Orientador : Jose Tadeu Jorge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-16T19:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiroz_MarleneRitade_M.pdf: 2559382 bytes, checksum: 0a998b2ad54b7e734eb99614900b2d09 (MD5) Previous issue date: 1985 / Mestrado / Mestre em Engenharia Agrícola

Orientador: Chin Shu Chen / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-17T06:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReyesHerrera_SantiagoJaime_M.pdf: 3969405 bytes, checksum: 843b03dc0cfb6a204a960164321a6a25 (MD5) Previous issue date: 1976 / Resumo: O presente estudo tem como objetivo o desenvolvimento de um processo de recuperação das proteínas do plasma sanguíneo de frangos, visando a obtenção de um concentrado protéico para utilização na alimentação humana. O processo compreende, fundamentalmente, as seguintes operações: coleta, centrifugação, concentração e secagem. Para cada uma destas etapas, estudaram-se os efeitos das operações e suas variáveis mais importantes, em função da qualidade, características e propriedades do produto final, com a finalidade de se estabelecer as condições ótimas de processamento. Na primeira etapa do processo, foi utilizada solução de citrato de sódio como anticoagulante, na concentração final de 0,5%. O sangue, coletado durante a sangria dos animais, foi misturado, de forma contínua, com o anticoagulante, obtendo-se o sangue líquido. Dentro das primeiras 3 horas, após a coleta, o sangue líquido foi centrifugado para se separar a massa celular do plasma. Na centrifugação do sangue, utilizou-se uma centrífuga contínua de câmara e disco, determinando-se para este equipamento, a posição da interfase de separação plasma/massa celular. Foram estudados, também, alguns dos fatores que influenciam na sedimentação, tais como: densidade, diâmetro da partícula, viscosidade e temperatura. Como parâmetros de operação estudados na centrifugação, incluiram-se: vazão de alimentação e força-rotacional. Resultando que, para o equipamento utilizado, com valores de força rotacional maiores do que 4000 x G e vazão de alimentação menor do que 150 kg/h, obtém-se plasma puro, com um rendimento de recuperação de aproximadamente 82%. A concentração do plasma foi realizada, para efeito de comparação, através de duas operações unitárias diferentes (evaporação a vácuo e osmose inversa). Na evaporação a vácuo, utilizou-se o evaporador "Centri-Therm", concentrando o plasma ate 25% de sólidos, funcionando a uma temperatura de evaporação de 45°C. As proteínas do plasma concentrado por esta operação apresentaram uma porcentagem de desnaturação de aproximadamente 7%. Pelas equações desenvolvidas para a determinação dos efeitos da concentração sobre as propriedades físicas e químicas do plasma, verificou-se que: proteína, cinzas, índice de refração e densidade apresentam-se como uma função linear de concentração, enquanto que a viscosidade, como uma função logarítmica. Na osmose inversa, estudaram-se os efeitos da pressão, da vazão de alimentação e da concentração no fluxo do permeado, observando-se que este aumenta com a vazão e a pressão até um ponto no qual tende a ser independente devido aos efeitos de polarização por concentração. Encontrou-se que o fluxo do permeado é inversamente proporcional ao logaritmo da concentração, obtendo-se uma concentração máxima de 18% de sólidos. A membrana apresentou parcial permeabilidade nos sais enquanto que, às proteínas, apresentou rejeição total. Na secagem, amostras de plasma sem concentrar e plasma concentrado por evaporação e por osmose inversa, foram levados ao secador "spray", utilizando-se condições similares durante a secagem dos diferentes lotes. Nesta operação, verificou-se que a solubilidade das proteínas diminui ã medida em que aumenta a temperatura de secagem. Verificou-se também, que a porcentagem de desnaturação térmica das proteínas do plasma e mais uma função da temperatura que do tempo , e que a temperatura máxima que se pode utilizar, na saída do ar do secador, para que não ocorra a desnaturação durante a secagem, é de 58ºC. As análises referentes a porcentagens de proteína, sua desnaturação e solubilidade, cinzas e densidade aparente mostraram que os melhores resultados são obtidos utilizando-se o plasma pré-concentrado por osmose inversa. O processo foi desenvolvido em escala piloto, utilizando-se cerca de 1.200 kg de sangue de frango. Os resultados encontrados nas diferentes experiências realizadas em cada etapa poderão, certamente, ser utilizados visando à sua aplicação em escala industrial, não somente para o aproveitamento do sangue de frango como também do sangue de outros animais. O aproveitamento deste subproduto, caracterizado pela sua riqueza proteica, seria uma contribuição para a resolução do grave problema de sub-alimentação popular / Abstract: The objetive of the present study was to develop a process for the recovery of proteins from chiken blood plasma in the form of a protein concentrate amenable to human consumption. The