Orientador: Luiz Antonio Viotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T04:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_CristianeVieira_M.pdf: 26073085 bytes, checksum: e85b49f13920a36cca3b83105b64210c (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: o processo de fracionamento das proteínas do leite por membranas, em comparação aos processos fisico-químicos convencionais, resulta em frações de proteínas na forma nativa, garantindo as suas propriedades funcionais e consequentemente sua aplicação como ingrediente na indústria de alimentos. A caseína e as proteínas do soro apresentam propriedades funcionais tais como geleificação, emulsificação, capacidade de retenção de água e capacidade de formação de espuma, e quando isoladas podem encontrar um grande número de aplicações. Leite em pó desnatado foi reconstituído, à temperatura de 50°C, microfiltrado a fator de concentração (FC) 4 e diafiltrado, por 4 ciclos em uma unidade piloto, utilizando uma membrana cerâmica de alumina de 19 canais, Membralox, com diâmetro de poro de 0,1 11m e 0,24 m2 de área de permeação, resultando em produtos com cerca de 85% de caseína, em base seca. Amostras da alimentação, do retentado a FC 2 e 4 e do produto diafiltrado a 2 e 4 ciclos de diafiltração (CD) foram tomadas para análise de composição química. Através de planejamento experimental, variando as condições operacionais de pressão transmembrana na faixa de 90 a 310 kPa e de velocidade tangencial na faixa de 1,9 a 6,1 m/s, foi possível verificar o efeito combinado destes parâmetros sobre a porcentagem de variação, em relação à alimentação, da razão entre a caseína e a proteína (CsfPt) e sobre o fluxo de permeado global ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: Fractionation of milk proteins by membrane technology, in comparison with a conventional physico-chemical process, results in proteins in native state, which maintain their functional properties and consequently permit their application as ingredients in the food industry. Casein and whey proteins have functional properties like gelling, binding of water, emulsifying, overrun and foaming stability, and when isolated can serve in a wide range of applications. Skim milk powder was reconstituted at a temperature of 50°C, microfiltrated to concentration factor (CF) of 4 and diafiltrated in a pilot with four repetitions, using a ceramic membrane of alumina, with a 19 channels, Membralox, pore size 0.1 um and a permeation area of 0.24 m2, resulting in products with aproximately 85% of casein on a dry basis. Samples of the feed, retentates at CF 2 and CF 4, and diafiltrated products of the 2nd and 4th cycle of diafiltration (CD) were taken to chemical analyses. Using the method of experimental design and varying the experimental preconditions like transmembrane pressure (90 to 310 kPa) and tangential flow velocity (1.9 to 6.1 m/s), it was possible to verify the correlated effect ofthem on percentage of variation of casein/protein ratio (Cs/Pt) and on average permeat fluxo ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Julio Cezar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pirovani_CarlosPriminho_D.pdf: 2183526 bytes, checksum: e9f5bfca7c6a1b7ac43410251e61f2d3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Humberto do Santo Neto, Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T01:56:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_AirtonJose_M.pdf: 5860113 bytes, checksum: e97b75872efa8bc6a4d1f44339c4a19f (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e a mais devastadora das distrofias musculares. É causada pela mutação do gene responsável pela expressão da distrofina, uma proteína estrutural do sarcolema, a membrana celular das fibras musculares esqueléticas. A ausência dessa proteína leva a uma instabilidade sarcolemal que termina em necrose da fibra muscular. As fibras necróticas perdem a capacidade regenerativa fazendo com que o tecido muscular seja substituído por tecido fibroso. O comprometimento muscular inicia-se pelos membros inferiores e progride até atingir os músculos respiratórios, o que ocorre geralmente ao redor dos 20 anos de idade, quando os pacientes invariavelmente vão a óbito. Atualmente acredita-se que a cura efetiva da doença poderá ser feita com a terapia gênica que pode ser feita de duas formas. Uma delas consiste em fazer com que as fibras musculares já existentes passem a expressar distrofina e a outra em gerar novas fibras musculares que expressem distrofina. O sucesso dessas terapias depende do restabelecimento funcional das novas fibras musculares e das pré-existentes, cuja inervação deve ter sido perdida durante o momento em que sofreu o primeiro ciclo de degeneração. Por sua vez, a capacidade de reinervação depende exclusivamente da capacidade dos axônios gerarem brotamentos axonais. A simples presença de fibras