trabalho s?o descritas as condi??es para a express?o produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purifica??o em uma ?nica etapa, por cromatografia l?quida de troca f?nica, seguida pela determina??o dos par?metros cin?ticos e termodin?micos da enzima atrav?s de calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). Usando uma t?cnica robusta de batelada alimentada, com vaz?o em perfil exponencial pr?-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de c?lulas secas e 0,9 gramas de prote?na rErAll na fra??o sol?vel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30?C, em meio de cultura Terrific Broth sob indu??o de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como c?lula hospedeira. O protocolo de purifica??o de uma ?nica etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homog?nea por grama de c?lula seca, correspondendo a 168 mg de prote?na rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que ? poss?vel produzir na fra??o celular sol?vel a enzima rErAII ativa e homog?nea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indu??o de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotorn?tricos bem estabelecidos, as t?cnicas calorim?tricas diretas para determina??o de cin?tica enzim?tica s?o exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poder?o contribuir para ind?strias farmac?uticas interessadas em desenvolver biosimilares. para pol?ticas de sa?de e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terap?uticas.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-10-05T19:17:14Z No. of bitstreams: 1 475514 - Texto Completo.pdf: 1720487 bytes, checksum: d25e86525eb79aae71491a51f3662cf9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-05T19:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 475514 - Texto Completo.pdf: 1720487 bytes, checksum: d25e86525eb79aae71491a51f3662cf9 (MD5) Previous issue date: 2015-08-07 / The healthy neuronal function and synaptic modification need both the synthesis and degradation of proteins. Evidence indicates that the protein turnover mediated by proteasome activity is involved in synaptic plasticity and long term memory. However, their role in different stages of memory is still under discussion, and previous studies did not evaluate the possible need of protein degradation in recognition memory. In this work, we have shown that proteasome inhibitor, lactacystin, infused in the CA1 area of the hippocampus at two specific time periods during consolidation affect the retention of the recognition memory in mice. The administration of lactacystin did not affect the reconsolidation of memory. These findings provide the first evidence for the importance of proteasome activity in memory recognition, indicating that the protein breakdown in the hippocampus is required during two specific time windows in memory consolidation, contributing to a better understanding of protein turnover's role in memory formation. Changes of brain iron levels have been observed in neurodegenerative diseases. It has been demonstrated by our research group, that iron overload in the neonatal period results in severe and persistent memory deficits in adulthood. Protein degradation mediated by the ubiquitin proteasome system plays an important role in regulating various cellular processes and their involvement has been implicated in pathogenesis of neurodegenerative diseases. So in this study was also evaluated the effects of iron exposure in the neonatal period on the expression of proteasome subunits ?1, ?2, and ?5 and polyubiquitinated proteins in brains of rats at 15 days of life and adulthood. Two types of hippocampal-dependent memory and recognition aversive were analyzed in adult animals. We confirm earlier evidence that iron administered in the neonatal period affect both the aversive memory and recognition memory. The levels of proteins polyubiquitinated found to be high in the hippocampus, but not in the cortex of adult animals treated with iron. The gene expression of the subunits ?1 and ?5 were affected by age in the hippocampus, which is higher in the early stages of development, accompanied by a related increase with age polyubiquitinated protein levels in adult rats. In the cortex, the gene expression of all three subunits of the proteasome was significantly higher in old adult than in neonatal age. Together, these results suggest that the expression of the subunits of the proteasome and are regulated activity of age-dependent