process includes four basic operations: collection, centrifugation, concentration and drying. Optimization of the conditions for the over-all process was done by studying the effects of the most important parameters on the characteristics of the final product at each stage. For the first stage of the process, blood collected from bleeding animals was continuously mixed with a sodium citrate solution (0,5 % final concentration) in order to prevent coagulation. The blood was separated into plasma and red blood cell fractions by centrifugation within three hours of collection. This operation was accomplished in a continuous disk-bowl separator. The plasma/cellular mass interface position was determined for this equipment. Some of the factors influencing the sedimentation, such as: particle diameter, density, viscosity and temperature, were also studied. Feed rate and centrifugal force were the two parameters studied in this operation. Pure plasma was obtained (about 82% recovery) utilizing centrifugal forces greater than 4000 x g, and a feed rate lower than 150 kg/h. Plasma concentration was accomplished by two different methods: vacuum evaporation and reverse osmosis. A centrifugal film evaporator ("Centri-Therm") was used to concentrate up to 2 5% solids and operated at 45ºC. The resulting plasma proteins showed about 7 % denaturation. A linear relationship between the concentration of plasma and the physical-chemical properties of protein, ash, index of refraction and density was found. The viscosity showed a logarithmic dependence on the concentration. Results by membrane concentration showed that increases in the feed flow rates and applied pressures could result in a higher permeate flux which was leveled off as a result of a concentration-polarization effect. The permeate flux was related to the plasma concentration by a logarithmic function. The maximum concentration obtained was 18% solids. While the membrane was partially permeable to the plasma salts, plasma proteins were completely retained. The products obtained by the two methods of concentration were dehydrated by spray drying under similar conditions. Drying at elevated temperature resulted in a loss of protein solubility. It was also found that the increase in per-cent heat protein denaturation was dependent more upon temperature than the time of heating. The maximum outlet air temperature that did not produce denaturation was 58°C. The results of physical-chemical analysis indicated that better product was obtained by reverse osmosis concentration / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador : Valdemiro C. Sgarbieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T12:22:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Togashi_Marie_M.pdf: 4208589 bytes, checksum: f990c78869ca56efc5f86c21faa07ab7 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O baru, uma leguminosa arbórea do cerrado (Leguminosae Faboideae), espécie Dipteryx alata, Vog., é uma planta nativa da região. Seus frutos são drupáceos, sendo que a polpa é consumida pelo gado e a semente é consumida pela população local, na forma crua ou torrada. Este trabalho foi motivado pela importância de se procurar novas fontes proteicas alternativas na alimentação e de se incentivar a preservação de espécies nativas do cerrado através da sua valorização, contribuindo ainda indiretamente para a complementação da renda familiar da população local, através da comercialização dos frutos. Teve como objetivos a caracterização química e dos fatores antinutricionais da semente (crua e torrada) e da polpa, a determinação do valor nutricional da proteína da semente (crua e torrada), a caracterização quimica e nutricional do óleo extraído da semente e a avaliação da aceitação da semente de baru torrada por consumidores. Nos resultados obtidos, destacam-se, na semente, os teores de proteína, 29,59"/., e lipídios, 40,27*/., possuindo ainda um teor médio de fibra alimentar, 19,04%. Já na polpa destacara-se o elevado teor de fibra alimentar, 28,20%, na forma, principalmente, de fibra insolúvel, e o teor de açúcares totais, 20,45%. Em relação aos índices de avaliação da qualidade proteica in vivo, a digestibilidade da proteína da semente de baru crua. 72,53%, foi superior à da semente de baru torrada, 66,35% (p 0,05), mas o valor biológico para proteína de semente de baru crua e torrada não diferiram, bem como a utilização líquida aparente da proteína. 0 óleo de baru aumentou significativamente o balanço de nitrogênio da caseína (319,26 para 339,2?.mgN/24h). Entretanto, não houve diferença significativa entre digestibilidade, valor biológico e utilização líquida aparente da proteína para caseína com óleo de soja e caseína com óleo de baru. Não houve diferença estatística entre o PER corrigido para a semente crua de baru, 1,28, e a torrada, 1,19. 