A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e Gβl) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e Gβl nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 µM) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor Gβl), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and Gβl cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.

A má nutrição precoce gera efeitos deletérios graves no crescimento, no comportamento e nas capacidades cognitivas de ratos e crianças, sendo que a desnutrição proteica é a principal insuficiência nutricional que pode ser examinada individualmente em estudos experimentais. O objetivo deste estudo foi estabelecer discriminações condicionais em ratos, comparando-se animais controles com animais desnutridos e que passaram por recuperação nutricional, bem como testar três modificações no procedimento de Feliciano (2007). Como modificações foram empregadas um maior número de reversões da discriminação simples, antes do treino de discriminação condicional e os procedimentos de fading e correção de tentativas. No Experimento 1, foram testados o procedimento de fading e as reversões da discriminação. No Experimento 2, as reversões foram testadas junto com o procedimento de correção, mas não foram empregados animais previamente desnutridos. Por fim, no Experimento 3 os animais só passaram pela discriminação condicional e pela correção. Ao final das reversões os animais controles e desnutridos apresentaram a mesma velocidade de aprendizagem. Ao término da vigência do procedimento de fading não houve manutenção do desempenho característico da aprendizagem sem erros, indicando que o procedimento de fading utilizado não foi eficiente. A correção de tentativas facilitou a aprendizagem da discriminação simples e melhorou o desempenho dos animais. Não ocorreu curva de aprendizagem para a discriminação condicional nos três experimentos. Ainda assim, ao final do treino os animais submetidos ao procedimento de correção de tentativas apresentaram melhor desempenho do que os animais submetidos apenas ao fading, ou do que o dos animais não submetidos a qualquer dos procedimentos. Entre os fatores apontados como responsáveis pela não aprendizagem da discriminação condicional, destacam-se a programação da contingência, a disposição espacial aleatória dos estímulos de escolha e a existência de mais de duas alternativas para a resposta de escolha. / Early malnutrition leads to serious deleterious effects on growth, behavior and cognitive abilities of rats and children. Protein malnutrition is the main nutritional failure that can be examined individually in experimental studies. The aim of this study was to establish conditional discriminations in rats by comparing control animals with early malnourished animals which have received nutritional recovery and to test three changes in the procedure used by Feliciano (2007). As changes were employed a greater number of simple discrimination reversals, before the conditional discrimination training and the the procedures of fading correction. In experiment 1, we tested the procedure of fading and the discrimination reversals. In the experiment 2, the discrimination reversals were tested along with the correction procedure, but preveiously malnourished animals were not used. Finally, in experiment 3 the animals were tested only in the conditional discrimination with or without the correction procedure. At the end of reversals control and malnourished rats showed the same learning speed. At the end of the duration of the fading procedure the performance characteristics of learning without errors was not maintained, indicating that the fading procedure was not used efficiently. Correction facilitated the learning of simple discrimination and improved animal performance. There was no learning curve for the conditional discrimination in all experiments, yet at the end of training the performance of the animals subjected to correction procedure was better than the performance of rats subjected only to fading, or that of animals not submitted to any procedures. Among the factors that have prevented the learning of the conditional discrimination by the rats, we highlight the programmed contingency, the random spatial arrangement of the choice stimuli and the existence of more than two alternatives for the responses.

Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição protéica compromete órgãos linfo-hematopoéticos e modifica a resposta imune. Sabendo que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos hematopoéticos e que o microambiente medular apresenta distintos moduladores que atuam sinergicamente para influenciar a sobrevivência, proliferação e o desenvolvimento das células hematopoéticas em todos os seus níveis de diferenciação, avaliamos em um modelo de desnutrição, alguns aspectos da complexa regulação do microambiente medular avaliando a expressão de fatores de transcrição envolvidos no processo de diferenciação da Célula Tronco Mesenquimal (CTM) e capacidade de produção de citocinas importantes para o controle da hematopoese. Camundongos Balb/C machos, adultos, adaptados em gaioleiros metabólicos foram separados nos grupos controles e desnutridos recebendo, respectivamente, ração normoprotéica (12% de proteínas) e hipoprotéicas (2% de proteínas). Após o grupo desnutrido perder cerca de 20% do peso inicial, os animais foram sacrificados para a avaliação nutricional e hematológica caracterizando a desnutrição. As células mesenquimais foram isoladas da medula óssea (MO) e caracterizadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo mostrando populações de células em ambos os grupos com marcação positiva para CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, baixa marcação para CD34 e negativa para CD14, CD45. Na quantificação de fatores de transcrição por Western Blot verificou-se que células mesenquimais