musculares em degeneração e em regeneração deve atuar como fator estimulador de brotamentos axonais. Entretanto, dados da literatura mostram que em pacientes portadores de DMD, bem como em camundongos da linhagem mdx, o modelo experimental para o estudo da DMD, não ocorre brotamentos axonais. O objetivo deste trabalho foi examinar a capacidade de axônios de camundongos emitirem brotamentos axonais. Foram empregadas duas linhagens de camundongos, mdx e C57BL/10, cada uma delas foi examinada de duas formas: sem nenhum tratamento e com esmagamento do nervo que teve por objetivo induzir a emissão de brotamentos nervosos. Para tal, os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de virbaxyl/ftancotar e o nervo para o músculo estemomastoideo esquerdo esmagado com pinça de relojoeiro. Oito dias após o esmagamento os animais foram anestesiados, perfundidos com paraformoldeido por via intracardíaca, e os músculos estemomastoídeos direito e esquerdo retirados para marcação dos receptores de acetilcolina e dos axônios pré-terminais e terminais. Isto foi realizado com o uso de a-bungarotoxina conjugada à rodamina e anticorpo monoclonal para filamentos nervosos, respectivamente. Os músculos foram examinados através da microscopia confocal de fluorescência. Nossas observações mostraram que em músculos de camundongos mdx, que não sofreram esmagamento do nervo, portanto que representa o que ocorre durante o curso normal da distrofia muscular, não houve aumento dos brotamentos axonais do tipo nodal, mas houve aumento significativo dos brotamentos extra e intraterminais, comparados aos camundongos C57BL/10. Por sua vez, quando estimulados pelo esmagamento do nervo, os brotamentos do tipo nodal e extraterminal, mas não aqueles intraterminais, estiveram presentes na mesma intensidade dos camundongos não distróficos. Essas observações permitem concluir que, embora durante o curso normal da doença não ocorra brotamento nodal, os axônios dos camundongos mdx são capazes de emitirem brotamentos extra e intraterminais. Considerando-se que a inervação de novas fibras musculares depende mais de brotamentos nodais, os quais podem propagar-se por maiores distâncias dentro de um mesmo músculo, é possível que as novas terapias de transplantes de mioblastos e de células tronco indiferenciadas apresentem menor possibilidade de sucesso que aquelas que consistem na transformação das fibras musculares pré-existentes, que não possuem distrofina em fibras distrofina positivas, já que sua inervação estaria garantida pela presença de brotamentos extraterminais e especialmente intraterminais / Abstract: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is characterized by deficiency of dystrophin, a component of the muscle fiber membrane. The absence of dystrophin leads to muscle fiber degeneration, resulting in progressive muscle weakness. Cell mediated therapy aimed to restore dystrophin expression by fusing transplanted cells into original dystrophic fibers or by forming new dystrophin positive fibers. Thus, the success of cell therapy depends, among other factors, on muscle fiber reinnervation, which in turn depends on the ability of host axons to sprout. It is accepted that sprouts are induced in the presence of degenerating and regenerating muscle fibers. Since muscle fiber degeneration-regeneration is observed in DMD, as well as in the mdx mice, the animal model of DMD, the frequency of sprouts would be expected to be higher in dystrophic than in normal muscles. However, no axonal sprouts have been observed in muscles of DMD and mdx mice. In the present, we investigated whether intramuscular nerve bundles and motor terminals of mdx mice keep their ability to sprout after a nerve crush lesion. The sternomastoid muscles of adult (5-6 months) mdx mice (n=5) and C57Bl/10 controls (n=5) had their acetylcholine receptors and nerve terminals labelled with rhodamine-alpha-bungarotoxin and anti-neurofilament-IGgfluorescein, respectively, for confocal microscopy observation. Additional mdx (n=5) and C57Bl/10 (n=5) had the nerve to the left STN muscle crushed and 8 days later AChRs and nerve terminals were labelled and viewed the same way. Nerve terminal distribution in the mdx was seen as thin filaments with bulbs at their tips, which were in apposition to fainter central areas in the islands of receptors, being suggested that they represent intra-terminal sprouts, seen in about 90% of the endplates viewed of normal and crushed mdx mice. In crushed-mdx mice, extra-terminal sprouts were seen in 73%, while in crushed controls sprouts were present in about 41 % of the endplates. In conclusion, these findings demonstrate that mdx nerve terminals are able to sprout when a second stimulus, such as nerve lesion (in addition to muscle degeneration-regeneration) is present and this response can be of major relevance to the success of cell