0 mesmo resultado foi obtido para caseína com óíeo de soja, 2,50, e caseína com óleo de baru, 2,37. A razão PER baru/PER caseína tanto para a semente de baru crua, como para a torrada foi, aproximadamente, de 50%. Considerando-se os índices de avaliação da qualidade proteica in vJíro, tanto a proteína das sementes crua e torrada como a da polpa apresentaram escores químicos baixos (29,60%, 33,60% e 16,40%, respectivamente) onde os aminoácidos sulfurados foram os primeiros limitantes. Na digestibilidade in vitro, não houve diferença significativa entre as sementes crua, 68,43%, e torrada, 67,69%, sendo que o maior valor obtido foi para a caseína, 98,93% (proteína de referência utilizada no ensaio in vivo). A digestibilidade da proteína da polpa também foi baixa (20,32%) devido, provavelmente, ao teor elevado de taninos e fibras. A semente de baru crua apresenta teor baixo de ácido fítico e inibidor de tripsina; ao submetê-la ao tratamento térmico, esses teores se tornam insignificantes. Não foram detectados atividade hemaglutinante e taninos na semente. A polpa apresentou um teor elevado de taninos provavelmente devido a seu estádio de maturação. O óleo de baru é uma boa fonte de ácidos graxos polHnsaturados (cerca de 80% do total), possui elevado teor de ácido oleico e linoléico, sendo comparável ao óleo de amendoim. Apresenta índices de saponifiçáveis, 190,13mgK0H/g, e iodo, 91, SSmgl/lOOg, coerentes com sua composição em ácidos graxos. Possui ainda 13,62 mg/lOOg de vitamina E, comparáveis aos teores encontrados nos óleos de amendoim, oliva, milho e soja. A semente de baru teve boa aceitação no teste de preferência pelo seu sabor suave e adocicado, sendo prejudicado pela sua textura dura / Abstract: Baru, an arboreous legume (Leguminosae Faboideae), species Dlpteryx alata, Vog., is a native plant of Cerrado's region. Its fruits are drupaceous, the flesh is consumed by cows in pastures of the region and the seed is consumed by the local population, in the raw or roasted forms. The motivation for this work born from the necessity of seaking for new alternative protein sources as human foods and incentivating the preservation of native species from Cerrado's vegetation through its increased value, at the same time contributing to the local family income through the commercialization of these fruits. The aims of this work were to determine the chemical composition and the characterization of the antlnutritional factors of the seed (raw and roasted] and the flesh; the determination of the nutritional value of the seed protein (raw and roasted); the nutritional and chemical characterization of the oil extracted from the seeds; and the evaluation of roasted seeds acceptability by consumers. In the results obtained, the seeds are composed 29.59% protein, 40.2751 lipids, and 19.04% dietary fiber. In the flesh, there is a high concentration of dietary fiber, 28.20%, predominantly insoluble fiber, and a fairly high concentration of sugars, 20.45%. Regarding the indices of the in vivo protein quality evaluation, the digestibility of the raw seed protein (72.53%) was statistically superior to that of the roasted seed protein (66.35%), while the biological value and the apparent net protein utilization of the raw and roasted seed protein did not differ statistically. The baru oil augmented significantly the nitrogen balance of the casein (119.36 to 139,22mgN/24h). However, there was no significant difference between digestibility, biological value and apparent net protein utilization of casein diet with soybean oil or with baru oil. There was no statistical difference between the corrected PERs of raw and roasted seeds [1.28 amd 1.19, respectively). The same conclusion, was arrived to from to casein with soybean oil (2.50) and casein with baru oil (2.37). The ratio baru PER to casein PER for raw and roasted seeds was approximately 50%. Regarding the indices of in vitro protein quality evaluation, the protein of raw and roasted seeds as well as the protein of the flesh showed low chemical score (29.60%, 33.60% and 16.4%, respectively) with the sulfur containing aminoacids as the limiting ones. There was no significant difference in the in vitro digestibility between raw and roasted seeds (68.43% and 67.69%, respectively), but the highest value obtained was that of casein, 98.93% (reference protein used in the in vivo assay). The digestibility of the flesh protein was also low (20.32%), probably because of the high concentration of tannin and fibers that partially block the enzyme action, The raw seeds present low concentration of phytic acid and trypsin inhibitor, which become insignificant after heat treatment. Hemagglutinating activity and tannins were not detected in the seeds. The flesh showed a high concentration of tannin, probably because of its incomplete maturation. The baru oil is a good source of unsaturated fatty acids (around S0% of its oil), shows a high concentration of oleic and llnoleic acid, being comparable to peanut oil. It showed saponification index of 190.13mgK0H/g, and iodine index of 91.58mgl/100g, coherent with its fatty acid composition. It has also 13.62nig of vitamin E per l00g of oil, comparable to those to peanut, olive, maize and soybean oils. The baru seed had good acceptability by the preference test due to its mild sweet taste, being low graded by its hard texture / Mestrado / Mestre em Ciência da Nutrição