medulares de animais desnutridos apresentaram maior expressão de PPARγ e RUNX2, fato este que pode ser explicado, em parte, pelo remodelamento microambiental observado nesses animais. Sobrenadantes de células mesenquimais de animais desnutridos quantificados por Elisa apresentaram uma maior concentração de SCF e uma redução na concentração de G-CSF e GM-CSF. As alterações encontradas nos permitem concluir que a desnutrição compromete as células mesenquimais tanto no aspecto regulatório de fatores de transcrição, bem como na capacidade de produção de citocinas, contribuindo para o comprometimento do microambiente hematopoético e induzindo a falência medular comumente observada em situações de desnutrição protéica. / Data from literature and our group showed that protein malnutrition compromises lympho-hematopoietic organs and modifies the immune response. Knowing that malnourished animals show severe hypoplasia of hematopoietic organs and the bone marrow microenvironment has distinct modulators that act synergistically to influence survival, proliferation and development of hematopoietic cells in all levels of differentiation, we evaluated in a model of protein malnutrition, some aspects of the complex regulation of bone marrow microenvironment evaluating the expression of transcription factors involved in the differentiation of Mesenchymal Stem Cells, and the production capacity of cytokines which are important in the regulation of the hematopoiesis. BALB/c mice, males, adults adapted in metabolic cages were separated in two groups: control and malnourished groups receiving, respectively, normal protein diet (12% protein) and low protein (2% protein). After the malnourished group lost about 20% of initial weight, the animals were sacrificed and evaluated the nutrition status, as well as hematological parameters. Mesenchymal Stem Cells were isolated from bone marrow and immunophenotypically characterized by flow cytometry showing cells populations in both groups stained positive for CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, low marking for CD34 and negative for CD14, CD45. In the measurement of transcription factors by Western Blot found that Mesenchymal Cells of bone marrow malnourished animals showed higher expression of RUNX2 and PPARγ. This fact can be explained, in part, by microenvironmental remodeling observed in these animals. Mesenchymal stem cells supernatants of malnourished mice quantified by Elisa presented a higher concentration of SCF and a reduced concentration of G-CSF and GM-CSF. The alterations found in malnourished animals allow us to conclude that malnutrition commits Mesenchymal Stem Cells on the expression of transcription factors involved in the regulatory aspects of the differentiation process, as well as at the capacity of cytokine production, contributing to an impaired hematopoietic microenvironment and inducing the bone marrow failure commonly observed in protein malnutrition states.

Orientador: Jose Antonio Rocha Gontijo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:32:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Custodio_AugustoHenrique_M.pdf: 4527903 bytes, checksum: 4f67c2ab2501e1bba65a4d2cf2320dfe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A programação fetal é um processo fisiológico que assegura, durante o desenvolvimento intrauterino, a adaptação para o mundo exterior. Ou seja, o organismo é "moldável" por estímulos durante sua formação e dependendo do insulto experimentado, existe a possibilidade de mudanças estruturais e funcionais que podem predispor o indivíduo a doenças na vida adulta. O modelo de restrição proteica, assim como outros modelos, leva a um "stress" gestacional e, segundo a hipótese de Barker, programa a prole ao desenvolvimento de doenças na vida adulta, dentre elas a hipertensão arterial. Os rins são órgãos fundamentais na manutenção do equilíbrio hemodinâmico. Mudanças morfológicas e neuroendócrinas nos rins levam a alterações hidroeletrolíticas frequentemente associadas à patogênese da hipertensão arterial. A gênese desta doença ainda não está bem descrita, por envolver alterações multifatoriais, dentre elas, modificações da atividade neural tanto central quanto periférica, que podem ser um indicativo da elevação pressórica em nosso modelo. A atividade simpática renal é um importante modulador da excreção dos eletrólitos e, quando alterada, promove maior ou menor retenção de sais, principalmente o sódio, podendo contribuir para a elevação da volemia e consequentemente da hipertensão arterial. Diversos neuropeptídeos estão envolvidos na atividade simpática renal e os níveis destes são um importante marcador na gênese da hipertensão. Dentre esses peptídeos estão a Substância P (SP), seu receptor NK1R e o Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP). Nossos resultados mostraram redução na imunorreatividade de SP, CGRP e aumento do receptor 1 para neurocinina nos gânglios da raiz dorsal da prole de ratas submetidas à restrição proteica gestacional. Identificamos também a elevação dos níveis de CGRP na parede pélvica renal. Assim, acreditamos que haja alterações na neuromodulação da atividade aferente renal, o que pode ser um fator contribuinte para a manutenção do estado hipertensivo neste modelo experimental / Abstract: A fetal programming is a physiologic process that ensures an adaptation for external world during the intra uterine development. In this period, the organism is "moldable" by stimulus that happens during its formation, which ensures adequate phenotypes formation for different environments. Kidneys are the most important organs when it has to do with maintaining the organism hemodynamic balance and also morphological and neuroendocrine alterations, which leads to fluid and eletrolytes changes, frequently associated to arterial hypertension pathogenesis. The genesis of this disease