manner. This was the first study to investigate the protein degradation system in the brain of rats newborns and also the first to study the proteasome subunits comparing neonatal and adult ages. Exposure to iron in the neonatal period produces long lasting harmful effects on the functioning of the ubiquitin-proteasome system, which may be related to deficiency of the iron induced memory, providing evidence that this system can be considered a target for the treatment of deficits memory. / A fun??o neuronal saud?vel e a modifica??o sin?ptica precisam tanto da s?ntese quanto da degrada??o de prote?nas. Evid?ncias indicam que o turnover de prote?nas mediado pela atividade do proteassoma est? envolvido na plasticidade sin?ptica e na mem?ria de longa dura??o. No entanto, seu papel nas diferentes fases da mem?ria continua em discuss?o, e estudos anteriores n?o avaliaram a poss?vel necessidade da degrada??o de prote?nas na mem?ria de reconhecimento. Nesse trabalho, n?s mostramos que o inibidor de proteassoma, lactacistina, infundido na ?rea de CA1 do hipocampo em dois per?odos de tempo espec?ficos durante a consolida??o, prejudica a reten??o da mem?ria de reconhecimento em ratos. A administra??o da lactacistina n?o afetou a reconsolida??o da mem?ria. Estas descobertas fornecem a primeira evid?ncia para a import?ncia da atividade do proteassoma na mem?ria de reconhecimento, indicando que a degrada??o de prote?nas no hipocampo ? necess?ria durante duas janelas de tempo espec?ficas na consolida??o da mem?ria, contribuindo para a melhor compreens?o do papel do turnover de prote?na na forma??o da mem?ria. Altera??es dos n?veis de ferro cerebral t?m sido observadas em doen?as neurodegenerativas. J? foi demonstrado pelo nosso grupo de pesquisa, que a sobrecarga de ferro no per?odo neonatal resulta em graves e persistentes d?ficits de mem?ria na vida adulta. A degrada??o das prote?nas mediada pelo sistema ubiquitina-proteassoma desempenha um importante papel na regula??o de v?rios processos celulares e seu comprometimento tem sido implicado na patog?nese de doen?as neurodegenerativas. Ent?o, nesse estudo, tamb?m foram avaliados os efeitos da exposi??o de ferro no per?odo neonatal sobre a express?o das subunidades do proteassoma ?1, ?2, e ?5 e das prote?nas poliubiquitinadas em c?rebros de ratos aos 15 dias de vida e na idade adulta. Dois tipos de mem?ria dependente do hipocampo, aversiva e de reconhecimento, foram analisados em animais adultos. Confirmamos as evid?ncias anteriores, de que o ferro administrado no per?odo neonatal prejudica tanto a mem?ria aversiva quanto a mem?ria de reconhecimento. Os n?veis de prote?nas poliubiquitinadas encontraram-se elevados no hipocampo, mas n?o no c?rtex, de animais adultos tratados com ferro. A express?o g?nica das subunidades ?1 e ?5 foram afetadas pela idade no hipocampo, sendo maior nos primeiros est?gios de desenvolvimento, acompanhado por um aumento relacionado com a idade nos n?veis de prote?na poliubiquitinada em ratos adultos. No c?rtex, a express?o g?nica das tr?s subunidades do proteassoma foi significativamente mais elevada na idade adulta do que na idade neonatal. Em conjunto, esses resultados sugerem que a express?o das subunidades e a atividade do proteassoma s?o regulados de forma dependente da idade. Este, foi o primeiro estudo a investigar o sistema de degrada??o de prote?nas em c?rebros de ratos neonatos e tamb?m, o primeiro a estudar as subunidades do proteassoma comparando as idades neonatal e adulta. A exposi??o ao ferro no per?odo neonatal produz efeitos nocivos duradouros sobre o funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma, que pode estar relacionado com a defici?ncia de mem?ria induzida pelo ferro, fornecendo evid?ncias de que esse sistema pode ser considerado um alvo para o tratamento dos d?ficits de mem?ria.