Las proteínas repetidas son proteínas no globulares caracterizadas por la presencia de repeticiones a nivel de secuencia y estructura. Pueden ser de 5 clases, cada una con un número variable de subclases. Estas proteínas son relevantes porque están relacionadas con una diversidad de enfermedades. Su correcta clasificación es parte fundamental para su estudio; sin embargo, la anotación manual de todas las estructuras de proteínas conocidas es una tarea que es logísticamente imposible completar. Por ello, la automatización de esta tarea es muy importante. En el presente trabajo, se desarrolló una herramienta para la identificación y clasificación de repeticiones de clase IV. Esta herramienta fue construida por el acoplamiento de dos módulos: uno de filtro y otro de clasificación. El primero fue construido reutilizando una red neuronal convolucional entrenada para la detección de simetrías rotacionales en la estructura de una proteína. Su uso estuvo fundamentado en el hecho que las repeticiones clase IV son de estructura cerrada, por lo que la presencia de simetrías rotacionales era altamente probable. Para el módulo de clasificación se transformó la información estructural en imágenes, por medio del cálculo y superposición de tres matrices. Estas imágenes fueron usadas para aplicar una técnica de transferencia de aprendizaje a una red Densenet, seleccionada luego de un análisis cualitativo y cuantitativo. Como resultado, el clasificador obtenido logró una exactitud de 89.8% sobre una muestra de 658 cadenas de proteínas. Los anteriores módulos fueron integrados en un servicio web construido sobre Flask. Se construyó una aplicación de una página (SPA) para hacer disponible dicho servicio en una forma amigable con el usuario. Dicha aplicación fue desplegada en la nube para su acceso.

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo / Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar la validez de los criterios de selección que se han establecido para la adición de extremos hidrofóbicos a proteínas para mejorar su purificación mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para esto se utilizó una enzima celulasa Cel5A de Bacillus Agaradherans y tres combinaciones de aminoácidos prolina (P), tirosina (Y) y triptófano (W): YYY (Y3), WPWP (WP2) y WPWPWPWP (WP4). Las secuencias fueron añadidas en el extremo carboxilo terminar de la enzima nativa mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se obtuvieron de forma exitosa las variantes recombinantes Celulasa-Y3, Celulasa-WP2 y Celulasa-WP4. Las variantes obtenidas fueron cultivadas e inducidas bajo las mismas condiciones preestablecidas, extrayéndose las fracciones extracelular y periplasmática a las cuales se les realizaron ensayos de actividad celulolítica y proteína total, para posteriormente calcular su actividad específica. La proteína total producida por las variantes mutantes fue similar a la obtenida por la cepa nativa, obteniéndose un nivel de proteína total con respecto a la cepa nativa de un 98% para la variante Cel-Y3, 88% para la variante Cel-WP2 y de un 75% para la variante Cel-WP4. En todos los casos se obtuvo una mayor parte de la proteína en la fracción extracelular con valores superiores al 56% del total de proteína producida. La variante Cel-WP2, mantuvo un 97% de la actividad celulolítica total de la enzima nativa, a diferencia de las variantes Cel-Y3 y Cel-WP4 que mantuvieron sólo un 18 y 14% respectivamente. Sin embargo, se obtuvo que todas las variantes presentaron una distribución similar de la actividad entre las distintas fracciones con aproximadamente un 87% de la actividad en la fracción extracelular, un 5% en la fracción de lavado con TES y un 8% en la fracción periplasmática. Fue posible evaluar la validez del criterio señala que: es recomendable la incorporación de prolina en los extremos a fin de evitar la formación de estructuras secundarias y asegurar la exposición del extremo , así como también de que: el valor de la hidrofobicidad del extremo debe ser menor a 500 para mantener la actividad de la enzima . Por el contrario se descartó el criterio de que: no es necesaria la presencia de prolina para mantener la actividad en enzima extracelulares , debido a que sólo la variante con prolina mantuvo una actividad específica alta. Por otra parte, se realizaron HIC para todas las variantes, pero no fue posible la determinación de los valores del tiempo de retención, debido que la enzima precipitaba al introducirla en un medio con alta concentración de sulfato de amonio, lo cual imposibilitaba la realización de ensayos de actividad en las fracciones, por lo cual se recomienda evaluar otras condiciones de operación para determinar estos tiempos de retención.