is not well described yet. It involves multifactorial changes like the neural activity in both central as peripheral, which, in our model, may be an indicative of increased pressure. The renal sympathetic activity is an important excretion modulator of electrolytes and when amended, promotes greater or lesser retention of salts, mainly sodium, contributing to the increase in blood volume and consequently hypertension. Several neuropeptides are involved in renal sympathetic activity, and these levels are an important marker in the genesis of hypertension. Among these peptides we find substance P (SP) and its receptor NK1R, and Related Peptide Calcitonin Gene (CGRP). Our research showed reduced immunoreactivity of SP, CGRP and increased neurokinin 1 receptor in dorsal root ganglia among the offspring of rats subjected to gestational protein restriction. According to this result, we believe that there are changes in afferent renal activity neuromodulation which may be a contributing factor for maintenance of hypertension in this experimental model / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Ciências

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-11T12:25:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 23. Dissertação Kássya - BC.pdf: 2666703 bytes, checksum: e183097b30e295d682e56df2e85dd818 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T12:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 23. Dissertação Kássya - BC.pdf: 2666703 bytes, checksum: e183097b30e295d682e56df2e85dd818 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / FACEPE / Estudos buscam esclarecer a relação entre desnutrição proteica em fase crítica do desenvolvimento e surgimento de hipertensão arterial na vida adulta, entretanto os mecanismos que participam deste processo ainda não são totalmente conhecidos. Neste estudo investigamos as repercussões da desnutrição proteica perinatal (gestação e lactação) sobre o nível basal e o controle barorreflexo da atividade do sistema nervoso simpático da prole. Ratas prenhes foram alimentadas com dieta hipoproteica (8% de proteína, grupo experimental) ou com dieta normoproteica (17% de proteína, grupo controle) durante o período perinatal. Após o desmame, a prole de ratos machos recebeu dieta padrão para animais de laboratório e os estudos funcionais foram realizados aos 90 dias de vida. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética em utilização animal da UFPE (processo nº 23076.016256/2013-83). Para registro direto das variáveis hemodinâmicas e infusão das drogas, foram implantadas cânulas na artéria e veia femoral, respectivamente. Os níveis de atividade autonômica foram estimados através de métodos lineares e não lineares de análise da variabilidade da pressão sistólica e intervalo de pulso em animais conscientes e anestesiados, enquanto a eficiência do mecanismo barorreflexo em regular a pressão arterial foi avaliado através de métodos indiretos de sequência espontânea e de forma induzida mediante infusão de fenilefrina e nitroprussiato de sódio. Além disso, foi realizado implante de eletrodo bipolar na cadeia simpática em nível L3-L5 para registro direto da atividade elétrica do nervo lombar em animais anestesiados. Os resultados demonstram que ratos submetidos à desnutrição proteica perinatal apresentam desbalanço autonômico para o coração, com aumento do componente de baixa frequência no espectro da pressão sistólica e intervalo de pulso, aumento do índice simpatovagal para o coração e aumento dos padrões 0V, relacionados ao tônus simpático cardiovascular. Além disso, observamos a integridade do controle barrorreflexo da pressão arterial em todas as doses avaliadas, uma vez que os animais não anestesiados submetidos à restrição proteica apresentaram sensibilidade barorreflexa semelhante aos controles. Em condições de anestesia, o registro direto do nervo lombar em ratos desnutridos não foi diferente dos seus pares, demonstrando que o controle barorreflexo da atividade nervosa simpática lombar está preservado neste modelo experimental. Esses achados apontam que o desenvolvimento da hipertensão arterial na prole submetida à desnutrição proteica perinatal não está relacionada à disfunção do barorreflexo em animais conscientes e anestesiados. Sugerimos que outros mecanismos centrais e periféricos possam estar envolvidos no surgimento e manutenção dos níveis elevados de pressão arterial neste modelo experimental. / Studies seek to clarify the relationship between protein malnutrition in critical stage of development and emergence of hypertension in adulthood, however the mechanisms involved in this process are not yet fully known. We investigated the effects of perinatal protein malnutrition (pregnancy and lactation) on the baseline and the baroreflex control of the sympathetic nervous system activity on the offspring. Pregnant rats were fed a low protein diet (8% protein, experimental group) or normal protein diet (17% protein, control group) during the perinatal period. After weaning, the male offspring of rats received standard diet to laboratory animals and functional studies were performed at 90 days of life. All experimental protocols were approved by the Ethics Committee on Animal use of UFPE (process n° 23076.016256 / 2013-83). For the direct recording of hemodynamic variables and for the infusion of drugs, cannulas were implanted in the femoral artery and vein, respectively. The autonomic activity levels were estimated by linear and nonlinear methods of analysis of the variability of systolic and pulse interval in conscious and anesthetized animals. The efficiency of the baroreflex mechanism in regulating the blood pressure was evaluated by indirect methods of sequence and form spontaneously induced by phenylephrine and sodium nitroprusside infusion. We also performed bipolar electrode implantation in the sympathetic chain at L3-L5 