Orientador : Laurecir Gomes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T09:38:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_EdsonDelgado_D.pdf: 13735157 bytes, checksum: bc1b213b05a7f7ae4652d0bc93a4d39a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A matriz extracelular é essencial para o desenvolvimento do organismo, desempenhando diferentes funções. Nas cartilagens das articulações, a composição da matriz determina uma estrutura com propriedades elásticas e de suporte mecânico que facilita os movimentos. O papel fisiológico da cartilagem depende da integridade dessa matriz, formada em geral por fibras de colágeno, principalmente do tipo 11, proteoglicanos e glicoproteínas não colagênicas. Variações na concentração dos componentes e no tipo de constituição conferem propriedades biomecânicas especiais ao tecido. A análise bioquímica destes componentes tem sido descrita, especialmente em mamíferos, porém pouco se sabe dessa matriz na cartilagem de aves. Os proteoglicanos são importantes para a fisiologia do tecido, e a sua expressão pode variar sob a influência de diferentes fatores. Pequenos proteoglicanos, como fibromodulim e decorim, estão distribuídos de maneira diversa nas sub-regiões articulares, sugerindo uma relação entre a expressão dessas moléculas e as diferentes propriedades biomecânicas do tecido resultantes das forças em ação. Neste contexto, este trabalho teve como finalidade fazer a análise bioquímica da matriz extracelular de cartilagens das articulações escapulo-umeral, úmero-ulnar e úmero-radial de frangos, visando analisar pequenos proteoglicanos e identificar os tipos de glicosaminoglicanos presentes em cada região. As cartilagens provenientes do úmero proximal, úmero distal em contato com o rádio e úmero distal em contato com a ulna apresentaram maior conteúdo de ácido hexurônico e glicosaminoglicanos sulfatados quando comparados com as cartilagens oriundas da ulna proximal e rádio proximal. Variações significativas na concentração de proteína, ácido urônico e glicosaminoglicanos sulfatados foram obtidas no extrato total e na fração 04 de cada região. O glicosaminoglicano encontrado nas cartilagens estudadas foi o condroitim sulfato, com predominância de resíduos de ácido a-L-glicurônico e N-acetil _-O-galactosamina 4-0-sulfatados com uma relação de três _Oi-4S para cada _Oi-6S em todas as regiões, com exceção da cartilagem da região proximal do rádio, onde a razão foi de 2,5. As amostras obtidas, após cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica das frações D4, apresentaram um perfil eletroforético semelhante em SDS-PAGE. Na ausência de _-mercaptoetanol ocorrem duas bandas de 160 e 200 kDa que após tratamento com _-mercaptoetanol ficam tênues e ocorre o aparecimento de uma banda com 57 kDa. Esse fenômeno pode representar interação com outros elementos de matriz ou mesmo auto-agregação. Duas moléculas parcialmente isoladas reagiram com anticorpos anti-fibromodulim e anti-decorim em immunoblotting, sugerindo uma correspondência com fibromodulim e decorim. Os resultados obtidos neste trabalho podem corresponder à fisiologia normal de tecidos sob diferentes condições de pressão mecânica. Esses resultados podem ser representativos para as condições que esses animais se encontravam, porém diferentes variações podem ocorrer quando essas cartilagens forem analisadas em diferentes idades, condições de criação, genótipo, etc / Abstract: The extracellular matrix is present in every tissue, but it is specially abundant in tendons and cartilages. In articular cartilages, the composition of the matrix determines a structure with elastic and structural properties that facilitate the movements. The physiological role of cartilage depends on the integrity of the matrix, made mainly by type 11 collagen fibers, proteoglycans and non collagen glycoproteins. Variations in the concentration and types of components may result in special biomechanical properties to the tissue. The biochemical analysis of extracellular matrix components has been carried out in several species, but it is scarce in avian. Proteoglycans are important for the tissue physiology and its expression may vary under the influence of different factors. Small proteoglycans, as the fibromodulin and decorin, are differentially distributed in the articular cartilage sub-regions, suggesting a relation among the expression of those molecules and the presence of different biomechanical properties of the tissue. According to that, this work was