Ingeniero Civil Químico / El presente trabajo tiene como objetivo principal, idear e implementar un algoritmo para guiar el diseño de proteínas recombinantes. Para lo anterior se recopiló y conformó una base de datos de uso de codones y abundancia de ARNt para un variado grupo de organismos, que incluyó eucariontes y procariontes. El algoritmo opera sobre una secuencia de ADN codificante, de manera que: identifica, analiza cuantitativa y cualitativamente, sugiere mutaciones de acuerdo a las bases de datos designadas automática o manualmente, analiza el plegamiento del ARNm, posibilita la disminución de la estabilidad de estructuras secundarias y permite la visualización gráfica del plegamiento. El algoritmo de mutación trabaja bajo el criterio que el sesgo en el uso de codones refleja la selección para la optimización del proceso de traducción guiado por la abundancia de ARNt. El algoritmo está diseñado para maximizar la expresión recombinante de la proteína codificada sin cambiar su secuencia de aminoácidos. Las mutaciones sugeridas son específicas para cada gen y para cada organismo hospedero en donde dicho gen se desea expresar. La principal tarea y mayor desafío del presente trabajo fue trascender los mecanismos de evolución y los inconvenientes asociados a la producción de proteínas recombinantes. Esto se realizó mediante la información y evaluación de resultados experimentales de diversas investigaciones focalizadas a la genética molecular. De este modo, se logró complementar estudios desarrollados en: el uso de codones, abundancia de ARNt, baja eficiencia de traducción en los primeros ~30-50 codones del ARNm, apareamiento de codones sinónimos en el ARNm, uso de codones mayoritarios y formación de estructuras secundarias en el ARNm. Estas características de presencia transversal en la biología celular, se utilizaron como base en el diseño e implementación de la presente herramienta bioinformática, para el análisis de secuencias codificantes de ADN y mutación sinónima en el proceso de optimización de la expresión de proteínas recombinantes.