mediated-therapy to treat DMD / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores : Telma Teixeira Franco, Ines Conceição Roberto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T12:46:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mayerhoff_ZeaDuqueVieiraLuna_D.pdf: 4590505 bytes, checksum: 842e0391400f99be260f73db7efc30c8 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A obtenção, extração e caracterização parcial da enzima xilose redutase (XR) presente no extrato celular da levedura Candida mogii NRRL Y-17032 cultivada em hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz foram estudadas neste trabalho. A concentração de hidrolisado no meio de cultivo para a produção da XR foi avaliada, e os maiores valores de produção e produtividade específica (35 U/g de célula e 0,97 U/[g de célula. h], respectivamente) foram obtidos em fermentações empregando meio contendo 49,2 g xilose/l. As condições para atividade ótima da XR in vitro foram estudadas e a máxima atividade volumétrica (0,54 U/ml) foi obtida empregando pH de 6,5 e 38°C. No estudo da estabilidade, a atividade da XR permaneceu constante por 3 horas às temperaturas de 4 e 38°C, e por 4 meses sob congelamento a -18 oCo Os parâmetros cinéticos determinados para a XR foram Vmax = 0,485 U/ml e Km = 63 mM para a xilose e Vmax = 0,390 U/ml e Km = 0,032 mM para o cofator NADPH. Para o rompimento celular de C. mogii por agitação com esferas de vidro, a maior atividade volumétrica (0,683 U/ml) foi encontrada empregando esferas de 300 µm de diâmetro, concentração celular de 45 g/l e 50 ciclos de agitação. No estudo para extração da XR em sistemas de duas fases aquosas, modelos matemáticos foram previstos para o fator de purificação e o percentual de recuperação (rendimento) na fase superior, e os valores máximos previstos por estes modelos foram 1,59 e 105,8, respectivamente / Abstract: The obtainment, extraction and partial characterization of the enzyme xylose reductase (XR) present in cell extract of the yeast Candida mogii NRRL Y-17032 cultivated in rice straw hemicellulosic hydrolysate were studied in this work. The XR production was evaluated by varying the concentration of hydrolysate in the growth medium, and the highest values of production and specific productivity (35 U/g of cell and 0.97 U/[g of cell.h], respectively) were obtained in fermentations employing medium containing 49.2 9 xylose/l. The conditions for in vitro optimal XR activity were studied and the maximum volumetric activity (0.54 U/ml) was obtained employing pH 6.5 and 38°C. In the study of the stability, XR activity remained constant for 3 hours at temperatures of 4 and 38°C, and for 4 months at -18°C. The kinetic parameters determined for XR were Vmax = 0.485 U/ml and Km = 63 mM for xylose and Vmax = 0.390 U/ml and Km = 0.032 mM for the cofactor NADPH. For the disruption of C. mogii cells by mechanical agitation with glass beads, the highest volumetric activity (0.683 U/ml) was found employing 300 µm diameter beads, cell concentration of 45 g/l and 50 cycles of agitation. In the study for XR extraction in aqueous two-phase systems, mathematical models were predicted for the purification factor and percent recovery (yield) on top phase, and the maximum values predicted by these models were 1.59 and 105.8, respectively / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador : Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T08:45:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hasan_SalahDinMahmud_D.pdf: 5686168 bytes, checksum: 0cbd2d887d53ee7fd2b651162ff8826a (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Neste trabalho, estudou-se a produção, recuperação e caracterização de proteínas alergênicas da biomassa de Drechslera (Helminthosporium) monoceras cultivada em meio sólido, com vistas à obtenção de extrato alergênico fúngico para aplicação em diagnóstico de doenças alérgicas. Para a produção, foram usados biorreatores aerados de leito fixo do tipo colunas de Raimbault, sendo testados como substratos o bagaço de cana de açúcar e os farelos de trigo e milho. A otimização das variáveis do processo fermentativo foi feita através de planejamento estatístico de experimentos e análise de superfície de resposta, sendo os melhores resultados de produtividade obtidos com valores iniciais de pH 9,5 e umidade de 45,8%. As condições mais adequadas para o cultivo em estado sólido de D. monoceras foram com o uso de farelo de trigo como substrato com tamanho de partícula de 0,59 mm; concentração de inóculo de 0,4 mg/mL, vazão de ar de 2,0 L/h/coluna e 25°C. A cinética da produção de biomassa foi estudada nas condições otimizadas do processo. O extrato bruto foi obtido por extração das proteínas do meio fermentado usando água como solvente. A recuperação dessas proteínas foi feita mediante precipitação por solventes orgânicos e sulfato de amônio, seguida da remoção de sais e polifenóis, para a obtenção de extrato com potencial alergênico. A caracterização do extrato com potencial alergênico foi feita mediante eletroforese SDS-PAGE, IEF, cromatografia de permeação em gel e testes in vivo ("prick-test") e in vitro ("Dot-blotting" e "Immunoblotting") para a avaliação da alergenicidade das proteínas. Foram identificadas 12 proteínas nos extratos com potencial alergênico, entre 14 e 156 kDa. Nos testes cutâneos, feitos em pacientes com sintomas de alergia respiratória, foram observadas positividades em 24% dos casos, para formação de pápulas maiores que 4 mm de diâmetro. Nas análises de "Immunoblotting", seis proteínas apresentaram reatividade mais intensa, podendo ser consideradas alergênicas as de 155,9; 104,2; 44,2; 35,7; 27,8 e 14,3 kDa / Abstract: The purpose of this work was the production, recovery and characterization of allergenic proteins of Drechslera (Helminthosporium) monoceras biomass; cultivated by solid-state fermentation, for the obtainment of standardized mould allergenic extract, applicable to diagnosis of allergy diseases. Bioreactors based on Raimbault-type aerated fixed bed columns were used for solid-state fermentation, and sugar cane bagasse, wheat and maize bran were tested as substrate. The most important variables of solid fermentation were optimized by statistical experimental design and by surface response analysis, and the best results, in terms of productivity, were obtained at pH 9.5 and 45.8% moisture. The solid state fermentation conditions were determined for wheat bran used as substrate (with 0.59 mm dimension); 0.4 mg/mL of inoculum; 2.0 Uh of air and 25°C. The kinetic of biomass growth was determined under the optimized conditions of the process. Water was used as solvent for the obtainment of the crude extracts. Potentially allergenic extracts were obtained by protein precipitation from the crude extracts by the use of organic solvents and ammonium sulfate, followed by salt and polyphenols removal. Characterization of potentially allergenic extracts was done by SDS-PAGE electrophoresis, isoeletric focusing, gel permeation chromatography and by cutaneous "prick-tests", dot-blotting and immunoblotting analysis for the allergenic evaluation of extracts. Twelve proteins were identified from the potentially allergenic extracts, in the range of low and high molecular mass, between 14 and 156 kDa. From cutaneous tests, 24% of the patients with respiratory allergy symptoms showed positive reactions. The immunoblotting assays revealed six proteins with allergenic activity due to their stronger reactivity, with the following molecular masses: 155.9; 104.2; 44.2; 35.7; 27.8 and 14.3 kDa / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Debora de Queiroz Tavares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-02T19:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LiliaZagoFerreirados_M.pdf: 24641493 bytes, checksum: a08d4a1e64d1abbf3542a5e11cc3717a (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A deficiência de ferro é um distúrbio econômico e educacional e constitui um dos maiores problemas de saúde pública. Muitas estratégias de intervenção para reduzir a prevalência são desenvolvidas por instituições competentes e responsáveis. A fortificação de alimentos é ferramenta indispensável para o controle de carências nutricionais, em especial a de ferro, e é praticada em diversos países. De modo geral, o sucesso da fortificação depende do tipo e da concentração do fortificante, bem como do alimento utilizado como veículo. Pelo fato do Brasil ser o segundo maior produtor mundial de soja, isto representa incentivo à utilização dos produtos de soja como veículos de fortificação. Devido a amplitude de produção decorrente da forte demanda do mercado interno a Proteína Texturizada de Soja (PTS) torna-se alvo de estudo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a biodisponibilidade do ferro presente na PTS isolada, em associação com proteína animal e posteriormente fortificada com Sulfato Ferroso-heptaidratado e Bisglicinato Quelato Ferroso em ratos depletados de ferro. O trabalho foi realizado em duas etapas, de forma que na primeira delas os objetivos foram avaliar a biodisponibilidade do ferro contido em uma associação de PTS e proteína animal na proporção 1:1 e, avaliar a fortificação da PTS com Sulfato Ferroso-heptaidratado (SF) e Bisglicinato Quelato Ferroso (QF). Os resultados demonstraram que a proteína animal associada a PTS foi suficiente para recuperar a anemia não severa. Diferenças de biodisponibilidade entre o SF e o QF não foram observadas. Na segunda etapa, os objetivos foram avaliar apenas a biodisponibilidade do ferro da PTS e, avaliar a fortificação com SF e QF. Os resultados indicaram que a fortificação mostrou-se efetiva, porém, diferenças de biodisponibilidade entre os fortificantes foram pequenas. Concluiu-se que dietas que contenham como fonte protéica, a associação de PTS e proteína animal (1:1), não necessitam de fortificação, e que dietas cuja fonte protéica seja exclusivamente PTS, são capazes de recuperar anemia em ratos Wistar, porém, a recuperação foi mais efetiva no tempo e quanto aos remanescentes de anisocitose e hipocromia quando a PTS foi fortificada para oferecer O,97mgde Fe/dia. / Abstract: lron deficiency, an educational and economic disturbance, is one of the major public health problems. Many intervention strategies for reducing its prevalence have been developed by competent and responsible institutions. Food fortification represents an indispensable toei for controlling nutritional deficiencies, especially iron deficiency, and has been practiced in many countries. Broadly, the success of fortification depends on the type of iron compound type and its quantity and also on the food used as the vehicle. Considering that Brazil is the second soybean producer in the world, this should represent an incentive to research into the use of soybean products as alternative fortification vehicles. Due to an increase in production as result of a strong internal demand, texturized soy protein (PTS) has become a target of study. The objectives of this work were to evaluate iron bioavailability in PTS alone and with added meat, and subsequently to evaluate fortification with Ferrous Sulfate (SF) and Ferrous Bisglycinate Chelate (QF). This work was carried out in two stages. The first one aimed to evaluate iron bioavailability in PTS associated with meat and also the fortification of PTS with SF and QF. The results showed that meat protein associated with PTS is adequate to recover from mild anemia. Differences between SF and QF were not observed. The second stage aimed at evaluating iron bioavailability of PTS alone and, as in the first stage, to evaluate the fortification of PTS with SF and QF. The results showed that fortification was efficient, however bioavailability differences between SF and QF were not observed. We concluded that diets with PTS + meat (1:1) as protein source do not need fortification and that diets which have exclusively PTS as the protein source, are capable of curing anemia in wistar rats, although the recovery was more efficient when the PTS was fortified. / Mestrado / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientadores: Angela Maria Moraes, Carlos Augusto Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_FabianaReginaXavier_M.pdf: 2519549 bytes, checksum: 9a767f56a5012a084b651731c3577e7f (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: William Jose da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T21:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lovato_MariaBernadete_M.pdf: 2508222 bytes, checksum: d1c3e021507c6229b6a5e1330df893f6 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Sete tipos de espigas segregantes, com proporções distintas de endosperma do duplo mutante sugary opaque-2 e do tipo normal, foram produzidas artificialmente para investigar se as diferentes fontes de consumo geradas poderiam alterar características físicas e conteúdo de proteínas dos dois tipos de endospermas estudados. As espigas segregantes foram obtidas através da polinização de plantas sugary opaqu-2, com sete diferentes misturas de polem, preparadas com base no volume dos micrósporos. Os endospermas foram analisados na maturação fisiológica, em seis espigas individuais de cada grupo segregante. A quantidade de matéria seca (mg / endosperma), a porcentagem de umidade, a porcentagem de nitrogênio total e a porcentagem de zeina não foram alteradas nos diferentes grupos segregantes, tanto nos endospermas normais, como nos endospermas sugary opaque-2. Esses resultados demonstram que o acúmulo de matéria seca, de nitrogênio total e de zeina nos endospermas sugary opaque-2 e normal não foram influenciados pelos diferentes fluxos de nutrientes gerado nos grupos segregantes. As outras frações protéicas de Landry-Moreaus nos endospermas sugary opaque-2, à semelhança da zeina, não se mostraram diferentes em dois grupos segregantes distintos com 71,7 e 7,9% de endospermas normais. A quantidade de aminoácidos livres, apesar de ter sido estatisticamente menor no grupo com proporção de 71,7% de endospermas normais, revelou uma pequena diferança equivalente a 5,8% do total do nitrogênio no endosperma... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Seven groups of segregating ears with different normal to sugary opaque-2 endosperm ratios were produced artificially to see whether the different sink effects of the two maize types could influence each other in terms of physical or protein characteristics when developing side-by-side on the same ear. The segregating ears were produced after pollination of sugary opaque-2 plants using different pollen mixtures of normal and sugary opaque-2 pollen grains based on volume of microspore. Endosperms were analysed at maturity from six individual ears in each of the seven segregating groups. Dry Matter accumulation (mg / endosperm). Moisture percentage, total nitrogen percentage, and zein percentage were studied. These traits were not altered in both normal and sugary opaque-2 endosperms of the several segregating groups. The results demonstrate that dry matter, total nitrogen and zein accumulation in normal and sugary opaque-2 endosperms are not affected by different levels of nutrients taken into the segregating ears. The Landy-Moureaux fractions in the sugary opaque-2 endosperms also showed no difference between the two segregating groups containing 71,7 and 7,9% of normal endosperms. The amount of free amino acid, though statistically lower in the group with 71,7% of normal endosperms, showed small difference corresponding to 5,8% of total endosperm nitrogen... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

La separación y purificación de una proteína desde una fermentación a gran escala es un elemento crítico en los procesos modernos biotecnológicos, puesto que representa el mayor costo industrial. Es por esto que numerosos estudios se enfocan en mejorar y/o disminuir las etapas de purificación, de manera de aumentar la pureza de la proteína de interés, y al mismo tiempo disminuir los costos de producción. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una celulasa del tipo endoglucanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para este estudio se seleccionaron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), de a lo más 6 aminoácidos, para formar la secuencia del extremo que fue adicionado en el extremo carboxilo terminal de la enzima nativa, mediante la técnica Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las endoglucanasas mutadas Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3. Los cultivos productores de las endoglucanasas modificadas con los extremos hidrofóbicos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas; luego las proteínas fueron recuperadas de la fracción extracelular para la posterior medición de actividad enzimática, proteína total y cálculo de la actividad específica. La adición de extremos hidrofóbicos no afectó la distribución de la actividad enzimática en las fracciones subcelulares, puesto que la endoglucanasa nativa y las mutadas presentaron comportamiento similar: más del 90% de actividad en el medio extracelular y en el periplasma un 6% aproximadamente. Los valores de proteína total demostraron que la endoglucanasa nativa y las mutadas tienen una igual distribución de proteínas, aproximadamente de un 87% en el medio extracelular y 8% en la fracción periplasmática. Con esto, fue posible concluir que la actividad y recuperación de la endoglucanasa no se vio afectada por la adición de los extremos hidrofóbicos. Adicionalmente, las endoglucanasas nativa y modificadas se purificaron por HIC, utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa Fast Flow 6FF. De los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retención adimensionales (DRT), de acuerdo a la fracción en la cual eluyó cada una de las endoglucanasas. En todos los cromatogramas se observó una tendencia similar, presentándose dos peaks de actividad tanto para la endoglucanasa nativa como para las modificadas. Esto se atribuye a la presencia de proteasas en el medio que posiblemente fragmentaron a la proteína en un sitio previo al extremo hidrofóbico. Se recomienda para futuros estudios, agregar inhibidores de proteasas para evitar estos sucesos. Por otra parte, se calculó la hidrofobicidad superficial de la endoglucanasa nativa y el aporte de cada extremo polipeptídico, para esto se usó como modelo una endoglucanasa de código pdb 1TVN, que tenía un 88,4 % de identidad a nivel de aminoácidos con la enzima utilizada en este estudio. Las proteínas mutadas presentaron en los valores de DRT un aumento porcentual promedio respecto de la endoglucanasa nativa de 19,7 %, 15,0 %, 14,3 % y 10,9 % para el caso de Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3 respectivamente, los cuales se relacionan con el porcentaje de aumento de la hidrofobicidad superficial total de la proteína (φ), según la recta: DRT = 2,41φ – 19,36 con un R2 = 0,96. Finalmente, se estableció como criterio cualitativo para seleccionar el extremo que reporte mayores mejoras en el proceso de purificación, que no es necesario que el extremo hidrofóbico incluya prolina para que esta proteína extracelular mantenga su actividad. Y como criterios cuantitativos, se estableció que el extremo a adicionar debe tener una hidrofobicidad menor a 500 y que existe una relación lineal entre el aumento de DRT y el aumento de hidrofobicidad.

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.