focused on the biochemical analysis of the extracellular matrix articular cartilages from scapular-humerus, ulnar-humerus and radial-humerus articulations of chicken, aiming to analyze small proteoglycans and identify the type of glycosaminoglycans present in each cartilage. The cartilages obtained from proximal humerus, distal humerus in contact with the radius and distal humerus in contact with the ulna, presented higher content of uronic acid and sulfated glycosaminoglycans, when compared with cartilages obtained from proximal ulna and proximal radius. Significant variations in the concentration of protein, uronic acid and sulfated glycosaminoglycan were obtained from the total extract and in the 04 fraction of each region. The glycosaminoglycan found in the different cartilages was condroitin sulfate, with a predominance of a-L-glucuronic acid and N-acetil _-O-galactosamine 4-0-sulfated residues with a relation of three LlOi-4S for each LlOi -6S in ali regions, with the exception of cartilage from the radium proximal region, where the relation was of 2.5. Samples obtained afier ion exchange and hydrophobic interaction chromatographies from 04 fraction presented the same electrophoretic profile in SDS-PAGE. In the absence of _mercaptoethanol two components of 160 and 200 kDa were detected, which afier treatment with _-mercaptoethanol appear as a faint band; a polypeptide with 57 kDa was also present in reducing conditions. If the 57 kDa component arose from a oligomeric component or from some autoaggregation process remains to be studied. Immunoassays using anti-fibromodulin and anti-decorin, indicated that the components with 57 kDa and 70-90 kDa found in matrix of each joint analyzed are the small proteoglycans fibromodulin and decorin. Despite the different sites and functional properties of the different cartilages, no differences were found in the composition of the extracellular matrix of each one / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Marcela Aldrovani Rodrigues / Banca: João Antonio Tadeu Pigatto / Banca: Aline Adriana Bolzan / Resumo: Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / Abstract: The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture / Mestre

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Proteoglicanos são macromoléculas complexas compostas de polissacarídeos lineares, os glicosaminoglicanos (GAGs), ligados covalentemente a um core protéico. Os GAGs contêm grupamentos sulfato em várias posições, formando domínios específicos, que permitem a interação com moléculas da matriz extracelular, incluindo os fatores de crescimento. Neste estudo, utilizamos o sistema de co-cultura em Transwell para analisar a interação entre fibroblastos e células de adenocarcinoma colorretal humano, Caco-2, e investigar os efeitos dessa interação na proliferação celular e na síntese de GAGs. Componentes solúveis trocados pelas células nesse sistema, induziram um aumento marcante na proliferação da Caco-2, efeito não observado nos fibroblastos. Um aumento na biossíntese de GAGs por incorporação de 35S-NaSO4, foi observado em ambas linhagens, contudo o aumento mais significativo de condroitim sulfato (CS) foi detectado nas células estromais. A microscopia confocal mostrou um aumento expressivo de versicam produzido pelos fibroblastos. TGF-b1 exógeno também foi testado e exibiu um significante aumento de CS dose-dependente. Estes resultados sugerem que este fator de crescimento possa ser, em parte, responsável pelo aumento de CS observado nas células estromais, durante a interação parácrina. A linhagem Caco-2, previamente analisada neste trabalho, também foi usada em comparação com outra linhagem de maior potencial metastático, HCT116. Uma linhagem de epitélio intestinal de rato, IEC-6, foi utilizada como controle. A marcação dessas células com 35S-NaSO4 e a investigação de GAGs com enzimas específicas, mostraram aumento de 6-O-sulfatação de HS e CS. Os dados estruturais foram confirmados por PCR em Tempo Real, onde observamos a elevação específica da expressão do mRNA da 6-Osulfotransferase de heparam nas células Caco-2 e HCT116, quando comparadas à IEC-6. O aspecto mais estudado até o momento, entre a estrutura fina do HS e a sinalização para fatores de crescimento, é o possível envolvimento da 6-O-sulfatação na ativação da sinalização do FGF. Altos níveis de expressão de 6-O-sulfotransferase de condroitim-4- sulfato, foram encontrados nas células HCT116, cuja estrutura do CS contem GalNAc-4,6-sulfato, presente