O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de atividade enzimática da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTPBMr) e da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) em osteoblastos humanos durante o ciclo e a diferenciação celular, correlacionando com os níveis de estresse oxidativo intracelulares. A atividade enzimática das fosfatases foi determinada nos períodos de 6, 18, 24, 48 e 72 horas (ciclo celular) e 7, 14, 21, 28 e 35 dias (diferenciação) utilizando o p-nitrofenilfosfato e na presença do inibidor específico phidroximercuribenzoato (pHMB) para a PTP-BMr, e na presença de tartarato e pHMB para a TRAP. A caracterização da diferenciação celular foi determinada medindo o nível de atividade da fosfatase alcalina e a coloração de Von Kossa. O estresse oxidativo foi determinado através da quantificação da glutationa reduzida e oxidada através dos ensaios de cromatografia líquida de alta performance eletroquímica e DTNB. Durante o ciclo celular a atividade específica (AE) da fosfatases foi fortemente diminuída, especificamente da TRAP e PTP-BMr, sendo praticamente zero após 18 horas da adição de soro, sugerindo que a diminuição na atividade destas enzimas seja necessária para a entrada na fase S. Durante a diferenciação celular observou-se um aumento progressivo da expressão de FALC, TRAP e PTP-BMr nos períodos de 7 e 14 dias, sendo máxima no 21o dia, declinando a seguir. Durante a proliferação, os estados mais reduzidos foram observados nos períodos de 18 e 48 horas e durante a diferenciação o estado mais reduzido foi observado no 21o dia. Desta forma, o presente trabalho mostra que as células da linhagem hFOB 1.19 representam um adequado modelo de estudo para análise da participação de fosfatase no ciclo e diferenciação celular, bem como que as atividades da PTP-BMr e TRAP são claramente moduladas durante o ciclo celular e a diferenciação de osteoblastos humanos, esta última dependente de adequado nível de glutationa reduzida. / Low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) activity were determined in hFOB 1.19 human osteoblasts cell line during cell proliferation and differentiation. LMW-PTP and TRAP enzymatic activity were determined at 6, 18, 24, 36, 48 and 72 hours after fetal calf serum stimulation of subconfluent cultures and 7, 14, 21, 28 and 35 days after cell confluence and differentiation. The LMW-PTP and TRAP activity were measured using p-nitrophenylphosphate as substrate. The osteogenic potential of hFOB 1.19 cells was studied by measuring alkaline phosphatase activity, and mineralized nodule formation by Von Kossa staining. The oxitative stress was determined by HPLC and DNTB assays. During cell cycle progression, LMW-PTP and TRAP activities were strongly reduced, being almost undetectable after 18h of serum stimulation, while H3-thymidine incorporation progressively increased, suggesting that the decrease in the LMW-PTP and TRAP activities were necessary for entry into the S phase. During osteoblastic differentiation, the activity of LMW-PTP and alkaline phosphatase progressively increased until the 21th day, decreasing thereafter. In conclusion, this work demonstrates that hFOB 1.19 cells constitute a suitable model system for the study of the role played by LMW-PTP and TRAP in cell cycle progression and cell differentiation, and that LMW-PTP and TRAP activities are clearly modulated during osteoblastic proliferation and differentiation in vitro. The activities of these phosphatases during cell differentiation depended on the correct levels of reduced glutathione.

El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres puentes disulfuro formados por las cisteínas C8- C27, C12- C24 y C18- C34. La presencia de estos puentes disulfuro nos permite estudiar el replegamiento del PCI a través de la captura de los intermediarios que se forman en el proceso de plegamiento a partir de la proteína reducida. Esto permite conocer el número de intermediarios dependientes de disulfuro, su diversidad, su estructura y sus propiedades, proporcionándonos información sobre el mecanismo de plegamiento.En una primera fase del presente trabajo, hemos estudiado el aislamiento y la purificación de los intermediarios con tres puentes disulfuro (denominados "scrambled species") a partir de la mezcla de intermediarios que se obtiene tras efectuar el replegamiento del PCI a partir de PCI purificado o a partir de cultivos de E. Coli que expresan PCI. Así mismo, hemos realizado una caracterización estructural de los intermediarios "scrambled" aislados en forma pura, se han determinado sus constantes de inhibición, éstas son del orden mM (unas 1000 veces superiores a la estimada para el PCI nativo). También se ha determinado cuáles son las cisteínas implicadas en cada uno de los puentes disulfuro de la estructura de tales especies mediante digestión proteolítica y mediante reducción química parcial de un puente disulfuro. Finalmente se ha realizado un análisis conformacional por estudios de Dicroísmo Circular y Resonancia Magnética Nuclear, técnicas que nos han permitido observar que tales intermediarios no presentan una estructura mayoritaria