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437701.pdf: 658664 bytes, checksum: 3842d70518efb4bc4633c3998b3a5859 (MD5) Previous issue date: 2012-03-28 / Sepsis is a systemic inflammatory disorder, and its progression to septic shock is a serious clinical problem associated with a high mortality rate. Despite significant advances in critical care, treatments do not reverse the systemic inflammatory response and its consequences. Gram-negative sepsis is initiated by exposure to a component of gram-negative bacterial membrane, lipopolysaccharide (LPS), and induces overproduction of host inflammatory cytokines, including tumor necrosis factor (TNF- α), interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6) from immunocytes such as monocytes. Recent studies have shown that similar to LPS, the Respiratory syncytial virus - leading cause of severe lower respiratory tract infections in infants and young children requires the toll-like receptor 4 (TLR4) for signaling. Studies have shown that the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein (RSV G) modulates cytokine and chemokine production in monocytes, inhibiting the inflammatory response elicited by LPS stimulation. In this report, we use murine monocytes from different knockout mice to show that RSV G can inhibit the release of cytokines in the immune response against lipoplysaccharide induced sepsis. We demonstrate the modulation of IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α by RSV G in monocytes LPS stimulated. Importantly, we also considered the effect of RSV G subunits (peptides) and future directions for the clinical use of the glycoprotein on LPS-mediated inflammation. / Sepse ? uma desordem inflamat?ria sist?mica e sua progress?o para o choque s?ptico caracteriza um s?rio problema cl?nico, apresentando altas taxas de mortalidade. Apesar dos significativos avan?os no tratamento intensivo, os mesmos n?o s?o capazes de reverter a resposta inflamat?ria sist?mica, assim como suas conseq??ncias. A sepse por bact?rias gramnegativas ? desencadeada pela exposi??o a um componente da membrana destas bact?rias, conhecido como lipopolissacar?deo (LPS), o que leva a uma super produ??o de citocinas inflamat?rias no hospedeiro, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF-α), a interleucina-1 (IL-1) e a interleucina-6 (IL-6), por sua vez provindas de c?lulas do sistema imune, como os mon?citos. Estudos recentes demonstraram que, de forma similar ao LPS, o v?rus sincicial respirat?rio (RSV) principal causa de infec??o respirat?ria baixa em crian?as e rec?m natos - utiliza o receptor toll-like 4 (TLR4) para sinaliza??o celular. Estudos demonstraram que a glicoprote?na de liga??o do v?rus sincicial respirat?rio (RSV G) age como imunomoduladora na produ??o de citocinas e quimiocinas por mon?citos, inibindo a resposta inflamat?ria estimulada por LPS. Neste artigo, n?s utilizamos mon?citos mon?citos murinos de diferentes camundongos knockout para demonstrar que RSV G pode inibir a produ??o de citocinas na resposta imune contra lipopolissacar?deos em um modelo de sepse. Demonstra-se tamb?m a modula??o das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α por RSV G em mon?citos estimulados por LPS. O artigo ainda considera de forma destacada o efeito de subunidades (pept?deos) de RSV G, bem como destaca perspectivas para o futuro uso cl?nico de glicoprote?nas na modula??o da resposta inflamat?ria mediada por LPS.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 411557.pdf: 393589 bytes, checksum: 053a463b93c95b4c46c869360ae19192 (MD5) Previous issue date: 2009-03-24 / As enzimas L-asparaginase do tipo II catalisam a hidr?lise de L-asparagina a Laspartato e am?nia e, em menor quantidade, a hidr?lise de L-glutamina. Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi s?o as principais origens das L-asparaginases II utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento da leucemia linfobl?stica aguda infantil. Entretanto, sua atividade de glutaminase tem sido relatada, causando graves efeitos colaterais. Felizmente, a L-asparaginase II obtida de Erwinia carotovora possui baixa atividade de glutaminase, representando uma importante terapia alternativa. Neste trabalho ? descrita a clonagem, express?o, purifica??o e determina??o dos par?metros cin?ticos em estado estacion?rio para duas constru??es de L-asparaginase II de E. carotovora: com (AspSP) e sem pept?deo-sinal (AspMP). AspMP foi purificada ? homogeneidade por um protocolo de uma etapa com 81% de rendimento, enquanto que AspSP por um protocolo de duas etapas com 35% de rendimento. Os valores de Km e kcat para as atividades de L-asparaginase e de L-glutaminase foram determinados para ambas as prote?nas. A an?lise de especificidade para os substratos indicou que a L-asparagina ? o melhor substrato que a L-glutamina para a AspSp quando comparado ? AspMP. Entretanto, a AspMP ? produzida por um protocolo de purifica??o simples que fornece um alto rendimento da enzima. Este processo pode ser adaptado para uma produ??o em larga escala e ser interessante para as pesquisas e companhias biofarmac?uticas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 422630.pdf: 863810 bytes, checksum: 54cbb559cd6e16dd1047303d63eb52f7 (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / O l?pus eritematoso sist?mico (LES) ? uma doen?a autoimune caracterizada por uma consider?vel diversidade de autoanticorpos circulantes. As prote?nas de choque t?rmico (Hsp), altamente conservadas na evolu??o das esp?cies, s?o um poss?vel alvo para autoanticorpos no LES. A resposta humoral contra a Hsp de 90 kilodaltons (Hsp90) no LES foi pouco estudada at? o momento. Material e m?todos: Neste estudo, tranversal controlado, avaliamos os n?veis de anticorpos anti-Hsp90 em pacientes com LES ativo e inativo e em controles sadios. O diagn?stico de LES foi fundamentado nos crit?rios do Col?gio Americano de Reumatologia de 1997. A presen?a de LES ativo foi confirmada atrav?s de SLEDAI acima de 4. Anticorpos IgG anti-Hsp90 foram testados atrav?s de ensaio imunoenzim?tico. N?veis acima de 2 desvios-padr?es (DP) em rela??o ? m?dia dos controles foram arbitrariamente considerados positivos. Para comparar vari?veis categ?ricas e cont?nuas e para obten??o de correla??es foram utilizados testes n?o-param?tricos, test t e coeficiente de Pearson. Resultados: Quarenta e cinco pacientes com LES (42 do sexo feminino, 93,3%) e 25 controles sadios (22 do sexo feminino, 88%) foram avaliados. Vinte e dois dos 45 pacientes com LES (49%) apresentaram doen?a ativa. Protein?ria acima de 0,5 g/dia, alop?cia, ?lceras mucosas e artrite foram significativamente mais freq?entes no LES ativo do que na doen?a inativa. Pacientes com LES ativo apresentaram n?veis m?dios de anti- Hsp90 significativamente acima dos controles (P<0,001). O teste de Pearson revelou correla??o significante entre n?veis de anti-Hsp90 e SLEDAI (R = 0,51, P<0,001). Dezesseis pacientes com LES (36%) tiveram teste positivo para anti-Hsp90 (P<0,02 em rela??o aos controles sadios). Um teste positivo para anti-Hsp90 foi significativamente mais freq?ente no LES ativo quando comparado a controles (P<0,001) e LES inativo (P<0,05). Positividade para anti-Hsp90 se associou ? ocorr?ncia de anticorpos anti-DNA, leucopenia e trombocitopenia. A especificidade e a sensibilidade do teste para anti-Hsp90 foram de 100% e 36%, respectivamente. O likelihood ratio positivo (LR+) para anti-Hsp90 acima de 2 DP foi elevado (18,7). Conclus?es: Os n?veis m?dios de anticorpos anti-Hsp90 foram significantemente mais elevados no LES do que em controles. A testagem positiva para anti-Hsp90 pareceu ser associada ? doen?a l?pica ativa, particulamente anticorpos anti-DNA e altera??es hematol?gicas. O teste se mostrou altamente espec?fico, mas com baixa sensibilidade em pacientes com LES. Em pacientes com n?veis antic?rpicos acima de 2 DP, a probabilidade de doen?a l?pica foi elevada. A utiliza??o do anticorpo anti-Hsp90 como biomarcador no LES e outras doen?as autoimunes deve ser avaliada em estudos futuros.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438529.pdf: 18860537 bytes, checksum: 9c31f74e1e908515a22fbc3a7838b2b1 (MD5) Previous issue date: 2012-05-29 / Gastrointestinal sarcomatoid tumors (GIST) are rare malignancies, corresponding to 1 - 3% of alli GI cancers. Nevertheless, GISts are the most common GI mesenchimal malignancies. GISTs are heterogeneous in presentation, clinical course and response to therapy. Their prognosis can be roughly estimated at diagnosis by assessing tumor size, mitotic index and the topography of the primary lesion. Despite the proved utility of these prognostic factors, their limitations are well documented, and a more refined set of biological markers are much needed. The abnormal activation of the cell survival signaling pathway provided by PI3K/Akt/PTEN proteins is a well known feature in advanced epithelial and hematological malignancies, impacting the aggressiveness of the disease as well as the resistance to different traditional therapies or biological agents. Besides their multi-effect in cell survival mechanisms, the PI3K/Akt/PTEN pathway is a powerful activator of angiogenesis via VEGF protein family transcription. The different isoforms of VEGF will in turn activate the VEGF receptor (VEGFR) at the surface of endothelial cells. Therefore, VEGFR is a reliable marker of angiogenesis in human tumors. We sought to evaluate the expression of VEGFR and Akt proteins in a series of GIST patients at diagnosis, treated in a single institution, in order to correlated the levei of expression of these proteins to clinical outcomes, such as overall survival (OS) and disease free survival (DFS). The levei of expression of these proteins was also correlated to the same outcomes in a subgroup of patients with advanced disease who received more than three months of therapy with Imatinib Mesylate (GleeveC?). Methods - 48 GIST patients were evaluated. Immunohystochemistry for VEGFR and Akt was performed by tissue microarray. Results - Akt hyperexpression was statistically correlated with a shorter DFS in the group of patients with metastatic disease (ali of them receiving GleeveC?). This correlation was not observed in early cases (defined as curable disease - stages I to III). We have not observed correlation between Akt expression and OS in any clinical stage. Lower VEGFR expression was associated to a significant better OS in ali stages (including patients receiving GleeveC?). Conversely, DFS was not affected by the levei of expression of VEGFR. CONCLUSIONS - Low VEGFR expression was related to a better prognosis in any clinicalstage of GIST, reflected in larger OS. The fact that this effect was observed in GleeveC? treated patients suggests that the betler response to the drug is much more related to the biology of the tumor than to the treatment itself. Akt showed also a promising role as a prognostic marker for disease free survival in advanced disease, indicating that GISTs with hyperexpressed Akt pathway behave more aggressively or may be less sensitive to GleeveC?. / Introdu??o: GISTs s?o raros, correspondendo de 1 a 3% de todas as neoplasias do trato gastrointestinal, entretanto, s?o as neoplasias mesenquimais mais comuns desta localiza??o. Possuem uma apresenta??o, comportamento cl?nico e resposta ? terapia heterog?neos. O progn?stico pode ser grosseiramente estimado pelo tamanho tumoral ao diagn?stico, topografia e ?ndice mit?tico. Apesar da utilidade destes fatores de progn?stico de simples obten??o, a heterogeneidade da doen?a exige que marcadores mais espec?ficos sejam aplicados para uma avalia??o individual n?o apenas progn?stica ao diagn?stico, mas tamb?m preditiva ao tratamento com novas drogas dispon?veis. A ativa??o aberrante das prote?nas da via de sinaliza??o PI3K/Akt/PTEN ? um fen?meno relativamente comum em neoplasias epiteliais e hematol?gicas, com repercuss?o tanto na agressividade da neoplasia como na sua resist?ncia adquirida a tratamentos anti-neopl?sicos. Al?m da sinaliza??o para mecanismos de sobreviv?ncia, a via PI3K/Akt/PTEN est? envolvida na ativa??o de angiog?nese por meio da transcri??o de VEGF e secundariamente do seu receptor endotelial, VEGFR. O objetivo deste trabalho foi avaliar a express?o das prote?nas VEGFR, Akt e PTEN em pacientes com GIST ao diagn?stico, na tentativa de correlacionar a mesma com desfechos cl?nicos. Paralelamente acompanhamos o efeito do n?vel de express?o destas prote?nas em um subgrupo de pacientes com doen?a avan?ada que recebeu a medica??o Mesilato de Imatinib (GliveC?). M?todo: Avalia??o imunoistoqu?mica com m?todo TMA de 48 esp?cimes de GISTs utilizando os anticorpos monoclonais para Akt e VEGFR. A hiperexpress?o de Akt foi verificada em 33,3% e VEGFR em 75% das amostras. Na an?lise do grupo geral de pacientes, a hiper-express?o de Akt correlacionou-se com uma SLP (sobrevida livre de progress?o) estatisticamente encurtada (p>O.05) exclusivamente para casos com doen?a metast?tica. Esta correla??o n?o foi observada em casos com doen?a n?o inicial (est?gios I a III). No entanto, mesmo em doen?a avan?ada, a hiper-express?o de Akt n?o teve impacto na sobrevida global. Como o grupo de pacientes com doen?a avan?ada foi o grupo que recebeu GliveC?, a correla??o com SLP e hiper-express?o de Akt se manteve. A aus?ncia de express?o de VEGFR se associou com melhor sobrevida global (SG) em todos os est?gios (incluindo os pacientes que receberam GliveC?), mas n?o com sobrevida livre de doen?a (SLD). Este dado sugere que os pacientes com baixa express?o de VEGFR poderiam ter uma doen?a de biologia mais indolente, mesmo que a taxa de recorr?ncia seja id?ntica ao grupo com VEGFR hiper-expresso. Conclus?es: os resultados deste estudo sugerem que a baixa express?o de VEGFR ? um fator de progn?stico favor?vel em pacientes com doen?a em qualquer est?gio. A hiperexpress?o de Akt associa-se a uma menor SLP apenas em casos avan?ados, sugerindo que a ativa??o desta via poderia ser um mecanismo adquirido em etapas finais da doen?a que conferem resist?ncia ao GliveC?.