nos tetrassacarídeos e dissacarídeos dissulfatados. A participação dessas estruturas super-sulfatadas no CS tem sido correlacionada com a motilidade de células tumorais. Os dados estruturais obtidos neste trabalho e as correlações com as funções biológicas mencionadas, necessitam ser melhor investigados. / Proteoglycans (PG) are complex macromolecules composed of linear polysaccharide chains, the glycosaminoglycans (GAGs), covalently attached to a core protein. These GAG chains contain sulphate groups at various positions, giving rise to specific domains, which allows them to interact with extracellular matrix molecules, including various growth factors. In this study, we have used a transwell coculture system to analyse the interaction between human fibroblasts stromal cells and human colonic carcinoma cell line (Caco-2) and investigate the effects of this interaction on cell proliferation and glycosaminoglycans synthesis. Soluble components exchanged between the cell lines in Transwell system caused a marked increase of Caco-2 cell proliferation, not observed on fibroblasts. An increase of GAGs biosynthesis was observed in both cell lines, whereas a prominent increase of CS was observed mainly in stromal cells, as determined by incorporation of 35SNa2SO4. Confocal microscopy showed significant increase of versican production by fibroblasts cells. TGF-â was also tested exhibiting a significant increase on GAG synthesis mainly in fibroblasts cells, producing a strong CS-stimulating response. These results suggest that this growth factor may be responsible for the CS increase observed in stromal cells. Caco-2 cells previously analyzed in this work were used to compare with a cell line with increased metastatic potential, HCT116. A normal rat intestinal epithelium cell line, IEC-6 was used as control. Labeling of cells with 35S-Na2SO4 and investigation of GAGs with specific enzymes showed an increased 6-O-sulfation of HS and CS. GAGs structural data were confirmed by Real Time PCR with elevation of specific heparan-6-O-sulfotransferase mRNA expression on Caco-2 and HCT116 cells, compared to IEC-6. The most extensively studied aspect of relationship between HS fine structure and growth factor signaling to date is the possible involvement of 6-Osulfation in the activation of FGF signaling. High levels of chondroitin-4,6-O-sulfotransferase expression was found only in HCT116 cells, whose CS structure contained GalNAc,4,6-sulfate, present on tetrasaccharides and disulfated disaccharides. The participation of the oversulfated structure on CS has been shown to promote tumoral cell motility. Whether these structural data obtained in this work correlate to the mentioned biological functions, remains to be elucidated. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:12Z : No. of bitstreams: 1 000848379.pdf: 743130 bytes, checksum: d77bb064fd18e5841495951287d9ff0f (MD5) / Por objetivos, estudaram-se procedimentos em cultivo celular e se eles alteram a supraorganização da matriz extracelular (MEC) amniótica e da límbica, considerando-se propriedades anisotrópicas dos biopolímeros em comum, isto é, colágenos fibrilares e proteoglicanos. Explantes límbicos de coelhos foram cultivados sobre fragmentos de membrana amniótica (MA) desepitelizada humana, por dois, sete e 15 dias. Fragmentos não cultivados de MA e de limbo foram usados como controles. Avaliaram-se parâmetros de birrefringência em fibras colágenas e de absorção e de dicroísmo linear (LD) em proteoglicanos, da MEC amniótica e da límbica. Todas as análises foram conduzidas em microscópio óptico munido de luz polarizada, filtros monocromadores com diferentes comprimentos de onda e vídeo-câmera. Empregaram-se procedimentos em análise digital de imagens (software Image J®, NIH, USA). Parâmetros de birrefringência revelaram que os graus de paralelismo das fibras colágenas amnióticas foram de 1,02 nos controles, 1,17 nas amostras cultivadas por dois dias, 1,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 1,17 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 1,33, 1,17, 1,25 e 1,44. Os contrastes dos brilhos das birrefringências das fibras amnióticas foram de 2,0 nos controles, 13,25 nas amostras cultivadas por dois dias, 19,26 nas amostras cultivadas por sete dias e de 13,23 nas amostras cultivadas por 15 dias. Relativamente às fibras límbicas, foram de 23,01, 13,39, 19,90 e 30,31. Cores de interferência causadas por dispersão anômala de birrefringência foram detectadas. Procedimentos em cultivo celular alteraram parâmetros absorciométricos relacionados à supraorganização dos proteoglicanos da MEC amniótica e da límbica. As MAs de todas as amostras, exceto as cultivadas por 15 dias, apresentaram-se com valores negativos de DL. Os valores de DL dos limbos de todas as amostras, exceto... / The goal of this study was to evaluate whether procedures on cell culture alter the supraorganization of amniotic and limbal extracellular matrix (ECM). Anisotropic properties of fibrillar collagen and proteoglycans were studied, since they correspond to major extracellular biopolymers. Rabbit limbal explants were cultured on denuded human amniotic membrane (AM) for two, seven, and 15 days. Uncultured AM and limbus were used as controls. Birefringence parameters related to the supraorganization of collagen fibers, and spectral absorption and linear dichroism (LD) related to the supraorganization of proteoglycans were evaluated. All samples were evaluated on microscope equipped with polarized light, monochromatic filters with varying wavelengths, and digital video camera. Birefringence, absorbances and LD were quantified by using image analyses software (Image J®, NIH, USA). Studies on birefringence showed that parallelism degrees of amniotic collagen fibers were of 1.02 for the control group, 1.17 for the two days culture, 1.26 for the seven days culture, and 1.17 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, parallelism degrees were of 1.33, 1.17, 1.25, and 1.44. Birefringence brightness contrasts of amniotic collagen fibers were of 2.0 for the control group, 13.25 for the two days culture, 19.26 for the seven days culture, and 13.23 for the 15 days culture. In relation to limbal collagen fibers, birefringence brightnesses were of 23.01, 13.39, 19.90, and 30.31. Interference colors due to anomalous birefringence dispersion were observed. Procedures on cell culture induced alterations in absorbance values related to proteoglycans from amniotic and limbal ECM. In all samples, except on those cultured for 15 days, the amniotic ECM showed negative DL values. The DL of limbal ECM varied between negative and positive values for all, except on two days culture

Orientadores: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pierucci_Amauri_M.pdf: 5128505 bytes, checksum: a07838aa6b35835acc1f67167d46c9dd (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A regeneração nervosa periférica é um fenômeno complexo que envolve diferentes tipos celulares, os quais auxiliam na regeneração axonal e na reorganização dos componentes da matriz extracelular do microambiente do nervo. Nesse, estão presentes as células de Schwann, fibroblastos, macrófagos, fibras de colágeno, laminina, fibronectina e proteoglicanos. Entre os componentes não neurais, as células de Schwann são fundamentais para o processo regenerativo, pois fagocitam os fragmentos de axônios e de bainha de mielina em degeneração no coto distal, guiam os axônios em regeneração através das bandas de Büngner e secretam fatores neurotróficos para a sobrevivência e crescimento neuronal. Entre os componentes da matriz extracelular, os proteoglicanos apresentam a propriedade de reter substâncias hidrossolúveis, interagir com outros componentes da matriz extracelular, e funcionar como receptores para fatores de crescimento. Tendo-se em vista as características estruturais dos proteoglicanos no que diz respeito à sua capacidade de retenção de moléculas hidrossolúveis, bem como a homologia de seus componentes a fatores de crescimento, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos do agrecan sobre a regeneração axonal in vivo, empregando-se a técnica da tubulização do nervo ciático. Adicionalmente, seus efeitos sobre o comportamento das células de Schwann serão investigados in vitro, através da cultura de explantes de nervo ciático. O nervo ciático esquerdo dos camundongos C57BL/6J (n=20) foi transeccionado e os cotos proximal e distal foram suturados no interior de um tubo de polietileno, permanecendo uma distância de 4mm entre os cotos. No grupo controle o tubo foi implantado e deixado vazio enquanto que no grupo experimental, esse foi preenchido com agrecam. Após 5 semanas, os animais foram sacrificados e o nervo regenerado foi processado para imunoístoquimica e microscopia eletrônica. Em cultura, nervos ciáticos de ratos Wistar (n=10) foram utilizados para estudo da migração e viabilidade celular. Os resultados in vitro mostraram que a migração e viabilidade celular foram maiores quando utilizada menor concentração de soro fetal bovino (20%) associada ao acréscimo do agrecam. In vivo, houve um aumento do número de fibras quando utilizado o agrecam (2343±370,31) em relação ao grupo controle (1522±424,58). Embora o diâmetro axonal, o diâmetro da fibra e a espessura da bainha de mielina tenham sido menores quando utilizado agrecam (3,01µm±0,10; 3,86µm±1,22; 0,36µm±0,10) em relação ao grupo controle (3,40µm±1,37; 4,53µm±1,56; 0,44µm±011), a razão ¿g¿ indicou que o padrão de mielinização foi proporcional ao diâmetro axonal no grupo com agrecam (0,76±0,06) e no controle (0,74±0,08). Os resultados desse estudo reforçam a hipótese que o agrecam, devido as propriedades biológicas e capacidade trófica, contribui para o processo da regeneração axonal e tem efeitos positivos sobre as células de Schwann / Abstract: Peripheral nerve regeneration is an intricate phenomenon that is dependent on the glial cells, which produce neurotrophic factors and reorganize the environment at the distal stump. It is well known that extracellular matrix components may have positive effects on both glial and neuronal survival and behavior. Among such molecules, collagen, laminin and fibronectin were proven to benefit the process both in vivo and in vitro. More recently, studies have shown that glycosaminoglycans also have, under certain conditions, a positive influence on the peripheral nerve regeneration process. In the present study we evaluated the effects of aggrecan, a high molecular weight proteoglycan, on non neuronal cell migration in vitro. Also, we investigated the properties of such a proteoglycan on axonal regeneration after sciatic nerve transection and tubulization. In vitro, non neuronal cell migration and viability were accessed for up to 2 weeks of culturing. In vivo, five weeks after tubulization, the number of axons, axonal and fiber diameter and myelin thickness were obtained from regenerated fibers found at the tube mid point. In culture, with lower fetal calf serum concentration (20%), aggrecan increased the glial cell number and viability. In vivo, the number of regenerated fibers was statistically greater when aggrecan was used (2343±370.31) compared to the empty tube (1522±424.58). Although the axonal diameter, fiber diameter and myelin thickness in the aggrecan treated group (3.01µm±0.10; 3.86µm±1.22; 0.36µm±0.10; respectively) were smaller than in the empty tube (3.40µm±1.37; 4.53µm±1.56; 0.44µm±0.11; respectively), the ¿g¿ ratio indicated a pattern of myelination that was proportional to the axonal diameter in both groups (0.76±0.06 - aggrecan; 0.74±0.08 - empty). The results of this study reinforce the hypothesis that aggrecan, due to its biological properties and trophic capabilities, contributes to the axonal regeneration process and has particularly positive effects on the Schwann cells / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Edson Rosa Pimentel, Benedicto de Campos Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mazon_Josete_M.pdf: 1402219 bytes, checksum: 4312afc51c95b035152e6363715bc138 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As cúspides da valva aórtica são constituídas principalmente de água (cerca de 80%), mas também contém proteínas colagênicas e não colagênicas, elastina, pequenos e grandes proteoglicanos, responsáveis por suas propriedades mecânicas. Estruturalmente são formadas por três camadas distintas, a fibrosa, a esponjosa e a ventricular. As camadas fibrosa e ventricular mantém a integridade estrutural da valva, enquanto a esponjosa tem papel importante na absorção de forças mecânicas de tensão e compressão. As valvas aórticas de porco têm sido utilizadas para a produção de biopróteses, mas sua durabilidade tem sido prejudicada especialmente devido à calcificação, o que justifica a necessidade de um melhor conhecimento sobre seus aspectos organizacionais e composicionais. A montagem total dos folhetos valvares corados com azul de toluidina, mostrou uma estrutura fortemente corada, com componentes fibrosos e material metacromático acompanhando estes componentes. Estes componentes fibrosos emergiam das regiões de inserção da valva na parede da artéria, de ambos os lados do folheto e exibiram um trajeto preferencialmente longitudinal, seguindo o eixo mais longo do folheto. A análise em microscopia de polarização mostrou brilho intenso exibido pelas fibras e fibrilas evidenciando a distribuição altamente orientada dessas estruturas. A metacromasia foi intensa ao longo dos feixes de colágeno e em várias regiões distribuídas de maneira não uniforme no folheto. Análise de cortes histológicos mostrou as três camadas bem distintas do folheto, sendo duas fibrosas e uma intermediária com características de tecido conjuntivo frouxo. Os folhetos apresentaram grande quantidade de células com diferentes morfologias e distribuição, enquanto que, nas faces voltadas para a artéria aorta e para o ventrículo, foi encontrada uma camada endotelial. Na camada fibrosa as células são alongadas, denominadas de fibroblastos, e apareceram dispostas ao longo dos feixes de colágeno. A camada ventricular apresentou células arredondadas, similares aos condrócitos. Na camada esponjosa foram encontrados os dois tipos celulares. O estudo bioquímico mostrou a presença de proteínas não colagênicas que apresentaram massa molecular aparente entre 18 - 170kDa. Uma banda polidispersa em torno de 70kDa e outra na faixa de 80 a 100kDa possivelmente correspondam aos pequenos proteoglicanos fibromodulim e decorim, além da presença de proteoglicano de alto peso molecular. Condroitim sulfato e dermatam sulfato são os principais glicosaminoglicanos presentes nesse folheto. Analizando os dados morfológicos e bioquímicos, podemos concluir que: 1) Pequenos e grandes proteoglicanos estão presentes na matriz extracelular da valva aórtica. 2) Os proteoglicanos estão preferencialmente distribuídos no folheto em certas regiões, devido a presença de intensas forças compressivas nestas regiões. 3) Feixes de colágeno estão distribuídos ao longo do maior eixo do folheto que se fundem formando uma estrutura entrelaçada para fornecer a sustentação da valva durante a sístole e a diástole / Abstract: The cuspids of the aortic valve are constituted mainly by water (approx. 80%), but also by collagen and noncollagenous proteins, elastin and proteoglycans, which are responsible for their mechanical properties. Structurally are formed by fibrous, spongeous, and ventricular layers. Fibrous and ventricular layers maintain the structural integrity of the valve, while the spongeous layer has an important role in absorption of tension and compression mechanical forces. The porcine aortic valves have been utilized for the production of bioprostheses, however its durability is reduced especially due to calcification process. Structural analyses of whole mounts of the valvar leaflets stained with toluidine blue showed strongly stained fibrous components and metachromatic material following the fibrilar components. The fibrous components emerged from the insertion regions of the valve at the aorta wall, from both sides of the leaflet and have exhibited a mainly longitudinal trajectory, according the main axis of the leaflet. Analysis in polarization microscopy showed an intense bright of the fibers and fibrils demonstrating the high molecular order of the collagen molecules in the fibrous components. Along the main axis of the collagen bundles intense metachromasy was observed. Several metachromatic regions were also found in a non-uniform distribution. Analysis of histological sections stained with toluidine blue showed the three well distinct layers of the leaflet. A great amount of cells was observed in the endothelial layer of the aortic and ventricular faces of the leaflet. Cells with different morphologies and distributions were also observed in the different layers. At the fibrous layer elongated cells, named fibroblasts, were found along the collagen bundles. The ventricular layer showed round cells, similar to condhrocytes. At the spongeous layer both types of cells were fond. The biochemical study consisted of extracting the extracellular matrix components using 4 M guanidine-chloride, fractionation in DEAE-Sephacel column and analysis in SDS-PAGE. The collagenic proteins found at the leaflets showed Mr values between 18- 170 kDa. A polydisperse band with 70 kDa and another between 80 and 100 kDa were found and possibly are the small proteoglycans fibromodulin and decorin. The analysis of glycosaminoglycans in agarose-propilenodiamino gel, after digestion with papain, revealed the presence of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. The analysis in agarosepolyacrylamide gel of the ultracentrifugation D1 fraction revealed a polydisperse and metachromatic band after toluidine blue staining, indicating the presence of proteoglycans of high molecular weight. Analyzing the biochemical and morphological data, may be concluded that: 1) Small and large proteoglycans are present in the extracellular matrix of the aortic valve. 2) Proteoglycans are distributed preferentially in certain regions of the leaflet probably due a more intense presence of compressive forces in those regions. 3) Collagen bundles are distributed along the main axis of the leaflet but are also found forming an interwoven structure to provide sustentation of the valve during systole and diastole / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estudio de las biocerámicas ha alcanzado grandes avances en los últimos años al lograr un mayor entendimiento de la formación de éstas, ya sean huesos, cáscara de huevo de aves, conchas de moluscos, urolitos o corales. Pero aún faltan muchos aspectos por comprender, como lo es la participación de las moléculas de la matriz orgánica, entre ellas los proteoglicanos, poco estudiados en cuanto a su ubicación y función en el proceso de biomineralización. Por esto se planteó como objetivo determinar su presencia y distribución en una biocerámica cuya matriz orgánica ha sido descrita en parte, la concha del abalón rojo (Haliotis rufescens), pero en la que los proteglicanos no han sido descritos. Para ello, en primer lugar se realizó un análisis estructural de la concha a través del uso de microscopía electrónica de barrido, y se utilizaron muestras descalcificadas parcialmente, las cuales aportaron un mayor entendimiento a la composición de los componentes orgánico e inorgánico de la porción aragonítica de la concha. Utilizando la misma técnica microscópica, se procedió a determinar la presencia de GAGs (glicosaminoglicanos) en la matriz orgánica por medio de inmunodetección; para lograrlo se obtuvieron cortes de concha desproteinizadas parcialmente, en las cuales se encontraron estos proteoglicanos y se describió una cierta distribución diferencial. También se utilizó microscopía electrónica de transmisión como apoyo para describir la presencia y localización de los GAGs en la concha, para lo cual se realizaron cortes finos de muestras descalcificadas y a través del uso de la técnica de inmunoro se reveló la existencia de estos proteoglicanos y su ubicación en la matriz orgánica. Queratán sulfato se presentó principalmente en la mesocapa y aragonita esferulítica, por lo que podría estar interviniendo en la nucleación de cristales de aragonita. Condroitín 4 sulfato, Condroitín 6 sulfato y Dermatán sulfato se ubicaron a nivel de las matrices de la aragonita en tabletas, determinando posiblemente la morfología de este tipo de aragonita, y Condroitín 4 sulfato también fue hallado en la matriz de la aragonita en bloques, por lo que puede estar influyendo la disposición de los cristales de aragonita en bloque en esta zona. Estos resultados sugerirían que al existir una localización diferencial de los proteoglicanos a través de la porción aragonítica de la concha, existe una función específica para cada uno de ellos en el proceso de biomineralización. / FONDAP 11980002

As proteínas são importantes componentes da matriz extracelular da polpa dentária e possuem diferentes funções nos tecidos. A literatura odontológica não relata como os proteoglicanos se distribuem e agem na matriz extracelular de dentes decíduos durante o processo fisiológico de rizólise. Foi objetivo do trabalho analisar as expressões dos proteoglicanos biglican e decorin e relacioná-las com as diversas fases do processo de rizólise. Para isso foram utilizados dentes decíduos humanos extraídos e livres de lesões de cárie, apresentando vários estágios de reabsorção radicular, divididos em três grupos: com dois terços ou mais do comprimento radicular médio, um terço ou mais do comprimento radicular médio e menos de um terço do comprimento radicular médio. Foi utilizada a técnica da imunoistoquímica, com o método da estreptavidina-biotina-peroxidase, e anticorpos contra as proteínas anteriormente citadas. Os resultados mostraram que os proteoglicanos estudados apresentaram imunorreatividade na matriz extracelular da polpa e da dentina dos dentes nas três fases de reabsorção. Foi possível concluir que houve diferença na distribuição e no padrão de expressão dos proteoglicanos biglican e decorin apenas na área de reabsorção, nos dentes decíduos hígidos nas três fases de rizólise o que sugere um papel regulador destes proteoglicanos no processo de reabsorção fisiológica nos dentes decíduos hígidos. / Proteins are important components in pulp extracellular matrix and perform several different roles in the body tissues. The distribution