definida.En una segunda fase, hemos estudiado la última etapa del camino de plegamiento del PCI, etapa donde las especies '"scrambled"" rompen y vuelven a formar sus puentes disulfuro para dar lugar a la estructura nativa. Con este fin se ha estudiado la estabilidad relativa de estos intermediarios frente a agentes desnaturalizantes y se han llevado a cabo experimentos cinéticos de su evolución a estructura nativa. Estos experimentos han probado que el plegamiento del PCI no tiene lugar a través de una vía única sino que se dan múltiples vías paralelas. Se han observado que los intermediarios que son más estables frente a agentes desnaturalizantes son los que presentan una evolución más lenta hacia la forma nativa.Finalmente en una tercera fase, se ha estudiado la influencia de agentes redox en la producción de PCI recombinante y en otras proteínas relacionadas. Se observó que la expresión de éstos en E. Coli, en forma secretada al medio, se acumulaba gran parte de la proteína en forma de intermediarios tipo "scrambled". Se ha determinado que la forma más eficiente para convertir estas especies en proteína nativa, consiste en la adición al medio tras el cultivo de agentes redox para catalizar el proceso de "reshuffling". De esta forma se consiguen importantes mejoras en el rendimiento de la producción. / Potato carboxipeptidase inhibitor (PCI) contains 39 amino acids. 27 residue composed the central globular structure and the rest composed the queue N- terminal and C- terminal. The globular part of the protein presents an helix 310, as the only secondary structure regular, and 4 loops. The protein is stabilised by tree disulfide bridges composed by the cystines: C8-C27, C12- C24 I C18- C34.The presents of this disulfide bridges let us to study the refolding of PCI by trapping the intermediates formed during the folding pathway of the reduced protein. This process let us know the number of intermediates disulfide dependents, his diversity, his structure and his proprieties, giving us information of the folding pathway.In a first stage of this work, we studied how to isolate and purification the intermediates with tree disulfide bridges (denominated "scrambled spices") by the intermediates obtained from the refolding of PCI, from the PCI purification or from E.Coli cultives. With the pure "scrambled" intermediates we have done a structural characterisation and we have defined their inhibitor constants. Also we defined which are the cystines implicated in each disulfide bridge by proteolysis and by partial chemical reduction to one disulfide bridge. Finaly we have done a conformacional analysis by Circular Dicroism and Nuclear Magnetic Resonance. This techniques reveal us that the intermediates don't have a main structure defined.In a second stage, we have been studied the last step of the folding pathway from PCI. During this step the scrambled spices break and refold their disulfide bridges to give the native structure. We studied the relative stability of the intermediates in front of disnatured agents and kinetics experiments of their evolution a native structure. This experiments reveal that the folding of the PCI isn't by one path, it is by multiple parallel pathways. We have seen that the most stable intermediates in front of disnature agents are the most slow to native structure.Finally in a third stage, we studied the effect of redox agents in the production of recombinant PCI and other relation proteins. We have seen that most protein was accumulate in intermediates type scrambled during the E.Coli expression. We determined that the most efficient conversion to the native form is by the addition of agents redox in the medium after the grow, this agents catalite the reshuffling process. By this form we have good improve in the production rendiment.

One of the important challenges in surface bioengineering is the fabrication of robust and regular supramolecular structures, tuning the chemical and topographical properties of the surface, in order to include functional biomolecules, which preserve their activity and/ or induce the desired biological process.Laccases, are redox enzyme, that catalyse the oxidation of a broad range of polyphenols and aromatic substrates. Wide variety of application in the industry has been reported, and lately their use for biosensors development. Bacterial S-layers are very interesting systems since they self-assemble forming 2-D crystals (S-layers) on many type of surfaces, and they can be fused with other biomolecules maintaining their functionality.HegG2 cell line is an hepatoma cell line that has been used for cancer research. These cells maintain part of the normal metabolic capacity of hepatocytes, what make them a useful tool for high-throughput in vitro toxicity assays, as well as in the development of bioartificial livers. The objective of this work was to generate biocompatible surfaces to immobilise lacase, S-layers and HepG2 cells, on which they mantain they active. Different surfaces with defined functionalities have been constructed with synthetic polyelectrolytes, using the layer-by-layer technique and soft lithography. At the nanoscale, an enzyme (laccase) was covalently immobilised on a gold/polyethylenimineI/glutaraldhyde layer, preserving its activity. The immobilisation was studied with a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and its activity assayed with a spectrophotometer.Besides, bacterial surface proteins (SbpA, SbpA-EGFP and SbpA-STV) were adsorbed on polyelectrolytes multilayers. The combination of soft-lithography with a protein resistant polyelectrolyte (PLL-g-PEG) led to the construction of micro-structured surfaces of functional bacterial proteins. Surface wetability, fluorescence and atomic force microscopy (AFM) were used to characterise those interfaces.Increasing the complexity, attachment of HepG2 cells on polyelectrolytes was studied. Cell adopted different morphologies depending on the hosting underlying polyelectrolyte as observed by transmission, scanning electron and atomic force microscopes. The adhesion and spreading of the cells that were monitored with QCM-D and transmission microscopy, and assayed with crystal violet, showed a higher affinity of the cells toward the adlayer formed on PEI, PAH and PLL in comparison with PSS and PLL-g-PEG. Force spectroscopy studies with AFM showed higher repulsion between PSS surfaces and the cell surface, and different local cell mechanical properties between cells attached to PEI and PSS. / La ingeniería de biomateriales busca obtener materiales biológicamente activos, ajustando las propiedades químico-físicas (y topográficas) de la superficie de interés. Las lacasas, son enzimas que catalizan la oxidación de un gran número de polifenoles con aplicación en la industria, así como en el desarrollo de biosensores. Las proteínas bacterianas S, son sistemas muy interesantes ya que se auto-ensamblan formando cristales en 2-D y se pueden fusionar con otras biomoléculas. La línea celular hepática cancerosaHepG2, se ha empleado en estudios relacionados con el cáncer, citotoxicidad , se ha incorporado en dispositivos extracorporales para suplir funciones hepáticas, ya que a pesar de su transformación mantienen ciertas funciones de los hepatocitos normales. El objetivo de este trabajo fue generar superficies biocompatibles en las que se inmovilizó lacasa y se adsorbieron proteínas (de fusión) bacterianas y células, comprobando su funcionalidad.El ajuste de la química superficial se realizó por adsorción capa tras capa de polielectrolitos y para su estructuración se utilizó litografía blanda ("micro-contact printing"). La lacasa se inmobilizó covalentemente sobre oro cubierto con PEI (polietilenimina) través de gluraldehído, para posteriormente recubrirla con otros polielectrolitos. Dicho proceso se monitoreó con QCM (microblanza de cuarzo) y espectrofotometría (actividad enzimática). Las proteínas bacterianas se adsobieron selectivamente sobre muliticapas de polielectrolitos previamente estructuradas. Su funcionalidad se comprobó usando AFM (microscopía de fuerza atómica) y microscopía de fluorescencia. Las células HepG2 se inmobilizaron sobre superficies homogéneas y estructuradas de con distintos polielectrolitos. Se comprobó su viabilidad por ensayos con MTT y se observaron con SEM (microscopía de escaneo de electrones). El proceso de adhesion de las células sobre las multicapas de polielectrolos se estudió en función del tiempo con QCM y microscopía de transmisión, y fue testado con cristal violeta. Se utilizó AFM para estudiar la interacción entre las células con los polielectrolitos.El protocolo de inmovilización usado es aplicable para la lacasa, la cual conserva su actividad catalítica en la presencia de ABTS. La enzima se recubrió con multicapas de polielectrolitos pero la determinación de su actividad se ve dificultada por la interferencia con el ABTS.Por primera vez se utilizó "micro-contact printing" para construir superficies estructuradas, en las que se adsorbieron proteínas (de fusión) S, generando superficies funcionales en escala nanométrica dentro de microestructuras. Cabe destacar que la posibilidad de manipular la distribución de la proteína en escala micro es un requerimiento básico para el desarrollo de biosensores. En lo que se refiere a la interacción célula/superficie, se encontró que las células HepG2 adoptan diferente morfología dependiendo del substrato al que se adhieren. Mientras polielectrolitos positivos (PEI, PAH) adsorben moléculas que inducen la expansión celular, PLL-g-PEG (interfase neutra e hidrofílica) y PSS (polielectrolito negativo) no favorecieron la expansión celular. El QCM-D revelan que las células no son detectadas cuando se depositan sobre PSS (lo opuesto sucede cuando se adhieren sobre PEI) aunque se mantiene adheridas. Las propiedades mecánicas de las células varían de acuerdo al sustrato al que se adhieren, más rígidas sobre PEI. La máxima adhesión de las puntas (funcionarizadas con PEI y PSS) del AFM a la superficie celular es independiente de la carga aplicada y de su recubrimiento, para un tiempo nulo de residencia de la punta sobre la superficie celular. La máxima adhesión observada fue de 750 pN para un tiempo de residencia de residencia de 3 s, cuando el tip fue funcionalizado con PEI.