level for direct recording of the electrical activity of the lumbar nerve in anesthetized animals. The results show that rats with perinatal protein malnutrition have autonomic imbalance to the heart, with increased low frequency component in the spectrum of systolic and pulse interval, increased sympathovagal index to the heart and increase the standards 0V, related to the tone cardiovascular friendly. In addition, we observe the integrity of baroreflex control of blood pressure in all evaluated doses, since unanesthetized animals submitted to protein restriction had baroreflex sensitivity similar to controls. In anesthesia conditions, the record of straight lumbar nerve in malnourished rats was not different from their peers, demonstrating that the baroreflex control of lumbar sympathetic nerve activity is preserved in this experimental model. These findings indicate that the development of hypertension in offspring submitted to perinatal protein malnutrition is not related to the baroreflex dysfunction in conscious and anesthetized animals. We suggest that other central and peripheral mechanisms may be involved in the emergence and maintenance of high levels of blood pressure in this experimental model.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-11T15:40:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 23. Dissertação Kássya - BC.pdf: 2666703 bytes, checksum: e183097b30e295d682e56df2e85dd818 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T15:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 23. Dissertação Kássya - BC.pdf: 2666703 bytes, checksum: e183097b30e295d682e56df2e85dd818 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / FACEPE / Estudos buscam esclarecer a relação entre desnutrição proteica em fase crítica do desenvolvimento e surgimento de hipertensão arterial na vida adulta, entretanto os mecanismos que participam deste processo ainda não são totalmente conhecidos. Neste estudo investigamos as repercussões da desnutrição proteica perinatal (gestação e lactação) sobre o nível basal e o controle barorreflexo da atividade do sistema nervoso simpático da prole. Ratas prenhes foram alimentadas com dieta hipoproteica (8% de proteína, grupo experimental) ou com dieta normoproteica (17% de proteína, grupo controle) durante o período perinatal. Após o desmame, a prole de ratos machos recebeu dieta padrão para animais de laboratório e os estudos funcionais foram realizados aos 90 dias de vida. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética em utilização animal da UFPE (processo nº 23076.016256/2013-83). Para registro direto das variáveis hemodinâmicas e infusão das drogas, foram implantadas cânulas na artéria e veia femoral, respectivamente. Os níveis de atividade autonômica foram estimados através de métodos lineares e não lineares de análise da variabilidade da pressão sistólica e intervalo de pulso em animais conscientes e anestesiados, enquanto a eficiência do mecanismo barorreflexo em regular a pressão arterial foi avaliado através de métodos indiretos de sequência espontânea e de forma induzida mediante infusão de fenilefrina e nitroprussiato de sódio. Além disso, foi realizado implante de eletrodo bipolar na cadeia simpática em nível L3-L5 para registro direto da atividade elétrica do nervo lombar em animais anestesiados. Os resultados demonstram que ratos submetidos à desnutrição proteica perinatal apresentam desbalanço autonômico para o coração, com aumento do componente de baixa frequência no espectro da pressão sistólica e intervalo de pulso, aumento do índice simpatovagal para o coração e aumento dos padrões 0V, relacionados ao tônus simpático cardiovascular. Além disso, observamos a integridade do controle barrorreflexo da pressão arterial em todas as doses avaliadas, uma vez que os animais não anestesiados submetidos à restrição proteica apresentaram sensibilidade barorreflexa semelhante aos controles. Em condições de anestesia, o registro direto do nervo lombar em ratos desnutridos não foi diferente dos seus pares, demonstrando que o controle barorreflexo da atividade nervosa simpática lombar está preservado neste modelo experimental. Esses achados apontam que o desenvolvimento da hipertensão arterial na prole submetida à desnutrição proteica perinatal não está relacionada à disfunção do barorreflexo em animais conscientes e anestesiados. Sugerimos que outros mecanismos centrais e periféricos possam estar envolvidos no surgimento e manutenção dos níveis elevados de pressão arterial neste modelo experimental. / Studies seek to clarify the relationship between protein malnutrition in critical stage of development and emergence of hypertension in adulthood, however the mechanisms involved in this process are not yet fully known. We investigated the effects of perinatal protein malnutrition (pregnancy and lactation) on the baseline and the baroreflex control of the sympathetic nervous system activity on the offspring. Pregnant rats were fed a low protein diet (8% protein, experimental group) or normal protein diet (17% protein, control group) during the perinatal period. After weaning, the male offspring of rats received standard diet to laboratory animals and functional studies were performed at 90 days of life. All experimental protocols were approved by the Ethics Committee on Animal use of UFPE (process n° 23076.016256 / 2013-83). For the direct recording of hemodynamic variables and for the infusion of drugs, cannulas were implanted in the femoral artery and vein, respectively. The autonomic activity levels were estimated by linear and nonlinear methods of analysis of the variability of systolic and pulse interval in conscious and anesthetized animals. The efficiency of the baroreflex mechanism in regulating the blood pressure was evaluated by indirect methods of sequence and form spontaneously induced by phenylephrine and sodium nitroprusside