and functions of some proteins have already been described but there aren?t studies showing how the proteoglycans are distributed and act in the extracellular matrix of deciduous teeth at the physiological resorption process. The aim of the present work was to study the expression and distribution of the following non-collagenous components of the extracellular matrix: biglycan and decorin in deciduous teeth dental tissues at the physiological root resorption. Hygid human deciduous teeth that were extracted for orthodontic reasons were grouped together according to root length: group I - two thirds or more of average length root, group II - one third or more of average length root and group III ? less than one third of average length root. The streptavidin-biotinperoxidase method of immunohistochemistry was used with antibodies against the antigens previously quoted. The results showed that the proteoglycans had been found in pulp and dentin extracellular matrix in all groups. In conclusion, biglycan and decorin were differentially found only in the resorption area, between tissues in resorption process and its adjacent zone, which make us believe that these proteoglycans act regulating the physiological resorption process in hygid deciduous teeth.

As proteínas são importantes componentes da matriz extracelular da polpa dentária e possuem diferentes funções nos tecidos. A literatura odontológica não relata como os proteoglicanos se distribuem e agem na matriz extracelular de dentes decíduos durante o processo fisiológico de rizólise. Foi objetivo do trabalho analisar as expressões dos proteoglicanos biglican e decorin e relacioná-las com as diversas fases do processo de rizólise. Para isso foram utilizados dentes decíduos humanos extraídos e livres de lesões de cárie, apresentando vários estágios de reabsorção radicular, divididos em três grupos: com dois terços ou mais do comprimento radicular médio, um terço ou mais do comprimento radicular médio e menos de um terço do comprimento radicular médio. Foi utilizada a técnica da imunoistoquímica, com o método da estreptavidina-biotina-peroxidase, e anticorpos contra as proteínas anteriormente citadas. Os resultados mostraram que os proteoglicanos estudados apresentaram imunorreatividade na matriz extracelular da polpa e da dentina dos dentes nas três fases de reabsorção. Foi possível concluir que houve diferença na distribuição e no padrão de expressão dos proteoglicanos biglican e decorin apenas na área de reabsorção, nos dentes decíduos hígidos nas três fases de rizólise o que sugere um papel regulador destes proteoglicanos no processo de reabsorção fisiológica nos dentes decíduos hígidos. / Proteins are important components in pulp extracellular matrix and perform several different roles in the body tissues. The distribution and functions of some proteins have already been described but there aren?t studies showing how the proteoglycans are distributed and act in the extracellular matrix of deciduous teeth at the physiological resorption process. The aim of the present work was to study the expression and distribution of the following non-collagenous components of the extracellular matrix: biglycan and decorin in deciduous teeth dental tissues at the physiological root resorption. Hygid human deciduous teeth that were extracted for orthodontic reasons were grouped together according to root length: group I - two thirds or more of average length root, group II - one third or more of average length root and group III ? less than one third of average length root. The streptavidin-biotinperoxidase method of immunohistochemistry was used with antibodies against the antigens previously quoted. The results showed that the proteoglycans had been found in pulp and dentin extracellular matrix in all groups. In conclusion, biglycan and decorin were differentially found only in the resorption area, between tissues in resorption process and its adjacent zone, which make us believe that these proteoglycans act regulating the physiological resorption process in hygid deciduous teeth.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 3 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 4 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 5 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5) Publico-12671e.pdf: 132448 bytes, checksum: 7153a9583a94f50f2a56c79c6d7d320a (MD5) / O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular. / Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações