Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4996_1.pdf: 368944 bytes, checksum: 8bd95b0fde9736f57f5f1b1e06fe2b78 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / O propranolol, utilizado frequentemente na patologia cardíaca por seu efeito bloqueador β-adrenérgico, está freqüentemente associado com efeitos sexuais colaterais. Esses efeitos não parecem estar relacionados ao bloqueio β-adrenérgico. O efeito do propranolol sobre o metabolismo dos fosfolipídios e do diacilglicerol tem sido referido na literatura. No presente trabalho foi estudado o envolvimento da via de tradução do sinal do diacilglicerol/proteína quinase C (DAG/PK-C) na ação do propranolol sobre a secreção de testosterona em células intersticiais testiculares de rato. O tratamento agudo com propranolol estimulou a secreção de testosterona in vitro com concentrações da droga variando de 1μM a 100 μM. O H-7 (20 μM), inibidor da PK-C, reduziu esse efeito em aproximadamente 50%. Na concentração de 75 μM o S-propranolol reduziu 50% da ligação do [3H]12,13-dibutirato de forbol ([3H]PDBu) às células enquanto que no homogeneizado dessas células a redução da ligação foi de apenas 5%. Esses resultados sugerem que o efeito do S-propranolol sobre a ligação do [3H]PDBu poderia ser indireto, possivelmente por aumentar a concentração de um mediador químico que interage com o domínio regulatório da PK-C. Em concentrações ainda mais baixas (1 nM a 100 nM), o S- ou R-propranolol adicionado diretamente à mistura de reação com PK-C parcialmente purificada das células intersticiais aumentou a fosforilação da histona. Essa fosforilação foi comparável àquela obtida com (25 μM) fosfatidilserina, não ocorreu em ausência de Ca2+ e foi revertida com 20 μM H-7. O tratamento crônico com propranolol por via intraperitoneal (30 mg/Kg/8 dias) bloqueou o efeitoestimulatório do S-propranolol e dos ativadores da PK-C (PDBu e LHRH) sobre a secreção de testosterona em células intersticiais testiculares in vitro, sugerindo a dessensibilização da via do DAG/PK-C nessas células. Contudo, a atividade da PK-C não foi modificada. O tratamento mais prolongado, por via oral, com propranolol (500 mg/L/5 semanas) produziu uma dessensibilização mais suave na resposta secretória das células, não modificou a ligação do [3H]PDBu e não modificou a atividade, em valores absolutos, da PK-C. Esses resultados sugerem que a PK-C não está envolvida na dessensibilização da resposta secretória. A especificidade dessa dessensibilização é sugerida pela não modificação (redução) do efeito inibitório do propranolol sobre a secreção de testosterona estimulada pelo hCG e dbAMPc, ativadores indireto e direto da PK-A. Concluindo, os resultados sugerem que a PK-C pode ser a quinase putativa envolvida no efeito agudo estimulatório do propranolol sobre a secreção de testosterona pelas células intersticiais testiculares e que a dessensibilização dessas células após tratamento crônico com propranolol não envolve diminuição da atividade ou de concentração dessa enzima

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T14:50:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T14:50:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T14:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) Previous issue date: 2017-05-29 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lauraceae family species are rich in bioactive compounds, including alkaloids, with high pharmaceutical potential, such as activities against Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. These protozoa are, respectively, etiological agents of cutaneous Leishmaniasis and Chagas’ disease, which affect millions of people in underdeveloped and developing countries. Current therapeutic options available for treatment of these infections have severe side effects and low efficacy, for this reason, the development of effective and less toxic chemotherapeutic agents is extremely important. In order to find bioactive plant compounds with potential against these parasites, we performed an in vitro screening with ethanolic extracts of 12 species of Lauraceae against T. cruzi and L. amazonensis. Furthermore, a new molecular approach had been proposed to identify molecular drug targets in L. mexicana. The most active extracts were submitted to acid-base partition and the fractions have been evaluated. The bioguided assay led to isolation of 6 alkaloids. A new indole alkaloid isolated from A. panurensis, 3-methoxy-2-oxa-4,10b-diaza-1,3,6a,10c-tetrahydrofluoranthene-3,5-diol, had moderate activity against the three forms of T. cruzi and Leishmania amazonensis promastigotes. It was also shown that this alkaloid induces morphological and biochemical modifications in L. amazonensis promastigotes, impairing cytokinesis and generating cells with multiple nuclei and flagella. The compounds tested in this thesis show potential for modifications to its structure to improve activity and could potentially be tested in other parasites. The second chapter of the thesis aims to validate an inducible overexpression approach for L. mexicana, which could be used to generate an overexpression library. The results demonstrated for the first time the expression of an endogenous L. mexicana kinase (CRK3). Furthermore, a new system to inducible overexpression had been produced. This new molecular tool is suitable for all life cycle stages and could be used as a tool for drug discovery and to understand the complex biology of the parasite. The phytochemical and molecular approaches used here resulted in original data wich will help the discovery for new molecules against the trypanosomatids. / Espécies pertencentes à família Lauraceae são ricas em alcaloides e outras substâncias bioativas com alto potencial farmacêutico, inclusive atividades contra os tripanosomatídeos Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Esses são, respectivamente, protozoários agentes etiológicos de leishmaniose e doença de Chagas, doenças que afetam milhões de pessoas em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento. As opções terapêuticas disponíveis atualmente para o tratamento de infecções causadas por esses parasitos têm severos efeitos colaterais e baixa eficácia, sedo a busca por novos fármacos de extrema importância. No sentido de buscar substâncias bioativas de plantas com potencial farmacêutico, foi realizada triagem in vitro utilizando extratos etanólicos de 12 espécies de Lauraceae contra T. cruzi e L. amazonensis a fim de encontrar os extratos mais promissores. Ainda, foi proposto a geração de uma ferramenta molecular para utilização na busca por substâncias ativas frente a L. mexicana. Os extratos mais ativos foram submetidos à partição ácido-base e as frações alcaloídicas avaliadas. A partir desse ensaio bioguiado, 6 alcaloides forem isolados e a atividade in vitro frente aos tripanosomatídeos avaliada. O alcaloide indólico 3-metoxi-2-oxa-4,10b-diaza-1,3,6a,10c-tetrahidrofluorantano-3,5-diol foi ativo contra T. cruzi e L. amazonensis. Este alcaloide induz alterações morfológicas e bioquímicas em promastigotas de L. amazonensis, atuando na divisão celular, com bloqueio na citocinese, processo autofágico e consequente colapso celular e morte. Já os resultados obtidos na parte final, com foco na ferramenta molecular para busca por substâncias, foi demonstrado pela primeira vez a superexpressão induzida de proteína endógena neste protozoário. Ainda, foi gerado modelo de superexpressão de proteínas que poderá ser utilizado para analisar as alterações fenotípicas, inferir funções de proteínas, ensaios para busca de fármacos, bem como compreender a complexa biologia de L. mexicana. As duas abordagens utilizadas resultaram em dados inéditos que permitem a continuação tanto dos trabalhos fitoquímicos quanto os moleculares, a fim de buscar novos fármcos frente aos tripanosomatídeos utilizados.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6583_1.pdf: 2036261 bytes, checksum: 2f9456a9138bbf6c7d3482c028af1558 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / O diabetes mellitus é um grave problema de saúde pública caracterizado por hiperglicemia crônica ocasionada pela ausência ou ineficiência da insulina nos tecidos-alvo. Muitas espécies de plantas têm sido usadas na medicina popular para tratar os sintomas da doença. Na etnofarmacologia, o chá da casca de Caesalpinia ferrea Martius Ext Tul tem sido usado no tratamento do diabetes. Nesse estudo, metabólitos secundários foram identificados e quantificados por HPLC. A fim de verificar a atividade antidiabética de C. ferrea, quatro grupos de ratos Wistar diabéticos induzidos por estreptozotocina (50mg/Kg) (n=7/grupo) foram tratados com o extrato aquoso da casca do caule de C. ferrea (EaCf) (300 e 450mg/Kg/dia), veículo e metformina (500mg/Kg/dia) durante 4 semanas. Mudanças no ganho de massa, no consumo de água e ração e nos parâmetros bioquímicos foram avaliadas. A expressão da proteína quinase B (Akt), da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) e acetil-CoA carboxilase (ACC) foram determinadas no fígado e músculo esquelético dos animais usando Western blot. A avaliação da segurança de uso do EaCf foi verificada através dos ensaios de toxicidade aguda, subcrônica, crônica e reprodutiva. Para os ensaios de toxicidade aguda, o EaCf (2000mg/Kg) foi administrado em ratos Wistar de ambos os sexos (n= 5/grupo/sexo). Na toxicidade subcrônica, ratos Wistar machos (n=10/grupo) foram tratados durante 30 dias com o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) e na crônica, o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) foi administrado aos camundongos Swiss machos durante 90 dias. Ao final do tratamento foram realizadas análises bioquímicas, hematológicas, macro e microscópicas dos órgãos. Na toxicidade reprodutiva, o EaCf (300 e 1500mg/Kg/dia) foi administrado em ratas Wistar prenhes durante o período integral de gestação para avaliação dos parâmetros reprodutivos maternos e comportamentais da prole. O conteúdo de ácido gálico, catequina, epicatequina e ácido elágico quantificado por HPLC foi de 112,76; 17,75; 6,13 e 12,00mg/g. Os resultados ainda mostraram que EaCf reduziu os níveis glicêmicos e melhorou o estado metabólico geral dos animais diabéticos. A ativação da Akt foi observada no fígado e músculo esquelético dos animais tratados com conseqüente desativação da AMPK no músculo e ativação da ACC em ambos quando comparado aos não-tratados. Na toxicidade aguda, o tratamento não induziu nenhum sinal de toxicidade ou morte, e na subcrônica, não houve alterações macro e microscópicas dos órgãos e nem nos parâmetros hematológicos e bioquímicos, exceto a amilasemia observada. Na toxicidade crônica, houve reduções no ganho de massa corporal, nos níveis séricos de proteínas totais e albumina (em ambas as doses). Na dose de 1500mg/Kg, houve aumento da lactato desidrogenase, amilase e necrose do intestino delgado. Durante toda a gestação, houve redução no ganho de massa corporal (1500mg/Kg) e na prole foram observadas reduções na massa corporal no 1º e 4º dias de vida e no comprimento, no 21º dia de vida pós-natal (1500mg/Kg). Os resultados sugerem que EaCf apresenta atividade antidiabética e age, possivelmente, regulando a captação hepática e muscular de glicose via Akt. O tratamento crônico sugere toxicidade principalmente na maior dose, provavelmente pela ação dos taninos que comprometem a absorção de macronutrientes

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / A Proteína quinase C (PKC) está intimamente envolvida em processos celulares de armazenamento de informações, formação de memória, plasticidade sináptica e sobrevivência e manutenção neuronal. Tendo em vista os efeitos inibidores da PKC de algumas substâncias usadas no tratamento de alguns transtornos psiquiátricos e outras patologias, neste estudo, foram avaliados os efeitos farmacológicos e a segurança da administração crônica de inibidores da PKC, tamoxifeno (TMX), Hypericum perforatum (HP) e lítio (Li), sobre alterações comportamentais, parâmetros de danos oxidativos e níveis de fatores neurotróficos no cérebro de ratos Wistar. Os animais receberam TMX (1mg / kg), HP (5mg / kg), Li (47,5 mg / kg) e água (grupo controle) durante um período de 28 dias, via gavagem. Os animais foram então submetidos aos testes comportamentais: campo aberto, labirinto em cruz elevado, nado forçado, reconhecimento de objetos e esquiva inibitória. Além disso, os níveis de NGF, BDNF e GDNF foram avaliados no hipocampo e córtex frontal de ratos. As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a formação de proteínas carboniladas foram avaliadas no córtex frontal, hipocampo, núcleo accumbens e estriado. Não foram observadas diferenças significativas nos testes do campo aberto, labirinto em cruz elevado e nado forçado, quando administrados os inibidores da PKC em ratos machos ou fêmeas. No teste de esquiva inibitória, o tratamento com HP induziu dano na aquisição de memória em ratos machos e fêmeas. A administração de TMX ou HP, mas não de Li, diminuíram o índice de reconhecimento de objeto em ratos machos e fêmeas, no teste de reconhecimento de objetos. A administração crônica de HP e TMX diminuiu, e o Li aumentou, os níveis de BDNF no hipocampo de ratos machos e fêmeas. TMX e HP diminuíram os níveis de NGF somente no hipocampo de fêmeas. O TMX protegeu o dano lipídico no núcleo accumbens e estriado, enquanto HP diminuiu os níveis de TBARS no hipocampo, núcleo accumbens e estriado em ratos fêmeas. No córtex frontal, o tratamento com TMX e HP induziu o dano a proteína, enquanto que apenas o HP diminuiu os níveis de proteínas carboniladas no estriado. O TMX reduziu o dano lipídico no núcleo accumbens e estriado, enquanto HP diminuiu os níveis de TBARS no hipocampo, núcleo accumbens e estriado em ratos fêmeas. No córtex frontal, o tratamento com TMX e HP diminuiu o dano protéico, enquanto que apenas o HP diminuiu os níveis de proteínas carboniladas no estriado. Os resultados do presente estudo sugerem que o tratamento a longo prazo com TMX ou HP pode conduzir a um déficit cognitivo significativo, pela diminuição dos níveis de fatores neurotróficos no cérebro de ratos machos e fêmeas quando comparado com o Li. Desta forma, sugere-se que a PKC está intimamente envolvida com a formação da memória. É importante ressaltar, que apesar do Li, TMX e HP, per se, mostrarem redução de dano oxidativo, o uso crônico de TMX e HP deve-se ter cautela quanto ao dano cognitivo.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Aging is associated with a decline in mitochondrial function, which is controlled mainly through peroxisome proliferator-activated receptor gamma coativator-1 alpha (PGC-1α), sirtuin 1 (SIRT-1) and AMP-activated protein kinase (AMPK). On the other hand, exercise is known to monitor the levels of SIRT-1 and PGC-1α protein and AMPK phosphorylation, but the effects of exercise intensity of these molecules has not been fully investigated. The present study aimed to investigate the potential effect of race at 1.2 and 0.8 km/h in protein levels of SIRT-1 and PGC-1α and AMPK phosphorylation in skeletal muscle of old adult rats. To this, young Wistar rats two months of age and older adults with eighteen months of age, weighing 218 ± 10 and 526 ± 12 g, respectively, before the exercise protocol, were divided into the following groups (n = 6): non-exercised ( NE ); exercised at 0.8 km/h (0.8 km/h) and exercised at 1.2 km/h (1.2 km/h ). The rats of the exercise groups were subjected to running at a constant speed of 0.8 km/h and 1.2 km/h without inclination, 50 minutes per day, 5 days per week for 8 weeks. Forty-eight hours after the last session of physical exercise, the animals were anesthetized and underwent extraction of the quadriceps for the analysis of intracellular proteins by immunoblot technique and enzyme activities. Our results showed that aging reduces levels of SIRT-1 proteins (45%), PGC-1α (39%) and AMPK (40%) phosphorylation when compared with young rats. On the other hand, the group that exercised to 0.8 km/h increased protein levels and phosphorylation of these molecules, when compared with NE rats, but this increase was higher in young rats. Rats that exercised at 1.2 km/h showed increased levels of SIRT-1, PGC-1α and AMPK phosphorylation, when compared to animals trained to 0.8 km/h, but there was no statistical difference when compared rats young and old adults. It was observed that age-related declines in AMPK, SIRT-1 and PGC-1α molecules can be largely ameliorated by exercise. However, the data demonstrated that, to achieve changes in SIRT-1, PGC-1α and AMPK that are comparable in magnitude with in young rats, higher intensities of exercise are necessary for older adults rats. / O envelhecimento está associado ao declínio da função mitocondrial, que é controlada principalmente através do coativador 1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PGC-1α), sirtuína 1 (SIRT-1) e proteína quinase ativada por AMP (AMPK). Por outro lado, o exercício é conhecido por controlar os níveis de SIRT-1 e PGC-1α e a fosforilação da AMPK, porém os efeitos da intensidade do exercício sobre estas moléculas não foi totalmente investigado. O presente estudo objetivou investigar o efeito da corrida a 0,8 e 1,2 km/h nos níveis proteicos da SIRT-1 e PGC-1α e na fosforilação da AMPK em músculo esquelético de ratos adultos velhos. Para tal, ratos Wistar machos jovens com dois meses de idade e adultos velhos com dezoito meses de idade, pesando 218±10 e 526±12 g, respectivamente, foram divididos nos grupos (n=6): não exercitado (NE); exercitado em 0,8 km/h (0,8 km/h) e exercitado em 1,2 km/h (1,2 km/h). Os animais dos grupos exercício foram submetidos à corrida em velocidade constante de 0,8 km/h ou 1,2 km/h sem inclinação, 50 minutos/dia, 5 dias/semana, por 8 semanas. Quarenta e oito horas após a última sessão de execício físico, os animais foram anestesiados e realizou-se a extração do quadríceps para as análises de proteicas pela técnica de imunoblot e atividades enzimáticas. Os resultados mostraram que o envelhecimento reduz os níveis de SIRT-1 (45%), PGC-1α (39%) e a fosforilação da AMPK (40%), quando comparados com ratos jovens. Por outro lado, o grupo exercitado a 0,8 km/h aumentou os níveis proteicos e a fosforilação destas moléculas, quando comparados com ratos NE, mas este aumento foi maior em ratos jovens. Ratos exercitados a 1,2 km/h mostraram aumento dos níveis de SIRT-1, PGC-1α e fosforilação da AMPK, quando comparado aos animais exercitados a 0,8 km/h, mas não houve diferença estatística quando comparado os ratos jovens e adultos velhos. Os declínios relacionados à idade nas moléculas AMPK, SIRT-1 e PGC-1α podem ser melhorados pelo exercício físico. No entanto, os dados demonstraram que, para atingir mudanças na SIRT-1, PGC-1α e AMPK que são comparáveis em magnitude com os ratos jovens, maiores intensidades de exercícios são necessárias para os ratos adultos velhos.

Plaquetas apresentam um papel importante no desenvolvimento de metastases tumorais. Os eventos que levam à ativação plaquetária, como agragação e secreção de proteínas, podem significar etapas importantes neste papel. O agonista plaquetário trombospondina está envolvido no processo de agragação plaquetária. Com o intuito de clonar o receptor de trombospondina GpIIIb, produziu-se um soro policlonal contra uma banda eluída de SDS PAGE de extrato proteico de plaquetas, que apresentava peso molecular igual ao de GpIIIb (denominada banda 80kD). Uma biblioteca de cDNA de endotélio de cordão umbilical humano construída em lambda gt11 foi varrida com este soro anti-80kD. Dois clones diferentes foram isolados, seus insertos foram subclonados no vetor pGEM-3Z e sequenciados. Através de consulta ao Genbank observou-se que um dos clones não apresentou homologia significativa com nenhuma proteína até então clonada. O outro clone, por sua vez, apresentou 100% de homologia com a proteína 80K-H, substrato de proteína quinase C. Levando em consideração o fato de que as vias detransdução de sinal que utilizam PKC apresentam extrema importância nos processos de ativação plaquetária decidiu-se prosseguir com a caracterização de 80K-H. Para isto foi produzido um soro policlonal contra a proteína de fusão 80K-H, que foi utilizado em ensaios bioquímicos e imunoquímicos que permitiram caracterizar a proteína 80K-H quanto a alguns aspectos como distribuição em diferentes tipos celulares, localização celular e fosforilação. Além de estar presente em plaquetas, a proteína 80K-H foi encontrada em todas as linhagens celulares testadas, parecendo portanto ser uma proteína ubíqua. Os dados obtidos indicaram que, apesar de apresentar uma sequência N-terminal que é clivada \"in vivo\" muito semelhante a um peptídeo sinal, 80K-H não é secretada nem é de membrana plasmática, mas sim citoplasmática. Em ensaios de fosforilação \"in vivo\" não se detectou fosforilação de 80K-H. Portanto, apesar de 80K-H ser um bom substrato para PKC \"in vitro\", ela não o é \"in vivo\", ao menos nas células analisadas, ou é fosforilada de uma forma extremamente rápida e transiente. / Abstract not available.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6077.pdf: 10672804 bytes, checksum: 8a7ba5e1820e96664e3cbb7f872f6f3e (MD5) Previous issue date: 2013-10-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Over the recent years, the incidence of human fungal infections has shown a significant increase. Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus opportunistic pathogen responsible for many human respiratory diseases, including invasive pulmonary aspergillosis, which is the most serious form of infection . Studies show that A. fumigatus virulence has a multifactorial process associated with its structure, capacity for growth, adaptation to stress conditions, evasion mechanisms of the immune system and ability to cause harm to the host. CWI (via cell wall integrity ) is a signaling cascade activated in yeast cells under conditions of cell wall stress and plays a role in the adaptation of various fungal pathogens in the human host . In many fungi , CWI is triggered by activation of protein kinase C ( PKC ) and that this pathway is associated with the transcription of genes related to maintaining the integrity of the cell wall and its redevelopment. In this work, a mutant Gly579Arg (G579R) was constructed by transformation mediated by inserting a gene replacement cassette comprising a G2044C transversion located in the cysteine-rich domain controller C1B pkcA of A. fumigatus. From the phenotypic analysis of the mutant strain was observed in the involvement of pkcAG579R CWI since the mutant showed high sensitivity to agents such as CR (congo red) and CFW (calcofluor white) . Furthermore, pkcA is also involved in tolerance to oxidative stress caused by paraquat and menadione. Additionally it was found to increase the sensitivity of the mutant pkcAG579R temperature variations as well as the inhibitor of Hsp90 radicicol. Como CWI is related to the transcriptional activation of biosynthetic genes and rugged cell wall (such as glucan synthase, glucanosil chitin synthases and transferases) the abundance of major genes coding for these enzymes was analyzed by RT-PCR in real time. Based on the tests can be α -1 ,3 glucan synthase ( agsA-C ) dependent signaling mediated PkcA for correct expression. Furthermore, genes such as β-1,3 glucan synthase (fksA) glucanosyltransferase (gelA-C) and some chitin synthases (chsB-E-C) appear not to be dependent function and CWI PkcA . These data demonstrated the role of pkcA signaling cascade in the maintenance of cell wall and thermotolerance in A. fumigatus. This work was the first in which a systematic analysis of gene pkcA was conducted in the human opportunistic fungal pathogen A. fumigatus. / Ao longo dos últimos anos, a ocorrência de infecções fúngicas humanas vem apresentando um aumento expressivo. Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patógeno oportunista responsável por diversas doenças respiratórias humanas, incluindo aspergilose pulmonar invasiva, que é a forma de infecção mais grave. Estudos demonstram que o A. fumigatus possui um processo de virulência multifatorial associado a sua estrutura, capacidade de crescimento, adaptação em condições de estresse, mecânismos de evasão do sistema imune e capacidade de causar danos ao hospedeiro. A CWI (via de integridade da parede celular) é uma cascata de sinalização ativada nas células fúngicas sob condições de estresse de parede celular e desempenha um papel na adaptação de vários fungos patogênicos no hospedeiro humano. Em muitos fungos, CWI é desencadeada através da ativação da proteína quinase C (PKC) sendo que esta via está associada à transcrição de genes relacionados com a manutenção da integridade da parede celular e sua remodelação. Neste trabalho o mutante Gly579Arg (G579R) foi construído através da transformação mediada pela inserção de um cassete de substituição gênica que compreende uma transversão G2044C localizado no domínio regulador rico em cisteína C1B da pkcA de A. fumigatus. A partir da análise fenotípica desse mutante foi possível observar o envolvimento de pkcAG579R na CWI uma vez que a linhagem mutante mostrou alta sensibilidade a agentes como o CR (congo red) e CFW (calcofluor white). Além disso, pkcA está envolvido também na tolerância ao estresse oxidativo causado por menadiona e paraquat. Adicionalmente verificou-se o aumento da sensibilidade da linhagem mutante pkcAG579R à variações de temperatura bem como ao inibidor de Hsp90, radicicol. Como a CWI está relacionada à ativação transcricional de genes de biossíntese e reforço de parede celular (como por exemplo glucanas sintases, quitinas sintases e glucanosil transferases), a abundância dos principais genes que codificam essas enzimas foi analisada através de RTPCR em tempo real. Baseado nos testes pode-se verificar que as α-1,3 glucana sintase (agsA-C) dependem da sinalização mediada por PkcA para sua expressão. Por outro lado, genes como a β-1,3 glucana sintase (fksA), glucanosiltransferases (gelA-C) e algumas quitinas sintases (chsB-C-E) parecem não ser dependente da CWI e da função de PkcA. Esses dados demostraram parte do papel de pkcA na cascata de sinalização da manutenção da parede celular e termotolerância em A. fumigatus. Este trabalho foi o primeiro no qual uma análise sistemática do gene pkcA foi conduzida no fungo patógeno oportunista humano A. fumigatus.

Plaquetas apresentam um papel importante no desenvolvimento de metastases tumorais. Os eventos que levam à ativação plaquetária, como agragação e secreção de proteínas, podem significar etapas importantes neste papel. O agonista plaquetário trombospondina está envolvido no processo de agragação plaquetária. Com o intuito de clonar o receptor de trombospondina GpIIIb, produziu-se um soro policlonal contra uma banda eluída de SDS PAGE de extrato proteico de plaquetas, que apresentava peso molecular igual ao de GpIIIb (denominada banda 80kD). Uma biblioteca de cDNA de endotélio de cordão umbilical humano construída em lambda gt11 foi varrida com este soro anti-80kD. Dois clones diferentes foram isolados, seus insertos foram subclonados no vetor pGEM-3Z e sequenciados. Através de consulta ao Genbank observou-se que um dos clones não apresentou homologia significativa com nenhuma proteína até então clonada. O outro clone, por sua vez, apresentou 100% de homologia com a proteína 80K-H, substrato de proteína quinase C. Levando em consideração o fato de que as vias detransdução de sinal que utilizam PKC apresentam extrema importância nos processos de ativação plaquetária decidiu-se prosseguir com a caracterização de 80K-H. Para isto foi produzido um soro policlonal contra a proteína de fusão 80K-H, que foi utilizado em ensaios bioquímicos e imunoquímicos que permitiram caracterizar a proteína 80K-H quanto a alguns aspectos como distribuição em diferentes tipos celulares, localização celular e fosforilação. Além de estar presente em plaquetas, a proteína 80K-H foi encontrada em todas as linhagens celulares testadas, parecendo portanto ser uma proteína ubíqua. Os dados obtidos indicaram que, apesar de apresentar uma sequência N-terminal que é clivada \"in vivo\" muito semelhante a um peptídeo sinal, 80K-H não é secretada nem é de membrana plasmática, mas sim citoplasmática. Em ensaios de fosforilação \"in vivo\" não se detectou fosforilação de 80K-H. Portanto, apesar de 80K-H ser um bom substrato para PKC \"in vitro\", ela não o é \"in vivo\", ao menos nas células analisadas, ou é fosforilada de uma forma extremamente rápida e transiente. / Abstract not available.

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKCβI. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas / The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKCβI. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins.

As alquilfosfocolinas (APC) são uma classe de fármacos derivados de fosfolipídios endógenos que apresentam potencial antitumoral. Diferentemente de outros fármacos antitumorais que agem no DNA da célula, as APCs têm como primeiro local de ação a membrana plasmática e proteínas de sinalização, como a PKC. O objetivo desse trabalho é elucidar, através de metodologias computacionais, os possíveis mecanismos de ação das APCs que provocam hemólise, inibição da PKC e interação com membranas celulares. Inicialmente, a toxicidade de um conjunto de 34 APCs foi estudada pelos métodos quimiométricos de Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA) e Componentes Principais (PCA). As moléculas foram simuladas com dinâmica molecular (DM) e propriedades físico-químicas e estruturais foram calculadas para os confôrmeros de menor energia. Após aplicação de HCA e PCA, as APCs foram divididas em 3 grupos, de acordo com suas características estruturais. Os resultados sugerem que a presença de grupos catiônicos volumosos, ou anéis como adamantila e ciclohexila, aumentam a hemólise de compostos de cadeia alquílica longa. Anéis macrocíclicos como ciclopentadecila parecem ser importantes para o potencial hemolítico de compostos com cadeia alquílica curta. Com relação a compostos sem anéis e de cadeia linear, grupos catiônicos menos volumosos parecem favorecer a hemólise. Na próxima etapa do estudo, 7 derivados de APC, com diferentes grupos catiônicos, foram selecionados e ancorados no domínio C2 da PKCα. O intuito foi mapear resíduos de aminoácidos importantes para a interação dos ligantes com a enzima, e comparar com o modo de ligação do ativador endógeno fosfatidilserina (PS). Mais uma vez, HCA e PCA foram aplicados para extrair informação relevante do mapeamento. Os resultados mostraram que as cadeias laterais de Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 e Thr250 não permitem a aproximação adequada do ligante, o que impede que a porção fosforila se coordene com um dos átomos de cálcio. A porção catiônica da PS, em contrapartida, consegue estabelecer ligação-hidrogênio com Asn189 de forma a posicionar os oxigênios da fosforila para interagir, ao mesmo tempo, com o átomo de cálcio. Com menos pontos de coordenação, a afinidade de ligação do cálcio pela PKCα diminui e a ativação da enzima fica comprometida, interrompendo toda a cascata de sinalização que depende dela. A parte final desse trabalho se dedicou ao estudo da interação da miltefosina com diferentes bicamadas lipídicas sob o ponto de vista termodinâmico. Oito bicamadas de diferentes fosfolipídios foram simuladas por DM e a interação energética da miltefosina foi calculada por Umbrella Sampling. Os resultados mostraram que a miltefosina apresenta maior partição em bicamadas contendo colesterol, sendo a miscibilidade nesses sistemas cerca de 76 vezes maior que os valores encontrados para bicamadas sem colesterol. Além disso, verificou-se que a internalização da miltefosina é mais fácil em regiões contendo lipídeos poli-insaturados, provavelmente devido ao empacotamento mais frouxo da bicamada. Os dados sugerem que a miltefosina age principalmente em rafts lipídicos e que células contendo mais lipídicos poli-insaturados podem incorporar maior quantidade do fármaco. / Alquilfosfocolines (APCs) comprise a class of drugs with antitumor activity derived from endogenous phospholipids. Differently from other drugs whose primary site of action is the DNA, APCs act firstly in the plasma membrane and signaling proteins, such as PKC. The main objective of this work is to elucidate, via computational approaches, the possible mechanisms of actions that cause hemolysis, PKC inhibition and interaction with cellular membranes. Initially, a set of 34 APCs was studied by means of Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Principal Component Analysis (PCA). The molecules were simulated by means of molecular dynamics simulations (MD) and molecular and structural properties were calculated for the lowest-energy conformer. After HCA and PCA methodologies, the set was divided into 3 groups according to their structural features. The findings suggest that the presence of bulky cationic moieties, or the adamantyl and cyclohexil rings, increase the hemolytic potential of compounds with long alkyl chains. Macrocyclic rings, such as cyclopentadecyl, seem to be important to elevate the hemolysis of compounds with short alkyl chains. Regarding linear carbon chain derivatives with no ring substitution, less bulky cationic head groups seem to favor hemolysis. In the next step of this work, 7 APC derivatives were selected and docked in the C2 domain of PKCα. The aim now was to map the residues relevant for ligands interaction compared to the binding mode of the endogenous activator, phosphatidylserine (PS). HCA and PCA were again applied in order to extract relevant information from the mapping. The results showed that the lateral chains of Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 and Thr250 do not allow the proper approximation of the ligands, impeding the phosphoryl moiety from coordinating with one of the calcium atoms. On the other hand, the cationic moiety of PS forms hydrogen-bonding with Asn189 in order to position the oxygens to interact, at the same time, with a calcium atom. With less coordination sites, calcium binding affinity diminishes and the enzyme activation is compromised, interrupting the signaling cascade. The final part of this work was dedicated to the study of miltefosine interaction with different lipid bilayers from the thermodynamics standpoint. Eight bilayers were simulated with MD and the energetic interaction was calculated via Umbrella Sampling simulations. The findings showed that miltefosine has higher partition in bilayers containing cholesterol, with miscibility of about 76 times higher than the values referring to bilayers without cholesterol. Moreover, it was observed that the internalization of miltefosine is facilitated in regions containing polyunsaturated lipids, probably due to the looser packing. The data suggest that miltefosine acts primarily in lipid rafts, and that cells containing more polyunsaturated lipids in their membranes can incorporate higher quantities of this drug.