infusion. We also performed bipolar electrode implantation in the sympathetic chain at L3-L5 level for direct recording of the electrical activity of the lumbar nerve in anesthetized animals. The results show that rats with perinatal protein malnutrition have autonomic imbalance to the heart, with increased low frequency component in the spectrum of systolic and pulse interval, increased sympathovagal index to the heart and increase the standards 0V, related to the tone cardiovascular friendly. In addition, we observe the integrity of baroreflex control of blood pressure in all evaluated doses, since unanesthetized animals submitted to protein restriction had baroreflex sensitivity similar to controls. In anesthesia conditions, the record of straight lumbar nerve in malnourished rats was not different from their peers, demonstrating that the baroreflex control of lumbar sympathetic nerve activity is preserved in this experimental model. These findings indicate that the development of hypertension in offspring submitted to perinatal protein malnutrition is not related to the baroreflex dysfunction in conscious and anesthetized animals. We suggest that other central and peripheral mechanisms may be involved in the emergence and maintenance of high levels of blood pressure in this experimental model.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T14:05:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_AndersonFelipe_Versão Final.pdf: 4770513 bytes, checksum: bd8c869ddc087cfbf7bc953f303cf9e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T14:05:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_AndersonFelipe_Versão Final.pdf: 4770513 bytes, checksum: bd8c869ddc087cfbf7bc953f303cf9e5 (MD5) Previous issue date: 2015-08-21 / A desnutrição durante o período perinatal tem sido associada a aumento da compulsão alimentar, preferência por alimentos palatáveis e risco de desenvolvimento de obesidade na vida adulta. O apetite é controlado por vários sistemas fisiológicos, dentre os quais o sistema neural de recompensa. A dopamina é um conhecido neurotransmissor deste sistema, estando envolvida nas relações de prazer proporcionado por alimentos e drogas, agindo através da ligação em receptores neuronais, de duas classes: D1-like e D2-like. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão dos receptores dopaminérgicos D1 no Núcleo Accumbens e estriado, áreas relacionadas ao comportamento alimentar, em ratas desnutridas. Dois grupos experimentais foram formados: grupo-controle (CF - fêmeas gestadas por mães normonutridas durante a gestação e lactação) e grupo-desnutrido (DF - fêmeas gestadas por mães que receberam dieta hipoprotéíca no período perinatal). Os animais passaram a receber dieta-padrão de laboratório após o desmame e tiveram o peso avaliado em diferentes momentos da vida. No 120º dia, foram sacrificadas e submetidas à perfusão, para retirada dos encéfalos. Após os cortes dos cérebros em micrótomo de congelamento, procedeu-se a Imunohistoquímica para contagem de neurônios marcados para DRD1. As imagens foram obtidas através de câmera acoplada ao microscópio óptico e a morfometria realizada no software livre ImageJ. Os dados estatísticos foram expressos em média±desvio-padrão, sendo analisados no software livre GraphPad Prism 5. Os animais desnutridos apresentaram menor peso em relação aos normonutridos desde o nascimento até o sacrifício. Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos na expressão de DRD1 nas áreas cerebrais analisadas (Estriado: CF: 230,0 ± 86,40, n=4; DF: 225,50 ± 89,90, n=4; Núcleo Accumbens: CF: 109,80 ± 41,40, n=4; DF: 128,0 ± 49,50, n=5; test t de Student, p<0,05). Estes dados sugerem que a expressão dos receptores D1 está diretamente relacionada à quantidade de dopamina liberada na fenda sináptica, quantidade essa que é maior na apresentação de alimentos novos e palatáveis. / Malnutrition during the perinatal period has been linked to increased binge eating, preference for palatable foods and risk of obesity developing in adulthood. Appetite is controlled by several physiological systems, including the neural reward system. Dopamine is a neurotransmitter in this system and it is involved in relations of pleasure provided by foods and drugs, acting through its binding to neuronal receptors of two classes: D1-like and D2-like. The goal of this study was to evaluate the expression of dopamine D1 receptors in the striatum and Nucleus Accumbens, areas related to feeding behavior, in malnourished rats. Two experimental groups were formed: the control group (CF - rats coming from normonutridas mothers during pregnancy and lactation) and group-malnourished (DF - coming rats of mothers who received low protein diet during the perinatal period). The animals began to receive standard laboratory diet after weaning and had the weight assessed at different times of life. In 120 days, they were sacrificed and submitted to perfusion, to remove the brains. After the cuts of the brains in freezing microtome, it proceeded to Immunohistochemistry for counting neurons marked for DRD1. The images were obtained through camera coupled to an optical microscope and morphometry performed on the Free Software ImageJ. Statistical data were expressed as mean ± standard deviation and analyzed the free software GraphPad Prism 5. Malnourished animals showed lower weight compared to well-nourished from birth to the sacrifice. There was no significant difference between groups in the expression of DRD1 the analyzed brain areas (Striatum: CF: 230.0 ± 86.40, n = 4; DF: 225.50 ± 89.90, n = 4; Nucleus Accumbens: CF: 109.80 ± 41.40, n = 4; DF: 128.0 ± 49.50, n = 5; Student's t test, p <0.05). These data suggest that the expression of D1 receptors is directly related to the amount of dopamine released in the synaptic cleft, which amount is higher in presenting new and palatable food.

Protein malnutrition (PM) causes anemia and leukopenia by reduction of hematopoietic precursors and impaired production of mediators that induce hematopoiesis, as well as structural and ultrastructural changes in the bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in the bone marrow (BM) in distinct regions called niches, which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of the hematopoietic stem cell (HSC). The perivascular niche, composed mainly by mesenchymal stem cells (MSC) and endothelial cells (EC), is the major modulator of HSC and its function extends to the migration of mature hematopoietic cells into the peripheral blood through the production of cytokines and growth factors. Thus, our hypothesis is that PM changes the perivascular niche and our objective is to evaluate whether PM affects the modulatory capacity of MSC and EC on hematopoiesis. C57BL/6 male mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PM. We performed leukemic myelo-monoblasts cells transplantation and observed that these cells have a lower proliferation rate and are rather in the cell cycle G0/G1 phases in malnourished mice, indicating that the BM microenvironment is compromised in PM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC cells, which were evidenced by CD31 and CD144 markers. We performed the quantification of HSC and hematopoietic progenitors, as well as some regulators of proliferation and differentiation, ex vivo and after cultures with MSC or EC. We observed that PM reduces HSC and hematopoietic progenitors ex vivo. In PM, MSC promote increase in HSC and suppress hematopoietic differentiation, whereas ECs induce cell cycle arrest. Additionally, we verified that PM affects granulopoesis by decreasing the expression of G-CSFr in granule-monocytic progenitors. Thus, we conclude that PD compromises hematopoiesis due to intrinsic alterations in HSC, as well as alterations in the medullary perivascular niche. / A desnutrição proteica (DP) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese. A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões distintas chamadas de nichos, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto renovação da célula tronco hematopoiética (CTH). O microambiente perivascular, composto principalmente por células tronco mesenquimais (CTM) e células endoteliais (CE), é o principal modulador das CTH e sua função se estende até a migração das células hematopoiéticas maduras para o sangue periférico, através da produção de citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, nossa hipótese é que a DP altera o microambiente perivascular e objetivamos avaliar se a DP afeta a capacidade modulatória das CTM e CE sobre a hematopoese. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoproteica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoproteica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DP. Realizamos transplantes de mielomonoblastos leucêmicos e observamos que estas células apresentam menor taxa de proliferação e se encontram em maior quantidade nas fases G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos, indicando que o microambiente medular está comprometido. Isolamos CTM, que foram caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE, o que foi evidenciado pelos marcadores CD31 e CD144. Quantificamos CTH e progenitores hematopoéticos, bem como reguladores de proliferação e diferenciação, ex vivo e após culturas com CTM ou CE. Observamos que a DP reduz CTH e progenitores hematopoéticos ex vivo. Na DP, as CTM promovem incremento de CTH e suprimem a diferenciação hematopoética, enquanto que as CE induzem parada no ciclo celular. Adicionalmente, observamos que a DP afeta a granulopoese por diminuição da expressão de G-CSFr nos progenitores grânulo-monocíticos. Dessa forma, concluímos que a DP compromete a hematopoese por alterações intrínsecas na CTH, como também por alterações ocasionadas no microambiente perivascular medular.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-12-01T13:27:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese corrigida Maria Cláudia 14.06.16.pdf: 1888975 bytes, checksum: 2dcb6ce91bd1b2bfc5c62b2744882c91 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T13:27:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese corrigida Maria Cláudia 14.06.16.pdf: 1888975 bytes, checksum: 2dcb6ce91bd1b2bfc5c62b2744882c91 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / CAPES / CNPQ / Durante o período perinatal, caracterizado por elevada plasticidade, a carência de proteínas é capaz de induzir adaptações morfológicas e funcionais nos tecidos, visando garantir a sobrevivência do indivíduo no ambiente atual e predito. Contudo, quando o ambiente posterior não é o mesmo para o qual o organismo foi adaptado, eleva-se o risco de aparecimento de doenças crônicas não transmissíveis. A ingestão excessiva de alimentos ricos em energia, gorduras e carboidratos simples ao longo da vida aumenta o risco de desenvolvimento de excesso de peso e doenças metabólicas e, quando está associada à desnutrição no início da vida, podem ocorrer alterações na trajetória de crescimento, no consumo alimentar, em parâmetros bioquímicos e na função imune. Este estudo objetivou avaliar os efeitos de uma dieta hiperlipídica pós-desmame sobre o crescimento somático, o consumo alimentar, parâmetros bioquímicos e a função de macrófagos peritoneais de ratos submetidos a uma dieta hipoproteica perinatal. Foram utilizados 52 ratos machos Wistar cujas mães receberam dieta normoproteica ou hipoproteica durante a gestação e lactação. Do desmame aos 60 dias, os filhotes receberam dieta padrão ou dieta hiperlipídica. Formaram-se 4 grupos experimentais (n=10-14/ cada): Controle (C, ratos que receberam dieta normoproteica na gestação e lactação e padrão pós-desmame), Desnutrido (LP, ratos que receberam dieta hipoproteica na gestação e lactação e padrão pós-desmame), Hiperlipídico (HF, ratos que receberam dieta normoproteica na gestação e lactação e hiperlipídica pós-desmame) e Desnutrido-Hiperlipídico (LP-HF, ratos que receberam dieta hipoproteica na gestação e lactação e hiperlipídica pós-desmame). Avaliou-se o crescimento somático [peso corporal (PC), comprimento da cauda, comprimento naso-anal] ao longo da vida e o consumo alimentar (ingestão alimentar relativa, ingestão energética relativa e coeficiente de eficácia alimentar) de 30 a 36 dias e de 54 a 60 dias de vida. Aos 60 dias, os ratos foram sacrificados e realizou-se coleta de sangue para avaliação sérica de triglicerídeo, colesterol, glicose e leptina, retirada de órgãos e do tecido adiposo epididimal e retroperitoneal para avaliação do peso relativo e de macrófagos peritoneais para avaliação de fagocitose e produção de óxido nítrico (NO) in vitro. Filhotes LP tiveram menor PC, comprimento da cauda e comprimento naso-anal do que filhotes C. Aos 60 dias, filhotes LP-HF não diferiram quando comparados aos C, exceto pelo reduzido comprimento naso-anal. De 57 a 60 dias, filhotes LP-HF apresentaram menor ingestão alimentar e energética relativa comparados aos LP, mas o coeficiente de eficácia alimentar foi maior comparado aos LP e C. Filhotes HF e LP-HF apresentaram maior peso relativo da gordura epididimal e retroperitoneal do que filhotes C e LP. Quanto aos parâmetros bioquímicos, filhotes LP apresentaram menor colesterol total do que os C, porém filhotes LP-HF tiveram maior colesterol total do que os LP. Fagocitose e produção de NO aumentaram nos filhotes LP. Diante de um desafio imunológico, a produção de NO por macrófagos aumentou quando comparada ao estado basal, exceto no grupo LP. Estes resultados sugerem que a dieta hiperlipídica pode modular os efeitos da desnutrição perinatal, elevando o risco de doenças metabólicas. / The perinatal period is characterized by high plasticity and the lack of protein is able to induce morphological and functional adaptations in the tissues in order to ensure the survival of the individual in the current and predicted environment. However, when the latter environment is not the same to which the organism has adapted to, it increases the risk of developing chronic diseases. Excessive consumption of foods with high levels of energy, fat, simple carbohydrates and low dietary fiber increases the risk of developing overweight and metabolic diseases. When associated with malnutrition early in life, there might be changes on the trajectory of growth, food intake, biochemical parameters and immune function. This study aimed to evaluate the effects of post-weaning high fat diet on somatic growth, food intake, biochemical parameters and peritoneal macrophages function in rats submitted to maternal low protein diet. Fifty-two Wistar rats whose mothers received normal protein or low protein diet during pregnancy and lactation were used. From weaning to 60 days old, pups received a standard diet or a high fat diet. They formed 4 experimental groups (n = 10-14 / each): control (C, rats fed with normal protein diet during pregnancy and lactation and post-weaning standard chow), Low protein (LP, rats fed with low protein diet during pregnancy and lactation and post-weaning standard chow), High fat (HF, rats fed with normal protein diet during pregnancy and lactation and post-weaning high fat diet) and Low protein-High fat (LP-HF, rats fed with low protein diet during pregnancy and lactation, and post-weaning high fat diet). It was evaluated the somatic growth [body weight (BW), tail length, body length] life time and food intake (relative food intake, relative energy intake, and feed conversion) from 30 to 36 days old and from 54 from 60 days old. At 60 days, pups were sacrificed and blood collection was performed to assess the serum profile of lipids, glucose and leptin. Organs and retroperitoneal and epididymal adipose tissues were collected and weighted to evaluate the relative weight. Peritoneal macrophages of rats were collected to evaluate phagocytosis and nitric oxide (NO) production in vitro. LP pups had a lower BW, tail length and body length than C pups. At 60 days old, LP-HF pups did not differ when compared to C pups, except by the reduced body length. From 57 to 60, LP-HF pups presented lower relative food intake and relative energy intake compared to LP pups, but feed conversion was higher than C and LP. HF and LP-HF pups had higher relative weight of epididymal and retroperitoneal fat than C and LP pups. Regarding the biochemical profile, LP pups had lower total cholesterol than C, but LP-HF pups had higher total cholesterol than the LP. Phagocytosis and NO production increased in LP pups. Dealing with an immune challenge, NO production by macrophages increased when compared to baseline, except in the LP group. These results suggest that a high fat diet is capable of modulate the effects of perinatal malnutrition, increasing the risk of metabolic diseases.

Orientadores: José Antônio Rocha Gontijo, Flávia Fernandes Mesquita / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:43:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canale_Vinicius_M.pdf: 2382904 bytes, checksum: bf0d6a9b4243b86411026cd098372cc8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Já está bem documentado que a dieta hipoproteica em ratos durante a gestação produz efeitos no crescimento fetal, uma persistente elevação na pressão arterial e disfunções no desenvolvimento renal da prole. Alterações na pressão arterial parecem estar relacionadas à acentuada redução no número de nefros que acaba por causar um quadro de hipertrofia e hiperfluxo nos nefros remanescentes como adaptação para equilibrar a taxa de filtração, no entanto, os mecanismos utilizados para esta adaptação culminam com o surgimento de albuminúria. Este processo acaba por causar esclerose glomerular culminando em um ciclo, comprometendo cada vez mais os nefros remanescentes. O desenvolvimento deste quadro pode levar à síndrome nefrótica e posteriormente à doença renal terminal. Acredita-se que o principal fator atuante na programação fetal neste modelo é devido à exposição exacerbada do feto aos glicocorticoides materno, o que acaba por comprometer a correto desenvolvimento e diferenciação de tecidos e órgãos, e na expressão ou atividade de uma série de receptores e enzimas. Recentemente, tem surgido a hipótese de que a atividade da mTORC poderia estar envolvida no surgimento de doenças na idade adulta neste modelo experimental. Este trabalho teve por objetivo avaliar se a inibição da mTORC através do tratamento com rapamicina em animais programados poderia ser benéfico, inibindo o surgimento de complicações relacionadas com a estrutura glomerular e como seria seu efeitos sistêmico, sobre a função renal e pressão arterial sistêmica. Ratos Wistar receberam ração com baixa proteína (6% LP) e dieta controle (17% NP) durante o período gestacional. A prole de machos foi tratada com rapamicina diluída em DMSO (5%) e administrada via intraperitoneal na dose de 1mg/kg, 3 vezes por semana, a partir da 4ª semana de vida até a 12ª semana. A aferição da pressão arterial sistólica foi realizada nas idades 8, 12 e 16. Foi observado que nos grupos que receberam rapamicina, a pressão artéria sistólica elevou-se consideravelmente em todas as idades. A avaliação da função renal foi realizada através de clearance de creatinina e lítio nas mesmas idades e observamos que durante todo o tratamento, o grupo NP que recebeu rapamicina excretou mais sódio, na porção pós-proximal do túbulo. Além disso, não houve diferença na taxa da filtração glomerular em nenhuma das idades. Quando a proteinúria foi avaliada, observamos que o grupo programado LP sem rapamicina, apresentou evolução com o passar das semanas sendo significativamente maior a partir das 12ª e 16ª semanas, no entanto, os grupos que receberam rapamicina, não apresentaram a mesma evolução, indicando preservação da estrutura glomerular. Os presentes resultados demonstram que apesar de a rapamicina ter elevado a pressão arterial em ambos os grupos, há uma indicação de que os animais programados tem um controle menos eficaz no controle da pressão arterial através da função renal. Mesmo diante da pressão elevada, a rapamicina foi capaz de inibir injúrias à barreira de filtração / Abstract: It is well established that a low protein diet in rats during pregnancy causes effects on fetal growth, a persistent elevation in blood pressure and renal dysfunction in the offspring at a later age. Alterations in blood pressure seem to be related to the marked reduction in the number of nephrons which ultimately causes an overflow and hypertrophy in the remaining nephrons in the attempt to adapt its balance on the filtration rate. However, the mechanisms used for this adaptation results in the appearance of albuminuria. This process might cause glomerular sclerosis culminating in a cycle, increasing the damage to the remaining nephrons. The development of this framework can lead to nephrotic syndrome and subsequently to ESRD. It is believed that the main factor in the fetal programming model is the fetus overexposure to maternal glucocorticoids, which ultimately compromises the proper development and differentiation of tissues and organs. Additionally, the expression and the activity of a number of receptors and enzymes is also affected. Recently, in this experimental model, there has arisen the hypothesis that the activity of mTORC could be involved in the onset of disease in adulthood. This study assess whether the inhibition of mTORC, through the treatment with rapamycin in programmed animals, could be beneficial by inhibiting the onset complications related to glomerular structure and its affect on renal function and blood pressure. Wistar female rats were fed with low protein (6 % LP) or control diet (17 % NP) during pregnancy. The male offspring were treated with rapamycin diluted in DMSO (5 %) and administered intraperitoneally at a dose of 1mg/kg, 3 times per week, from the 4th week of life until the 12th week. The measurement of systolic blood pressure was measured at 8, 12, and 16 weeks old. We noticed that in the groups treated with rapamycin the arterial systolic pressure rose considerably in all ages. The assessment of renal function was performed by creatinine clearance and lithium at the same ages as the blood pressures assessment. The NPR group that received rapamycin had an increase in sodium excretion at the post- proximal tubule during the whole treatment. Additionally, there was no difference in the rate of glomerular filtration rate at any age among the groups. When proteinuria was assessed, we found that the programmed Group LP without rapamycin, showed an increase along the weeks and as expected, the groups that have received rapamycin did not show the same trend, indicating preservation in the glomerular structure. The present results demonstrate that rapamycin caused increase in the blood pressure in both groups however, it was able still to inhibit the injury into the filtration barrier. Additionally, there is an indication that the programmed animals, has a less effective control in the blood pressure and the excretion of sodium, even when the treatment is interrupted / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências